KR101693275B1 - IFN-γ 및 IL-32γ를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IFN-γ 단백질 및 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태의 조합을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물, 또는 IFN-γ 단백질에 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태가 결합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 IFN-γ 단백질과 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태를 병용하거나 융합단백질의 형태로 사용함으로서 IFN-γ 단백질의 항암 효과를 상승적으로 극대화할 수 있다.

Description

IFN-γ 및 IL-32γ를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물{Anti-Cancer Composition Comprising Interferon-γ and Interleukin-32γ As Active Ingredient}

본 발명은 IFN-γ 및 IL-32γ를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

만성 골수성 백혈병(Chronic myelogenous leukemia, CML)은 골수와 순환 혈액의 백혈구가 과도하게 분화하는 것을 특징으로 하는 암이다. 치료법의 비약적인 발전에도 불구하고 백혈병은 혈액암환자에게 가장 흔한 암이며 그 치료법 또한 급성 독성과 장기간의 후유증을 수반하는 부작용이 있다. 만성 골수성 백혈병은 원시 조혈 줄기세포(primitive hematopoietic stem cell)에 필라델피아 염색체 전좌(Philadelphia chromosomal translocation)가 있으며, 이러한 상호 전좌(reciprocal translocation)에 의해 9번 염색체의 아벨슨 종양유전자(Abelson oncogene, ABL)가 22번 염색체의 절단점군영역(Breakpoint Cluster Region, BCR)과 나란히 위치되어 ABL 타이로신 키나아제가 항상적으로 활성화되는 융합 유전자를 생성시킨다.

임상적으로 만성 골수성 백혈병은 골수가 확장되고 백혈구가 거핵화되며 백혈구 수가 증가하는 증상이 있으며, BCR-ABL 단백질 타이로신 키나아제의 억제제인 이매티닙메실산염(matinib mesylate, imatinib, Gleevec)이 치료제로 사용된다.

인간 세포주 K562은 급성전환기였던 만성 골수성 백혈병 여성 환자의 흉수로부터 확립되었으며, 세포 표면에 HLA 클래스 I과 II(HLA classes I&II)의 발현이 결핍되어 있어 인 비트로(in vitro)상에서 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포)의 가장 예민한 목표물이 된다.

최근 들어 면역세포들의 항암효과에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다. NK세포는 선천성 면역체계(innate immune system)에 특화된 효과기 세포(effector cell)이며 암세포 및 바이러스 감염에 대한 방어에 중요한 역할을 한다. NK세포가 가지고 있는 자연 세포독성은 적절한 세포막의 자극에 의하여 빠르게 반응하며 유전부호화 활성세포 표면수용체(germline-encoded activating cell surface receptor) 또는 유전부호화 억제세포 표면수용체(germline-encoded inhibitory cell surface receptors)의 복잡한 신호전달에 의하여 조절된다. NK세포는 T-세포(cytotoxic T cell)와 유사하게 퍼포린(perforin)과 그랜자임(granzyme)을 통해 세포독성을 나타낸다. 퍼포린은 세포막에 결합하여 그랜자임이 세포질내로 유입되도록 도와줌으로서 표적세포(target cell)의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. 표적세포의 세포사멸을 유도하는 그랜자임은 용균단백질(lytic protein)로서 그랜자임 A와 그랜자임 B로 구성되며 표적세포의 세포사멸을 유도한다. 그랜자임은 프로테오글리간 serglycin과 복합체를 형성하고 낮은 pH 및 칼슘농도에 의해 불활성화 상태로 유지된다. 친-세포사멸성 그랜자임 B는 NK세포의 세포독성에서 중요한 역할을 한다. 분비된 그랜자임은 표적 세포에서 세포사멸의 3가지 다른 경로를 활성화시킨다. 인간에서 그랜자임은 리소좀 관련 막당단백질(lysosomal associated membrane glycoprotein)인 CD107a, CD107b 및 CD63이 포함된 지질 이중층으로 둘러싸인 과립체의 형태로 세포막 주변에 존재하며 NK세포가 표적세포를 인식하면 탈과립현상을 통하여 면역시냅스내로 분비된다. 과립 분비 경로는 NK 세포 세포독성에서 가장 우세한 경로이다. 분비된 그랜자임은 표적세포의 수용체 경로(death receptor pathway)를 자극하여 세포사멸을 유도한다.

NK세포의 다른 세포독성은 NK세포에 발현된 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 리간드에 의하여 이루어진다. NK세포에 발현된 종양괴사인자 리간드가 표적세포의 Fas(CD95/Apo-1)또는 종양괴사인자 관련 세포사멸 유도 리간드(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)와 결합하게 되면 표적세포의 세포사멸이 유도되며 상기 신호전달 경로는 NK세포에서 분비된 인터페론-γ(Interferon-γ, IFN-γ)에 의해 증폭된다. NK세포에서 분비된 IFN-γ는 표적세포의 TRAIL과 Fas 리간드의 발현을 증가시키며 세포사멸 관련 유전자들에 대한 전사유전자를 활성화하여 사멸 수용체 경로에 대한 표적세포의 민감도를 증가시킨다.

IFN-γ는 면역체계세포 뿐만 아니라 병원균에 감염된 모든 인간 세포에서 생성된다. IFN은 여러 기능을 가진 사이토카인(cytokine)으로 항바이러스, 항증식, 항암 및 면역조절효과를 가지고 있다. IFN-γ의 세포막수용체는 IFN-γR1과 IFN-γR2로 이루어져 있으며 JAK(Janus kinase)-signal transducer 또는 STAT1 (activator of transcription 1)에 의하여 신호전달이 이루어진다. IFN-γ에 대한 세포막 수용체는 2개의 서브유닛인 IFN-γR1 및 IFN-γR2로 구성된다. IFN-γ 수용체에 IFN-γ가 결합하면 IFN-γ 수용체는 야누스 티로신 키나아제(Janus tyrosine kinase)인 JAK1 및 JAK2와 빠르게 결합한다. JAK 효소들은 서로를 인산화시키고, IFN-γ의 수용체를 인산화 한다. 상기 인산화 과정을 통해 IFN-γ의 세포막수용체는 STAT (signal transducer and activator of transcription) 단백질의 패밀리 중의 하나이며 잠재적인 세포질 전사 인자인 STAT1의 결합부위를 만든다.

종양억제자의 기능도 가지고 있는 STAT1은 Tyr701과 Ser727에 인산화가 될 수 있는데 Tyr701에 인산화가 되면 이합체화(dimerization)되어 핵 내로 이동되며 DNA와 결합한다. Ser727에 인산화가 되면 IFN들과 무관하게 p38 MAP 인산화 효소(Mitogen-Activated Protein kinase)에 의하여 인산화 될 수 있으며 STAT1에 의한 세포사멸과 관련이 있다. 하지만 Tyr701의 인산화와 STAT1에 의한 세포사멸의 관계는 알려지지 않았다.

인터페론 조절인자-1(interferon-regulatory factor 1, IRF-1)은 IFN에 의해 세포내 발현이 조절되는 전사인자 단백질 패밀리 중 하나이다. IRF-1은 IFN-γ에 의하여 조절되며 세포주기, 세포사멸, 종양억제 및 항바이러스 반응에 관여한다.

인간 NK세포 전사인자-4로 알려진 인터루킨-32(interlukin-32, IL-32)는 다기능 염증매개체로서 류마티스 관절염 및 만성 폐쇄성 폐질환과 같은 염증성 질환의 발병원인이며 만성 골수 단핵구성 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia) 및 고형종양의 발생과 관련이 있다. IL-32의 동형단백질인 IL-32α, β, γ 및 δ의 발현은 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의하여 조절되며 발현된 동형단백질 중 IL-32γ의 생물학적 활성도가 가장 높다. 선행연구에 의하면 과발현된 IL-32γ와 IL-32β는 종양괴사인자(tumor necrosis factor α, TNFα)에 의해 유도된 염증신호와 세포내 형태 인식 수용체들(intracellular pattern recognition receptors)신호를 증폭시켜 염증유도 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 발현을 상승시킨다는 결과가 알려졌다. 최근의 결과에 의하면, IL-2, IL-18 또는 IFN-γ는 T-세포, NK세포, 상피세포 및 단핵백혈구를 자극하여 IL-32의 분비를 유도하며 상기 IL-32에 유도된 사이토카인들은 NF-κB와 p38 MAP 인산화 효소의 활성을 증가시킨다는 것이 알려졌다. 그러나, IFN-γ에 의해 유도된 세포사멸에 대한 IL-32γ의 효과에 대하여는 아직까지 알려진 바가 없다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

미국등록특허 제7,560,265호

본 발명자들은 사이토카인 단백질을 사용한 효과적인 항암제를 개발하기 위해 연구노력하였다. 그 결과, IFN(interferon)-γ 및 IL(interleukin)-32γ 단백질을 조합하여 사용하면 IFN-γ 단백질의 암세포에 대한 사멸효과를 상승적으로 극대화할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 (i) IFN-γ 단백질; 및 (ⅱ) IL-32γ 단백질 또는 이 단백질의 절단된 형태를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 IFN-γ 단백질에 IL-32γ 단백질 또는 이 단백질의 절단된 형태가 연결된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) IFN(interferon)-γ 단백질; 및 (ⅱ) IL(interleukin)-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 IFN-γ 단백질과, IL-32γ 단백질 또는 이 단백질의 절단된 형태를 병용하여 사용하면 IFN-γ 단백질의 세포사멸(apoptosis)에 의한 항암효과가 상승적으로 극대화될 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 용어 “IFN(interferon)-γ 단백질”은 인간 IFN-γ 유전자의 발현물인 단백질을 의미한다.

상기 IFN-γ 단백질은 인터페론 타입 Ⅱ 클래스에 속하는 이량성 가용성 사이토카인이다(Nature 298 (5877) 859-63, "Structure of the human immune interferon gene"). 인간에서 IFN-γ 단백질은 IFNG 유전자에 의해 코딩된다(Naylor SL, et al., March 1983, "Human immune interferon gene is located on chromosome 12". J. Exp. Med. 157 (3): 10207; "Entrez Gene: IFNGR2"). IFN-γ은 바이러스, 박테리아, 원생동물에 대한 선천성 및 후천성 면역에서 매우 중요한 역할을 하는 사이토카인이고, 대식세포의 중요한 활성자이면서 클래스 Ⅱ MHC (major histocompatibility complex) 분자 발현 유도자이다. IFN-γ는 바이러스 복제를 직접적으로 억제할 뿐만 아니라 면역촉진 및 면역조절자로서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IFN-γ는 자연살해세포(natural killer cell, NK cell) 및 자연살해 T 세포(natural killer T cell, NKT cell)에 의해 생성되고, 항원-특이적 면역이 전개되면 CD4 Th1 및 CD8 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 효과기(effector) 세포에 의해서도 생성된다(Schoenborn JR, Wilson CB (2007). "Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses". Adv. Immunol. 96: 41101). IFN-γ는 항바이러스 활성, 면역조절활성 및 항종양 활성을 갖는다(Schroder K, et al., February 2004, "Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions". J. Leukoc. Biol. 75 (2): 16389).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IFN-γ 단백질은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 용어 “IL(interleukin)-32γ 단백질”는 인간 IL-32γ 유전자의 발현물인 단백질을 의미한다.

IL-32는 인간 IL-32 유전자에 의해 코딩되는 단백질로서, NK 세포, 혈액단핵세포, T 림프구 및 상피세포 등에서 생성되며 6개의 스플라이싱 변이체인 IL-32α, IL-32β, IL-32γ, IL-32δ, IL-32ε 및 IL-32ζ가 존재하는 것으로 알려져 있다. IL-32는 면역세포들이 TNF-α 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인을 분비하도록 유도할 수 있는 염증 유도 사이토카인으로 역할을 하며, IL-8 및 MIP-2/CXCL2와 같은 케모카인의 생성도 유도할 수 있다(Kim SH, et al., January 2005. "Interleukin-32: a cytokine and inducer of TNFalpha". Immunity 22 (1): 13142). 또한, IL-32는 MAPK/ERK 경로 및 액틴 세포골격을 조절함으로써 파골세포 분화를 촉진하나 파골세포의 활성화는 촉진하지 않는 것으로 알려져 있다(Mabilleau G, Sabokbar A (2009). "Interleukin-32 promotes osteoclast differentiation but not osteoclast activation". PLoS ONE 4 (1): e4173).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-32γ 단백질은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 IL-32γ 단백질의 절단된 형태(truncated form)도 IFN-γ 단백질의 세포사멸에 의한 항암효과를 상승적으로 향상시킨다.

본 명세서에서 용어 “IL-32γ 단백질의 절단된 형태”는 IL-32γ 단백질이 IFN-γ 단백질과 조합하여 상승적 항암 효과를 유지하거나 더욱 증강시키는 범위내이면 어떠한 절단된 형태이든 모두 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 상기 용어 “IL-32γ 단백질의 절단된 형태”는 “IL-32γ 단백질의 절편” 또는 “IL-32γ 단백질의 단편”과 동일한 의미로 혼용된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 “IL-32γ 단백질의 절단된 형태”는 서열번호 2에 개시된 IL-32γ 단백질의 아미노산 서열에서 1번 - 64번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 65번 - 153번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 19번 - 110번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 111번 - 210번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 IFN-γ 단백질에 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태가 연결된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

상기 융합단백질에서 IL-32γ 단백질 또는 이의 절단된 형태는 IFN-γ 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 바람직하게는 IL-32γ 단백질 또는 이의 절단된 형태는 IFN-γ 단백질의 C-말단에 연결된다.

상기 융합단백질에서 상기 “IL-32γ 단백질의 절단된 형태”에 대한 내용은 상기 IFN-γ 단백질 및 IL-32γ 단백질의 병용에서 설명된 내용과 동일하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 “IL-32γ 단백질의 절단된 형태”는 서열번호 2에 개시된 IL-32γ 단백질의 아미노산 서열에서 1번 - 64번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 65번 - 153번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 19번 - 110번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 111번 - 210번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 융합단백질에서 IL-32γ 단백질의 절단된 형태는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열에서 1번 - 64번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 65번 - 153번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 융합단백질에서 IFN-γ 단백질과, IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태는 링커(linker)를 통해 서로 연결된다.

상기 링커는 바람직하게는 아미노산의 서열로 이루어지는 펩타이드 링커이다. 단백질 사이를 연결하여 융합단백질 제조에 사용될 수 있는 펩타이드 링커에 대한 내용은 문헌 Argos, P. (1990) J, Mol. Biol., 211, 943-958; Alfthan, K et al., (1995) Protein Eng., 8, 725-731; Suzuki, C., et al., (1999) J. Immunol. Methods, 224, 171-184에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 링커는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 발린(valine), 글루타민산(glutamic acid), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 라이신(lysine), 메티오닌(methionine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 루신(leucine), 글루타민(glutamine), 및 페닐알라닌(phenylalanine)으로 이루어지는 아미노산 군에서 선택된 2-100개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 융합단백질은 서열번호 13, 서열번호 14, 또는 서열번호 15에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암세포의 세포사멸(apoptosis)를 촉진한다.

본 발명에서 치료 대상 질병인 암(cancer)은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 특성, 주위 조직에 침투하는 침윤적 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 치료 대상 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 보다 바람직하게는 혈액암이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 IFN-γ 단백질 및 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물 형태로 제공된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 IFN-γ에 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태가 연결된 융합단백질의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물 형태로 제공된다.

본 발명에서 “약제학적 유효량”은 암 또는 종양의 치료를 위해 효과적이며 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 단백질들의 “약제학적 유효량”은 다른 의미로는 상술한 함께 투여되는 활성 단백질들이 항암 활성의 상승적 효과를 달성하기에 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 활성성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 IFN-γ 단백질 및 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태의 조합을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명은 IFN-γ 단백질에 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태가 결합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

(ⅲ) 본 발명의 조성물은 IFN-γ 단백질과 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태를 조합하여 병용하거나 융합단백질의 형태로 사용함으로써, IFN-γ 단백질의 세포사멸에 의한 항암 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다.

도 1은 IL-32γ의 유전자를 포함한 재조합 아데노바이러스를 HEK293 세포에 감염시킨 후 발현된 단백질을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 보여준다.
도 2는 IL-32γ 유전자를 포함한 재조합 아데노바이러스를 HEK293 세포에 감염시킨 후 발현된 녹색형광단백질을 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 공배양 환경에서 NK 세포의 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염에 따른 NK세포의 K562 세포에 대한 세포독성변화를 보여준다.
도 4는 공배양 환경에서 NK 세포의 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염에 따른 NK세포에 의한 K562 세포의 세포사멸을 보여준다.
도 5는 공배양 환경에서 NK 세포의 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염에 따른 K562 세포의 BAX 및 BCL2의 발현변화를 보여준다.
도 6은 IL-32γ siRNA를 실시한 NK 세포의 K562 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과를 보여준다.
도 7은 NK 세포에서 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염에 따른 그랜자임 B의 발현변화를 보여주며 NK 세포를 K562 세포와 공배양한 실험군과 NK 세포만을 배양한 실험군에서 발현된 그랜자임 B를 보여준다.
도 8은 IL-32γ 재조합 아데노바이러스에 감염된 NK 세포에 IL-32γ siRNA를 수행하였을 때 변화된 그랜자임 B의 분비량을 보여준다.
도 9은 NK 세포에서 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염에 따른 IFN-γ의 분비량의 변화를 보여준다.
도 10은 K562 세포가 공배양된 NK 세포의 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염에 따른 IFN-γ의 분비량의 변화를 보여준다.
도 11은 K562 세포가 공배양된 NK 세포의 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염에 따른 STAT1 인산화의 변화를 보여준다. 패널 A는 IL-32γ 재조합 아데노바이러스의양을 증가시킴에 따라 STAT1의 인산화가 증가한 결과를 보여준다. 패널 B는 IL-32γ에 대한 siRNA를 수행한 실험군은 IL-32γ 재조합 아데노바이러스의 양을 증가시켜도 STAT1의 인산화가 증가하지 않는다는 결과를 보여준다.
도 12은 K562 세포가 공배양된 NK 세포의 IL-32γ 재조합 아데노바이러스 감염 및 STAT1에 대한 siRNA에 따른 STAT1 인산화의 변화를 보여준다. 패널 A는 STAT1에 대한 siRNA를 수행한 실험군은 IL-32γ 재조합 아데노바이러스의 양을 증가시켜도 STAT1의 인산화가 증가하지 않는다는 결과를 보여준다. 패널 B는 STAT1에 대한 siRNA를 수행한 실험군은 IL-32γ 재조합 아데노바이러스의 양을 증가시켜도 세포사멸이 증가하지 않는다는 결과를 보여준다.
도 13은 K562 세포에 IFN-γ와 IL-32γ가 함께 처리되었을 때 K562 세포의 STAT1 인산화가 상당히 증가한 결과를 보여준다.
도 14는 K562 세포에 IFN-γ와 IL-32γ가 함께 처리되었을 때 K562 세포의 세포사멸이 현저히 증가한 결과를 보여준다.
도 15는 K562 세포에 IFN-γ와 IL-32γ가 함께 처리되었을 때 K562 세포의 성장이 억제된 결과를 보여준다.
도 16은 절단된 IL-32γ단백질의 제조결과를 보여준다. 패널 A는 IL-32γ 절편 단백질의 구조의 모식도를 보여준다. 단백질 절편은 각각 IL-32γ의 1-64aa (amino acid) 도메인, 65-153aa 도메인, 19-110aa 도메인, 111-210aa 도메인 및 1-234aa 도메인인 것을 보여준다. 패널 B는 발현된 IL-32γ단백질들을 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅으로 확인한 것이다.
도 17은 제작한 IL-32γ 단백질 절편들을 이용하여 항암 유도 활성 부위를 확인한 결과이다. IFN-γ와 함께 IL-32γ 절편 단백질들을 처리한 세포를 아넥신 V-FITC 및 PI로 염색하고 유세포분석을 통하여 세포사멸을 확인한 결과이다.
도 18은 IFN-γ와 IL-32γ 단백질 또는 이의 절단된 형태가 결합된 융합 단백질들의 제작결과를 보여준다. 패널 A는 IL-32γ 및 IL-32γ 절편 단백질들이 IFN-γ에 결합된 융합단백질의 대략적인 모식도를 보여준다. 패널 B는 IL-32γ의 1-64aa, 65-153aa 절편, 또는 절단되지 않은 IL-32γ가 결합된 IFN-γ 융합단백질의 단백질 크기가 His-표지(His-tagged)를 포함하여 25.9 kDa, 28.7 kDa 또는 44.55 kDa로 성공적으로 발현된 결과를 보여준다.
도 19는 융합 단백질들을 처리한 세포를 아넥신 V-FITC 및 PI로 염색하고 유세포분석을 통하여 세포사멸을 확인한 결과를 보여준다.
도 20은 K562 세포의 플루다라빈(fludarabine) 노출양에 따른 STAT1의 인산화의 변화를 보여준다. 패널 A는 플루다라빈을 처리한 세포에 대하여 아넥신 V-FITC 및 PI로 염색하고 유세포분석을 수행한 결과를 보여준다. 패널 B는 IFN-γ를 처리한 세포에서 플루다라빈에 의한 STAT1 인산화의 변화를 보여준다.
도 21은 플루다라빈에 의하여 IL-32γ에 의해 유도된 세포사멸과정에 연관된 단백질의 발현이 차단된 결과를 보여준다.
도 22는 플루다라빈에 의하여 IL-32γ에 의한 세포사멸의 상승효과가 억제된 결과를 보여준다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 세포배양

인간 NK세포주인 NK92MI는 ATCC (American Type Culture Collection)으로부터 구입하였고 12.5% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 12.5% 말혈청(horse serum), 1% L-글루타민(glutamine), 0.1% 머켑토에탄올(2-mercaptoethanol) 및 1% 페니실린(penicillin)/스트랩토마이신(streptomycin)이 첨가된 α-최소필수배지(alpha minimum essential medium, α-MEM, Sigma)에서 37℃에서 습화된 5％ CO₂ 분위기하에서 배양하였다. 인간 만성 골수 백혈병 세포주인 K562는 ATCC로부터 수득하였으며 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지(Gibco)에서 37℃에서 습화된 5％ CO₂ 분위기하에서 배양하였다.

2. Ad-IL-32γ의 제조 및 역가측정

실험에 사용한 아데노바이러스(adenoviruis)는 아데노바이러스 백본 벡터 (adenoviral backbone vector), Adeasy 벡터 및 셔틀벡터(shuttle vector)로 pshuttle-CMV-EGFP 벡터를 사용하여 개발하였다. PCR을 통해 IL-32γ 유전자를 증폭시킨 후 IL-32γ CDS를 셔틀벡터에 클로닝하고 유전자 전달기(electroporator, Bio-Rad,GENEPULSER)를 이용하여 E.coli BJ5183에 클론과 백본 벡터를 삽입하였다. E.coli BJ5183에서 증폭한 아데노바이러스 벡터를 유전자 전달기를 이용하여 HEK293세포에 삽입하였다. 상기와 같은 방법으로 음성대조군을 제조하고 재조합 아데노바이러스에 대하여 아데노-Xrapid 타이터 키트(Adeno-Xrapid titer kit, Clontech)를 이용하여 역가를 측정하였다.

3. IL-32γ의 mRNA 간섭(interference) 실험

인간 IL-32γ의 siRNA(Cat. No. sc-60841, Santa Cruz)와 STAT1의 siRNA(Cat. No. sc-44123, Santa Cruz), 그리고 음성대조군의 siRNA(Cat. No. sc-37007, Santa Cruz)를 사용하여 실험을 수행하였다. 모든 siRNA 간섭실험은 Lipofectamine^™ RNAiMAX (invitrogen)와 60pM siRNA를 사용하였다. Lipofectamine 시약과 siRNA를 Opti-MEM 배지에서 혼합하고 상온에서 15분 동안 인큐베이션 하였다. 1 X 10⁶ 세포/웰의 K562세포에 혼합한 시약을 최종 부피가 2㎖이 되도록 첨가하여 37℃에서 24 - 48시간동안 인큐베이션 하였다. IL-32γ의 발현은 웨스턴 블로팅(western blotting)과 PCR을 통해 확인하였다.

4. 웨스턴 블로팅 분석

IL-32γ의 발현을 분석하기 위하여 NK92MI 세포를 24시간 동안 아데노바이러스로 감염시킨 후 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척하고 0.2% PMSF가 포함된 RIPA 버퍼에서 용해하였다. 웨스턴 블로팅을 위하여 동량의 단백질을 SDS-PAGE(10 - 15%)에서 분리하고 PVDF 막으로 전이하였다. 전이막을 5% 탈지분유로 블로킹하고 0.05% Tween 20이 포함된 Tris-Buffered saline (TBST)로 세척하였다. 전이막은 1차 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션하고 5분씩 5회에 걸쳐 TBST로 세척한 후 2차 항체로 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 그 후 5분씩 5회에 걸쳐 TBST로 세척하고 반응단백질을 ECL법(enhanced chemiluminescence blotting detection system)으로 검출하였다. IFN-γ가 포함된 IL-32의 신호를 분석하기 위하여, 인간 재조합 IL-32γ(R&D system)와 IFN-γ(BD)를 K562세포에 4시간 동안 처리하고 PBS로 세척한 후 2% PMSF가 포함되어 있는 RIPA버퍼로 용해하였다. 실험방법은 이전 실험과 같다.

5. 유세포분석

세포의 세포사멸을 정량적으로 확인하기 위하여, 아넥신-V 분석 키트(Annexin-V assay kit, BD Biosciences)를 사용하였다. 감염된 NK세포를 K562세포와 4:1의 비율로 배양한 6웰 플레이트에서 세포를 수확하고 PBS로 세척한 후 결합버퍼에서 현탁한 후 암실에서 30 - 60분 동안 아넥신 V-FITC와 PI로 염색하였다. 염색한 지 1 시간이 지난 세포를 유세포분석기(BD, cantoⅡ)에서 분석하고 각 결과당 10000개의 세포들을 분석하였다. 세포사멸 여부는 아넥신 V-양성 및 PI-음성 세포 또는 아넥신 V-양성 및 PI-양성 세포로 판단하였다. 재조합단백질을 이용하는 실험에서는 IFN-γ, IL-32γ 또는 IFN-γ 및 IL-32γ를 세포가 배양된 24웰 플레이트 처리하고 4 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수확하여 PBS로 세척하고 상온 하에서 30분에서 60분 동안 암실에서 아넥신 V-FITC 및 PI로 염색하였다.

6. 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)

IL-32γ를 포함한 아데노바이러스(adIL-32γ)에 감염된 NK92MI세포와 K562세포를 공배양하고 사이토카인과 과립의 분비정도를 측정하였다. 공배양된 세포를 수확하고 2000rpm으로 10분 동안 원심분리를 수행하여 상청액을 수득하였다. 수득된 상청액에 대하여 효소결합 면역흡수 분석법의 안내서에 따라 실험을 수행하였다.

7. 젖산탈수소효소(LDH) 분석법

효과기세포(effector cells)인 NK92MI 세포와 표적세포(target cells)인 K562 세포를 각 4:1의 비율로 96웰 세포배양플레이트에 넣고 250xg의 속도로 2분간 원심분리하여 효과기세포와 표적세포가 확실히 접촉하도록 유도한 후 37℃에서 4시간 동안 습화된 5％ CO₂ 분위기에서 배양하였다. 배양 후 플레이트를 250xg 속도로 10분간 원심분리하고 효소분석키트(Takara)를 이용하여 젖산탈수소효소의 농도를 분석하였다. 배양액의 INT (tetrazoliumsalt 2-p-(iodophenyl) -3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchloride)로부터 변환된 포르마잔의 흡광정도를 490nm에서 측정하여 젖산탈수소효소의 농도를 분석하였고 아래의 식에 따라 세포독성을 산출하였다.

8. IL-32γ 절편 단백질의 제조

IL-32γ 절편 단백질은 AccuRapid^™ ProXpress PCR 주형 키트(AccuRapid^™ ProXpress PCR template kit)와 무세포 단백질 발현(Cell-Free protein expression) 키트(바이오니아)를 이용하여 제조하였다. 주형의 제작을 위한 첫 번째 프라이머는 표 1과 같이 디자인하였다.

또한, IL-32γ와 IFN-γ의 상호작용을 확인하기 위하여 유전자 카세트(gene casattes)를 제작하였다. 유전자 카세트는 임의의 서열(Gly x 5) 이용하여 IL-32γ CDS를 IFN-γ CDS에 결합시켰다. 이에 사용한 프라이머는 표 2와 같이 디자인하였다.

9. 세포생존력의 측정

세포의 생존력을 측정하기 위하여, 5 x 10⁴세포/웰의 K562세포를 24웰 플레이트에서 배양하고 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리로 침전된 세포를 10㎖의 PBS로 풀어주고 0.2% 트립판 블루(trypan blue) 0.1㎖를 첨가한 후 세포용액 한 방울을 뉴바우어 챔버(Neubauer chamber)에 떨어뜨려 K562세포를 계수하였다. 트립판 블루로 염색된 세포는 죽은 세포로 판단하고 염색되지 않은 세포는 생존한 세포로 판단하였다. 상기 실험은 세 번에 걸쳐 반복하였다.

10. 일산화 질소(NO)의 생산량 측정

상층액의 아질산염(nitrite)의 축적은 그리스반응(Griess reaction)으로 측정하였다. 배양액의 상층액 50㎕에 같은 양의 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민, 1% 술파닐아마이드 및 5% 인산으로 구성된 그리스반응 물질을 첨가하고 상온하에서 10분간 반응시켰다. 마이크로플레이트 흡광기를 이용하여 540nm에서 흡광을 측정하고 알려진 아질산나트륨 시료들의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 만들어 농도를 산출하였다.

실험결과

1. IL-32γ는 자연살해세포(NK 세포)의 세포독성을 활성화시켜 K562세포의 세포사멸을 증가시킨다.

아데노바이러스 벡터 시스템을 이용하여 NK세포 세포주인 NK92MI에서 IL-32γ를 과발현하고 K562세포의 생존력을 측정하여 IL-32γ가 과발현된 NK세포의 항암효과를 측정하였다. 본 실험에 앞서, IL-32γ 유전자를 포함한 재조합 아데노바이러스의 단백질 발현능을 HEK293 세포에 감염시킨 후 웨스턴 블로팅과 아데노바이러스 벡터에서 유래한 녹색형광 단백질(Green Fluorescence Protein, GFP)의 발현을 통해 확인하였다(도 1 및 도 2). IL-32γ가 NK 세포의 세포독성에 영향을 주는 지 측정하기 위하여, 배지에 존재하는 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)의 농도를 측정하였다. 실험결과, IL-32γ의 NK세포내 발현증가에 의한 NK세포의 세포독성이 약 40% 증가하였다(도 3). 또한, 아넥신 V 염색(annexin V staining) 결과를 통하여 IL-32γ의 NK 세포내 발현증가가 K562 세포의 세포사멸의 증가를 유도한 것이 확인되었다. IL-32γ를 과발현하는 NK세포의 K562세포 사멸율이 대조군에 비하여 90% 가량 증가하였으며 전구세포사멸 단백질인 BAX의 발현이 증가와 항세포사멸 단백질인 BCL2의 발현이 감소한 것이 확인되었다(도 4 및 도 5). 상기 결과들은 IL-32γ에 대해 siRNA를 실시한 결과 NK세포의 세포독성이 증가하지 않은 결과로부터 더욱 확실시되었다(도 6).

2. IL-32γ는 NK세포의 그랜자임 B 분비를 촉진한다.

웨스턴 블로팅 분석을 통하여 IL-32γ 재조합 바이러스의 감염에 의하여 NK세포에서 그랜자임 B의 분비가 증가되는 것을 확인하였으며 내인성 그랜자임 B의 발현은 변하지 않는 것을 확인하였다. 또한, NK세포는 NK세포만 배양한 것보다 K562세포를 함께 배양했을 때 더 많은 그랜자임 B을 발현한다는 것을 확인하였으며 같은 조건에서 IL-32γ 재조합 바이러스로 감염된 NK세포는 그렇지 않은 세포보다 50% 가량 더 많은 그랜자임 B를 분비하는 것이 확인되었다(도 7 및 도 8). 하지만 퍼포린(perforin)의 분비량은 IL-32γ 재조합 바이러스의 감염에 의하여 변하지 않았다. 그랜자임 B가 탈과립현상에 의하여 분비되는지 확인하기 위하여 CD107a의 발현여부를 유세포분석기로 분석하였다. 분석결과 CD107a 및 CD69의 발현이 변하지 않았다. 그러므로 IL-32γ의 효과는 NK 세포의 활성도와 무관한 것으로 사료된다.

3. IL-32γ는 NK세포의 IFN-γ의 분비를 촉진한다.

IFN-γ는 NK 세포나 자연살해 T 세포(NKT세포)에 의해 주로 만들어지며 내재면역반응의 일부로서 항바이러스, 면역조절 및 항암특성을 가진다. NK 세포의 항암효과를 확인하기 위하여 ELISA를 이용하여 IFN-γ의 분비를 측정하였다. 측정결과, IL-32γ 과발현 NK 세포의 IFN-γ 분비는 100, 300 및 500 MOI에서 113.74, 147.61 및 157 ng/㎖으로 증가하였다. 이는 음성대조군에 비하여 IFN-γ 분비가 각각 1.86배, 2.42배 및 2.57배씩 증가한 것이다(도 9). K562세포와 공배양된 IL-32γ 과발현 NK세포에서는 IFN-γ의 분비가 100, 300 및 500 MOI에서 731.59, 799.2 및 1180.68 ng/㎖으로 증가하여 음성대조군에 비하여 IFN-γ 분비가 각각 1.04배, 1.13배 및 1.67배씩 증가하였다(도 10). 이러한 결과들은 IL-32γ가 NK세포에서 IFN-γ의 분비를 촉진하며 K562 세포에 의해 NK세포의 활성이 증가한 경우 IFN-γ의 분비가 더욱 증가한 것을 의미한다.

4. IL-32γ는 K562세포에서 STAT1의 인산화를 활성화시킨다.

이전의 실험을 통해 IL-32γ 바이러스에 감염된 NK세포에서 세포밖으로 분비되는 IL-32γ 단백질의 증가를 확인할 수 있었다. NK세포에서 분비된 재조합 IL-32γ와 IFN-γ의 상호작용을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. IFN-γ에 의한 세포사멸은 JAK-STAT 신호전달에 의해 활성화되며 IFN-γ의 전구세포사멸 활성과 세포성장억제효과가 STAT1의 신호전달에 의해 이루어지는 것으로 판단해 보면 STAT1이 세포사멸의 증진에 중요함을 알 수 있다. IFN-γ에 유도된 단백질 발현에 대한 IL-32γ의 효과를 확인하기 위하여, IL-32γ 과발현세포를 K562세포와 공배양하였다. 실험결과, IL-32γ의 분비량에 비례하여 STAT1의 인산화가 진행되는 것을 확인할 수 있었다(도 11의 패널A). IL-32γ에 대한 siRNA 실험(siIL-32γ)을 수행한 결과, IL-32γ의 단백질 발현이 일시적으로 제거되면 STAT1의 인산화가 자극 이전 수준으로 감소하는 것이 확인되었다(도 11의 패널B). STAT1에 대한 siRNA(siSTAT1)를 수행한 결과, IL-32γ에 의한 세포사멸상승효과는 STAT1의 단백질로 인해 나타나는 것임을 확인하였다(도 12의 패널A). IL-32γ 과발현 NK세포와 siSTAT1 트랜스펙션한 K562세포를 공배양한 후 유세포분석을 이용하여 세포사멸 정도를 확인한 결과, K562세포의 세포사멸은 100, 300 및 500 MOI에서 각각 6.02%, 8.01%, 및 8.06%로 감소하였다(도 12의 패널B). 또한, K562세포를 siIL-32γ 처리된 NK세포와 공배양 하였을 경우 IL-32γ 과발현 NK세포와 공배양 하였을 경우에 비해 K562세포의 세포사멸이 70% 가량 감소하였다. 이러한 결과들은 IL-32γ가 STAT1 의존성 IFN-γ 유도 세포사멸에 상승작용을 하여 K562세포의 세포사멸을 향상시킨다는 것을 의미한다. IL-32γ 또는 STAT1의 발현을 녹-다운(knock-down) 시키면 K562세포의 세포사멸이 저해된다.

5. K562세포에서 IFN-γ에 의한 세포사멸신호는 IL-32γ의 처리에 의하여 증가한다.

IL-32γ가 IFN-γ 유도 세포사멸 조절에 직접적으로 관여하는지를 확인하기 위하여, IL-32γ와 IFN-γ를 K562세포에 각각 단독, 병용 처리하였다. STAT1은 여러 스트레스로 인해 발현되는 세포사멸 유전자를 조절하는데 이는 STAT1 Ser727의 인산화에 의한 것으로 알려져 있다. 실험결과, K562세포에 IL-32γ와 IFN-γ를 함께 처리하면 STAT1의 Ser727과 Tyr701의 인산화가 IFN-γ 단독처리 시 보다 상당히 증가하였다(도 13). 또한, 동일한 조건 하에서 종양 억제자인 IRF-1의 발현과 IRF-1 유도 세포사멸과 관련된 PUMA의 발현이 증가하였다. IL-32γ와 IFN-γ를 함께 처리했을 경우, K562세포의 세포사멸은 IFN-γ만을 처리했을 경우에 비하여 약 7배가 증가하였으며, IL-32γ에 의한 자극은 K562세포의 성장을 억제하였다(도 14 및 도 15 결과 참조). STAT1 매개 IFN-γ의 신호전달은 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 같이 염증과정에 밀접하게 관련된 유전자의 발현을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 실험결과, 유도성 산화질소 합성효소의 발현과 산화질소의 합성은 IL-32γ와 IFN-γ를 함께 처리 했을 시에 감소되었다. 이러한 결과는 백혈병 세포에서 IL-32γ가 IFN-γ에 의해 유도된 세포사멸을 효과적으로 증가시킨다는 것을 의미한다.

6. 절단된 IL-32γ들에 의한 세포사멸의 유도

K562세포의 세포사멸에 미치는 IL-32γ 및 IFN-γ의 상호 관련성을 규명하기 위해, IL-32γ 절편 단백질들을 PCR을 이용하여 제조하였다. 절편 단백질들은 전체 IL-32γ 단백질의 1-64aa(amino acid), 65-153aa, 19-110aa 및 111-210aa 및 1-234aa 부위에 해당한다. IL-32γ와 IL-32γ 절편 단백질을 비교한 대략적인 모식도는 도 16의 패널 A에 나타나 있다. 7kDa, 9.8kDa, 10.1kDa, 11kDa 또는 25.7kDa 크기의 His-표지(His-tagged)된 IL-32γ 절편 단백질이 성공적으로 발현되는 것을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 후, IFN-γ와 함께 IL-32γ 절편 단백질들의 처리에 의한 K562 세포의 세포사멸 효과를 확인하기 위하여, IL-32γ 절편 단백질들과 IFN-γ를 K562 세포에 4시간 동안 함께 처리하였다. 그 결과 IL-32γ 단백질의 1-64aa(amino acid), 65-153aa, 19-110aa, 111-210aa 및 1-234aa 를 IFN-γ과 동시에 처리한 경우 세포사멸은 각각 9.43%, 22.41%, 4.28%, 4.5% 및 14.49% 씩 증가하였다(도 17). 이는 음성대조군에 비해 각각 1.28, 3.04, 0.96, 1.01 및 1.97배 증가한 것이다. IFN-γ에 의존한 IL-32γ의 세포사멸 유도 활성을 확인하기 위하여 IL-32γ 및 IL-32γ 절편단백질들이 IFN-γ에 결합된 융합단백질들을 제조하고 상기의 실험을 실시하였다. IL-32γ 및 IL-32γ 절편단백질들이 IFN-γ에 결합된 융합단백질의 대략적인 모식도는 도 18의 패널 A에 나타나있다. IL-32γ의 1-64aa, 65-153aa 절편, 또는 절단되지 않은 IL-32γ가 결합된 IFN-γ 융합단백질의 단백질 크기는 26 kDa, 28.7 kDa 또는 44.6 kDa로서 His-표지(His-tagged)된 단백질들이 성공적으로 발현되는 것을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 후, 실험한 결과 IL-32γ의 1-64aa, 65-153aa 절편, 또는 절단되지 않은 IL-32γ가 결합된 IFN-γ 융합단백질에 의한 K562 세포의 세포사멸은 각각 16.7%, 37.5%, 29.42% 이었으며 이는 음성대조군에 비해 각각 2.44배, 5.48배, 4.3배 증가한 것이다(도 19). 이러한 결과를 통해 K562세포의 세포사멸을 유도함에 있어서 IL-32γ 65-153aa 부분이 IFN-γ와 함께 처리했을 때 가장 효과가 좋다는 것을 확인할 수 있었다.

7. IL-32γ의 상승작용은 STAT1 억제제인 플루다라빈(fludarabine)에 의하여 억제된다.

STAT1 활성 차단을 위해 약효가 나타지 않는 정도의 농도의 플루다라빈을 K562세포에 처리하였다. K562세포를 5μM 플루다라빈으로 24시간 동안 처리한 경우 IFN-γ에 의해 활성화된 STAT1의 양이 줄어들었다(도 20). 실험결과에 의하면 플루다라빈은 STAT1의 Ser727의 인산화만을 억제하였으며 IL-32γ와 IFN-γ이 함께 처리된 세포에서는 STAT1의 인산화를 차단하지 못하였다. 하지만 플루다라빈은 IRF-1, PUMA 및 절단된 카스파아제9(cleaved caspase 9)과 같이 IL-32γ에 의해 유도된 세포사멸과정에 연관된 단백질의 발현을 차단하였다(도 21). 그러므로 K562세포에서 플루다라빈에 의해 유도된 STAT1의 활성 억제는 IL-32γ에 의한 세포사멸의 상승작용을 폐지시켰다(도 22). 결과적으로, 플루다라빈에 의한 STAT1 활성의 억제는 IL-32γ의 상승적 효과를 억제하였다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Anti-Cancer Composition Comprising Interferon-gamma and Interleukin-32gamma As Active Ingredient <130> MP15-0069 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Gln 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln 165 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Cys Phe Pro Lys Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Met Val Met Leu Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp 20 25 30 Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly Pro Trp 35 40 45 Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser Ser Gln 50 55 60 His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala Glu Ser 65 70 75 80 Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp Asp Phe 85 90 95 Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu Gln His 100 105 110 Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu Arg Cys 115 120 125 Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe Gln Ala 145 150 155 160 Met Leu Gln Arg Leu Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala Trp Val 165 170 175 Lys Glu Lys Val Val Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu Trp Lys 180 185 190 Gln Phe Gln Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met Ser Ser 195 200 205 Phe Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu Thr Pro 210 215 220 Gln Lys Cys Ser Glu Pro Gln Ser Ser Lys 225 230 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Forward Primer of IL-32gamma 1-64aa or The Forward Primer of IL-32gamma 1-64aa for Gene Casattes to Make IFN-gamma/IL-32gamma Fusion Protein <400> 3 atgtgcttcc cgaaggtc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Reverse Primer of IL-32gamma 1-64aa or The Reverse Primer of IL-32gamma 1-64aa for Gene Casattes to Make IFN-gamma/IL-32gamma Fusion Protein <400> 4 ctgtgaagag aggcagag 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Forward Primer of IL-32gamma 65-153aa <400> 5 caccaggcca tagaaaga 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Reverse Primer of IL-32gamma 65-153aa or The Reverse Primer of IL-32gamma 65-153aa for Gene Casattes to Make IFN-gamma/IL-32gamma Fusion Protein <400> 6 cttgtcacaa aagctctc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Forward Primer of IL-32gamma 19-110aa <400> 7 gtaatgctcc tccctact 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Reverse Primer of IL-32gamma 19-110aa <400> 8 ctcctcataa taagccgc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Forward Primer of IL-32gamma 111-210aa <400> 9 cagcacccag agctcact 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Reverse Primer of IL-32gamma 111-210aa <400> 10 ctggaaagag gacatgaa 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Reverse Primer of IL-32gamma 1-234aa or The Reverse Primer of IL-32gamma 1-234aa for Gene Casattes to Make IFN-gamma/IL-32gamma Fusion Protein <400> 11 ttttgaggat tggggttc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The Forward Primer of IL-32gamma 1-64aa, 65-153aa, or 1-234aa for Gene Casattes to Make IFN-gamma/IL-32gamma Fusion Protein <400> 12 aaatatacaa gttatatc 18 <210> 13 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of IFN-gamma/IL-32gamma 1-64aa Fusion Protein Containing Glycine Linker(G-G-G-G-G) Between Proteins <400> 13 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Gln 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln Gly Gly Gly Gly Gly Met Cys Phe Pro Lys 165 170 175 Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala Arg Met Val Met Leu 180 185 190 Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp Val Ser Ala Cys Asp 195 200 205 Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly Pro Trp Arg Asp Lys Asp Pro 210 215 220 Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser Ser Gln 225 230 235 <210> 14 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of IFN-gamma/IL-32gamma 63-153aa Fusion Protein Containing Glycine Linker(G-G-G-G-G) Between Proteins <400> 14 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Gln 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln Gly Gly Gly Gly Gly His Gln Ala Ile Glu 165 170 175 Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala Glu Ser Gly Arg Gly Gln Val 180 185 190 Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp Asp Phe Lys Glu Gly Tyr Leu 195 200 205 Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu Gln His Pro Glu Leu Thr Pro 210 215 220 Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu Arg Cys Arg Gly Asn Arg Ser 225 230 235 240 Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala Thr Glu Glu Pro Gly Glu Ser 245 250 255 Phe Cys Asp Lys 260 <210> 15 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of IFN-gamma/IL-32gamma 1-234aa Fusion Protein Containing Glycine Linker(G-G-G-G-G) Between Proteins <400> 15 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Gln 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln Gly Gly Gly Gly Gly Met Cys Phe Pro Lys 165 170 175 Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala Arg Met Val Met Leu 180 185 190 Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp Val Ser Ala Cys Asp 195 200 205 Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly Pro Trp Arg Asp Lys Asp Pro 210 215 220 Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser Ser Gln His Gln Ala Ile Glu 225 230 235 240 Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala Glu Ser Gly Arg Gly Gln Val 245 250 255 Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp Asp Phe Lys Glu Gly Tyr Leu 260 265 270 Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu Gln His Pro Glu Leu Thr Pro 275 280 285 Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu Arg Cys Arg Gly Asn Arg Ser 290 295 300 Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala Thr Glu Glu Pro Gly Glu Ser 305 310 315 320 Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe Gln Ala Met Leu Gln Arg Leu 325 330 335 Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala Trp Val Lys Glu Lys Val Val 340 345 350 Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu Trp Lys Gln Phe Gln Ser Phe 355 360 365 Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met Ser Ser Phe Gln Ser Tyr Gly 370 375 380 Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu Thr Pro Gln Lys Cys Ser Glu 385 390 395 400 Pro Gln Ser Ser Lys 405

Claims (12)

1. (i) IFN(interferon)-γ 단백질; 및 (ii) IL(interleukin)-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물로서, 상기 IL-32γ 단백질의 절단된 형태는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열에서 65번 - 153번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 19번 - 110번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 111번 - 210번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 항암용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-32γ 단백질은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 세포사멸(apoptosis)를 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
   
6. IFN-γ 단백질에 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태가 연결된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물로서, 상기 IL-32γ 단백질의 절단된 형태는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열에서 1번 - 64번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 65번 - 153번 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 IL-32γ 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 삭제
9. 제 6 항에 있어서, 상기 융합단백질은 IFN-γ 단백질과 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ 단백질의 절단된 형태가 링커(linker)를 통해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 링커는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 발린(valine), 글루타민산(glutamic acid), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 라이신(lysine), 메티오닌(methionine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 루신(leucine), 글루타민(glutamine), 및 페닐알라닌(phenylalanine)으로 이루어지는 아미노산 군에서 선택된 2-100개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 세포사멸(apoptosis)를 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제 6 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.

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