KR101689540B1

KR101689540B1 - 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101689540B1
Application number: KR1020150068643A
Authority: KR
Inventors: 이동윤; 황용화; 이민형
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-04
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2016-12-27
Also published as: US11191808B2; US20170224769A1; WO2016003067A1; KR20160005308A

Abstract

본 발명은 HMGB1A(high mobility group box 1 A domain)를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 세포 이식시 발생할 수 있는 면역거부반응을 최소화하고, 세포의 이식 성공률을 높일 수 있다.

Description

세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Inhibiting Cell Transplant Rejection}

본 발명은 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

생체 내에 세포치료제를 이용한 치료 과정에서의 중요한 이슈는 (1) 투여된 세포치료제에 대한 면역반응 및 (2) 투여된 주변 환경에 의한 비특이적 염증반응이다. 이러한 중요한 문제점들에 의해서, 생체 내에 투여된 세포치료제들의 60~80%가 기능을 하지 못하는 초기 이식 손실(early graft loss)이 나타나게 된다. 이의 주된 이유는 세포들이 갖고 있는 HMGB1(High Mobility Group Box 1; 유전자 전사 단백질(transcription factor protein)들 중의 한 종류) 단백질이 세포치료제가 미미한 손상을 입게 되면 세포 밖으로 방출된 후 주위 면역세포들 등의 TLR2/4 및 RAGE 등의 세포막 수용체(receptor)에 결합하여 면역반응 및 염증반응을 유발하게되고, 결국 이러한 과정이 지속되게 되면 세포치료제가 그 기능을 상실하게 되기 때문이다.

하나의 예를 들면, 당뇨병치료를 위한 췌도세포 이식(pancreatic islet transplantation)의 경우, HMGB1이 이식 초기에 수술적 손상과 면역반응으로 인하여 췌도세포로부터 과량으로 방출되게 되고 이렇게 분비된 HMGB1은 추가로 다른 면역세포들과 상호작용을 일으켜 극심한 면역반응을 진행하게 되어, 결국 이식된 췌도세포의 대부분이 심각하게 파괴되어 인슐린의 분비 능력을 잃게 되어 당뇨병 치료를 실패하게 된다. 따라서 상기 예에서 알 수 있듯이, 세포 내에 있는 HMGB1 단백질의 방출을 제어하는 기술 개발이 매우 중요하다는 것을 이해할 수 있다.

췌도 세포의 이식 시 초기에 발생하는 HMGB1의 작용을 막기 위해 현재 진행하고 있는 연구는 HMGB1의 항체를 세포 이식 된 동물에 정맥(Intravenous) 투여하여 HMGB1의 면역반응을 줄여주는 연구 결과가 있다(Ulloa L, Messmer D. High-mobility group box 1 (HMGB1) protein: Friend and foe. Cytokine Growth F R 17, 189-201 (2006), Huang Y, et al. Extracellular Hmgb1 functions as an innate immune-mediator implicated in murine cardiac allograft acute rejection. Am J Transplant 7, 799-808 (2007)). 이로 인해 동종이식에서 적은 수의 세포를 이식하여도 혈당을 조절하는 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 패혈증 모델에서 HMGB1A를 복강주사(intraperitoneal)나 정맥주사 시에 HMGB1 항체만큼 면역 물질의 분비를 줄여주는 효과가 있다는 연구 결과가 있다(Yang H, et al. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 296-301 (2004).). 또한, 세포 전사 요소중 하나인 NF-κB를 막아주는 DHMEQ나, 췌도 세포를 간에서 이식할 때 항응고 물질인 항트롬빈III을 동종 이식 후에 동물에 투여 해주면 HMGB1의 발현을 줄일 수 있다는 등의 연구 결과가 공지되어 있다. 한편, HMGB1 항체나 siRNA의 사용이 HMGB1의 활성을 저해하여 암의 혈관신생(angiogenesis)을 저해한다는 연구가 진행되고 있다.

췌도 세포를 이식하고 난 후에 HMGB1을 줄여 주기위하여 추가 약물을 투입하는 방법은 번거로움이 많으며 정확한 시기에 투여하기엔 환자의 고통이 동반될 수 있다. 또한 대부분의 물질이 이식 된 세포를 타겟하는 것이 아니라 온몸으로 퍼져 나가기 때문에 그 효과를 바로 보기에는 한계가 있으며 체내에 약물을 투여하는 방법은 추후 임상적용 시에 안전성의 문제를 유발할 수 있다. 뿐만 아니라 대부분의 기술들은 동종이식에서만 그 효과를 보이고 있으며 이종 이식을 했을 때 효과를 증진 시키려면 다른 조치를 취해야만 효과를 보이는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세포 치료를 위한 세포 이식시 발생할 수 있는 면역거부반응을 최소화하고, 이식 세포의 이식 성공률을 높일 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 HMGB1A(high mobility group box 1 A domain), 특히 PTD가 결합된 HMGB1A를 이용하는 경우 세포 이식시의 면역거부반응을 극적으로 경감시키고, 이식 세포의 생착률을 높일 수 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물로 전처리된 세포를 포함하는 이식용 세포 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 HMGB1A(high mobility group box 1 A domain)를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 세포 이식 치료를 위한 세포 이식시 발생할 수 있는 면역거부반응을 최소화하고, 세포의 이식 성공률을 높일 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 HMGB1A(high mobility group box 1 A domain)를 이용하는 경우 세포 이식시의 면역거부반응을 극적으로 경감시키고, 이식 세포의 생착률을 높일 수 있다는 것을 규명하였다.

본 발명의 HMGB1A는 HMGB1 단백질에서 유래한 단백질 절편(fragment)으로서, 본 발명자들은 HMGB1A 단백질이 HMGB1 단백질와 결합이 가능하다는 사실을 최초로 밝혔으며, 이의 활용 기술로써 HGMB1A를 ex vivo 상에서 세포 내 유입이 가능하도록 PTD(protein transduction domain)가 도입된 PTD-HMGB1A 단백질을 개발을 하였다. 이러한 PTD-HMGB1A를 세포 내 전달을 통해서 HMGB1 단백질의 세포 밖으로의 분비를 효과적으로 억제할 수 있음을 밝혔다. 따라서 이러한 PTD-HMGB1A를 이용한 세포내의 전달 기술은 세포 치료 분야, 특히 당뇨병과 같은 췌도세포 결함 질병의 치료를 위한 췌도 세포 이식에서의 세포이식 거부반응 억제를 기대할 수 있으며, 더 나아가 줄기세포의 이식을 포함한 모든 세포의 이식 치료에서 또한 그 효과가 있을 것을 예상할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 HMGB1A는 PTD(protein transduction domain)가 추가적으로 결합된 것이다.

본 발명자들은 PTD가 부착된 HMGB1A인 PTD-HMGB1A를 포함하는 약제학적 조성물을 세포 이식시 사용하여, 세포의 이식 성공률을 극적으로 향상시킬 수 있음을 입증하였다. 상기 PTD는 10-16개의 염기성 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드로, 특별한 수용체의 도움 없이 자기 자신 혹은 자신과 결합하고 있는 물질들과 함께 세포막(plasma membrane)을 통과하여 세포 내에 축적되는 물질이다. PTD를 HMGB1A에 부착하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면, PTD-HMGB1A를 발현하는 발현벡터를 제조하여 이를 통해 PTD-HMGB1A을 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 PTD는 당업계에 공지되어 있는 것을 제한없이 사용가능하며, 구체적으로 예를 들면, Tat, Hph1, 페네트라틴(Penetratin), 트랜스포탄(Transportan), VP-22, 양쪽 친매성 펩타이드(Amphipathic peptides), MPG, Pep-1, MAP, SAP, PPTG1, 양이온성 펩타이드(Cationic peptides), 올리고알기닌(Oligoarginine), hCT(9-32), SyrB 및 Pvec으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 PTD는 Tat이다. 상기 Tat는 하위 타입에 따라 86개-101개의 아미노산으로 이루어진(참조: Jeang, K. T. (1996) In: Human Retroviruses and AIDS: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Los Alamos National Laboratory (Ed.) pp. III-3-III-18) HIV-1에 의해 발현되는 단백질로서, 단백질 전달(protein transduction) 현상을 일으킨다. Tat의 아미노산 서열 중 49-57번째 서열인 "RKKKRRQRRR"이 PTD 역할을 하는데 있어서, 최소 부위임이 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 (a) 이식 전의 세포 전처리 및 (b) 세포가 이식된 객체(subject)에 대한 전신적 투여 중 적어도 하나에 사용된다. 본 발명에 있어서, 이식용 세포 전처리는 객체에 이식하기 위한 세포를 준비하여, 객체에 이식하기 전의 이식용 세포에 HMGB1A, 구체적으로 PTD-HMGB1A, 더욱 구체적으로 Tat-HMGB1A을 처리하는 것을 의미하며, 구체적인 처리 방법은 분리된 이식용 세포를 실험실내에서 배양하며 순수 분리된 PTD-HMGB1A, 예를 들어 Tat-HMGB1A을 배양액에 함께 배양하는 것이다. 본 발명에 있어서, 이식용 세포가 이식된 객체에 대한 전신적 투여는, 이식용 세포 이식과 함께 또는 직후 언제라도 가능하며, PTD-HMGB1A, 예를 들어 Tat-HMGB1A는 이식용 세포가 이식된 부위에 직접 투여하지 않고, 다른 부위를 통해 투여하는 경우라도 전신적으로 효과가 발휘된다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 이식 전의 세포 전처리에 사용된다. 이식 전의 세포를 전처리 함으로서 이식 거부 반응을 예방할 수 있다는 점에서 이식 후 전신적 투여 또는 이식 부위 국소 투여만이 가능한 기존 약물들에 비하여 효율성이나 안정성 면에서 크게 유리하며, 이식 거부 반응 억제를 위한 기존의 약물들과 차별화 된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본발명의 세포는 췌도세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(IPSC)이다. 본 발명의 세포 이식은 세포 결함 질병이라면 제한없이 질병의 치료를 위해 실시할 수 있으며, 특히 손상된 세포의 재생이 어렵거나 불가능하다고 여겨지는 질병의 치료를 위하여 실시될 수 있다. 췌도세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(IPSC)는 현재 세포 이식 치료를 위해 임상적으로 이용되고 있거나, 임상적 이용이 기대되는 세포들로서 세포 이식 치료를 위해 적절하게 이용이 가능하다. 이식용 세포의 이식은 당업계에 공지된 적절한 이식부위를 선정하여, 공지된 방식을 통해 세포를 주입하는 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 췌도세포의 이식의 경우 당업계에 공지된 적절한 이식부위(예를 들면, 신장 피막 하 및 간문맥 등)를 선정하고, 이식부위에 공지된 방식, 예를 들면 복강 절개없이 초음파 투시 하에서 경피적으로 간문맥을 통해 간 내로 준비한 췌도를 주입하는 방법 등을 통해 수행된다. 이식에 적합한 도세포의 조건은 ABO 일치형으로서 췌도 (islet)수가 5,000/kg(객체 체중) 이상, 췌도 순도(islet purity)가 30% 이상, 최종 부피가 10 ml 이하이며 그램 염색상 음성이고, 엔도톡신 음성인 경우 이식 조건이 된다(Shapiro J et al., International trial of the edmonton protocol for islet transplantation, N Engl J Med 355:1318-1330(2006)).

본 발명의 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물은 세포 이식시 이식용 세포와 함께 객체(subject)에 투여될 수 있고, 세포 이식 후에도 세포 이식 부위에 투여될 수 있다. PTD-HMGB1A의 경우에는 세포 이식 부위가 아닌 다른 어떠한 부위를 통하여도 투여가 가능하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 객체에 투여되는 방식으로 사용되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 당뇨병성 만성 신질환, 백혈병, 재생불량성빈혈, 헌팅톤병, 뇌졸중, 척수손상 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 다른 일 구현예에서 상술한 바와 같이 세포 결함 질병이라면 제한없이 질병의 치료를 위해 실시할 수 있으며, 특히 손상된 세포의 재생이 어렵거나 불가능하다고 여겨지는 질병의 치료를 위하여 실시될 수 있으나, 특히 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 당뇨병성 만성 신질환, 백혈병, 재생불량성빈혈, 헌팅톤병, 뇌졸중, 척수손상 또는 다발성 경화증의 치료를 위해 실시될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 질병은 제1형 당뇨병이다. 제1형 당뇨병의 경우에는, 인슐린을 분비하는 췌도의 베타세포가 파괴됨으로 인하여 인슐린 분비기능이 소실되어 발생하고, 췌도세포 이식이 제1형 당뇨병에 대한 좋은 치료방법이 될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물로 전처리된 세포를 포함하는 이식용 세포 조성물을 제공한다.

본 발명의 이식용 세포는 인간 또는 다른 공여 동물, 구체적으로 예를 들어 돼지에서 유래한 것을 사용할 수 있다. 현재 췌도세포의 경우, 인간으로부터 기증받은 췌장에서 분리한 췌도세포 뿐만아니라, 돼지로부터 분리한 췌도세포가 췌도세포 이식 치료에 이용되고 있으며, 본 발명의 이식용 췌도세포 조성물 또한 돼지로부터 분리한 췌도세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 세포는 췌도세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(IPSC)이다.

본 발명의 이식용 세포 조성물은, 이식을 위해 준비한 이식용 세포를 상기에서 설명한 조성물로 전처리한 것이므로, 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복되는 내용은 그 기재를 생략하도록 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 HMGB1A(high mobility group box 1 A domain)을 유효성분으로 포함하는 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 HMGB1A(high mobility group box 1 A domain)을 유효성분으로 포함하는 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물로 전처리된 세포를 포함하는 이식용 세포 조성물을 제공한다.

(c) 본 발명에 의하면 세포 이식시의 면역거부반응을 극적으로 경감시킬 수 있다.

(d) 본 발명에 의하면 이식 세포의 생착률을 높이고, 세포의 이식 성공률을 높일 수 있다.

도 1은 HMGB1A 및 TAT-HMGB1A 발현을 위해 제작한 플라스미드를 나타낸다.
도 2a-c는 TAT-HMGB1A를 췌도 세포에 처리했을 때, 세포의 viability에 영향을 주는지를 판단하는 실험 결과를 나타낸다.
도 3a-b는 488nm에서 형광을 띄는 Alexa Flour 488 dye를 각각 HMGB1A와 TAT-HMGB1A에 표지 시킨 후, 각각의 단백질을 췌도 세포에 처리한 후, 세포내에 유입된 단백질을 공초점 현미경을 사용하여 촬영한 이미지를 나타낸다.
도 4a-b는 TAT-HMGB1A의 처리가 췌도 세포의 기능인 인슐린 분비능력에 영향을 주는지를 측정하기 위하여 GSIS(Glucose Stimulated Insulin Secretion)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5a-d는 in vitro상에서 일반 췌도 세포와 TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포를 STZ에 노출을 시키게 되면, 대부분의 세포들은 손상을 입게 되는데, 이때의 세포외 기질에서 측정되는 HMGB1의 양을 HMGB1 ELISA kit를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 TAT-HMGB1A, HMGB1A, TAT-MT, 및 HMGB1 항체를 분석대상으로 하여 다양한 농도에서 HMGB1과의 결합 유무를 SPR(Surface Plasmon Resonance)분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 HMGB1과 분석 대상들 간의 결합 유무를 알아보기 위한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다.
도 8a-b는 제1형 당뇨를 유도한 누드 마우스에서의 췌도 세포 이식에 있어서, 각각의 시료 처리에 따른 정상 혈당 조절능, 염증반응 유무, 인슐린 분비능, 또는 시료의 세포내 유입 정도를 나타낸다.
도 9는 제1형 당뇨를 유도한 Balb/c 마우스에서의 췌도 세포 이식에 있어서, 이식된 췌도세포의 생존 기간을 나타낸다.
도 10은 제1형 당뇨를 유도한 Balb/c 마우스에서의 췌도 세포 이식에 있어서, 신장에 이식된 췌장소도의 H&E와 insulin, 6X his tag, HMGB1의 염색을 시행결과를 나타낸다.
도 11a-c는 암세포에서의 TAT-HMGB1A 전달 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 암세포의 HMGB1 방출 조건에서 TAT-HMGB1A 처리에 따른 HMGB1 방출 억제 효과 실험 결과를 나타낸다.
도 13a-c는 TAT-HMGB1A에 의한 HUVEC의 생존율, TAT-HMGB1A의 세포 내 전달 실험 결과를 나타낸다.
도 14는 HUVEC세포를 이용한 세포 침윤 분석 결과를 나타낸다.
도 15a-b는 래트(rat) 대동맥 고리(aortic ring)를 이용한 TAT-HMGB1A의 혈관신생 억제 실험 결과를 나타낸다.
도 16은 HMGB1A 처리에 따른 HUVEC 세포 내에서의 HMGB1의 발현 변화 실험 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: TAT-HMGB1A 융합 단백질 제작

1-1. HMGB1A 및 TAT-HMGB1A 플라스미드 제작

HMGB1 cDNA를 HEK(Human Embryonic Kidney) 293 세포로부터 총(total) RNA를 RT-PCR을 사용하여 증폭시켰다. cDNA 단편(fragment)을 인코딩하고 있는 인간 rHMGB1의 아미노산 서열 1-164를 PCR로 증폭시켰다. 사용한 프라이머는 다음과 같다.

forward(EcoRI site 밑줄) 5'-CCGGAATTCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG-3'

reverse(HindIII site 밑줄) 5'-CCCAAGCTTGATGTAGGTTTTCATTTCTCTTTC-3'

증폭된 유전자를 EcoRI과 HindIII로 자르고 아가로오스 겔 전기영동을 실시하였다. 정제된 rHMGB1A cDNA를 pET21a 벡터에 삽입 후, 6 히스티딘을 C-말단에 인코딩(rHMGB1A-his₆)하고 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 진행하였다. TAT 펩타이드 서열을 제작하였다. upstream DNA(BamHI site 밑줄) 5'-GATCCAAGCTTCGCAAAAAGCGGAGACAGAGACGCAGGG-3', downstream DNA(EcoRI site 밑줄) 5'-AATTCCCTGCGTCTCTGTCTCCGCTTTTTGCGAAGCTTG-3'를 이용하였다. TAT cDNA를 box A cDNA와 결합시킨 후, pET21a 플라스미드에 삽입하였다(rTAT-HMGB1A-his6). 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. DNA 서열 분석을 통해 구조를 확인하였다(참조: 도 1).

1-2. 재조합 단백질의 발현

E.coli BL21(λDE3) 균주를 유전자 재조합 단백질 발현에 사용하였다. 박테리아를 LB 배지(Luria-Berani medium)(50 μg/ml 암피실린, LB-amp)으로 자라게 하고, 단일 콜로니(pET21a-HMGB1A 또는 pET21a-TAT-HMGB1A)를 37℃ LB-amp에서 키웠다(OD_600nm=0.6). IPTG 500 μM 첨가 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 원심분리를 하여 펠릿(pellet)을 만든 후, 1 mM PMSF가 들어간 용해 버퍼(lysis buffer)를 넣고 30초씩 3번 초음파처리(sonication) 하였다. 4℃, 10000 g로 원심분리하여 잔해물(debris)을 제거 한 후, 상층액을 정제하였다.

1-3. 재조합 단백질의 정제

rTAT-HMGB1A-his6 펩타이드를 니켈-킬레이트 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 반응을 하지 않은 단백질은 버퍼를 이용하여 제거하였다. 융합 단백질은 이미다졸을 첨가한 후, BCA 분석을 통하여 농도를 측정하고 SDS-PAGE를 통하여 사이즈를 분석하였다. 20% 글리세롤과 0.2 mM PMSF가 함유된 PBS에서 6000-8000 Da 막(membrane)으로 투석하였다. 프로테아제 억제제 칵테일을 넣고 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

실시예 2: 췌장소도 세포 분리

7주령의 수컷 SD-래트를 마취제를 이용하여 마취한 후 복부 절개하였다. 췌장 장기를 노출 시킨 후 총담관(Common bile duct)을 통해서 콜라게나아제 P 용액을 이용하여 췌장 장기를 부풀린 후 췌장 장기를 적출하였다. 17분 동안 효소 반응 후 차가운 M199 배지를 넣어 효소 반응을 정지 한 후 2번의 세척을 실시하였다. 피콜-히스토페이크(Ficoll-histopaque) 및 M199 배지의 이중 층(double-layer)을 이용한 밀도 구배-원심분리(density gradient-centrifugation)를 24분간 실시하였다. 분리된 층 사이의 췌장소도를 모아 2번의 세척 후 스테레오스코프(stereoscope)를 이용하여 핸드 피킹(handpicking)하였다. 10% FBS 및 1%항생제가 들어 있는 RPMI-1640 배양액에서 1일 동안 배양하였다. 다음날 배양액을 1회 교체하였다.

실시예 3: 췌장소도에서의 TAT-HMGB1A 처리 조건 확립

TAT-HMGB1A의 처리 농도에 따른 생존율을 측정하였다. 췌장소도에 TAT-HMGB1A 농도 0 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM 및 25 μM을 RPMI-1640 용액으로 맞춘 후 24시간 동안 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 처리하였다. 처리한 췌장소도를 RPMI-1640으로 2회 세척 후, 세포의 모양을 광학현미경으로 촬영하고 CCK-8 분석 키트로 생존율을 측정하였다. 10 μM TAT-HMGB1A 농도를 0, 4, 8, 12, 24시간에 따라서 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 처리한 후, RPMI-1640으로 2회 세척 후, CCK-8 분석 키트로 생존율을 측정하였다.

본 실시예는 TAT-HMGB1A를 췌도 세포에 처리했을 때, 세포의 생존력에 영향을 주는지를 판단하는 실험이다. 도 2의 A의 그래프에서 TAT-HMGB1A를 췌도 세포에 농도별로 처리 했을 시, 농도가 높아질수록 세포의 생존율이 떨어지는 것을 알 수 있다. 특히 농도가 20 μM 이상으로 처리 했을 때, 세포의 생존력이 현저하게 떨어지는 것을 알 수 있었다. 이는 광학현미경으로 촬영한 도 2의 C의 이미지와도 같은 결과를 보이고 있는 것을 알 수 있다. 고농도의 TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포에서 세포의 겉 콜라겐 층이 깨져있는 것을 확인 할 수 있었다. 도 2의 B 그래프는 TAT-HMGB1A를 10 μM에서 처리 시간에 따른 세포의 생존율을 관찰한 것인데, 이를 통해서 단백질의 처리 시간은 세포의 생존율에 크게 영향을 주지 않는 것으로 판단을 하였다. 췌도 세포는 다른 일반 세포들과는 다르게 하나의 세포가 여러 개 모여서 하나의 클러스터를 이루는 세포이기 때문에, 단백질의 세포내 유입은 상당히 힘든 것으로 알려져 있다. 따라서 위 생존율 실험을 통해서 TAT-HMGB1A의 전달을 극대화시키기 위하여 TAT-HMGB1A의 처리 농도와 시간을 10 μM, 24시간으로 결정하였다.

실시예 4: TAT-HMGB1A의 췌도 세포내 유입 확인 (형광물질 Alexa 488을 이용한 Alexa 488-표지된 TAT-HMGB1A을 제작하여 췌장소도 세포내 유입 정도 관찰)

1 M 소듐바이카보네이트 용액을 제작하였다(pH 8.3). TAT-HMGB1A 100 μl와 10 μl의 1M 소듐바이카보네이트 용액을 섞어주었다. 4 μl의 Alexa 488을 넣고 15분간 반응시키고 스핀 필터를 이용하여 정제하였다. Alexa 488-표지된 TAT-HMGB1A를 췌장소도에 10 μM로 24시간 동안 RPIM-1640 배지안에서 처리하였다. 췌장소도를 RPMI-1640으로 2회 세척 후 공초점 현미경으로 췌장소도 세포 내 유입을 확인하였다. 처리가 끝난 췌도 세포를 Tryple Express 용액을 사용하여 단일 세포로 분리 후, FACs 측정을 실시하였다.

488 nm에서 형광을 띄는 Alexa Flour 488 염료를 각각 HMGB1A와 TAT-HMGB1A에 표지 시킨 후, 각각의 단백질을 췌도 세포에 처리한 후, 세포내에 유입된 단백질을 공초점 현미경을 사용하여 촬영한 이미지를 도 3의 A에 나타내었다. 도 3의 A에서 보는 바와 같이, TAT-HMGB1A는 일반 HMGB1A 단백질 보다 훨씬 췌도 세포내의 유입이 잘 된 것을 확인 할 수 있다. 정량적으로 분석을 하기 위하여 FACs를 측정해본 결과, TAT-HMGB1A의 유입율은 22.31%로 단순히 HMGB1A(6.1%)처리 하는 것보다 훨씬 좋은 효율로 전달이 잘 되는 것을 알 수 있다.

실시예 5: TAT-HMGB1A 처리 후 In vitro 상에서의 췌장소도 인슐린 방출(release) 능력 평가

췌장소도에 TAT-HMGB1A 10 μM을 24시간 처리한 후 RPMI-1640 배지로 세척하였다. 일반 췌장소도와 TAT-HMGB1A를 처리한 췌장소도를 2.8 mM 글루코오스 크랩 버퍼(glucose Kreb's buffer)로 2회 세척하였다. 인서트(Insert)에 각 그룹 50IEQ씩 담아서 저농도 글루코오스(2.8 mM) 크랩 버퍼로 1시간동안 37℃에서 배양하였다. 반응이 끝난 후 용액을 E-튜브에 담고, 인서트를 고농도 글루코오스(20.2 mM) 크랩 버퍼로 옮긴 후 1시간동안 37℃에서 배양하였다. 고농도 글루코오스에서 반응한 용액을 E-튜브에 담고 인슐린 ELISA를 이용하여 용액의 인슐린의 양을 정량 분석하였다. 인서트에 있는 각 그룹의 췌장소도를 회수한 후, 세포를 RIPA 버퍼를 이용하여 용해시킨 후, 세포 잔여물(debris)을 제거 한 후, DNA를 회수 하여 DNA 분석 키트(Quant-iT^TM dsDNA assay kit; Invitrogen)를 사용하여 정량하였다.

TAT-HMGB1A의 처리가 췌도 세포의 기능인 인슐린 분비능력에 영향을 주는지를 측정하기 위하여 GSIS(Glucose Stimulated Insulin Secretion)을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 A에서 보는 바와 같이, TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포는 일반 췌도 세포와 마찬가지로 낮은 농도와 높은 농도의 글루코오스 용액 상에서 인슐린을 분비하는 양상이 비슷했다. 또한 낮은 농도의 글루코오스에서 높은 농도의 글루코오스의 용액으로 바뀔 때 분비량이 얼마나 증가하는지를 알아보는 인슐린 자극 인덱스 값(Insulin Stimulation Index value)을 확인해본 결과, 도 3의 B에서 보는 것처럼 TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포는 일반 췌도 세포처럼 인슐린의 증가 비율이 2배 이상임을 확인 할 수 있었다. 이는 TAT-HMGB1A의 처리가 췌도 세포의 인슐린 분비 능력에는 영향을 주지 않는다는 것을 확인 할 수 있는 지표이다.

실시예 6: 손상된 췌도 세포에서의 HMGB1 분비량 측정

일반 췌도 세포와 TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포에 스트렙토조토신(STZ)을 1.5 mM 8시간동안 처리하였다. 반응 시간이 끝난 후, 세포의 배지를 회수하여 HMGB1 ELISA측정을 실시하였다. 회수한 세포는 웨스턴 블랏 및 HMGB1 항체를 이용하여 면역염색하였다.

췌도 세포의 핵에는 HMGB1이 풍부하게 들어있고, 세포가 손상을 받게 되면, 이 HMGB1이 세포외 기질로 방출이 되게 된다. STZ는 동물모델에서 세포 사멸을 유도하여 제 1형 당뇨를 유발하는 시약으로 알려져 있다. In vitro상에서 일반 췌도 세포와 TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포를 STZ에 노출을 시키게 되면, 대부분의 세포들은 손상을 입게 되는데, 이때의 세포외 기질에서 측정되는 HMGB1의 양을 HMGB1 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 도 5의 A에서 보는 바와 같이, TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포 그룹에서는 일반 췌도 세포의 그룹과 비교 했을 때, 세포외 기질에서 측정되는 HMGB1의 양이 현저하게 줄었음을 확인 할 수 있었다. 또한 각각의 그룹에 STZ를 처리한 세포들을 회수하여 웨스턴 블랏을 시행하였을 때, 도 5의 B와 C에서 보는 바와 같이, 세포 내에 존재하는 HMGB1의 양이 TAT-HMGB1A 그룹에서 훨씬 많이 존재하고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 뿐만 아니라, 각 그룹의 세포들을 HMGB1 항체를 이용하여 면역염색을 해본 결과, 일반 췌도 세포에서는 STZ처리에 의하여 세포에 존재하고 있는 대부분의 HMGB1이 세포외로 빠져나가 염색되는 정도가 약한 반면, TAT-HMGB1A를 처리한 그룹에서는 HMGB1의 염색이 세포의 핵과 세포질에서 관찰이 되었다. 이를 통해서, TAT-HMGB1A의 세포내 유입은 췌도 세포가 손상을 입었을 때 방출하는 HMGB1을 현저히 막아준다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: HMGB1과 TAT-HMGB1A의 결합 친화도 확인

7-1. SPR(Surface Plasmon Resonance)

골드 칩(Gold chip)으로는 CMDH 칩을 사용하였고, Reichert SR7500DC system의 장비를 이용하여 측정하였으며, scrubber2 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 사용되는 버퍼는 PBS-T(0.05% Tween 20)이며, 리간드로는 HMGB1 10 μg을 20 μl/min 플로우(flow)로 10분간 칩에 코팅을 시켜주었다. 그 후, TAT-HMGB1A, HMGB1A, TAT-MT, HMGB1 항체를 분해물질(analyte)로 다양한 농도에서 HMGB1과의 결합 유무를 분석하였다. 이때, 사용되는 TAT-MT는 메탈로티오네인(metallothionein)이라는 단백질에 TAT 펩타이드를 붙인 것으로 TAT-HMGB1A와 결합 능력을 비교하기 위한 그룹으로 이용하였다.

	Ka(M^-1S^-1)	Kd(S^-1)	KD
HMGB1A+TAT-HMGB1A	(9.20±4)×10³	(6.91±3)×10^-4	75.1±3 nM
HMGB1+HMGB1A	(1.4±2)×10³	(3.942±3)×10^-3	2.8±3 μM
HMGB1+TAT-MT	-	-	-
HMGB1+HMGB1Ab	(7.298±6)×10⁴	(6.38±9)×10^-5	876.9±7 pM

SPR분석 결과, HMGB1 단백질은 TAT-HMGB1A와 HMGB1A 각각의 단백질과 결합을 하는 것을 알 수 있었다(참조: 표 1 및 도 6). 비록 HMGB1 항체에 비하여 그 결합력은 훨씬 작지만, 이러한 결합을 한다는 것을 밝히는 것은 상당한 의미가 있다. TAT-HMGB1A는 일반 HMGB1A와 비교 했을 때, 다소 결합의 세기가 더 크고 안정적으로 되는 것을 알 수 있었는데, 이때 TAT-MT그룹은 HMGB1과 결합을 하지 않는 것을 보아 이러한 결합은 단순한 TAT가 가지고 있는 (+)charge 때문에 결합이 되는 것이 아니라는 것을 알 수 있었다.

7-2. 웨스턴 블랏을 이용한 결합 테스트

HMGB1 단백질에 TAT-MT, HMGB1A, TAT-HMGB1A 단백질을 1:1의 질량비로 섞고 상온에서 한 시간 반응시켰다. HMGB1, TAT-MT, HMGB1A, TAT-HMGB1A, HMGB1+TAT-MT, HMGB1+HMGB1A, HMGB1+TAT-HMGB1A 단백질 2 μg을 각각 10% 아크릴아마이드 겔에 넣고 SDS-PAGE를 실시하였다. PVDF 막에 SDS-PAGE가 끝난 겔을 넣고 트랜스퍼하였다. 5% 탈지유(skim milk)로 1시간동안 상온에서 블록킹하였다. 토끼 HMGB1 항체로 1:1000으로 희석한 후 1시간 상온에서 반응시켰다. TBS-T로 10분간 세 번 세척 후, 항-토끼 2차 항체로 1:5000으로 희석한 후, 1시간에서 상온 반응시켰다. TBS-T로 10분간 세 번 세척 후, 화학발광 시약(chemiluminescent reagent) 처리 후, 화학발광 이미지(chemiluninescent image)를 촬영하였다(참조: 도 7).

웨스턴 블랏의 결과, 도 7에 나타낸바와 같이 HMGB1+HMGB1A, HMGB1+TAT-HMGB1A의 라인에서만 밴드가 2개가 염색이 됨을 알 수 있었다. 따라서 이는 SPR의 결과와 마찬가지로 각각의 HMGB1A, TAT-HMGB1A 단백질은 HMGB1과 결합한다는 것을 알 수 있다. 더욱이 HMGB1+TAT-MT에서는 밴드가 하나만 관찰되는 것으로 보아 TAT-HMGB1A와 HMGB1A 단백질이 HMGB1과 특이적으로 반응을 한다는 것을 알 수 있다.

실시예 8: 제1형 당뇨를 유도한 누드 마우스에서의 췌도 세포 이식

8-1. 당뇨병 모델

인위적으로 당뇨병을 유도하기 위해 시트르산 버퍼 200 μl에 스트렙토조토신을 누드 마우스의 체중 kg당 200 mg의 비율로 녹였다. 이를 신속히 복강에 주사한 후 1주일 후 혈당을 측정하여 혈당 수치가 이틀 연속 >350 mg/dl 이상인 실험동물을 당뇨병 모델로 사용하였다.

8-2. TAT-HMGB1A를 처리한 췌장소도의 신장 이종이식(xenotransplantation)

당뇨병이 유발된 실험동물을 마취제를 이용하여 마취하였다. 마우스의 왼쪽 신장 위치 부근을 알코올 솜으로 충분히 닦아 준 후, 절개하였다. 신장을 조심스럽게 꺼낸 후, 아무 처리도 하지 않은 일반 췌장소도와 TAT-HMGB1A를 처리한 췌장소도를 각각 200개, 400개씩 헤밀턴 시린지를 이용하여 왼쪽신장 내피 막 사이에 이식하였다. 실험동물의 피부를 이식 후 봉합하였다. 실험동물이 마취에서 깨어날 때까지 적절한 온도 하에서 관찰하였다. 격일로 매일 오후 1시-3시 사이에 췌장소도를 이식 받은 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 얻어 원터치 울트라 혈당 측정 시험지를 사용하여 혈당을 측정하였다. 이식 한 다음 날부터 30일 동안 혈당을 측정하였다.

8-3. 이식 받은 누드 마우스에 대한 체내 포도당 저항성 테스트(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 실험을 통한 혈당 변화량에 따른 반응성 평가

D-글루코오스를 200 mg/ml의 비율로 PBS에 녹였다. 췌장소도를 이식한 ICR-SCID 마우스를 6시간 동안 금식시켰다. PBS에 녹아있는 D-글루코오스를 마우스 체중 g당 10 μl 씩 복강으로 주사하였다. 매 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120분에 마우스의 꼬리정맥에서 혈액을 얻어 원터치울트라 혈당측정 시험지(Johnson & Johnson Lifescan Glucometer, One Touch Ultra)를 사용하여 혈당량을 측정하였다.

8-4. 신장에 이식된 췌장소도의 조직검사

이식한지 30일이 지난 후, 마우스를 희생시켜 신장을 분리하였다. 분리된 신장을 PBS에서 가볍게 헹궈 혈액을 제거하였다. 10% 포름알데히드에 넣은 후 하루 동안 고정하고 파라핀 블락을 제작하였다. 5 μm로 시리얼 섹션한 후, H&E를 통해서 이식된 췌장소도의 위치를 찾았다. 췌장소도가 존재하는 슬라이드 번호 주위 샘플로 인슐린, HMGB1, 6His taq 면역 검사를 시행하였다.

누드마우스는 T세포가 결핍된 쥐로써, 면역반응이 크지 않아 기초적인 세포 이식의 효능을 평가하는데 적합한 동물 모델이다. 일반적으로 당뇨모델의 마우스에서 래트(rat)에서 분리한 췌도 세포를 이식했을 경우 정상혈당으로 조절하기 위한 세포의 수는 대략 400개 정도이다. STZ로 제1형 당뇨병을 유도한 후, 아무것도 처리하지 않은 췌도 세포(untreated)와 TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포 200개와 400개를 각각 왼쪽 신장막에 이식을 하였을 때 일반 췌도 세포의 그룹에서는 200개의 세포를 이식을 해주었을 때 정상혈당을 조절하지 못하는 반면에, TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포의 이식에서는 200개의 췌도 세포를 이식을 해주었음에도 정상 혈당 수치를 계속 유지해 주는 것으로 관찰이 되었다(참조: 도 8). 이는 일반 췌도 세포 이식 그룹은 수술적인 손상에 의하여 염증반응이 진행되어 이식 된 췌도 세포가 대부분 기능을 하지 못하는 반면에, TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포는 이러한 수술적 과정에서 오는 손상에 의한 HMGB1의 작용을 어느 정도 줄여줬기 때문인 것으로 판단된다. 또한, 이식 후 30일째에 시행한 IPGTT에서 TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포 200개의 이식 그룹은 췌도 세포를 400개를 이식해준 그룹들과 비슷하게 체내의 증가된 혈당의 농도를 성공적으로 조절하는 것을 알 수 있었다(참조: 도 8). 뿐만 아니라, TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포는 이식 후 초기 기간인 6시간과 장시간 후인 30일째에도 꾸준하게 인슐린을 분비하는 것을 알 수 있었다. 이때, 췌도 세포에 처리한 TAT-HMGB1A 단백질이 얼마나 췌도 세포내에서 존재하는지 알기 위하여 염색한 6X his tag 염색에서는 이식 초기에는 TAT-HMGB1A가 발견이 되었으나, 30일 이후에는 염색이 되지 않는 것으로 나타났다. 하지만, 이식 후, 초기에 HMGB1에 의한 염증반응이 극대화 되는 시기는 이식 후 6시간 이후이기 때문에 이러한 결과는 큰 영향을 주지 않을 것으로 판단이 된다.

실시예 9: 제1형 당뇨를 유도한 Balb/c 마우스에서의 췌도 세포 이식

9-1. 당뇨병 모델

인위적으로 당뇨병을 유도하기 위해 시트르산 버퍼 200μl에 스트렙토조토신을 Balb/C 마우스의 체중 kg당 200 mg의 비율로 녹였다. 이를 신속히 복강에 주사한 후 1주일 후 혈당을 측정하여 혈당 수치가 이틀 연속 >350 mg/dl 이상인 실험동물을 당뇨병 모델로 사용하였다.

9-2. TAT-HMGB1A를 처리한 췌장소도의 신장 이종이식(xenotransplantation)

당뇨병이 유발된 실험동물을 마취제를 이용하여 마취하였다. 마우스의 왼쪽 신장 위치 부근을 알코올 솜으로 충분히 닦아 준 후, 절개하였다. 신장을 조심스럽게 꺼낸 후, 아무 처리도 하지 않은 일반 췌장소도와 TAT-HMGB1A를 처리한 췌장소도 400개를 헤밀턴 시린지를 이용하여 왼쪽신장 내피 막 사이에 이식하였다. 실험동물의 피부를 이식 후 봉합하였다. 실험동물이 마취에서 깨어날 때까지 적절한 온도 하에서 관찰하였다. 매일 오후 1시-3시 사이에 췌장소도를 이식 받은 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 얻어 원터치 울트라 혈당 측정 시험지(Johnson & Johnson Lifescan Glucometer, One Touch Ultra)를 사용하여 혈당을 측정하였다. 이식 한 다음 날부터 혈당이 >350 mg/dl 이상이 3일 연속이 되면 마우스의 장기를 적출하였다.

9-3. 신장에 이식된 췌장소도의 조직검사

이식 후, 6시간째와 정상혈당을 조절하지 못한지 3일이 된 날에 마우스를 희생시켜 신장을 고정액에 처리하였다. 파라핀 블록을 만든 후, H&E와 인슐린, 6X his tag, HMGB1의 염색을 시행하였다.

	생존 일 수	중앙값(median)±S.E.
무처리(n=8)	3, 5, 6, 5, 6, 7, 8, 7	6±0.54
TAT-HMGB1A(n=8)	12, 8, 3, 13, 12, 9, 10, 13	11±1.19

Balb/C 마우스는 누드 마우스와는 다르게 면역반응이 정상적으로 이루어지고 있는 동물이다. 보통 래트에서 분리한 췌도 세포를 Balb/c 마우스에 이식을 하게 되면, 극심한 염증반응과 면역반응으로 인하여 이식한 췌도 세포가 대부분 사멸이 일어나기 때문에 정상 혈당조절이 일주일을 넘기기 힘들다. 또한, Balb/c 마우스를 이용하면, 췌도 세포를 이식한 후 일어나는 면역반응에 의한 HMGB1과의 작용을 TAT-HMGB1A가 얼마나 줄여 줄 수 있는지를 확인할 수 있다. 상기 표 2 및 도 9를 보면 알 수 있듯이, TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포를 Balb/c 마우스의 왼쪽 신장막에 이식을 하게 되면, 이식된 췌도 세포의 생존율이 일반 췌도 세포의 이식에 비하여 약 2배 정도 증가하는 것을 알 수 있다. 또한 이식 후 6시간째에 HMGB1을 염색을 해본 결과, 일반 췌도 세포에서는 HMGB1의 염색이 이식된 췌도 세포 주변과 세포의 세포질에서 염색이 많이 된 반면에, TAT-HMGB1A를 처리한 췌도 세포의 이식에서는 HMGB1의 염색이 세포의 핵에서 염색이 된 것을 확인 할 수 있었다(참조: 도 10). 이는 TAT-HMGB1A가 이식 후 일어나는 HMGB1을 매개로 하는 염증반응을 상당히 줄여 줄 수 있음을 의미한다.

실시예 10: 췌도 세포 이외의 다른 세포인 췌장암세포에서의 TAT-HMGB1A 전달 확인

10-1. 췌장암 세포에서의 TAT-HMGB1A 생존율 측정

Mia PaCa-2 췌장 세포 주를 96 웰 플레이트에 1X10⁴ 으로 접종하였고, TAT-HMGB1A를 농도 0, 5, 10, 15, 20 μM로 24시간동안 처리하였다. 그 후 CCK-8로 세포의 생존율을 측정하였다.

10-2. TAT-HMGB1A가 췌장암 세포의 증식(proliferation)에 미치는 영향 측정

Mia PaCa-2 세포를 96 웰 플레이트에 5X10³으로 접종하였다. TAT-HMGB1A를 10 μM로 처리하여 1일, 4일, 7일째의 증식률을 측정하였다.

10-3. TAT-HMGB1A의 췌장암세포로의 전달 확인

TAT-HMGB1A를 Alexa 488 형광 염료로 컨쥬게이션하여 10 μM로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척해주고 형광 이미지를 촬영하였다. 전달 효율을 측정하기 위하여 유동 세포 분석법(flow cytometry)을 이용하여 췌장암 세포에 전달된 TAT-HMGB1A를 측정하였다.

Mia PaCa-2 세포는 췌장암의 대표적인 세포 주로 많은 양의 HMGB1을 함유하는 것이 확인이 되었다. 우선 TAT-HMGB1A의 전달이 췌장암 세포의 독성을 주는지를 알아 보기 위하여 TAT-HMGB1A를 농도별로 처리를 해보았다. 도 11a에서 보는 바와 같이 TAT-HMGB1A를 농도별로 처리를 하여도 세포의 독성을 일으키지는 않았다. 또한 10 μM의 TAT-HMGB1A를 지속적으로 세포에 노출을 시켜 세포의 증식률을 측정 해본 결과 아무것도 처리하지 않은 세포와 비슷한 속도의 세포 증식이 일어나고 있음을 확인 할 수 있었다. TAT-HMGB1A가 췌장암 세포에 효과적으로 전달이 되었는지를 알아 보기 위하여 TAT-HMGB1A를 Alexa 488 녹색 형광 염료와 결합을 시킨 후 동일한 농도로 췌장암 세포에 처리를 해본 결과, 대부분의 세포에서 녹색 형광이 나타나는 것을 알 수 있었고, 이를 통하여 TAT-HMGB1A가 효과적으로 전달이 되었음을 알 수 있었다(참조: 도 11b). 유동 세포 분석법을 이용하여 전달 효율을 측정 해본 결과, 95% 이상의 단백질이 췌장암 세포에 전달이 되었음을 알 수 있었고, 이는 상당히 높은 수치의 결과 였다(참조: 도 11c).

실시예 11: 저산소증(hypoxia) 상태에서 췌장암세포에 남아있는 HMGB1의 양 측정

HMGB1 분비 조건 환경에 놓인 췌장암세포에 대한 TAT-HMGB1A 처리 효과를 보기 위한 실험을 실시하였다. Mia PaCa-2 세포에 TAT-HMGB1A를 처리하지 않은 대조군과 TAT-HMGB1A를 10 μM로 24시간 처리한 세포를 준비하였다. 저산소(hypoxia) 챔버에 각 그룹의 세포들을 넣고 저산소 조건(1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂)으로 6시간 처리하였다. 각 그룹의 세포들을 용해시킨 후, 웨스턴 블랏을 시행하였다.

암세포들은 성장하는 과정에서 저산소 조건에 노출이 되게 되고, 이러한 저산소조건은 세포 괴사를 일으켜, 세포에서 HMGB1의 분비를 촉진 시키게 된다. 이러한 현상을 측정해 보기 위하여 Mia PaCa-2 세포 주에 TAT-HMGB1A를 처리하지 않은 그룹과 처리한 그룹에 저산소 조건을 6시간 동안 노출을 하여 세포에 남아있는 HMGB1의 양을 웨스턴을 이용하여 비교를 해보았다. 정상 산소 조건에서는 두 그룹에서 HMGB1의 발현양이 차이가 없다는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만, 저산소 상태에 장시간 노출이 되면 세포 괴사가 일어나 세포로부터 HMGB1이 지속적으로 분비가 되어 세포 밖 주변 환경으로 이동하게 되는데, TAT-HMGB1A를 처리한 췌장암 세포에서는 세포 안에 전달된 TAT-HMGB1A가 세포에서 분비되는 HMGB1과 결합하여 HMGB1의 세포 밖 분비를 억제 시키는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 웨스턴 블랏의 세포 밴드를 통해서 확인이 가능하다(참조: 도 12).

실시예 12: 또 다른 세포인 HUVEC에 미치는 TAT-HMGB1A의 영향

12-1. TAT-HMGB1A가 미치는 세포의 생존율 측정

HUVEC 세포(LONZA, 한국) 4x10⁴개를 96 웰 플레이트에 접종하였다. TAT-HMGB1A를 농도 0, 5, 10, 15, 20, 25 μM로 24시간 동안 처리하였다. CCK-8을 통하여 세포 생존력을 측정하였다.

12-2. TAT-HMGB1A의 HUVEC 세포 전달 확인

Alexa 488 컨쥬게이션된 TAT-HMGB1A를 10 μM의 농도로 HUVEC 세포에 24시간 처리하였다. PBS로 세척 후 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.

TAT-HMGB1A는 HUVEC 세포에서도 농도별로 처리를 하였을 시, 세포의 생존력에는 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다(참조: 도 13a). 또한, Alexa 488 염료를 TAT-HMGB1A와 결합을 시킨 후, HUVEC에 처리를 해보았을 때, TAT-HMGB1A가 HUVEC 세포에도 전달이 가능하다는 것을 Alexa 488 형광을 통해서 알 수 있었다(참조: 도 13b). 유동 세포 분석법을 이용하여 HUVEC 세포로의 전달 효율을 측정을 해본 결과, 95% 이상의 단백질이 HUVEC 세포에 전달이 되었음을 알 수 있었고 이는 상당히 높은 수치의 결과였다(참조: 도 13c).

실시예 13: 세포 침투 분석

매트리겔을 0.2 mg/ml의 농도로 인서트(8 μm pore)에 24시간 동안 코팅하였다. HUVEC 세포 4x10⁵개를 혈청 프리 배지(serum free media)를 이용하여 각 인서트에 옮겨 담았다. 바텀 라인(bottom line)에는 혈청 프리 배지에 VEGF(20 ng/ml), HMGB1(500 ng/ml), HMGB1(500 ng/ml) + TAT-HMGB1A(10 μM)로 각각 처리하였다. 인서트를 바텀(bottom) 용액과 함께 24시간 동안 배양하였다. 세척 후, 4% 파라포름알데히드로 고정한 후, 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 30분간 염색하였다. 침투하지 않은 세포를 제거 후, 사진 촬영을 실시하였다. 메탄올로 염색약을 녹인 후 540 nm에서 흡광도 촬영을 하였다.

VEGF는 대표적으로 HUVEC 세포를 활성화(activation)하는데 사용되는 것으로 본 발명에서는 양성 대조구(positive control)로 사용이 되었다. HMGB1을 500 ng/ml의 농도로 HUVEC 세포에 자극을 주면 VEGF와 마찬가지로 HUVEC 세포의 세포 침투가 일어나는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 여기에 TAT-HMGB1A를 섞어 주게 되면 이러한 HMGB1의 효과를 감소시켜 세포 침투가 감소되는 것을 알 수 있었다(참조: 도 14). 이는 TAT-HMGB1A가 HMGB1에 경쟁적 길항제(antagonist)로 작용하여 생긴 결과로 여겨진다.

실시예 14: 래트 대동맥 고리( aortic ring ) 분석

48 웰에 매트리겔(환원형) 120 μl를 넣고 겔화시켰다. SD-래트에서 대동맥 고리(aortic ring)를 추출하여 48 웰 매트리겔 위에 삽입시켰다. 매트리겔 100 μl를 넣고 다시 겔화시켰다. 혈청 프리 배지에 무 첨가제(no additive), HMGB1(500 ng/ml), HMGB1(500 ng/ml) + TAT-HMGB1A(10 μl)를 각각 넣어 준 후 6일간 관찰하였다.

래트 대동맥 고리 분석 결과 HMGB1 500 ng/ml의 처리는 대동맥 고리 주변에 미세 혈괄의 형성이 매우 많이 일어난 것을 확인 할 수 있었다(참조: 도 15a). 이는 HMGB1이 미세 혈관의 형성을 촉진 시킨다고 말할 수 있으며, 이는 HMGB1이 신생 혈관 생성(angiogenesis)의 중요한 작용을 한다고 할 수 있다. 이때, HMGB1에 TAT-HMGB1A 처리를 하게 되면, 미세혈관(microvessel)이 매우 적게 형성 되는 것을 확인 할 수 있었다. 위 사진의 데이터를 정량화 시켜본 결과, HMGB1을 처리한 경우 대조구와 TAT-HMGB1A를 처리한 그룹보다 미세 혈관의 형성에 있어서 대략 3배 정도 증가된 수치를 보이는 것을 알 수 있었고, 이는 통계적으로 분석해본 결과 유효성이 있는 것으로 나타났다(참조: 도 15b).

실시예 15: HMGB1 의 처리에 따른 HUVEC 세포 내에서의 HMGB1 의 발현 변화

HUVEC 세포를 혈청 프리 배지 조건에서 6시간동안 영양 공급 차단(starvation) 시켰다. HMGB1 500 ng/ml의 농도를 HUVEC 세포에 24시간 처리한 그룹과 TAT-HMGB1A 10 μM을 섞어주어 24시간 동안 처리한 후, 세포 용해를 통해 웨스턴 샘플링하였다. HMGB1 항체를 통해서 웨스턴 블랏을 시행하였다.

HUVEC을 혈청 프리 배지 상태에서 6시간 동안 영양 공급 차단(starvation) 시키면, HMGB1의 발현이 사일런싱(silencing)되어 그 발현의 양이 상당히 줄어들게 된다. 하지만 HMGB1을 500 ng/ml의 농도로 처리를 해주게 되면, HMGB1의 자극에 의해서 HUVEC에서 발현되는 HMGB1의 발현이 증가가 되어 웨스턴 블랏에서 보이는 HMGB1의 밴드가 증가되는 것을 볼 수 있었다. 하지만, HMGB1에 TAT-HMGB1A를 처리를 하게 되면 이러한 발현 역시 억제가 되어 대조구 HUVEC과 비슷한 수준의 HMGB1이 검출되었다(참조: 도 16). 이를 통해서 TAT-HMGB1A는 세포 내부의 HMGB1의 세포 외부로의 방출을 억제하는 것 뿐만 아니라, 세포 외부의 HMGB1의 자극에 의한 세포의 HMGB1의 발현도 억제시킨다는 것을 알 수 있다. 이는 HMGB1의 리셉터인 RAGE나 TLR4를 가진 세포에서 모두 같은 결과를 보일 것으로 예상된다. 대표적으로 췌도 세포의 경우에도 HMGB1의 리셉터를 가지고 있기 때문에 이에 해당이 될 것으로 판단된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

HMGB1A(high mobility group box 1 A domain)를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 거부반응 억제용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 HMGB1A는 PTD(protein transduction domain)가 추가적으로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 PTD는 Tat, Hph1, 페네트라틴(Penetratin), 트랜스포탄(Transportan), VP-22, 양쪽 친매성 펩타이드(Amphipathic peptides), MPG, Pep-1, MAP, SAP, PPTG1, 양이온성 펩타이드(Cationic peptides), 올리고알기닌(Oligoarginine), hCT(9-32), SyrB 및 Pvec으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 PTD는 Tat인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 (a) 이식 전의 세포 전처리 및 (b) 세포가 이식된 객체(subject)에 대한 전신적 투여 중 적어도 하나에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 이식 전의 세포 전처리에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 췌도세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(IPSC)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 질병은 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 조성물로 전처리된 세포를 포함하는 이식용 세포 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 세포는 췌도세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(IPSC)인 것을 특징으로 하는 조성물.