KR101695962B1 - 리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물 - Google Patents

리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101695962B1
KR101695962B1 KR1020140144795A KR20140144795A KR101695962B1 KR 101695962 B1 KR101695962 B1 KR 101695962B1 KR 1020140144795 A KR1020140144795 A KR 1020140144795A KR 20140144795 A KR20140144795 A KR 20140144795A KR 101695962 B1 KR101695962 B1 KR 101695962B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chloroform
volume
concentration
fraction
methanol
Prior art date
Application number
KR1020140144795A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160048375A (ko
Inventor
박윤석
김길용
이용성
김선배
Original Assignee
주식회사 푸르네
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 푸르네 filed Critical 주식회사 푸르네
Priority to KR1020140144795A priority Critical patent/KR101695962B1/ko
Publication of KR20160048375A publication Critical patent/KR20160048375A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101695962B1 publication Critical patent/KR101695962B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 항균 활성 및 선충 방제 활성을 모두 가지는 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 선충 방제 활성뿐만 아니라, 항균 활성도 동시에 나타내어 농작물에 살포하는 경우 유해 식물 병원균과 선충의 생육을 동시에 억제하여 선충 및 유해 미생물에 의한 농작물의 피해를 최소화 할 수 있고, 화학농약의 과도한 사용에 따른 환경파괴 및 생태계 변화 등의 부작용을 최소화 할 수 있다.

Description

리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물{Composition for controlling of Nematode and bacterial}
본 발명은 항균 활성 및 선충 방제 활성을 모두 가지는 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
토양선충은 선형동물에 속하는 동물 중 토양에서 자유생활을 하면서 식물에 기생하는 선충으로써, 선충강에 속하는 0.2 ~ 0.5mm 크기의 매우 작은 생물로 육안으로 확인하기가 어려우며, 현미경으로 관찰이 가능하다. 대부분의 선충 형태는 실 모양으로 가늘거나 방주형으로 좌우대칭형이며, 몸에는 마디가 없고 체표에 주름을 가지고있다. 식물에 기생하는 토양선충으로 수백 종이 알려져 있으며 농작물에 기생할 경우, 토마토, 당근, 고구마, 담배, 사과나무 등의 뿌리를 혹투성이로 만들고 무, 우엉, 감자, 국화, 복숭아나무 등의 뿌리를 썩게 한다.
토양선충 중 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)은 작물의 뿌리 생장점 부근으로 침입하여 식물의 뿌리내에서 양분을 흡즙하면서 성장하는데 이 과정에서 선충이 분비하는 호르몬의 작용으로 작물의 뿌리가 혹 모양으로 변하게 된다. 이러한 기생으로 인해 다른 병원성 미생물에 감염되거나 뿌리 생육을 방해하여 작물의 정상적인 생육을 방해하여 결국엔 작물이 고사하게 된다. 뿌리썩이선충(Pratylenchus sp.)은 이동성내부기생성선충으로 유충 및 선충이 뿌리조직내외를 자유롭게 이동하면서 가해하고 뿌리조직내에서 산란한다. 따라서, 이 선충에 의해 지상부가 위축, 왜화되며 황화현상이 나타나고 뿌리가 짧아지며 잔뿌리의 발육이 억제되고 신초생성이 중지되어 결국에는 고사, 부패하게 된다.
우리나라에서는 선충 피해를 막고자 작물을 심기 전 농가에서 무분별한 합성농약을 사용하고 있다. 하지만 농약의 효과가 거의 없을 뿐 아니라 이마저도 농작기 중에는 선충을 방제하기 위해 사용할 수 없는 실정이다.
현재 토양선충이 곡류, 콩과작물 등의 식용작물에 일으키는 손실은 전세계적으로 매년 약 11 %로 추정되고, 이외에 주요 채소, 과일 등의 주요 경제작물에 일으키는 손실은 매년 약 14 %에 이르러 세계적으로 매년 800 억 달러 이상의 손실을 가져오는 것으로 확인된 바 있다.
식물에 기생하는 토양선충을 방제하기 위한 방법으로 현재 토양개량, 침수, 태양열소독 등의 물리적 방제, 윤작이나 저항성품종 등 작부체계에 따른 경종적방제 및 천적인 곰팡이나 세균을 이용한 생물학적 방제, 그리고 살선충제를 이용하는 화학적 방제 등이 있다.
할로겐화 탄화수소(halogenated hydrocarbons)(예를 들면, 에틸린 디브로마이드(ethylene dibromide), 메틸 브로마이드(methyl bromide))는 세계에서 가장 많이 사용된 살선충제였다. 그들의 높은 인체 유독성 및 성층권(stratospheric) 오존층에 해로운 영향으로 인해 이러한 화합물은 몬트리올 의정서(Montreal Protocol)에서 사용이 금지되었지만 선충 및 식물 병원체 조절에서 메틸 브로마이드의 사용은 대체물 생산의 부족으로 인해 미국 내에서 확장되었다. 카바메이트(carbamates)는 가장 효과적인 비-훈증(non-fumigant) 살선충제이다. 그러나 알디카브(aldicarb) 및 옥사밀(oxamyl)과 같은 대부분의 카마베이트 또한 독성이 높다. 2010년 8월부터, 알디카브의 생산 회사인, Bayer는, 미국 내에서 감자 및 감귤류 과일(citrus)에 모든 생산 등록을 취소하는 것에 대해 합의하였으며, 알디카브는 2018년 8월을 끝으로 완전히 폐지될 것이다.
현재는 이러한 화학적방제와 물리적방제를 선호하고 있으나, 물리적방제는 매 3 년마다 방제를 해야하는 번거로움과 고비용이 소요되는 단점이 있으며, 화학적방제는 에토프 입제(etoprophos), 카두사포스 입제(cadusafos), 카보입제(carbofuran), 포스치아제트 입제(fosthiazate), 메탐소디움 액제(metam-sodium)와 같은 화학 살선충제를 경작기간 동안 여러 차례 처리해야 하므로 토양 및 수질을 오염시킬 수 있는 단점이 있다.
따라서, 이를 개선하기 위한 방안으로 미생물이나 천연물을 이용한 뿌리혹선충의 방제방법이 연구되고 있으며, 미생물로는 파스테리아속의 세균, 바실러스속의 세균, 페실로마이세스속의 곰팡이 등과 천연물로는 만수국, 천수국, 다닥냉이, 감, 아선약 등이 알려져 있다.
한국등록특허공보 제10-0518362호(선충 방제용 조성물)에는, 율피, 감, 호프, 솔잎, 아선약, 암마륵, 커피, 가자, 소목, 지유, 호장, 대황, 조 등을 유효성분으로 하여 이들 추출물의 1 종 또는 2 종 이상의 혼합물에 관한 것이 공개되어 있다. 그런데, 위와 같은 기술들은 첨가되는 구성요소가 너무 많아 준비가 어렵고 제조하기 힘들며, 처리농도가 높아 실제 농가적용시 경제적 어려움이 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-0518362호(2005.09.23. 등록) 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0037158호(2009.04.15. 공개) 미합중국 등록특허공보 제5,208,159호(1993.05.04. 등록)
본 발명의 발명자들은 새로운 항선충 활성 물질에 관하여 연구하던 중 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215의 배양물을 본 발명의 방법에 따라 분리 정제하여 사용하는 경우 우수한 항선충 효과와 더불어 항균효과가 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 배양액에 에틸아세테이트를 첨가하여, 에틸아세테이트 층을 분획한 후 이를 건조하여 조추출물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득한 조추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 99% 부터 1%까지 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 90 내지 60%인 분획을 수득하는 단계를 포함하는 항균 및 선충 방제 활성을 가지는 리소박터 캡시시 YS1215 배양 분획물 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 항균 및 선충 방제 활성을 가지는 리소박터 캡시시 YS1215 배양 분획을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 및 선충 방제용 조성물을 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물을 제공한다.
상술한 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 배양액에 에틸아세테이트를 첨가하여, 에틸아세테이트 층을 분획한 후 이를 건조하여 조추출물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득한 조추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 99% 부터 1%까지 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 90 내지 60%인 분획을 수득하는 단계를 포함하는 항균 및 선충 방제 활성을 가지는 리소박터 캡시시 YS1215 배양 분획물 제조방법을 제공한다.
상술한 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 항균 및 선충 방제 활성을 가지는 리소박터 캡시시 YS1215 배양 분획을 제공한다.
상술한 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 및 선충 방제용 조성물을 제공한다.
상기와 같이, 본 발명은 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 선충 방제 활성이 우수할 뿐 만 아니라, 항균활성을 함께 나타내어 선충 방제 및 식물 병원균의 감염을 동시에 억제할 수 있어 친환경 농약 제조에 효과적이다.
도 1은 본 발명 조성물의 활성물질 정제과정 모식도이다.
도 2는 본 발명 조성물의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 실험 후 분획의 항균 활성을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명 조성물의 실리카 컬럼 크로마토그래피 실험 후 분획의 항균활성을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명 조성물 처리에 따른 뿌리혹선충 알 부화 억제율을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명 조성물 처리에 따른 뿌리혹선충 유충 치사율을 측정한 결과 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시 예들의 상세한 설명이 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다. 하기 설명에서 구체적인 특정 사항들이 나타나고 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해 제공된 것일뿐, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물을 제공한다.
리소박터 캡시시 YS1215(Lysobacter capsici YS1215)는 Lysobacter sp.의 일종으로 개껍질로부터 분리되었다. 리소박터(Lysobacter sp.)는 대표적인 길항미생물로서 활성을 가진 그람 음성(Gram 陰性) 박테리아이며, 다양한 용균효소(Lytic Enzymes)와 항생물질을 분비하여 식물 병원성 곰팡이 및 식물 해충을 억제하고, 식물생장 호르몬을 생성하여 작물의 생장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
상기 본 발명의 조성물로 억제할 수 있는 선충은 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 멜로이도진 종(Meloidogyne sp.), 티렌코린쿠스 종(Tylenchorhynchus sp.), 호플로라이무스 종(Hoplolaimus sp.), 헬리코틸렌쿠스 종(Helicotylenchus sp.), 프란티렌쿠스 종(Pratylenchus sp.), 헤테로데라 종(Heterodera sp.), 글로보데라 종(Globodera, sp.), 트리코도루스 종(Trichodorussp.), 파라트리코도루스 종(Paratrichodorus sp.), 시피네마 종(Xiphinema sp.), 및 크리코네마 종(Criconema sp.)의 선충일 수 있으며, 상기 선충은 구체적으로 멜로이도진 인코그니타(Meloidogyne incognita) (뿌리혹 선충), 글로보데라 로스키엔시스(Globodera rostochiensis) 및 글로보데라 파일리다(globodera pailida)(감자 낭포종 선충); 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)(콩 낭포종 선충); 헤테로데라 스카이츠티(Heterodera schachtii)(근대 낭포종 선충); 및 헤테로데라 아베나에(Heterodera avenae)(곡물 낭포종 선충)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 선충은 뿌리혹선충(멜로이도진 인코그니타, Meloidogyne incognita) 일 수 있다.
또한, 본 발명에서 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215를 배양하는　방법은 널리 공지된 미생물 배양 방법에 따라서 수행될 수 있고, 이들 공지된 배양방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall Interantional Editions, pp.138~176)에 개시되어 있다. 배양과 관련된 배양온도, 배양시간 및 배지의 pH 등의 조건은 유효성분의 생산을 극대화하기 위하여 적절하게 조절될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물을 이용한 방제방법은 통상 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 살포시기는 식물 병원균이 발병, 증식하기 전 예방적으로 미리 처리하는 것이 방제효과를 더욱 상승시킬 수 있다.
한편 본 발명은 항균 및 선충 방제 활성을 가지는 리소박터 캡시시 YS1215 배양 분획물 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 (a) 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 배양액에 에틸아세테이트를 첨가하여, 에틸아세테이트 층을 분획한 후 이를 건조하여 조추출물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득한 조추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 100% 부터 0%까지 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 90 내지 60%인 분획을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명의 방법을 단계별로 설명한다.
(a) 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 배양액을 수득하는 단계
(a) 단계에서는 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 배양액을 수득한다. 리소박터 캡시시 YS1215의 배양방법은 공지의 미생물 배양 방법에 의할 수 있다.
본 발명의 배양을 위한 배지는 공지의　배지가 포함될 수 있으며, 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215의 배양과정은 당업계에 알려진 적절한 배지와　배양조건에 따라 이루어질 수 있다.
본 발명의 배양을 위한 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원의 예로는 포도당, 자당, 과당, 갈락토스, 글리세롤, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 질소원은 효모추출물, 효모농축액, 비프추출물, 옥수수침지가루, 옥수수침지액, 참치추출물, 글루타민산나트륨, 펩톤, 트립톤, 구연산암모늄, 인산암모늄, 암모니아수, 질산나트륨, 황산암모늄 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 배지는 질소원은 효모 추출물 일 수 있으며, 탄소원은 자당(수크로스, sucrose) 또는 포도당일 수 있다. 또한 상기 배지는 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215의 효율적인 증식을 위하여 각종 염 및 미량성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 배양배지는 바람직하게는 L-글루탐산나트륨(L-monosodiumglutamate, MSG)을 0.1 내지 10g/L, 효모추출물(Yeast extract)을 0.1 내지 10g/L, 자당(Sucrose)을 1 내지 10g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4)을 0.1 내지 5g/L, 황산암모늄((NH4)2SO4)을 0.1 내지 5g/L, 탄산칼슘(CaCO3)을 0.1 내지 5g/L, 황산마그네슘(MgSO4)을 0.1 내지 1g/L, 황산구리(CuSO4)를 0.001 내지 0.1g/L, 황산아연(ZnSO4)을 0.001 내지 0.1g/L, 염화제이철(FeCl3)을 0.01 내지 0.1g/L 포함하는 배양배지 일 수 있다.
이러한　배양과정은 당업자라면 선택되는 균주의 종류에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기　배양방법의 예에는, 회분식　배양(batch culture), 연속식　배양(continuous culture) 또는 유가식　배양(fed-batch culture)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215를 배양하는　방법은 널리 공지된 미생물 배양 방법에 따라서 수행될 수 있고, 이들 공지된 배양방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall Interantional Editions, pp.138~176)에 개시되어 있다. 배양과 관련된 배양온도, 배양시간 및 배지의 pH 등의 조건은 유효성분의 생산을 극대화하기 위하여 적절하게 조절될 수 있다.
바람직하게는 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 수득한 배양액은 원심분리 등 공지의 방법에 의해 세포와 배양여액을 분리하여 배양여액을 본 발명의 배양액으로 하여 분획할 수 있다.
(b) 상기 배양액에 에틸아세테이트를 첨가하여, 에틸아세테이트 층을 분획한 후 이를 건조하여 조추출물을 수득하는 단계;
상기 (b) 단계에서는 상기 배양된 배양액으로부터 조추출물을 수득한다. 본 발명의 조추출물 수득 단계는 에틸아세테이트를 첨가하여 상기 에틸아세테이트에 용해되는 성분을 분리 추출하는 것을 특징으로 한다.
상기 에틸아세테이트에 용해되어 분리된 조추출물은 증발 등의 공지의 방법을 통하여 에틸아세테이트로부터 분리될 수 있다.
(c) 상기 수득한 조추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 100%부터 0%까지 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 90 내지 60%인 분획을 수득하는 단계
본 발명의 분획물은 상기 크로마토그래피 과정에서 클로로포름의 농도가 90 내지 60%인 구간에 포함된다. 더욱 바람직하게는 클로로포름의 농도가 70 내지 60%인 구간에 포함된다.
한편 본 발명의 방법은 상기 (c) 단계에서 수득한 분획을 추가적으로 정제하기 위하여 세파덱스 LH-20 겔 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 gel column chromatography) 및 실리카 컬럼(silica column)으로 추가 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 추가 단계에 의하여 본 발명의 제조방법은 항균 활성 및 항선충 효과가 더욱 효과가 우수한 분획물을 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면 항선충 효과뿐만 아니라 항균 활성도 함께 보유한 조추출물 분획을 효과적으로 분리할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 항균 및 선충 방제 활성을 가지는 리소박터 캡시시 YS1215 배양 분획물을 제공한다.
본 발명의 배양 분획물은 본 발명의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하며, 항균 및 선충 방제 활성을 동시에 가지는 것을 특징으로 한다.
따라서 본 발명은 상기 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 및 선충 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 항균 활성 및 선충 방재 활성을 동시에 가지고 있어, 농작물의 유해 균 및 선충을 동시에 방재하는데 매우 효과적이다.
본 발명의 조성물은 공지의 식물 유해 균 방제를 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 항선충 미생물 대량 배양
항선충 미생물(Lysobacter capsici YS1215)을 최적 배지에 접종한 후 진탕 배양기에서 30℃, 140rpm의 조건으로 하여 5일간 배양하였다. 배지 조성은 하기 표 1과 같으며, 기본 배지 조성에 키틴 및 젤라틴을 4:1 로 혼합하여 0.1%(w/v) 추가하였다. 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215는 전배양을 통하여 7X109CFU/ml의 농도의 1차 배양액 만든 후 이를 0.1% 비율로 접종하여 배양하였다.
배양 종료 후, 배양액은 원심분리(6,000 rpm, 15 min)하여 균체와 배양여액을 각각 분리하였고, 분리된 배양 여액을 대상으로 활성성분의 분리 정제를 실시하였다.
기본 배지 조성
성분 용량(g/L)
L-monosodiumglutamate(MSG) 1.0g
Yeast extract 1.0g
Sucrose 3.0g
KH2PO4 1.4g
(NH4)2SO4 1.0g
CaCO3 1.0g
MgSO4 0.3g
CuSO4 0.02g
ZnSO4 0.02g
FeCl3 0.03g
<실시예 2> 활성물질 분리
<lactic acid 임은 공개하지 않는 것이 좋을 것으로 보입니다.>
<2-1> 조추출물 분리
실시예 1에서 배양한 배양 액을 원심분리(6,000 rpm, 15 min)하여 균체와 배양여액으로 분리하였다.
분리된 배양여액을 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 등으로 추출하여 각 추출액의 항균활성을 조사하였다. 조사 결과 에틸아세테이트로 추출한 경우 항균활성 및 선충알 부화억제율, 유충 치사율이 가장 높은 것을 확인하였다.
이에 배양여액을 에틸아세테이트로 추출한 후, evaporation 시켜 조추출물을 수득하였다.
<2-2> 활성성분 분리1
수득한 조추출물을 Silica gel column chromatography를 통하여 항균활성이 있는 분획을 분리하였다.
실리카겔 컬럼크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 통해 ethylacetate 추출물을 1차 정제 하였다. 살 선충물질 용출은 CHCl3-MeOH을 100:0 부터 0:100(v/v)까지 10% 단위로 변화시키면서 각각 분획을 분리하였다.
각 분획은 식물병원성 곰팡이(Rhizoctonia solani)를 이용하여 항균활성을 측정하였다. 고형 아가로스 겔 한쪽 가장자리에 Rhizoctonia solani 균체 조각을 올려놓은 후, 반대편 가장자리에 본 발명 활성성분 각 분획을 0.1%인 50ul를 로딩하고 배양하면서 항균활성을 관찰하였다.
측정 결과, [도 2] 및 [표 2]에서 보는 바와 같이, 클로로포름 90%, 70%, 60% 분획에서 항균활성을 보이는 것을 확인하였다.
분획별 항균활성 측정 결과
Fraction Chloroform
(ml)		 Methanol
(ml)		 항균활성
A 100 0
B 90 10 +
C 80 20
D 70 30 +++
E 60 40 +++
F 50 50
G 40 60
H 0 100
<2-3> 활성성분 분리2
실시예 2-2에서 분리된 분획 중 활성이 나타난 분획을 모아, 다시 Sephadex LH-20 column chromatography (1.5×30cm, 25-100mesh; Sigma-Aldrich, Steinheim,Germany)를 이용하여 활성성분을 분리하였다. 용출용매는 메탄올을 이용하였으며, 5ml 단위로 분획을 수집하여 실시예 2-2와 동일한 방법으로 항균활성을 측정하였다.
실험 결과 [표 3]에서 보는 바와 같이, 분획 B 및 C에서 항균활성이 나타나는 것을 확인하였다.
Sephadex 분획별 항균활성 측정 결과
Fraction Methanol
(ml)		 항균활성
A 5
B 5 ++
C 5 ++
D 5
E 5
F 5
G 5
H 5
I 5
J 5
<2-4> 활성성분 분리3
Sephadex LH-20 column chromatography 실시 후 항균활성이 있는 분획을 모아 500mg silica column (StrataSI-1silica, 55um, Phenomenex, Torrance,CA)을 이용하여 CHCl3-MeOH (100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 0:100, v/v) 용출 조건으로 정제하였다.
실험결과, [도 3]에서 보는 바와 같이, 분획 D 및 E에서 활성이 높은 것을 확인하였다.
<실시예 3> 조성물의 항선충 활성 측정
상기 실시예 2에서 분리한 활성성분 분획의 항선충 활성을 측정하였다. 이를 위하여 상기 활성성분 분획을 250, 500, 750, 1000, 1250 mM 농도로 선충 알 및 유충에 처리하였다.
구체적으로 뿌리혹선충 알 500개가 들어 있는 24 well-plate에 본 발명의 활성성분 분획을 각 농도별로 처리하고 2일 및 5일 후 알 부화 억제율을 조사하였다.
유충 치사율은 뿌리혹선충 유충 300개가 들어 있는 24 well-plate에 본 발명의 활성성분 분획을 각 농도별로 처리하고 1일 및 3일 후 유충의 치사율을 조사하였다.
실험 결과, [도 4] 및 [도 5]에서 보는 바와 같이, 조사 5일째 250 mM에서 36.4%의 알 부화율로, 물 처리구 44.5% 보다 8.1%의 알 부화율이 낮게 조사되었다. 또한 유충 치사율에서는 조사 3일째 물 처리구 6.5% 보다 250 mM에서 10.1%로 3.5% 높게 조사되었다
이로서 본 발명의 조성물은 항균활성 및 선충 방제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
한편 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구의 범위뿐 아니라 이 특허청구의 범위와 균등한 것들에 의해서 정해져야 한다.

Claims (7)

  1. (a) 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 배양액에 에틸아세테이트를 첨가하여, 에틸아세테이트 층을 분획한 후 이를 건조하여 조추출물을 수득하는 단계;
    (c) 상기 수득한 조추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 100 부피% 부터 0 부피%까지 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 70 내지 60 부피%인 분획을 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 분획을 세파덱스 LH-20 겔 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 gel column chromatography) 및 실리카 컬럼(silica column)으로 추가 분리하는 단계를 포함하며;상기 (d) 단계의 실리카 컬럼 분리는 상기 (d) 단계의 세파덱스 LH-20 겔 컬럼 크로마토그래피의 분획물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 100 부피% 부터 0 부피%까지 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 20 내지 40 부피%인 분획을 수득하는 단계에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 수득한 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici) YS1215 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물.
  2. (a) 리소박터 캡시시 YS1215를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 배양액에 에틸아세테이트를 첨가하여, 에틸아세테이트 층을 분획한 후 이를 건조하여 조추출물을 수득하는 단계;
    (c) 상기 수득한 조추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 100 부피% 부터 0 부피% 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 70 내지 60 부피%인 분획을 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 분획을 세파덱스 LH-20 겔 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 gel column chromatography) 및 실리카 컬럼(silica column)으로 추가 분리하는 단계;를 포함하며,
    상기 (d) 단계의 실리카 컬럼 분리는 상기 (d) 단계의 세파덱스 LH-20 겔 컬럼 크로마토그래피의 분획물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 로딩한 후, 클로로포름과 메탄올으로 구성된 용매를 이동상으로 하며, 시간에 따라 이동상의 클로로포름의 농도를 100 부피% 부터 0 부피%까지 변화시키며, 나머지는 메탄올로 하는 농도 기울기를 주면서 크로마토그래피를 수행하고, 클로로포름의 농도가 20 내지 40 부피%인 분획을 수득하는 단계를 포함하는 항균 및 선충 방제 활성을 가지는 리소박터 캡시시 YS1215 배양 분획물 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)인 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020140144795A 2014-10-24 2014-10-24 리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물 KR101695962B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140144795A KR101695962B1 (ko) 2014-10-24 2014-10-24 리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140144795A KR101695962B1 (ko) 2014-10-24 2014-10-24 리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160048375A KR20160048375A (ko) 2016-05-04
KR101695962B1 true KR101695962B1 (ko) 2017-02-01

Family

ID=56021911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140144795A KR101695962B1 (ko) 2014-10-24 2014-10-24 리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101695962B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101866814B1 (ko) * 2016-09-29 2018-06-18 전남대학교산학협력단 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카 el 000614 균주 및 이의 용도

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2829325B2 (ja) 1989-05-16 1998-11-25 株式会社トダバイオシステム研究所 抗菌・抗線虫剤、植物細胞活性剤及びそのための微生物
KR100518362B1 (ko) 2003-01-21 2005-10-04 이형철 선충 방제용 조성물
KR20090037158A (ko) 2007-10-11 2009-04-15 장용석 식물 추출물을 포함하는 소나무 재선충 방제제

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
[논문] JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160048375A (ko) 2016-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102078252B1 (ko) 인삼 뿌리썩음병에 대한 길항력을 가지는 바실러스 벨레젠시스 arri17 및 이의 이용
Sang et al. Biological control of Phytophthora blight of pepper by antagonistic rhizobacteria selected from a sequential screening procedure
CN102428966B (zh) 一种作物病害防治复合生物制剂及其应用
CN106686983B (zh) 甲基营养型芽孢杆菌作为植物生长刺激剂和生物控制要素的应用、以及该物种的分离物
EP2552218B1 (en) Bacterial strains and a bionematicide and plant growth stimulator containing them
Sujarit et al. Streptomyces palmae CMU-AB204T, an antifungal producing-actinomycete, as a potential biocontrol agent to protect palm oil producing trees from basal stem rot disease fungus, Ganoderma boninense
Lahkar et al. Biosurfactant of Pseudomonas aeruginosa JS29 against Alternaria solani: the causal organism of early blight of tomato
EP3011833A1 (en) Bacteria with nematicidal activity and the ability to promote plant growth
CN109844095B (zh) 对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉f22菌株及其用途
KR101313900B1 (ko) 푸자리시딘을 이용한 식물 보호 방법
WO2015029872A1 (ja) ネコブ線虫を忌避させるための忌避剤及びその製造方法並びにその忌避剤を用いた忌避方法
CN117580815A (zh) 用于促进植物生长和/或保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病的组合物
WO2010060528A2 (en) Plant extracts for use as phytochemicals
Sethi et al. Screening of biocontrol potential of indigenous Bacillus spp. isolated from rice rhizosphere against R. solani, S. oryzae, S. rolfsii and response towards growth of rice.
Kim et al. Evaluation of the endophytic nature of Bacillus amyloliquefaciens strain GYL4 and its efficacy in the control of anthracnose
RU2305927C2 (ru) Способ защиты растений
Alexander et al. The effectiveness of selected biological control agents in controlling Ganoderma boninense
KR101802911B1 (ko) 코지산을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물 및 이의 용도
KR101695962B1 (ko) 리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물
CN113115777A (zh) 伊枯草素家族脂肽在防治害虫中的应用
Pandey et al. Trichoderma spp. in the management of stresses in plants and rural prosperity
KR101501033B1 (ko) 살선충 효과를 가지는 스트렙토마이세스 고양엔시스 big11003 균주 및 이의 용도
Ramírez R et al. Metabolites produced by antagonistic microbes inhibit the principal avocado pathogens in vitro
Akello et al. Insect antagonistic bio-inoculants for natural control of leaf-mining insect pests of French beans
US20100285054A1 (en) Antimicrobial Composition Comprising Fungal Extract, Process for Producing Fungal Extract and Method for Protecting Organisms

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191024

Year of fee payment: 4