KR101698270B1

KR101698270B1 - A Pharmaceutical composition comprising extract of Scutellaria baicalensis for enhancing the therapy of diabetes mellitus and obesity

Info

Publication number: KR101698270B1
Application number: KR1020150089774A
Authority: KR
Inventors: 김호준; 진영원; 최한석
Original assignee: 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2015-06-24
Publication date: 2017-01-19
Also published as: KR20160011571A

Abstract

본 발명은 황금 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 및 항비만 효과 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 황금 추출물과 대표적인 항당뇨병제인 Metformin의 병용투여를 통한 항당뇨 효과 증진 및 Metformin에 의해 유발되는 부작용의 감소를 확인하였고, 이와 함께 지방축적 억제를 통한 비만 치료 효과를 확인하였는바, 당뇨병의 효과적인 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. The present invention relates to a composition for promoting an anti-diabetic effect and an anti-obesity effect comprising a gold extract. The combination of the gold extract of the present invention and Metformin, a representative anti-diabetic agent, showed an increase in antidiabetic effect and a decrease in side effects caused by metformin. In addition, the effect of treating obesity by inhibiting fat accumulation was confirmed. It is expected to be useful for effective treatment.

Description

TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for enhancing an anti-diabetic and anti-obesity effect including a gold extract,

본 발명은 항당뇨 효과 및 항비만 효과 증진용 조성물로서, 보다 구체적으로는 항당뇨병제인 메트포민(Metformin)의 당뇨병 치료효과를 증진시킴과 동시에 비만도 치료할 수 있는 황금(Scutellaria baicalensis) 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for promoting an anti-diabetic effect and an anti-obesity effect, More particularly, the present invention relates to a composition comprising an extract of Scutellaria baicalensis, which is an anti-diabetic drug, Metformin, which is capable of treating diabetes and treating obesity.

당뇨병은 인슐린의 절대적 또는 상대적 결핍 및 조직에서의 인슐린 작용성 저하에 기인하는 고혈당과 이에 수반되는 대사 장애를 특징으로 하는 질환이다. 인류문명의 발달에 따른 식이 형태와 생활양식의 변화로 인해 비만 인구와 함께 증가추세에 있는 제 2형 당뇨병(Type 2 Diabetes Mellitus)은 인슐린의 분비가 절대적으로 부족한 제 1형 당뇨병(Type 1 Diabetes Mellitus)과는 달리 인슐린 저항성이 주요한 병태 생리학적 특징이다. 인슐린 저항성은 유전적인 요인과 함께 말초조직에서 인슐린 감수성을 감소시키는 식이 형태나 비만, 운동부족, 스트레스 등의 생활습관과 밀접한 관련이 있다. 인슐린 민감성의 감소는 비만과 매우 높은 연관성을 가지며, 비만 상태에서의 염증 반응이 인슐린 민감성을 감소시킨다는 연구들이 많이 보고되고 있다.Diabetes is a disease characterized by hyperglycemia resulting from the absolute or relative deficiency of insulin and a decrease in insulin action in tissues and concomitant metabolic disorders. Type 2 Diabetes Mellitus is a type 1 diabetes mellitus (Type 1 Diabetes Mellitus) that is insufficiently secreted due to changes in dietary patterns and lifestyle due to the development of human civilization. ), Insulin resistance is a major pathophysiological feature. Insulin resistance is closely linked to genetic factors and dietary patterns that reduce insulin sensitivity in peripheral tissues, lifestyle such as obesity, lack of exercise, and stress. There are many reports that the decrease of insulin sensitivity is highly related to obesity, and the inflammatory response in obese state reduces insulin sensitivity.

현재 제 2형 당뇨병 치료제로서, 인슐린 분비능을 증가시키는 sulfonlurea 계통의 약물이 있고, 인슐린 작용력을 향상시키는 peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPAR-γ) agonist인 pioglitazone과 rosiglitazone의 약물이 있다. 이 밖에도 간에서 당신생 합성을 감소시키는 Metformin 계통의 약물, 탄수화물의 소화흡수를 방해하여 식후 혈당의 상승을 방지하는 acarbose 계통의 약물이 있다.Currently, there are sulfonlurea drugs that increase insulin secretion, and pioglitazone and rosiglitazone, a peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR-γ) agonist that improves insulin action. In addition, there is a drug called acarbose, which prevents the increase of postprandial blood glucose by interfering with digestion and absorption of Metformin system drugs, carbohydrates, which reduce your biosynthesis in the liver.

이러한 약물 중에서도 Metformin은 다른 경구용 혈당강하제에 비해 저혈당 및 체중증가 등의 부작용이 적다는 장점이 있어 현재 제2형 당뇨병 환자의 1차적인 약물요법으로 사용되고 있다. 현재, Metformin은 이의 염산염으로서 글루코파지 (GLUCOPHAGE: 등록상표명, Bristol-Myers Squibb Company)의 정제 형태로 시판되고 있다. 시판되고 있는 글루코파지 정제는 500 mg, 850 mg, 또는 1000 mg의 염산 Metformin을 함유하고 있으며, 그 투여는 효능 및 내성의 양 측면을 고려하여 하루에 2,550 mg의 최대 요구 용량을 초과하지 않는 범위 내에서 이루어지고 있다.Among these drugs, Metformin has the advantage of less side effects such as hypoglycemia and weight gain than other oral hypoglycemic agents and is currently being used as the first drug therapy for type 2 diabetes. Presently, Metformin is marketed as its hydrochloride salt in the form of a tablet of GLUCOPHAGE (registered trademark, Bristol-Myers Squibb Company). Commercially available glucophage tablets contain 500 mg, 850 mg, or 1000 mg of Metformin hydrochloride, and its administration is within a range that does not exceed the maximum required dose of 2,550 mg per day, taking into consideration both efficacy and tolerance. .

Metformin은 French lilac의 주요성분으로 1957년부터 유럽에서 사용되어 왔고, 미국에서는 1994년부터 사용이 허가되었으나 작용기전은 비교적 최근에 밝혀졌다. 이제까지 알려진 대표적인 작용기전은 세포의 에너지 조절에 관여하는 AMP-activated protein kinase(AMPK)의 활성화를 유도하여 간에서 당 신생작용을 억제하고 근육 및 간에서 지방산 산화를 촉진시키는 것으로 보고되었다. 최근 연구결과에 의하면 Metformin의 혈당 저하작용에는 AMPK의 인산화 상위 kinase인 LKB1이 필요한 것으로 밝혀졌으며, LKB1에 의해 transcriptional co-activator인 TORC2의 인산화를 통한 당신생 억제작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다.Metformin has been used in Europe since 1957 as a major component of French lilac and has been approved for use in the United States since 1994, but its mechanism of action has been relatively recent. It has been reported that the typical mechanism of action thus far is to induce activation of AMP-activated protein kinase (AMPK), which is involved in energy regulation of the cell, thereby suppressing the hepatogenic activity and promoting fatty acid oxidation in muscles and liver. Recent studies have shown that LKB1, an upper kinase for phosphorylation of AMPK, is required for the hypoglycemic action of Metformin, and it has been shown that LKB1 inhibits your life by phosphorylation of the transcriptional co-activator TORC2.

다만, Metformin에 의해 유발되는 부작용으로서, 복용 환자의 20 내지 30 ％에서, 식욕 감퇴, 복부 팽만감, 구역, 설사 등이 보고된바 있다. 또한, 드물게 젖산증(lactic acidosis)을 유발하는 것으로 보고되었고, 이로 인해 신질환, 간질환, 저산소증, 심각한 감염, 알코올중독증 등이 동반된 경우에는 주의를 필요로 한다. 이러한 부작용은 최소 및/또는 지속 용량을 감소시키거나 투약 횟수를 줄이거나 다른 약제와 병용 투여하는 방법에 의해 부분적으로 해결될 수 있다.However, as a side effect caused by Metformin, anorexia, abdominal bloating, nausea and diarrhea have been reported in 20 to 30% of patients taking it. It is rarely reported to cause lactic acidosis, and caution should be exercised when accompanied by renal disease, liver disease, hypoxia, severe infection, alcoholism, and the like. Such side effects can be partially resolved by reducing the minimum and / or sustained dose, by reducing the number of dosing regimens, or by co-administering with other drugs.

따라서, 약제의 병용 또는 혼합을 통한 Metformin의 당뇨병 치료효과 상승 및 부작용 감소가 주요한 과제의 대상 되고 있고, 관련 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2011-0123908), 아직 미비한 실정이다. Therefore, the increase of the therapeutic effect of Metformin through the combination of drugs or the mixing thereof and the reduction of side effects are the main problems, and related studies have been made (Korea Patent Publication No. 10-2011-0123908).

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 항당뇨병제인 Metformin과 황금 추출물의 병용에 의한 항당뇨 효과의 증진, 부작용 감소 및 지방축적 억제 효과를 확인하고, 이에, 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.Disclosure of the Invention The present invention has been conceived to solve the problems as described above. The present inventors have confirmed that the combination of Metformin, an anti-diabetic agent, and a gold extract improves the antidiabetic effect, reduces side effects and inhibits fat accumulation, Thereby completing the present invention.

이에, 본 발명의 목적은 항당뇨병제인 Metformin과 병용되는, 황금 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for enhancing antidiabetic effect comprising a gold extract, which is used in combination with Metformin, an anti-diabetic agent.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항 당뇨병제인 Metformin과 병용되는, 황금 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention as described above, the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing the antidiabetic effect comprising a gold extract, which is used in combination with Metformin, an anti-diabetic agent.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 상기 항 당뇨병제인 Metformin과 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the composition is administered simultaneously, separately or sequentially with Metformin, the anti-diabetic agent.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 지방세포의 분화를 억제시키는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the composition is characterized by inhibiting the differentiation of adipocytes.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 황금 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매로 추출한 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the gold extract is characterized by being extracted with at least one solvent selected from the group consisting of water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, and a mixed solvent thereof.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 AMPK-α 및 PPAR-α로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the composition is characterized in that the expression of one or more genes selected from the group consisting of AMPK-alpha and PPAR-alpha is increased.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 XBP-1, TNF-α 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the composition is characterized in that expression of one or more genes selected from the group consisting of XBP-1, TNF-a and IL-6 is reduced.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료효과 증진 및 비만 치료방법을 제공한다.The present invention provides a method of treating hyperlipemia and an obesity treatment method comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject.

본 발명은 황금 추출물을 포함하는 조성물의 당뇨병 치료효과 증진 및 비만의 치료 용도를 제공한다.The present invention provides the use of a composition containing a golden extract to improve the therapeutic effect of diabetes and to treat obesity.

본 발명에 따른 조성물은 황금 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 황금 추출물과 항당뇨병제인 Metformin을 병용함으로써, 당뇨병, 전당뇨 치료효과 증진 및 부작용 감소를 확인하였는바, 당뇨병을 치료효과를 증진시키기 위한 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 아울러, 상기 당뇨병 치료효과와 함께 지방축적 억제효과를 확인하였는바, 당뇨병 치료와 함께 비만의 예방 또는 치료 효과를 기대할 수 있다.The composition according to the present invention contains a gold extract as an active ingredient and the combination of the gold extract and Metformin, an anti-diabetic agent, has been shown to improve diabetic and pre-diabetic therapeutic effects and reduce side effects. And is expected to be useful as a pharmaceutical composition. In addition, as a result of confirming the fat accumulation inhibitory effect as well as the diabetic therapeutic effect, it can be expected to prevent or treat obesity together with the treatment of diabetes.

도 1은 3T3-L1 세포에서, 황금 추출물(HG; 수 추출물, HG30; 30% 에탄올 추출물, HG100; 100% 에탄올 추출물) 투여에 의한 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2는 3T3-L1 세포에서, 황금 추출물(HG; 수 추출물, HG30; 30% 에탄올 추출물, HG100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 3T3-L1 세포에서, 다양한 농도의 황금 추출물(20, 50, 100, 200 ㎍/㎖) 투여에 의한 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 HepG2 세포에서, 황금 추출물(HG; 수 추출물, HG30; 30% 에탄올 추출물, HG100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서, 황금 추출물(HG; 수 추출물, HG30; 30% 에탄올 추출물, HG100; 100% 에탄올 추출물) 투여에 따른 일산화 질소 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서, 황금 추출물(HG; 수 추출물, HG30; 30% 에탄올 추출물, HG100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 3T3-L1 세포에서, 황금 추출물 (HG; 수 추출물, HG30; 30% 에탄올 추출물, HG100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 지방세포 분화 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 미분화된 L6 rat myoblast 세포에서, 황금 추출물(HG)과 Metformin의 병용 투여에 의한 포도당 섭취능 증진 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 3T3-L1 세포에서, 황금 100% 에탄올 추출물(HG100)과 Metformin의 병용 투여에 의한 PPAR-γ 단백질 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 3T3-L1 세포에서, 다양한 농도의 황금 추출물(50, 100, 200㎍)과 Metformin의 병용 투여에 의한 PPAR-γ 단백질 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 3T3-L1 세포에서, 다양한 농도의 황금 추출물(50, 100, 200㎍)과 Metformin의 병용 투여에 의한 AMPK 단백질 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 12는 RAW 264.7 세포에서 Metformin (M), 황금 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGE), 또는 황금 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGW)에 의한 AMPK-α 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 13은 RAW 264.7 세포에서 Metformin (M), 황금 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGE), 또는 황금 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGW)에 의한 PPAR-α 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 14는 RAW 264.7 세포에서 Metformin (M), 황금 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGE), 또는 황금 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGW)에 의한 XBP-1 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 15는 RAW 264.7 세포에서 Metformin (M), 황금 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGE), 또는 황금 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGW)에 의한 TNF-α 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 16은 RAW 264.7 세포에서 Metformin (M), 황금 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGE), 또는 황금 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M-HGW)에 의한 IL-6 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 17은 4주령의 OLETF/LETO rat에서, (a) 황금 추출물 및 Metformin 병용 투여 (HG+Met)에 의한 인슐린 저항성 변화, 및 (b) 시간의 경과에 따른 혈당 변화를 확인한 결과이다.
도 18은 황금 추출물 및 Metformin 병용 투여후, 시간의 경과(120, 240, 360, 380, 600, 720 min)에 따른 (a) 1일째, 7일째, 또는 (b) 28일째 혈중 Metformin의 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 19는 황금 추출물 및 Metformin 병용 투여에 따른 Metformin의 uptake 변화를 확인한 결과이다. 1 shows the results of confirming cell viability by administration of a golden extract (HG; water extract, HG30; 30% ethanol extract, HG100; 100% ethanol extract) in 3T3-L1 cells.
2 is a result of confirming cell survival rate by administration of gold extract (HG; water extract, HG30; 30% ethanol extract, HG100; 100% ethanol extract) and Metformin in 3T3-L1 cells.
FIG. 3 shows the results of confirming cell survival rate by administration of various concentrations of gold extract (20, 50, 100, 200 μg / ml) in 3T3-L1 cells.
Figure 4 shows changes in the activity of reactive oxygen species (ROS) in the HepG2 cells by the combination of gold extract (HG; water extract, HG30; 30% ethanol extract, HG100; 100% ethanol extract) .
Figure 5 shows the results of confirming the inhibitory effect on the production of nitrogen monoxide by administration of a golden extract (HG; water extract, HG30; 30% ethanol extract, HG100; 100% ethanol extract) in RAW 264.7 cells.
6 shows the activity of reactive oxygen species (ROS) in RAW 264.7 cells by administration of gold extract (HG; water extract, HG30; 30% ethanol extract, HG100; 100% ethanol extract) This is the result of confirming the change.
FIG. 7 shows the results of confirming the inhibitory effect of 3T3-L1 cells on adipocyte differentiation by the combination of gold extract (HG; water extract, HG30; 30% ethanol extract, HG100; 100% ethanol extract) and Metformin.
FIG. 8 shows the results of confirming the glucose uptake by the combination of gold extract (HG) and Metformin in undifferentiated L6 rat myoblast cells.
FIG. 9 shows the results of confirming the change in the amount of PPAR-gamma protein expression in 3T3-L1 cells by the combined use of 100% ethanol extract of golden (HG100) and Metformin.
FIG. 10 shows the results of confirming the change in the expression level of PPAR-γ protein by the combined administration of Metformin and various concentrations of gold extract (50, 100, 200 μg) in 3T3-L1 cells.
FIG. 11 shows the results of examining the changes in the expression level of AMPK protein in 3T3-L1 cells by the combined administration of various concentrations of gold extract (50, 100, 200 μg) and Metformin.
12 shows changes in the expression level of AMPK-a gene in RAW 264.7 cells induced by Metformin (M), 30% ethanol extract of gold, M-HGE combined with gold extract and Metformin combination (M-HGW) The result is confirmed.
Figure 13 shows changes in the expression level of PPAR-alpha gene by metformin (M), golden 30% ethanol extract and Metformin combination (M-HGE) or gold water extract and Metformin combination (M-HGW) in RAW 264.7 cells The result is confirmed.
14 shows changes in the expression level of XBP-1 gene in RAW 264.7 cells by metformin (M), golden 30% ethanol extract, metformin combination (M-HGE) or golden water extract and metformin combination (M-HGW) The result is confirmed.
15 shows changes in the expression level of TNF-α gene in RAW 264.7 cells by metformin (M), golden 30% ethanol extract, metformin combination (M-HGE) or golden water extract and metformin combination (M-HGW) The result is confirmed.
16 shows changes in IL-6 gene expression levels by metformin (M), gold 30% ethanol extract, metformin combination (M-HGE), or golden water extract and Metformin combination (M-HGW) in RAW 264.7 cells The result is confirmed.
FIG. 17 shows the results of (a) changes in insulin resistance by administration of gold extract and Metformin (HG + Met), and (b) blood glucose changes over time in OLETF / LETO rats at 4 weeks of age.
18 shows the change in the concentration of Metformin in the blood after (a) 1st day, 7th day, or (b) 28th day according to the passage of time (120, 240, 360, 380, 600, 720 min) .
FIG. 19 shows the uptake changes of Metformin according to the combination of gold extract and Metformin.

본 발명에서, Metformin 및 황금(Scutellaria baicalensis) 추출물의 병용에 의한 항당뇨 및 지방축적 억제효과와 관련된 AMPK-α(AMP-activated protein kinase-alpha), PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha) 유전자 발현의 증가를 확인하였다. 또한, Metformin의 부작용과 관련된 XBP-1(X-box binding protein 1), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-6 유전자 발현의 감소를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.In the present invention, AMP-activated protein kinase-alpha (AMPK-alpha), Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR-alpha), and the like, which are associated with the anti-diabetic and fat accumulation inhibitory effects of Metformin and gold (Scutellaria baicalensis) The increase in gene expression was confirmed. In addition, the decrease of XBP-1 (X-box binding protein 1), TNF-alpha (tumor necrosis factor-alpha) and IL-6 gene expression associated with adverse effects of Metformin was confirmed.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 항 당뇨병제인 Metformin과 병용되는, 황금 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing antidiabetic effect comprising a gold extract, which is used in combination with Metformin, an anti-diabetic agent.

본 발명에서, 황금 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 황금 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 또한, 황금으로부터 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the gold extract can be extracted using conventional solvents known in the art for extracting the extract from natural products, that is, under ordinary temperature and pressure conditions. For example, in the present invention, the gold extract may be extracted using at least one solvent selected from the group consisting of water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixed solvent thereof, preferably ethanol. In addition, the method for extracting the extract from gold can be extracted by various methods such as hot water extraction, cold extraction, reflux extraction, ultrasonic extraction, etc., but is not limited thereto.

상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.The extract thus prepared may be filtered, concentrated or dried to remove the solvent, and may be subjected to both filtration, concentration and drying. For example, the filtration can be performed using a filter paper or a vacuum filter, the concentration can be carried out using a vacuum concentrator, and the lyophilization can be carried out, but the present invention is not limited thereto.

또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수도 있다. 상기 분획 시 온도는 4℃ 내지 120℃일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.Further, the extract extracted with the solvent may be further fractionated with a solvent selected from the group consisting of hexane, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, ethyl ether, chloroform, water, and mixtures thereof. The fractionation temperature may be 4 캜 to 120 캜, but is not limited thereto.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "treatment" refers to any action that improves or alters the symptoms of diabetes by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.

본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 "당뇨병(diabetes Mellitus)"은 만성 대사성 질환으로 오랜 시간이 경과함에 따라 혈관장애와 신경, 신장 및 망막 등의 기능이상을 초래하고 이로 인해 생명까지 잃게 하는 질환이다. 당뇨병은 크게 발생하는 기전에 따라 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 구분되며, 본 발명에서는 바람직하게는 인슐린 비의존형 당뇨병을 의미한다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병은 일반적으로 인슐린에 대하여 저항성을 나타내며 인슐린의 작용부전으로 인하여 과혈당 상태가 지속되는 것이 보통이다. 만성적 고혈당은 췌장 베타 세포에 손상을 일으켜 세포 사멸을 야기하므로 제2형 당뇨병의 치료를 위해서는 효과적인 혈당 조절을 필요로 한다."Diabetes Mellitus", a preventive and therapeutic disease to be treated and prevented by the composition of the present invention, is a chronic metabolic disease, and it causes a vascular disorder and dysfunction such as nerve, kidney and retina, . Diabetes mellitus is divided into insulin-dependent diabetes mellitus (type 1 diabetes) and non-insulin dependent diabetes mellitus (type 2 diabetes mellitus) according to a mechanism that occurs largely, and in the present invention, it means preferably non-insulin dependent diabetes mellitus. The non-insulin-dependent diabetes mellitus is generally resistant to insulin, and the hyperglycemic state is usually sustained due to insulin action. Chronic hyperglycemia causes damage to pancreatic beta cells, leading to apoptosis, so effective glycemic control is required for the treatment of type 2 diabetes.

본 발명의 조성물과 병용되는 항당뇨병제로서, gliclazide, glibenclamide, repaglinide, nateglinide, mitiglinide, rosiglitazone, pioglitazone, acarbose, voglibose 등일 수 있으며, 바람직하게는 Metformin일 수 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다.The antidiabetic agent used in combination with the composition of the present invention may be gliclazide, glibenclamide, repaglinide, nateglinide, mitiglinide, rosiglitazone, pioglitazone, acarbose, voglibose and the like, preferably Metformin, but is not limited thereto.

예컨대, 본 발명에서 사용되는 항당뇨병제인 "메트포민(Metformin)"은 바이구아나이드(biguanide)계열 약물로서, 2형 당뇨병 환자의 1차적인 치료약물로 이용되고 있으나, 식욕 감퇴, 복부 팽만감, 구역, 설사, 피부 발진등의 부작용이 있는 바, 이에 대한 각별한 주의가 요구되는 실정이다. For example, the anti-diabetic agent "Metformin" used in the present invention is a biguanide-based drug, which is used as a first-line treatment for patients with type 2 diabetes, but it has been reported that anorexia, abdominal bloating, Diarrhea, skin rash, etc., it is necessary to pay special attention to this.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 항당뇨병제 투여에 의한 항당뇨 효과의 증진 및 부작용 경감을 위하여, 항당뇨병제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 한다.Accordingly, the composition according to the present invention is characterized in that it is administered simultaneously, separately or sequentially with an anti-diabetic agent in order to enhance the anti-diabetic effect and reduce the side effects by the administration of the anti-diabetic agent .

또한, 본 발명에 따른 조성물은 항당뇨 효과 증진과 동시에 비만을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 한다.In addition, the composition according to the present invention is characterized by preventing or treating obesity while enhancing the antidiabetic effect.

본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 "비만(obesity)"은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우, 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가된다. 세포 수준에서의 비만은 지방세포의 증식 및 분화의 촉진으로 인한 지방세포의 수와 부피의 증가를 의미한다.The term "obesity" which is a preventive and therapeutic disease caused by the composition of the present invention means a state in which the fat cells multiply and differentiate in the body due to metabolic disorders and the fat is accumulated excessively, In the case of relative increase, the number and volume of adipocytes are increased, resulting in an increase in the mass of adipose tissue. Obesity at the cellular level means an increase in the number and volume of adipocytes due to promotion of proliferation and differentiation of adipocytes.

비만은 제2형 당뇨병의 주요한 병태생리학적 특징인 인슐린 저항성 증가와 밀접한 연관성을 가지고 있다. 인슐린 저항성은 다량의 인슐린 주사에 의해서도 혈당강하가 일어나지 않는 상태로써, 인슐린 민감도 감소를 의미한다. 이러한 인슐린 민감도 감소는 아디포카인들(adipokines)과 유리지방산(free fatty acid)의 불규칙적인 분비로 인하여 지방산이 베타세포나 신장, 간, 심장 등 인슐린 민감성 조직내에 쌓여 지방 독성(lipotoxicity)을 나타내기 때문에 발생하는 것으로 알려져 있다. Obesity is closely associated with increased insulin resistance, a major pathophysiological feature of type 2 diabetes. Insulin resistance means a decrease in insulin sensitivity with no blood glucose lowering even with a large amount of insulin injections. This decrease in insulin sensitivity is due to the irregular secretion of adipokines and free fatty acids, which causes fatty acids to accumulate in insulin-sensitive tissues such as the beta cells, kidney, liver, and heart, resulting in lipotoxicity It is known to occur because of.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 AMPK-α 및 PPAR-α로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다. In addition, the composition according to the present invention is characterized in that the expression of one or more genes selected from the group consisting of AMPK-alpha and PPAR-alpha is increased.

상기 AMPK-α 및 PPAR-α은 항당뇨 및 지방축적 억제효과와 관련성이 있는 유전자로서, AMPK(AMP-activated protein kinase)는 세포 내 에너지가 부족한 상황(ATP에 비해 AMP가 증가하는 상황)에서 활성화 되어 정상 에너지 균형을 회복시키기 위해 ATP를 소비하는 과정(지방산, 콜레스테롤 등의 합성을 억제하고 반대로 ATP를 생산하는 과정), 즉 지방산 산화, 해당과정을 활성화하며, PPAR-α는 중성지방의 분해에 관여하는 당지질 대사를 조절하고, lipoprotein lipase (LPL)을 통해 triglyceride(TG)의 level을 낮추는 역할을 한다. The AMPK-alpha and PPAR-alpha genes are associated with anti-diabetic and fat accumulation inhibitory effects. AMPK (activated protein kinase) is activated in a situation where the intracellular energy is insufficient (AMP increases compared to ATP) In order to restore normal energy balance, the process of consuming ATP (the process of inhibiting the synthesis of fatty acids and cholesterol, and the production of ATP inversely), namely, the oxidation of fatty acids, activates the corresponding process, and PPAR- It controls lipid metabolism and lowers the level of triglyceride (TG) through lipoprotein lipase (LPL).

또한, 본 발명에 따른 조성물은 XBP-1, TNF-α 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.In addition, the composition according to the present invention is characterized in that expression of one or more genes selected from the group consisting of XBP-1, TNF-a and IL-6 is reduced.

상기 XBP-1, TNF-α 및 IL-6 유전자는 Metformin의 부작용과 관련성이 있는 유전자로서, XBP-1 유전자는 소포체 스트레스에 관여하며, TNF-α 및 IL-6 유전자는 M2 대식세포와 관련된 염증성 사이토카인으로서, 염증 반응을 증가시키는 역할을 한다. The XBP-1 gene, the TNF-α and the IL-6 gene are related to the adverse effect of Metformin. The XBP-1 gene is involved in the stress of the endoplasmic reticulum. As a cytokine, it plays a role in increasing the inflammatory response.

본 발명의 일시예에서는 황금 추출물의 단독 투여, 또는 Metformin와의 병용 투여의 경우, 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였으며, 병용 투여에 의한 세포 내 활성산소종 감소, 자유 라디칼 제거, 일산화 질소 생성 억제, 및 지방 세포 분화 억제 효과를 실험적으로 확인하였다(실시예 1 내지 5 참조). 또한, 황금 추출물의 병용 투여를 통한 포도당 섭취 증진 효과를 확인하였으며, PPAR-γ, AMPK 단백질 발현 증가를 확인하였다(실시예 6 내지 7 참조), 또한, AMPK-α, PPAR-α 유전자 발현의 증가를 통해 항당뇨 효과의 증진 및 지방축적 억제효과를 확인하였고, XBP-1, TNF-α 및 IL-6 유전자 발현의 감소 통해 Metformin에 의하여 유발되는 부작용 감소를 확인하였으며, In vivo 동물실험을 통하여, 인슐린 저항성 감소, 및 황금 추출물과 Metformin의 병용 투여에 의해 Metformin의 약동학적 성질에는 변화가 없음을 구체적으로 확인하였다(실시예 8 내지 10 참조). In the example of the present invention, it has been confirmed that cytotoxicity is not exhibited when the gold extract is administered alone or in combination with Metformin. In addition, reduction of intracellular reactive oxygen species, free radical elimination, inhibition of nitrogen monoxide generation, (Example 1 to 5). In addition, the effect of increasing the glucose uptake by the combined use of the gold extract was confirmed, and the increase of PPAR-γ and AMPK protein expression was confirmed (see Examples 6 to 7), and the increase of AMPK-α, PPAR-α gene expression The results showed that the inhibition of lipid peroxidation and the inhibition of lipid accumulation by XBP-1, TNF-α and IL-6 gene expression were decreased by Metformin. In vivo animal experiments, The decrease in insulin resistance, and the concomitant administration of gold extract and Metformin, confirmed that there was no change in the pharmacokinetic properties of Metformin (see Examples 8-10).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may contain, in addition to the active ingredient, a pharmaceutically acceptable carrier. Herein, pharmaceutically acceptable carriers are those conventionally used at the time of formulation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose But are not limited to, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. Further, in addition to the above components, a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like may be further included.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) depending on the intended method, and the dose may vary depending on the condition and weight of the patient, The mode of administration, the route of administration, and the time, but may be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, The sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, sequentially or concurrently with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Specifically, the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, body weight, absorbency, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, type of disease, 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg, per 1 kg of body weight may be administered daily or every other day, or one to three divided doses per day. However, the dosage may be varied depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc. Therefore, the dosage is not limited to the scope of the present invention by any means.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a method for treating diabetes comprising administering the above pharmaceutical composition to a subject. The term " individual "as used herein refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically refers to a mammal such as a human or non-human primate, mouse, dog, cat, horse and cattle .

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예 1. 세포 독성 실험 Example 1. Cytotoxicity experiment

3T3-L1 세포를 96-well plate에 3×10³/well 세포로 100㎕씩 분주하여 CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 샘플을 각 well에 첨가하고 24시간 동안 배양한 후, EZ-Cytox 10㎕를 각 well에 첨가하였다. 2시간 동안 incubator에서 반응 시킨 후, 흡광도를 측정하기 전 1분 동안 plate를 shaking하고 96-well plate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출방법(물 (HG), 30% 에탄올(HG 30), 100% 에탄올 추출(HG 100)), Metformin과의 병용 투여 여부, 및 황금 추출물의 농도 변화(20, 50, 100, 200㎍/㎖)에 따른 세포 독성을 측정하였다.3T3-L1 cells were plated at 3 × 10 ³ / well in 96-well plates and cultured for 24 hours in a CO ₂ incubator. Samples of various concentrations were added to each well and cultured for 24 hours, and 10 E of EZ-Cytox was added to each well. After incubation for 2 h in an incubator, the plate was shaken for 1 min before absorbance measurement and absorbance was measured at 450 nm using a 96-well plate reader. Extraction method (water (HG), 30% ethanol (HG 30), 100% ethanol extraction (HG 100)), combination treatment with Metformin and change of concentration of gold extract (20, 50, 100, 200 ㎍ / ㎖ ) Were measured for cytotoxicity.

그 결과, 도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, 단독 또는 Metformin과의 병용 투여여부 및 추출방법의 차이와 관계없이 모든 군에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한, 황금 추출물 투여 농도의 증가에도 불구하고, 역시 세포 독성은 관찰되지 않았다. As a result, as shown in Fig. 1 to Fig. 3, no cytotoxicity was shown in all the groups regardless of whether they were used alone or in combination with Metformin and in the extraction method. In addition, despite the increase in the concentration of the gold extract administered, no cytotoxicity was observed.

실시예 2. 세포 내 활성산소종 활성 측정Example 2. Measurement of intracellular reactive oxygen species activity

HepG2 세포를 6-well plate에 3×10⁵/well 세포로 2mL씩 분주하여 8시간 동안 CO₂ incubator에서 배양한 후, Metformin 단독 투여 또는 황금 추출물과 Metformin을 병용 투여하였으며, 다시 6시간 동안 배양한 후, 세포를 회수하였다. 1200g 5분간 원심분리 후, 상층액을 버리고, 5ug/mL DHR123을 처리하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 다시 5분간 원심분리한 후, PBS로 2번 washing하고 여과시켰으며, FACS 형광 값으로 세포 내 활성산소종 활성을 측정하였다. HepG2 cells were plated in 2-mL portions of 3 × 10 ⁵ cells per well in a 6-well plate and cultured in a CO ₂ incubator for 8 hours. Metformin alone or combination of Metformin and goldform extract was added for 6 hours After that, the cells were recovered. 1200g After centrifugation for 5 minutes, the supernatant was discarded, treated with 5 ug / mL DHR123 and incubated at 37 캜 for 30 minutes. After 5 minutes of centrifugation, the cells were washed 2 times with PBS, filtered, and the activity of intracellular reactive oxygen species was measured by FACS fluorescence.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상군(Normal)과 비교하여, Metformin 투여군(Metformin)에서 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 활성이 감소하는 경향을 보였다. 또한, 황금 추출물 및 Metformin 병용 투여군은, 세포 내 활성산소종의 활성을 더욱 감소시켰으며, 황금 수 추출물(HG+Met)에서 가장 우수한 효과를 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 4, the activity of intracellular reactive oxygen species (ROS) tended to decrease in the Metformin administration group as compared with the normal group. In addition, the group treated with gold extract and Metformin showed a further decrease in activity of intracellular reactive oxygen species, and the best effect was observed in the golden water extract (HG + Met).

실시예 3. DPPH 자유 라디칼 소거활성 측정 Example 3. Measurement of DPPH free radical scavenging activity

샘플 40ul를 300uM의 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 760ul에 혼합하고 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96-well에 triplicate로 분주하였으며, microplate reader에서 515nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 BHT를 사용하였으며, 본 실시예에서는 3가지 추출방법(물, 30% 에탄올, 100% 에탄올 추출)에 따른 황금 추출물에서 DPPH 자유 라디칼(DPPH free radical) 제거능력을 측정하였고 IC₅₀를 계산하였다. 40ul of sample was mixed with 760ul of 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) in 300uM, reacted at 37 ℃ for 30 minutes, and then divided into triplicate in 96-well. Absorbance was measured at 515nm wavelength in a microplate reader Respectively. Was used as the BHT as a positive control, in the present embodiment, three kinds of extraction methods DPPH in golden extract according to (water, 30% ethanol, 100% ethanol extract), a free radical (DPPH free radical) was measured removal capacity calculating the IC ₅₀ Respectively.

그 결과, 대조군인 BHT의 경우, 113.85㎍/㎖으로 측정되었으며, 황금 물, 30% 에탄올, 또는 100% 에탄올 추출물을 투여한 경우, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, IC₅₀은 각각 123.44㎍/㎖, 244.36㎍/㎖, 249.47㎍/㎖으로 우수한 자유라디칼 제거능을 확인하였으며, 황금 수 추출물(Water extract)에서, 가장 우수한 효과를 확인하였다. As a result, in the case of BHT as the control group, it was measured to be 113.85 占 퐂 / ml. In the case of administration of the golden water, 30% ethanol or 100% ethanol extract, IC ₅₀ was 123.44 占 퐂 / ml , 244.36 ㎍ / ㎖ and 249.47 ㎍ / ㎖, respectively, and the best effect was confirmed in the water extract of golden water.

실시예 4. 일산화 질소 생성 억제능 측정Example 4. Measurement of inhibitory effect on nitrogen monoxide formation

항염증 기능을 비교하기 위해서 LPS로 유도된 일산화질소(NO) 형성 in vitro 모델을 이용하여 실험하였으며, NO 측정은 cell의 상층액에서 Griess reaction (Green et al., 1982)에 기초해 측정하였다. RAW 264.7 세포를 1.5×10⁵ cells/mL로 접종하고, 여러 농도로 희석한 시료로 전 처리한 후, 1시간 뒤에 lipopolysaccharide (LPS; Sigma, St Louis, MO, USA) 1㎍/mL을 처리하여 24시간 배양하였다. 96-well plate에 세포 배양 상층액 50μL와 Griess 시약 1%(w/v) sulfanilamide 50μL를 첨가한 다음 차광하여 10분 동안 실온에서 반응시킨 후, 2.5% (v/v) phosphoric acid에 녹인 0.1% (w/v) N-1-napthylethylenediamine을 50 μL 혼합하여 10분 동안 차광하여 반응시켰다. 흡광도는 30분 이내에 microplate reader (Molecular Device, CA, USA)를 이용하여 540㎚에서 측정하였다. NO의 생성량 산출은 nitric oxide standard solution을 이용하여 계산하였다. In order to compare the anti-inflammatory function, LPS-induced NO production was measured using an in vitro model. NO measurements were performed on the cell supernatants based on the Griess reaction (Green et al., 1982). RAW 264.7 cells were inoculated at 1.5 × 10 ⁵ cells / mL and treated with 1 μg / mL of lipopolysaccharide (LPS; Sigma, St Louis, MO, USA) And cultured for 24 hours. 50 μL of cell culture supernatant and 50 μL of 1% (w / v) sulfanilamide reagent were added to a 96-well plate and incubated for 10 min at room temperature. The cells were incubated with 0.1% (w / v) N-1-naphthylethylenediamine were mixed and shaded for 10 minutes. Absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader (Molecular Device, CA, USA) within 30 min. The amount of NO production was calculated using a nitric oxide standard solution.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 LPS 투여군(LPS)과 비교하여, Metformin 단독 투여군(Met 0.5, Met 1, Met 2)에서 일산화 질소의 생성량이 감소하는 경향성을 보였으며, 황금 추출물을 단독으로 투여한 경우에도 추출 방법과 관계없이 LPS 투여군(LPS)보다 일산화 질소 생성량이 감소하였다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, Metformin 단독 투여군과 비교하여, Metformin 및 황금 추출물 병용 투여군에서 일산화 질소 생성량이 더욱 감소됨을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 5, the amount of nitrogen monoxide was decreased in Metformin alone (Met 0.5, Met 1, Met 2) as compared with LPS administration group (LPS) The production of nitrogen monoxide was decreased in the LPS - treated group (LPS) regardless of the extraction method. In addition, as shown in FIG. 6, it was confirmed that the production of nitrogen monoxide was further reduced in the group treated with Metformin and gold extract, as compared with the group treated with Metformin alone.

실시예 5. 지방세포 분화 억제 효과 확인Example 5 Confirmation of Inhibitory Effect on Adipocyte Differentiation

3T3-L1 세포를 6-well plate에서 5×10⁵ cells/well의 농도로 seeding 한 후, 세포가 full confluence가 될 때까지 배양하였다. 1uM Dexamethasone, 0.5mM IBMX, 10ug/ml insulin이 포함된 DMEM(Differentiation media)으로 바꾸어 48시간 동안 배양한 후, 10ug/ml의 insulin이 포함된 DMEM(maturation media)을 처리하여 분화를 유도하였다. 상기와 같이 분화가 유도된 지방 세포에 다양한 농도의 샘플 또는 양성대조군을 처리하였으며, Oil red O staining 염색법, TG, 및 TC assay를 통해서 지방세포 분화 억제 효과를 분석하였다.3T3-L1 cells were seeded at a density of 5 × 10 ⁵ cells / well in a 6-well plate and cultured until the cells became full confluence. The cells were cultured for 48 hours in DMEM supplemented with 1 μM Dexamethasone, 0.5 mM IBMX, and 10 μg / ml insulin, followed by DMEM (maturation media) containing 10 μg / ml insulin. The differentiation-induced adipocytes were treated with various concentrations of the sample or positive control, and the inhibitory effect of adipocyte differentiation was analyzed through Oil red O staining staining, TG, and TC assay.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, Metformin 단독 투여군(Met)에서, 전지방세포인 3T3-L1의 분화에 의한 지질 형성이 억제되는 경향성을 보였다. 또한, Metformin 및 황금 추출물 병용 투여군에서 보다 우수한 억제효과를 나타냈으며, 황금 100% 에탄올 추출물(HG 100%+Met)에서 가장 우수한 효과를 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 7, the formation of 3T3-L1, a pre-adipocyte, was suppressed in the Metformin alone administration group (Met) as compared with the control group. In addition, the inhibitory effect was better than that of Metformin and Golden extract, and the best effect was observed in 100% ethanol extract (HG 100% + Met).

실시예 6. 포도당 섭취능 측정 (Glucose uptake assay)Example 6. Measurement of Glucose uptake assay (Glucose uptake assay)

미분화된 L6 rat myoblast 세포를 2% Horse serum등을 이용하여 myotube 세포로 분화 유도시키거나 HepG2 cell을 이용하여 96-well clear-bottom blackwell plate에서 incubation 한 이후, 12시간 동안 glucose free media로 배지를 바꾸어 glucose starvation 상태에서 incubation하였다. 이 후 다양한 샘플과 함께 형광시약인 2-NBDG를 100ug/ml의 농도로 포함한 glucose free media로 바꾸어 6~12시간 동안 incubation하였으며, DPBS를 이용하여 2회 washing 한 후, fluorescence microplate reader를 이용하여 Ex/Em = 485/535nm 파장에서 형광을 측정하였으며, 포도당 섭취를 억제시키는 Apigenin을 대조군으로 이용하였다. Undifferentiated L6 rat myoblast cells were induced to differentiate into myotube cells using 2% horse serum or incubated in a 96-well clear-bottom blackwell plate using HepG2 cells, and then the medium was changed to glucose free medium for 12 hours and incubated under glucose starvation conditions. After incubating for 6 ~ 12 hours, the cells were washed twice with DPBS, and then analyzed with a fluorescence microplate reader. Ex. Ex. 2-NBDG / Em = fluorescence was measured at 485/535 nm wavelength and Apigenin, which inhibits glucose uptake, was used as a control.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, Metformin 단독 투여군(Met)에서 포도당 섭취능력이 증가하였으며, Metformin 단독 투여군과 비교하여, 황금 추출물 및 Metformin 병용 투여군에서 포도당 섭취능력이 유의적으로 증진됨을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 8, glucose uptake capacity was increased in Metformin alone group (Met) compared to the control group, and glucose uptake ability in the group treated with gold extract and Metformin was significantly Respectively.

실시예 7. 관련 단백질의 발현량 변화 확인Example 7. Confirmation of Expression Amount of Related Protein

3T3-L1 전지방세포를 10% FBS, 1% PS(Penicillin Streptomycin)가 포함된 DMEM(WELGENE Inc, Korea)에 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 세포 배양용 6-well plate에 8x10⁴/well로 분주하였고, 세포의 분화를 유도하기 위하여 세포의 confluency가 50~60%가 될 때, 0.5mM IBMX, 1μΜ Dexamethasone, 10μg/ml insulin / 10% FBS가 포함된 DMEM 분화유도 배양액으로 바꾸어 3일간 배양하였다. 3일 후, 10μg/mL insulin/10% FBS가 포함된 DMEM으로 배양하며, 2일마다 배지를 교환하였으며, 분화 5일째 샘플을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 6-well plate의 세포를 PBS로 두 번 washing하고 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl pH7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM NaF, 1mM sodium, 1㎍/㎖ aprotinin, leupeptin, pepstatin)를 이용하여 용해하고, 12,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 단백질을 포함하는 상층액을 얻어내었다. BCA(Thermo Scientific, USA) 방법에 따라 정량 후 10%의 polyacrylamide gel상에서 전기영동을 하였다. 전기영동 후, gel상의 단백질을 PVDF membrane에 200mA로 1.5 시간 동안 전이시켜 5% skim milk 또는 5% BSA로 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 한 후, 일차 항체를 4℃에서 overnight 처리하고 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하였다. 이후 이차 항체를 상온에서 1시간 처리하여 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하고 ECL(NEURONEX, Korea) 용액을 처리하여 LAS-3000(FUJIFILM, Japan)으로 단백질 발현량을 관찰하였다. 3T3-L1 preadipocytes were treated with DMEM (WELGENE Inc, Korea) containing 10% FBS and 1% PS (Penicillin Streptomycin) and cultured in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C. The cells were seeded in a 6-well plate for cell culture at 8 × 10 ⁴ / well. To induce cell differentiation, cells were incubated with 0.5 mM IBMX, 1 μM Dexamethasone, 10 μg / ml insulin / DMEM differentiation induction medium containing 10% FBS was added and cultured for 3 days. After 3 days, the cells were cultured in DMEM supplemented with 10 μg / mL insulin / 10% FBS, and the medium was changed every 2 days. After 5 days of differentiation, the cells were cultured for 24 hours. Cells in 6-well plates were washed twice with PBS and resuspended in RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM sodium , 1 μg / ml aprotinin, leupeptin, pepstatin) and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes to obtain supernatant containing protein. After quantification according to BCA (Thermo Scientific, USA), 10% polyacrylamide gel electrophoresis was performed. After electrophoresis, gel proteins were transferred to a PVDF membrane at 200 mA for 1.5 h and blocked with 5% skim milk or 5% BSA for nonspecific protein. The primary antibody was then treated overnight at 4 ° C and washed with TBS-T And washed three times for 10 minutes. Subsequently, the secondary antibody was treated at room temperature for 1 hour, washed three times for 10 minutes with TBS-T, treated with ECL (NEURONEX, Korea) solution and observed for protein expression with LAS-3000 (FUJIFILM, Japan).

그 결과, 도 9 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, Metformin 단독 투여군(MET1, MET2)과 비교하여, Metformin 및 황금 추출물 병용 투여군에서 PPARγ 및 AMPK의 발현량은 유의적으로 증가하였다, 본 실시예에서, PPARγ은 발현량이 증가함에 따라 인슐린의 감수성을 증가시키는 역할을 하며, AMPK는 생체내의 에너지 대사 및 항상성 조절의 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 결과는 Metformin 및 황금 추출물 병용 투여를 통해 보다 항당뇨 효과를 보다 증진시킬 수 있음을 의미한다. As a result, as shown in Fig. 9 to Fig. 11, the expression levels of PPARγ and AMPK were significantly increased in the group treated with Metformin and gold extract, as compared with the group treated with Metformin alone (MET1, MET2) PPARγ increases insulin sensitivity as the expression level increases, and AMPK plays a central role in the regulation of energy metabolism and homeostasis in vivo. Thus, the above results indicate that the combined use of Metformin and gold extracts can further enhance the anti-diabetic effect.

실시예 8. 관련 유전자의 발현량 변화 확인Example 8. Confirmation of Expression Amount of Related Gene

8-1. 세포 및 황금 추출물의 준비8-1. Preparation of cells and golden extracts

Macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분주 받아 사용하였고, 세포배양은 DMEM에 10% FBS와 2 mML-glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 lg/ml streptomycin이 함유된 배지를 사용하였다. CO₂ incubator 37℃, 5% CO₂ -95% O₂조건하에서 배양하였다. 실험에 사용된 황금 추출물(water 100%, ethanol 30%)은 동국대학교 약학대학에서 제공받아 사용하였다. 각각의 세포를 정상군(N), Metformin 투여군(M), Metformin + 황금 추출물(ethanol 30%) 투여군(M+HGE), 황금 추출물(수 추출물) 투여군 (M+HGW)으로 총 4군에 대하여 실험을 진행하였다. RAW 264.7 cell line, a macrophage cell line, was used in a Korean cell line bank (KCLB, Seoul, Korea). Cell culture was performed in DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM glutamine, 100 U / ml penicillin, and 100 lg / ml streptomycin Was used. CO ₂ incubator. The cells were cultured under the conditions of 37 ° C and 5% CO ₂ -95% O ₂ . The gold extracts (water 100%, ethanol 30%) used in the experiment were supplied from the College of Pharmacy of Dongguk University. Each group was divided into four groups as normal (N), Metformin (M), Metformin + golden extract (30%), M + HGE and gold extract (M + HGW) The experiment was carried out.

RAW 264.7 세포는 DMEM에 10% FBS와 2 mML-glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 lg/ml streptomycin이 함유된 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂, 90% humidity의 조건하에서 배양되었다. 배양된 세포는 2~3일에 한 번씩 배양액을 바꾸어 주면서 배양하여 세포분화가 최대에 도달하였을 때 phosphate buffered saline(PBS)으로 세포를 세척한 후, trypsin-EDTA 용액으로 부착된 세포를 분리한 뒤 원심 분리하여 세포를 모은 다음, 세포와 배지를 잘 혼합하여 계대 배양하여 사용하였다.RAW 264.7 cells were cultured in DMEM with culture medium containing 10% FBS, 2 mML-glutamine, 100 U / ml penicillin, and 100 lg / ml streptomycin at 37 ° C, 5% CO ₂ , and 90% humidity . The cultured cells were cultured with the culture medium changed every 2-3 days. When the cell differentiation reached its maximum, the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), and the cells adhered with trypsin-EDTA solution were separated Cells were collected by centrifugation, and cells and medium were mixed well and subcultured.

8-2. 항당뇨 효과 관련 유전자 발현 8-2. Antidiabetic effect related gene expression

Metformin과 황금 추출물의 병용이 항당뇨 효과와 관련 유전자의 발현에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 단독으로 Metformin을 처리(M)한 RAW 264.7 세포와 Metformin + 황금(ethanol 30% 또는 water 100%)을 처리한 RAW 264.7 세포간의 AMPK-α, PPAR-α 유전자 발현을 Real-time PCR을 통하여 비교하였다.Metformin + gold (ethanol 30% or water 100%) was treated with Metformin alone (M) and RAW 264.7 cells alone to determine the effect of the combination of Metformin and gold extracts on the antidiabetic effect and the expression of the related genes AMPK-α and PPAR-α gene expression in RAW 264.7 cells were compared by real-time PCR.

total RNA는 Trisure(Bioline, USA)를 사용하여 protocol에 따라 분리 정제하였다. 1㎍의 total RNA를 cDNA synthesis kit(Sprint TMRT Complete Oligo-(dT)18, Clontech, MountainView, CA, USA)를 이용하여 protocol에 따라 역전사 반응을 수행하여 first strand cDNA를 얻었다. RT-PCR 샘플은 Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green(Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA)을 이용하여 최종 반응 용량을 20μL로 하여 Light Cycler instrument(Roche Applied Science)에서 진행하였다. Total RNA was isolated and purified according to the protocol using Trisure (Bioline, USA). 1 μg of total RNA was reverse transcribed according to the protocol using cDNA synthesis kit (Sprint TMRT Complete Oligo- (dT) 18, Clontech, MountainView, CA, USA) to obtain first strand cDNA. RT-PCR was performed on a Light Cycler instrument (Roche Applied Science) with a final reaction volume of 20 μL using Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA).

상기 실시예에서 사용된 Primer의 DNA sequence는 다음과 같다. The DNA sequence of the primer used in the above example is as follows.

PCR amplification은 C/EBPα에서 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 45 cycle의 amplification(95℃에서 10초간 denaturation, 52℃에서 10초간 annealing, 72℃에서 15초간 extension) 하였고 beta-actin에서는 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 35 cycle의 total RNA는 Trisure(Bioline, USA)를 사용하여 protocol에 따라 분리 정제하였다. 1㎍의 total RNA를 cDNA synthesis kit (Sprint TMRTCompleteOligo-(dT)18, Clontech, MountainView, CA, USA)를 이용하여 protocol에 따라 역전사 반응을 수행하여 first strand cDNA를 얻었다. RT-PCR 샘플은 Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green(Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA)을 이용하여 최종 반응 용량을 20μL로 하여 Light Cycler instrument(Roche Applied Science)에서 진행하였다. PCR amplification was carried out at 95 ° C for 10 min in C / EBPα for 10 min, followed by 45 cycles of amplification (denaturation at 95 ° C for 10 sec, annealing at 52 ° C for 10 sec, extension at 72 ° C for 15 sec) After 10 minutes of prior incubation, 35 cycles of total RNA were isolated and purified according to the protocol using Trisure (Bioline, USA). 1 μg of total RNA was reverse-transcribed according to the protocol using cDNA synthesis kit (Sprint TMRTCompleteOligo- (dT) 18, Clontech, MountainView, CA, USA) to obtain first strand cDNA. RT-PCR was performed on a Light Cycler instrument (Roche Applied Science) with a final reaction volume of 20 μL using Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA).

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, AMPK-α 유전자 발현은 정상군 (N)은 0.80, Metformin 처리군 (M)은 0.76으로 측정되었다. Metformin 및 황금 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+HGW)은 4.50으로 측정되었으며, AMPK-α 유전자의 발현의 증가를 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 12, the AMPK-a gene expression was measured to be 0.80 in the normal group (N) and 0.76 in the Metformin treated group (M). Metformin and gold extract (water 100%) group (M + HGW) was measured to be 4.50 and the increase of expression of AMPK-α gene was confirmed.

또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, PPAR-α 유전자 발현은 정상군 (N)은 1.01, Metformin 처리군 (M)은 0.68로 측정되었다. Metformin 및 황금 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+HGW)은 3.38로 측정되었으며, PPAR-α 유전자의 발현의 증가를 확인하였다.In addition, as shown in Fig. 13, PPAR-a gene expression was measured to be 1.01 in the normal group (N) and 0.68 in the Metformin treated group (M). Metformin and gold extract (water 100%) group (M + HGW) was measured to be 3.38 and the increase of expression of PPAR-α gene was confirmed.

8-3. Metformin의 부작용 관련 유전자 발현8-3. Metformin Side Effects Related Gene Expression

Metformin과 황금 추출물의 병용이 Metformin에 의해 유발되는 부작용과 관련 유전자의 발현에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 단독으로 Metformin을 처리(M)한 RAW 264.7 세포와 Metformin + 황금 (ethanol 30% 또는 water 100%)을 처리한 RAW 264.7 세포간의 XBP-1, TNF-α, IL-6 유전자 발현을 Real-time PCR을 통하여 비교하였다.Metformin + gold (ethanol 30% or water 100%), Metformin (M), and Metformin + gold were used to determine the effects of Metformin and gold extracts on Metformin- The expression of XBP-1, TNF-α, and IL-6 genes in RAW 264.7 cells was compared by Real-time PCR.

XBP-1, TNF-α, IL-6 유전자 발현을 확인하기 위하여, Primer를 제외하고, 상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법으로, Real-time PCR을 실시하였다.Real-time PCR was performed in the same manner as described in Example 3 except for the primer in order to confirm the expression of XBP-1, TNF-α and IL-6 gene.

상기 실시예에서 사용된 Primer의 DNA sequence는 다음과 같다.The DNA sequence of the primer used in the above example is as follows.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, XBP-1 유전자 발현은 정상군 (N)은 1.00, Metformin 처리군 (M)은 1.01로 측정되었다. Metformin 및 황금 추출물(ethanol 30%) 병용 투여군(M+HGE)은 0.38, Metformin 및 황금 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+HGW)은 0.05로 측정되었으며, XBP-1 유전자 발현의 감소를 확인하였다.As a result, XBP-1 gene expression was measured to be 1.00 in the normal group (N) and 1.01 in the Metformin treatment group (M), as shown in Fig. (M + HGE) and Metformin and gold extract (ethanol + 30%) were 0.38 and 0.05, respectively, and the reduction of XBP-1 gene expression was confirmed Respectively.

또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, TNF-α 유전자 발현은 정상군 (N)은 1.01, Metformin 처리군 (M)은 1.34로 측정되었으며, Metformin 및 황금 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+HGW)에서, TNF-α 유전자 발현의 감소를 확인하였다.As shown in FIG. 15, the expression of TNF-α gene was measured to be 1.01 in the normal group (N) and 1.34 in the metformin treated group (M) ), A decrease in TNF-a gene expression was confirmed.

아울러, 도 16에 나타낸 바와 같이, IL-6 유전자 발현은 정상군 (N)은 1.11, Metformin 처리군 (M)은 1.91로 측정되었다., Metformin 및 황금 추출물(ethanol 30%) 병용 투여군(M+HGE)은 0.12, Metformin 및 황금 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+HGW)은 0.74로 측정되었으며, IL-6 유전자 발현의 감소를 확인하였다.As shown in FIG. 16, the expression of IL-6 gene was measured to be 1.11 in the normal group (N) and 1.91 in the metformin treated group (M). Metformin and gold extract (30% HGE) was 0.12, and M + HGW was 0.74 in the combination of Metformin and Gold extract (water 100%), and the decrease of IL-6 gene expression was confirmed.

실시예 9. Intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT)Example 9. Intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT)

당뇨병에 대한 메트포민과 황금 추출물 병용 투여 효과를 확인하기 위해 4주령의 OLETF rat, LETO rat (Otsuka Pharmaceutical, Japan)을 분양받아 8주간의 적응기간 거쳐 100mg/kg의 Metformin 단독 투여 또는 200mg/kg의 황금 추출물과 100mg/kg의 Metformin을 병용 투여하였다. 매주 식이 섭취량과 무게, 상태 등을 체크하였고, 24주째에 꼬리정맥에서 채혈하여 IPITT를 수행하였다. 12주 후 동물을 zoletil/rumpun IP 투여로 마취하여 희생하였고, 지방과 각 장기 샘플과 혈청 샘플을 분리하였다. 실험 종료 1주전 OLETF/LETO를 15시간 동안 금식시키고, 1U/kg 농도의 인슐린을 IP로 주사한 후, 각 개체의 꼬리정맥에서 0min, 30min, 60min, 90min, 120min의 시간대에 소량의 출혈을 시켜 혈액에서 Accucheck 혈당 검사기 (Roche, USA)를 이용하여 혈당을 측정하였다. 결과는 AUC(area under curve)등을 이용하여 분석하였다.In order to confirm the effect of combination of metformin and gold extract on diabetes, 4-week-old OLETF rats, LETO rats (Otsuka Pharmaceutical, Japan) were distributed and received 100 mg / kg of Metformin alone or 200 mg / The extract was combined with 100 mg / kg of Metformin. Weekly dietary intake, weight, and status were checked. At week 24, IPITT was performed by collecting blood from the tail vein. After 12 weeks, the animals were sacrificed by anesthetizing with zoletil / rumpun IP, and fat and each organ sample and serum sample were separated. One week prior to the end of the experiment, OLETF / LETO was fasted for 15 hours and insulin IP was injected at a concentration of 1 U / kg. A small amount of bleeding was performed in the tail vein of each individual at 0 min, 30 min, 60 min, 90 min and 120 min Blood glucose was measured using an Accucheck blood glucose meter (Roche, USA) in the blood. The results were analyzed using AUC (area under curve).

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, LETO군보다 OLEFT군에서 인슐린 저항성이 높게 관찰되었으며, 상기 저항성은 Metformin 단독 처리를 통해 감소하는 경향을 보였다. 또한, Metformin 단독 투여군과 비교하여, Metformin 및 황금 추출물 병용 투여군에서 인슐린 저항성이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 17, insulin resistance was observed to be higher in the OLEFT group than in the LETO group, and the resistance tended to decrease through Metformin alone treatment. In addition, insulin resistance was significantly reduced in the Metformin and gold extract combination groups compared to the Metformin alone group.

실시예 10. 병용 투여에 의한 Metformin의 약동학적 변화 측정Example 10. Measurement of pharmacokinetic change of Metformin by concomitant administration

10-1. 병용 기간에 따른 Metformin의 약동학적 변화 10-1. Pharmacokinetic Changes of Metformin over Combined Periods

Rat를 마취 후, 동맥에 cannula를 삽입하고 마취에서 깬 후 경구를 통해 Metformin 100 mg/mg 단독 투여군 또는 Metformin 100 mg/kg와 황금 추출물 200 mg/kg을 병용 투여군으로 나누어 약물을 투여하였으며, 상기 약물은 실험조건에 따라 1회, 7일간, 또는 4주간 투여하였다. 투여 후 일정한 시간 간격으로 채혈을 하고 24시간 동안 소변을 수집하였으며, 24시간이 경과한 시점에 위장관에 남아있는 메트포르민 양을 측정하기 위해 개복하여 위장관 샘플을 채취하였다. 또한, LC/MSMS를 이용 정량하여 혈중 농도 프로파일, 뇨, 위장관에 남아있는 Metformin의 양을 계산하였다. After anesthesia with rats, the cannula was inserted into the artery and the anesthesia was broken, and the drug was administered by oral administration of Metformin 100 mg / mg alone or in combination with Metformin 100 mg / kg and gold extract 200 mg / kg. Were administered once, 7 days, or 4 weeks according to the experimental conditions. After administration Blood samples were taken at regular time intervals and urine was collected for 24 hours. Gastrointestinal samples were taken at 24 hours after lapse of time to measure the amount of metformin remaining in the gastrointestinal tract. In addition, the amount of Metformin remaining in the blood concentration profile, urine, and gastrointestinal tract was calculated by quantification using LC / MSMS.

그 결과, 하기 표 4 및 도 18에 나타낸 바와 같이, Metformin 단독 처리군과 비교하여 Metformin 및 황금 추출물 병용 투여군 (단회, 7일, 또는 4주)에서, C_max가 다소 감소하는 경향을 보였으나, AUC에서는 유의적인 변화가 없었는바, Metformin의 축적 효과와 같은 유의적인 약동학적 파라미터의 변화는 관찰되지 않았다. As a result, as shown in the following Tables 4 and 18, the C _max tended to decrease slightly in the Metformin and gold extract combination groups (single, 7 days, or 4 weeks) as compared with the Metformin alone treatment group, There was no significant change in AUC, and no significant changes in pharmacokinetic parameters such as the accumulation effect of Metformin were observed.

10-2. OCT 1 및 OCT 2 저해에 의한 Metformin의 uptake 변화10-2. Metformin uptake changes by inhibition of OCT 1 and OCT 2

OCT transporter cells product에서 Metformin과 황금 추출물의 병존에 따른 Metformin의 uptake 변화를 관찰하였다. OTC1와 OTC2의 저해제로 30 uM 과 300 uM verapamil을 사용하였으며, OCT1,2의 기질로는 10 uM Metformin을 사용하였다. Metformin uptake changes were observed in the OCT transporter cell products due to the coexistence of Metformin and gold extracts. 30 uM and 300 uM verapamil were used as inhibitors of OTC1 and OTC2, and 10 uM Metformin was used as the substrate of OCT1,2.

그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, OCT1 및 OCT2의 저해제인 30 uM verapamil 또는 300 uM verapmil 처리군에서는 유의적으로 Metformin의 uptake가 감소된 반면, Metformin 및 황금 추출물을 병용 투여군에서는 Metformin의 uptake를 감소시키지 않음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 19, the uptake of Metformin was significantly decreased in the 30 uM verapamil or 300 uM verapmil treated group, which is an inhibitor of OCT1 and OCT2, while the uptake of Metformin was decreased in the combination administration of Metformin and gold extract Respectively.

상기 결과들을 종합해 볼 때, 황금 추출물과 항당뇨병제인 Metformin을 병용하여 투여하여도 Metformin 약물 자체의 흡수 및 작용에는 아무런 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. Taken together, these results indicate that the combined use of the gold extract and Metformin, an anti-diabetic agent, has no effect on the absorption and action of the Metformin drug itself.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> Dongguk University Gyeongju Campus Industry-Academy Cooperation Foundation <120> A Pharmaceutical composition comprising extract of Scutellaria baicalensis for enhancing the therapy of diabetes Mellitus and obesity <130> MP15-043 <150> KR 10-2014-0092196 <151> 2014-07-21 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer_forward <400> 1 gcaagtgctt ctaggcggac 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer_reverse <400> 2 aagaaagggt gtaaaacgca gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha1 primer_forward <400> 3 aagccgaccc aatgacatca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha1 primer_reverse <400> 4 cttccttcgt acacgcaaat 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-alpha primer_forward <400> 5 gcctgtctgt cgggatgt 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-alpha primer_reverse <400> 6 ggcttcgtgg attctcttg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer_forward <400> 7 tggccgggtc tgctgagtcc g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer_reverse <400> 8 gtccatggga agatgttctg g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer_forward <400> 9 gaactggcag aagaggcact 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer_reverse <400> 10 agggtctggg ccatagaact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer_forward <400> 11 agttgccttc ttgggactga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer_reverse <400> 12 cagaattgcc attgcacaac 20 <110> Dongguk University Gyeongju Campus Industry-Academy Cooperation Foundation <120> A Pharmaceutical composition comprising extract of Scutellaria baicalensis for enhancing the therapy of diabetes Mellitus and obesity <130> MP15-043 <150> KR 10-2014-0092196 <151> 2014-07-21 <160> 12 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer_forward <400> 1 gcaagtgctt ctaggcggac 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer_reverse <400> 2 aagaaagggt gtaaaacgca gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha1 primer_forward <400> 3 aagccgaccc aatgacatca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha1 primer_reverse <400> 4 cttccttcgt acacgcaaat 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-alpha primer_forward <400> 5 gcctgtctgt cgggatgt 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-alpha primer_reverse <400> 6 ggcttcgtgg attctcttg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer_forward <400> 7 tggccgggtc tgctgagtcc g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer_reverse <400> 8 gtccatggga agatgttctg g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer_forward <400> 9 gaactggcag aagaggcact 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer_reverse <400> 10 agggtctggg ccatagaact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer_forward <400> 11 agttgccttc ttgggactga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> IL-6 primer_reverse <400> 12 cagaattgcc attgcacaac 20

Claims

A pharmaceutical composition for enhancing an anti-diabetic effect in combination with an anti-diabetic agent,
Wherein the composition comprises a scutellaria baicalensis water extract and the antidiabetic agent is metformin.

The method according to claim 1,
Wherein said composition is administered simultaneously, separately or sequentially with said anti-diabetic agent.

The method according to claim 1,
Wherein said composition inhibits the differentiation of adipocytes.

delete

The method according to claim 1,
Wherein the composition increases expression of any one or more of the group consisting of AMP-activated protein kinase-alpha (AMPK-alpha) and peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR-alpha).

The method according to claim 1,
Wherein the composition reduces expression of any one or more of the genes selected from the group consisting of X-box binding protein 1 (XBP-1), tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and IL-6.