KR101678553B1 - Oligonucleotide kit for detecting Epstein-Bar virus and EBV detecting methods using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Bar virus; EBV)를 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 EBV 검출용 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로서, 엡스타인-바 바이러스를 매우 낮은 농도까지 신속하게 정량적으로 검출할 수 있어, EBV에 의한 질병을 차단하는 효과가 기대된다.The present invention relates to an EBV detection kit comprising primers and probes that can be used to detect Epstein-Bar virus (EBV) using real-time polymerase chain reaction (PCR) The present invention relates to a detection method using the same, and it is possible to quantitatively detect Epstein-Barr virus to a very low concentration in a quantitative manner, and it is expected to have an effect of blocking EBV disease.
Description
본 발명은 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트에 관한 것이며, 상기 키트를 이용하여 생물학적 시료에 존재하는 엡스타인-바 바이러스의 유무를 확인 및 정량적 검출방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a kit for detecting Epstein-Barr virus, and relates to a method for identifying the presence or absence of Epstein-Barr virus present in a biological sample using the kit and a quantitative detection method.
버키트림프종(Burkitt's lymphoma) 환자에게서 처음 발견된 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Bar virus; 이하 'EBV'라고 함)는 인간 허피스 바이러스(human herpes viridae)에 속하는 B 림프종 바이러스(B lymphotropic virus)로 전염성 단핵구증을 일으키며, 버키트림프종, 비인강암, 호즈킨병, 중추신경계 B세포 림프종, 림프세포증식성 등 다양한 임상적 증상을 유발하는 원인체로 그 중요성은 점점 더 커지고 있다.(정재림, 김현숙. Korean J Lab Med, 2000 Jun; 20(03) 320-329)Epstein-Bar virus (EBV), first discovered in patients with Burkitt's lymphoma, is a B lymphotropic virus belonging to the human herpesvirus, It has been reported that the clinical manifestations of various clinical symptoms such as Burkitt's lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, Hodgkin's disease, CNS lymphoma, lymphoproliferative disease are becoming increasingly important as they cause mononucleosis (Jung Jim Jung, 2000 Jun; 20 (03) 320-329)
전염성단핵구증이 EBV의 대표적인 임상적 증상으로 전염성단핵구증의 특징은 전신적 신체 합병증으로 피로감, 무력감, 발열, 인후통 및 전신 림프절 병증으로 나타난다. 또한, 고형장기 또는 조혈모 세포의 이식 이후에 림프구 증식성 질환에 대한 병인과 높은 연관 관계가 있어 혈액 종양환자에게서도 감염의 상태를 확인하는 것이 중요하다고 알려져 있다.(Seungwon Jung et al. Korean J Lab Med 2010; 30: 554-8)Infectious mononucleosis is a typical clinical manifestation of EBV. Characteristic of infectious mononucleosis is systemic physical complication, resulting in fatigue, weakness, fever, sore throat, and systemic lymphadenopathy. In addition, it is known that it is important to confirm the status of infection in hematologic tumor patients because of the high correlation with pathogenesis of lymphoproliferative diseases after transplantation of solid organs or hematopoietic stem cells (Seungwon Jung et al. Med 2010; 30: 554-8)
EBV와 관련된 림프구 증식성 질환의 발생에 관여하는 B 림프구의 기원을 분석하는 것은 장기이식 후의 감염여부 및 이식 시 발생하는 임상적 증상원인을 분석하는데 유용하며, 공여자 EBV의 정량적 분포는 혈중 EBV 부하량과 이식환자로의 전파가능성의 관계를 분석하는데 있어서도 중요한 데이터가 될 수 있다.(Seungwon Jung et al. Korean J Lab Med 2010; 30: 554-8)The analysis of the origin of B lymphocytes involved in the development of EBV-associated lymphoproliferative disorders is useful for analyzing the etiology of clinical signs and symptoms after transplantation and the quantitative distribution of donor EBV is related to the EBV load (Jung et al., 2002), and the role of the transplantation in the development of transplantation.
감염 발생은 경제적인 여건, 위생 상태, 지리적 위치에 따라 차이를 보이는데 전염성 단핵구증의 역학적 관계는 EBV 감염된 환자의 연령과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. EBV 초감염 연령은 위생적 환경에 따라 다르지만 3세에 약 80%, 20세 전후에 90%, 20대 후반에는 거의 100%에서 항체 양성율을 나타낸다, 유아기에 초감염 되면 무증상이나 경미한 증상에 그치는 경우가 많지만, 청년기에 초감염 되면 일부 전연염성 단색구증(infectious mononucleosis, IM)을 일으키고, 때로는 만성 EBV 감염증(chronic EBV infection)이나 일단 감염이 잠재되는 EBV가 재활성화 과정에서 opportunistic B cell lymphoma, 버키트림프종(Burkitt's lymphoma)을 일으킨다. 일차감염 시기에는 말초 B 림프구의 10%가 감염되고, 숙주의 변역 반응 결과 림프구 백만 개 당 감염된 림프구는 몇 개 수준으로 떨어져, 잠복상태(latent state)의 EBV 유전체로 평생 지속된다. The incidence of infection varies according to economic conditions, hygiene status and geographical location. The epidemiological relationship of infectious mononucleosis is known to be related to the age of EBV infected patients. The EBV infection rate differs depending on the hygienic environment, but the positive rate is 80% at 3 years, 90% at around 20 years, and almost 100% in late 20s. When infected with infancy, the symptoms become asymptomatic or mild However, EBV infection, which causes chronic infectious mononucleosis (IM) and sometimes chronic infectious EBV infection or infection, may cause opportunistic B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma (Burkitt's lymphoma). At the time of primary infection, 10% of peripheral B lymphocytes are infected, and as a result of host transformation, infected lymphocytes per million lymphocytes fall to several levels and last for a lifetime as a latent EBV genome.
EBV 감염의 진단은 임상적 증상과 동반하는 말초혈액을 이용한 혈청 검사로 이루어지며, 최근 분자생물학적 진단법에 도입되고 있는 실정이다. 대한민국 특허 제 10-0378942호는 EBV 진단에 대한 특허로 항체를 검출할 수 있는 진단제와 시료 내 EBV 항체를 검출하는 방법을 제시하고 있지만, 이러한 면역학적 분석법을 기반으로 하는 진단법들은 빠른 검사가 가능하다는 장점이 있으나, 낮은 민감도와 감염 정도에 대한 정량검출이 어렵다는 한계점이 있다.
The diagnosis of EBV infection is made by serologic tests using peripheral blood with clinical symptoms and has recently been introduced into molecular biologic diagnosis. Korean Patent No. 10-0378942 discloses a patent for EBV diagnosis and a method for detecting an antibody capable of detecting an antibody and a method for detecting an EBV antibody in a sample. However, the diagnostic methods based on the immunological method can be quickly tested However, there is a limitation in that it is difficult to detect quantitatively the sensitivity and the degree of infection.
EBV 감염에 대한 진단에 있어서, 상기한 바와 같은 문제점인 EBV 검출에서의 낮은 민감도를 극복하고자 하며, 정량적 검출을 수행 할 수 있도록 하는 것이다.
In the diagnosis of EBV infection, it is intended to overcome low sensitivity in EBV detection, which is a problem as described above, and to perform quantitative detection.
본 발명은 EBV 감염의 진단에 있어서, 높은 민감도를 가지고 있어 매우 낮은 농도의 엡스타인-바 바이러스를 신속하게 정량적 검출이 가능한 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 제공한다. The present invention provides a kit for detecting Epstein-Bar virus capable of rapidly quantitatively detecting Epstein-Barr virus at a very low concentration due to its high sensitivity in the diagnosis of EBV infection.
보다 상세하게는 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 엡스타인-바 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는, 서열번호 1로 기재된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2로 기재된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머와 서열번호 3으로 기재된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 제공하고, 이를 이용한 EBV 감염여부에 대한 정량적 검출방법을 제공한다. A primer consisting of the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 2 and the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 3, which can be used for detecting Epstein-Barr virus using real-time polymerase chain reaction Provided is a kit for detecting Epstein-Bar virus including a probe, and provides a quantitative detection method for EBV infection using the kit.
본 발명에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 프라이머 및 프로브와 같은 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성된 분자를 말하며, 프라이머는 자연 발생적(예컨테, 제한 단편으로서) 또는 합성으로 제조된 올리고뉴클레오티드로서, DNA 의존성 또는 RNA 의존성 폴리머라아제와 같은 핵산 증폭제 및 뉴클에오티드의 존재하의 적합한 조건하에 놓일 때 핵산 가닥(주형 또는 표적 서열에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 것을 말한다. Oligonucleotides used in the present invention refer to molecules composed of two or more deoxyribonucleotides or ribonucleotides such as primers and probes, wherein the primers are oligonucleotides that are naturally occurring (e.g., as restriction sites) or synthetically produced oligonucleotides, Refers to a nucleic acid strand that can act as a starting point for the synthesis of a primer extension product complementary to a template or target sequence when placed under suitable conditions in the presence of nucleic acid amplifiers such as DNA-dependent or RNA-dependent polymerases and in the presence of nucleotides .
EBV 검출을 위한 주형 DNA는 상동성이 높은 서열을 표적 서열로 선정하였다.(진뱅크 접근번호; HM366190)(서열번호 4, 도 1 참조) 이를 근거로 1100 내지 1250번째 서열인 81bp의 유전자를 합성해 pGEM-T-Easy 벡터에 클로닝 하였다.(실시예 1 참조)The template DNA for EBV detection was selected as the target sequence with high homology (Jinbank accession number: HM366190) (SEQ ID NO: 4, see Fig. 1). Based on this, 81bp gene of the 1100th to 1250th sequence was synthesized And cloned into the pGEM-T-Easy vector (see Example 1).
표적서열을 실시간 중합효소연쇄 반응으로 증폭하기 위하여 프라이머 및 프로브를 디자인하여 증폭효율이 우수한 후보인 서열번호 1 내지 3을 선정하였다. 비특이적 인 증폭을 야기할 수 있는 GC 함량은 낮추고, 3′ 말단에 티민(thymidine)이 오지 않도록 하며, 적절한 Tm 값을 나타내며, 프라이머가 2차 구조를 형성하지 않도록 디자인 된 것들 중에서 증폭효율이 가장 우수한 것을 선정한 것이다.Primers and probes were designed to amplify the target sequence in a real-time PCR, and SEQ ID NOS. 1 to 3, which are candidates with excellent amplification efficiency, were selected. The GC content that can cause nonspecific amplification is lowered, the thymidine does not come to the 3 'end, the proper Tm value is shown, and the primer is designed so as not to form the secondary structure, .
본 발명에 따른 실시간 중합효소연쇄 반응의 감지는 형광 발색을 통해 이루어지며, 프로브의 양말단에 표지된 염색시약인 형광물질(reporter dye)와 켄쳐물질(quencher dye)을 포함하는 것이 특징이다. 바람직하게는 FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, HEX, JOE, VIC, TET, Alexa Fluor647, Alexa Fluor660, Texas Red, Bodipy630/650, ROX, 또는 BHQ1 중에서 2종이 선택되며, 프로브의 5′ 말단 및 3′ 말단에 표지되며, 더욱 바람직하게는 상기 프로브의 5′ 말단은 형광시약(reporter dye)인 FAM 또는 TAMRA로 표지되고, 3′ 말단은 켄쳐시약(quencher dye)인 BHQ1로 표지되는 것이다.The detection of the real-time PCR reaction according to the present invention is performed through fluorescence coloring and includes a reporter dye and a quencher dye which are labeled at both ends of the probe. Two species are selected from among FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, HEX, JOE, VIC, TET, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Texas Red, Bodipy 630/650, ROX or BHQ1, , More preferably the 5 'end of the probe is labeled with a reporter dye, FAM or TAMRA, and the 3' end is labeled with a quencher dye, BHQ1.
또한 본 발명 키트는 상기 프라이머 및 프로브 이외에 실시간 중합효소연쇄반응법에 이용되는 반응 완충용액, DNA 중합효소, dNTP, 내열성 피로포스파타아제, PPi, 및 안정화제 중에서 선택된 하나이상의 조성물을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기한 본 발명의 키트에 사용되는 조성물은 의약용 또는 연구용으로 시판되는 시약 또는 직접 제조하여 사용하는 것이 모두 사용가능하다. 상기 키트에 포함되는 조성물은 상온, 고온 또는 동결건조가 모두 가능하다. 또한 키트의 형태는 시판되고 있는 웰-플레이드 형태나 튜브에 로딩하여 제작되는 것이 가능하다. 상기 웰-플레이트는 96웰, 384웰 등 제한없이 제작될 수 있는 것이 특징이다. 상기 키트의 보관온도는 상온, 냉장 또는 냉동(-20℃ 또는 -70℃이하) 보관이 가능하지만, 바람직하게는 -20℃에서 보관하는 경우 유효기간이 1년이며, 보관조건에 따라 달라 질수 있다.In addition, the kit of the present invention may further comprise at least one composition selected from a reaction buffer solution, DNA polymerase, dNTP, heat-resistant pyrophosphatase, PPi, and a stabilizer used in the real-time PCR in addition to the primer and the probe desirable. The composition for use in the kit of the present invention can be used either as a reagent commercially available for medicinal use or for research, or as a composition for direct use. The composition contained in the kit may be room temperature, high temperature or freeze-dried. In addition, the kit can be in the form of a commercially available well-plate or tube. The well-plate can be fabricated without limitation, such as 96 wells and 384 wells. The storage temperature of the kit can be stored at room temperature, refrigerated or frozen (-20 ° C or -70 ° C or less), preferably at -20 ° C, and the shelf life is one year. .
본 발명의 키트의 특징은 실시간 중합효소연쇄 반응법에 의해 실시 될 수 있으며, 상기의 키트를 사용하는 것은 EBV 검출을 하는데 있어서, 결과 획득의 신속성, 편리성 및 높은 민감도를 갖는 것이 특징이다.The kit of the present invention can be characterized by real-time PCR, and the use of the kits described above is characterized by rapidity of acquisition, convenience, and high sensitivity in EBV detection.
본 발명에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출방법은 (a) 검체로부터 DNA를 추출하고 정량하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 획득된 DNA 및 본 발명에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응법으로 상기 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 바이러스 DNA의 발현량을 분석하고 EBV 감염정도를 판별하는 단계;를 포함하는 엡스타인-바 바이러스를 검출하는 방법이다.The method for detecting Epstein-Barr virus according to the present invention comprises the steps of: (a) extracting and quantifying DNA from a specimen; (b) amplifying the DNA by real-time PCR using the DNA obtained in step (a) and the kit for detecting Epstein-Barr virus according to the present invention; And (c) analyzing the expression level of the amplified viral DNA and determining the degree of EBV infection.
상기 단계(a)에서 검체로부터 DNA를 추출하는 것은 종래의 방법은 제한없이 사용할 수있으며, UV 측정을 통한 정량을 하거나 또는 종래의 알려진 방법으로 제한없이 사용할 수 있다. The method of extracting DNA from the sample in step (a) can be used without limitations in the conventional method, and can be quantitatively determined by UV measurement or can be used without limitation in known methods known in the art.
본 발명의 EBV 검출방법에서 사용될수 있는 검체는 전혈(whole blood), 혈장,혈청,적혈구, 백혈구, 혈소판, 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부, 호흡관, 장관, 소화관들의 외부 분비물, 척수액, 림프액, 체액, 또는 조직 등에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 혈장 또는 혈청을 이용하는 것이다.
The sample that can be used in the EBV detection method of the present invention may be a whole blood, plasma, serum, red blood cells, white blood cells, platelets, feces, urine, tears, saliva, skin, respiratory tract, Lymph fluid, body fluid, tissue, or the like is preferably used. Most preferably plasma or serum.
본 발명은 EBV 검출용 키트에 관한 것이고, 상기 키트를 이용한 EBV의 검출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 EBV 검출용 키트에 있어서 EBV 특이성을 갖는 신규한 프라이머와 프로브를 포함하는 키트를 제공하는 것이며, 본 발명에 따른 키트를 이용한 EBV의 검출방법에 있어서도, EBV 감염여부 뿐만 아니라 감염의 정도를 정량적으로 제시할 수 있는 것이다. The present invention relates to an EBV detection kit, and a method of detecting EBV using the kit. More particularly, the present invention provides a kit comprising a novel primer and a probe having EBV specificity in an EBV detection kit, and in the method of detecting EBV using the kit according to the present invention, not only EBV infection but also the degree of infection Can be quantitatively presented.
본 발명의 EBV 검출용 키트는 실시간중합효소연쇄 반응에 사용되는 반응물을 건조하여 제조된 것이 특징이다. 상기 키트는 반응물이 용액상태로 보관 하였을 때와 비교하면, 건조상태의 반응물은 유효기간이 길며, 실험과정을 간소화하여 사용자 편의성을 극대화할 수 있고, 실험자 실수에 의한 오차의 가능성을 현저히 감소 시킬수 있다는 장점이 있다. 무엇보다도, 종래의 EBV 진단에서 있어서 낮은 민감도를 해결하여 본 발명에 따른 EBV 검출용 키트를 활용한 EBV 검출은 높은 민감도를 갖는 정량적 결과를 획득할 수 있으므로 EBV 감염에 대한 진단에 있어서 보다 정확한 결과를 제공할 수 있게 한다.
The EBV detection kit of the present invention is characterized in that the EBV detection kit is prepared by drying a reaction product used in real-time PCR. As compared with the case where the reactants are stored in a solution state, the kit can maximize the user convenience by simplifying the experimental procedure and the possibility of errors due to the operator errors, There are advantages. Above all, since EBV detection using the EBV detection kit according to the present invention solves the low sensitivity in the conventional EBV diagnosis, it is possible to obtain a quantitative result with a high sensitivity, so that a more accurate result is obtained in the diagnosis of EBV infection .
도 1은 주형 DNA의 상동성을 나타낸 도면이다. 빨간색으로 표시된 부분은 선택된 프라이머 및 프로브가 포함된 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 검출범위를 확인하기 위하여, 주형 DNA의 농도(101 내지 1010 (copies/rxn))별 실시간 중합효소연쇄반응 결과를 나타낸 도면이다. (a)는 실시간 중합효소연쇄반응 그래프이고, (b)농도변화에 따른 Ct값의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 키트에 대한 재현성 평가로 3번의 배치에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프와 획득된 Ct 값의 표준편차(STDEV) 및 변동계수(CV)를 나타낸 것이다.
도 4는 본발명 EBV 검출용 키트의 검출한계를 나타낸 그래프이다.
도5는 본 발명의 EBV 검출용 키트의 프라이머 및 프로브인 실시예와 선정되지 않은 후보군인 비교군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응 결과를 비교한 그래프이다. Fig. 1 is a diagram showing the homology of the template DNA. The area marked in red indicates the location of the selected primer and probe.
FIG. 2 is a diagram showing the results of a real-time PCR reaction according to the concentration (10 1 to 10 10 (copies / rxn)) of the template DNA in order to confirm the detection range of the present invention. (a) is a real time PCR chain reaction graph, and (b) is a graph showing a change in Ct value according to concentration change.
Figure 3 shows a graph of the real time PCR reaction for three batches with the reproducibility evaluation for the kit of the present invention and the standard deviation (STDEV) and the coefficient of variation (CV) of the obtained Ct values.
4 is a graph showing detection limits of the EBV detection kit of the present invention.
FIG. 5 is a graph comparing the results of real-time PCR for the primers and probes of the EBV detection kit of the present invention and the non-selected candidate group.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and comparative examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments.
실시예 1. EBV 바이러스 주형 DNA의 제조Example 1. Preparation of EBV virus template DNA
본 발명에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응법(real time PCR)으로 EBV의 정량적 검출을 시험하기 위한 주형 DNA를 제조하였다. Template DNA for the quantitative detection of EBV was prepared by real-time PCR using a kit for detecting Epstein-Barr virus according to the present invention.
EBV 검출을 위한 주형 DNA는 상동성이 높은 서열을 선택하였으며(도 1 참조), 이에 대한 상동성 분석을 통하여 변이가 없는 부분을 표적 서열로 선택하고, 선택된 프라이머의 조합을 이용하여 표준염기 서열정보(진뱅크 접근번호; HM366190)를 근거로 1100 내지 1250번째 서열인 81 bp의 유전자를 합성하였고(Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203), 이를 pGEM-T-Easy 벡터(Cat: A1360, 프로메가(Promega)사, 미국)에 클로닝하였다. The template DNA for EBV detection was selected with high homology (see FIG. 1). Through the homology analysis of the template DNA, the region without the mutation was selected as the target sequence, and using the combination of the selected primers, (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203) was synthesized using the pGEM-T-Easy vector (GenBank Accession No. HM366190) Cat: A1360, Promega, USA).
클로닝 방법은 프로메가(Promega)사에서 제공된 실험법에 따라 진행하였으며, E. coli 만능세포(competent cell)는 HIT-DH5a(Real Biotech Corporation, 대만) 제품을 사용하였으며, 준비된 벡터(vector)를 리얼바이오텍사(Real Biotech Corporation)에서 제공하는 실험방법에 따라 형질전환을 진행하였다. E. coli competent cells were obtained from HIT-DH5a (Real Biotech Corporation, Taiwan), and the prepared vector was transferred to Real Biotechnology Co., Ltd. Transformation was carried out according to the experimental method provided by Real Biotech Corporation.
준비된 만능세포는 앰피실린, IPTG, X-Gal이 도포된 LB 평판배지 상에 도말한 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양이 완료된 평판배지 상의 흰 콜로니를 취하여 다시 LB 액체 배지에서 16시간 정도 증균 배양한 후 원심 분리하여 상층액은 버리고, 플라스미드 DNA 추출 키트(Accuprep plasmid DNA prep kit, 바이오니아사, 한국)를 사용하여 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA는 UV 분광계(Shimazu사, 일본)로 농도와 순도를 측정하였다. 순도가 1.8∼2.0 사이인 것을 확인하였고, 농도 측정 결과를 바탕으로 DNA 복제 개수(copy number)를 아래의 공식에 의하여 계산하였다.
The prepared pluripotent cells were plated on LB plate medium coated with ampicillin, IPTG, X-Gal, and cultured at 37 ° C for 16 hours. The white colony on the culture plate was taken and cultured for 16 hours in LB liquid medium. After centrifugation, the supernatant was discarded and the pellet was extracted using a plasmid DNA preparation kit (Bioneer, Korea) The plasmid DNA was extracted from the plasmid DNA. Plasmid DNA was measured for concentration and purity using a UV spectrometer (Shimazu, Japan). The purity was confirmed to be between 1.8 and 2.0, and the copy number of DNA was calculated by the following formula based on the result of the concentration measurement.
DNA 복제 개수(copy number) = {6.02× 1023 × 농도}/{(3015bp+80)× 660} [식 1]
DNA copy number = {6.02 × 10 23 × concentration} / {(3015 bp + 80) × 660}
(상기 농도는 UV 분광계로 측정된 농도(g/㎖)이며; 3015 bp는 T-easy vector의 크기이고; 80 bp는 EBV 주형 DNA의 크기이고; 1bp=660Da이다. )
(Concentration is the concentration (g / ml) measured by UV spectrometer; 3015 bp is the size of the T-easy vector; 80 bp is the size of the EBV template DNA; 1 bp = 660 Da).
주형 DNA 복제 개수를 계산한 다음, 1X TE 완충용액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)으로 10배 희석하여 사용 시까지 -70℃에 보관하였다.
The number of template DNA copies was calculated and then diluted 10 times with 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) and stored at -70 ° C until use.
실시예 2. EBV 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 선정Example 2. Selection of primers and probes for EBV detection
EBV 특이 프라이머 및 프로브의 선정은 실시예 1에서 선택한 유전자 서열 중, 상동성이 가장 높고, 증폭효율이 가장 우수하며, 증폭 산물이 100 bp 전후에 가장 가깝게 선택되어 질 수 있는 서열을 이용하였다. 정방향의 프라이머(서열번호 1)는 표준염기서열정보(GeneBank 접근번호; HM366190)의 1145 bp 내지 1168 bp의 염기서열 범위를 채택하였으며, 역방향의 프라이머(서열번호 2)는 1207 bp 내지 1235 bp 의 염기서열 범위를 채택하였다. 채택 기준은 Tm 값이 55℃ 내지 60℃ 범위에 포함되고, 길이는 80 bp 내지 85 bp에 포함되는 염기서열 범위를 포함하는 것이다.Selection of EBV-specific primers and probes was performed using the sequences selected from the gene sequences selected in Example 1 that have the highest homology, the highest amplification efficiency, and the amplification products that can be selected closest to about 100 bp. The forward primer (SEQ ID NO: 1) adopts the base sequence range of 1145 to 1168 bp of the standard sequence information (GeneBank Accession No. HM366190) and the reverse primer (SEQ ID NO: 2) adopts the base sequence of 1207 to 1235 bp Sequence coverage was adopted. Adoption criteria include those in which the Tm value is in the range of 55 占 폚 to 60 占 폚 and the length is in the range of 80 to 85 bp.
프로브의 선정은 표준염기서열정보(GeneBank 접근번호; HM366190)의 1185 bp내지 1206 bp의 염기서열 범위를 채택하였으며, 이는 도 1의 상동성 결과를 근거로 하여 염기변이가 최소화 될 수 있으며, Tm 값이 55℃내지 60℃범위에 포함되고, 길이가 80 bp내지 150 bp 범위에 포함되는지 여부를 기준으로 하였다. (표 1 참조)
Selection of the probes employs a base sequence range of 1185 bp to 1206 bp of the standard sequence information (GeneBank Accession No. HM366190), which can minimize the base mutation based on the homology result in Fig. 1, Was included in the range of 55 占 폚 to 60 占 폚, and the length was included in the range of 80 to 150 bp. (See Table 1)
표 1. EBV 감염여부를 검출하기 위한 프라이머와 프로브로 채택된 올리고뉴클레오티스 서열Table 1. Primer to detect EBV infection and oligonucleotide sequence adopted as probe
실시예 3. EBV 검출용 키트의 제작.Example 3 Preparation of EBV detection kit.
EBV 검출용 키트를 제작은 10× TE 완충용액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA), 2.5U Taq DNA 폴리머라아제(polymerase) , 20mM dNTP, 내열성 피로포스파타제(thermostable pyrophosphatase), PPi 및 안정화제(α-MG, trehalose, Tween 20)로 구성된 조성물을 혼합하고, 상기 실시예 2에서 채택된 프라이머(서열번호 1 및 2)와 프로브(서열번호 3)를 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물은 96웰 플레이트에 로딩하고 건조하여 EBV 검출용 키트 제작를 완성하였다.
EBV detection kit was prepared using 10 × TE buffer solution (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA), 2.5 U Taq DNA polymerase, 20 mM dNTP, thermostable pyrophosphatase, PPi and stable (Α-MG, trehalose, Tween 20) were mixed, and the mixture was prepared by adding the primers (SEQ ID NOs: 1 and 2) and the probe (SEQ ID NO: 3) adopted in Example 2 above. The mixture was loaded on a 96-well plate and dried to complete the kit for EBV detection.
실시예 4. EBV 검출용 키트 검출범위의 평가Example 4 Evaluation of detection range of kit for EBV detection
상기 실시예 3에서 제작된 EBV 검출용 키트를 이용한 EBV 검출범위를 평가하기 위해, 상기 실시예 1에서 준비된 각 농도의 EBV 주형 DNA를 키트에 투여하고, 총 용량이 50㎕가 되도록 하였다. 총 용량 50㎕ 혼합액을 기준으로 하였을대 키트에 포함된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 농도는 각각 15 pmole이 되도록 하는 것이 특징이다. 이와같이 준비된 키트의 검출범위는 실시간 중합효소연쇄반응법으로 확인하였다. 구체적으로는 상기 실시예 1에 따른 EBV 주형 DNA는 높은 농도에서 낮은 농도로 단계적으로 희석하여 10개 구간으로 준비하였다(1× 101~ 1× 1010 copies/rxn). 실시간 중합효소연쇄반응은 엑시사이클러 실시간중합효소연쇄반응 시스템(ExiCyclerTM Real-Time PCR System, Bioneer사, 한국)을 이용하였다. 구체적으로, 실시간 중합효소연쇄반응 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 5초, 55℃에서 5초씩 45 사이클 반응시켰다. 증폭된 형광값은 각 사이클(cycle)이 진행됨에 따라 55℃ 30초 반응 후에 1회씩 지속적으로 측정되었다. (도 2 참조) 이때, 내부기준(internal control)유전자는 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus; TMV) DNA 서열을 사용하였다.
In order to evaluate the EBV detection range using the EBV detection kit prepared in Example 3, the EBV template DNA of each concentration prepared in Example 1 was administered to the kit so that the total volume was 50 μl. The concentration of the forward primer, the reverse primer and the probe contained in the kit was 15 pmole, respectively, when the total volume was 50 μl. The detection range of the prepared kit was confirmed by real-time PCR. Specifically, the EBV template DNA according to Example 1 was diluted stepwise from a high concentration to a low concentration to prepare 10 sections (1 × 10 1 to 1 × 10 10 copies / rxn). Real-time PCR was performed using Exisycler real-time PCR (ExiCycler ™ Real-Time PCR System, Bioneer, Korea). Specifically, the real-time PCR reaction conditions were denatured at 95 ° C for 5 minutes, followed by 45 cycles of reaction at 95 ° C for 5 seconds and at 55 ° C for 5 seconds. The amplified fluorescence value was continuously measured once at 55 ° C for 30 seconds as the cycle progressed. (See FIG. 2). At this time, the internal control gene used the tobacco mosaic virus (TMV) DNA sequence.
실시예 5. EBV 검출용 키트의 재현성 평가Example 5: Evaluation of reproducibility of EBV detection kit
재현성 평가는 실시예 3과 동일한 방법으로 3번 반복 실험하였다. 반복실험 결과는 하기 표2와 도 3에 나타내었다. 제시된 바와 같이 표준편차(STDEV) 및 변동계수(CV)가 유효한 값으로 나타났다. The reproducibility evaluation was repeated three times in the same manner as in Example 3. The results of the repeated experiments are shown in Table 2 and FIG. As shown, the standard deviation (STDEV) and the coefficient of variation (CV) were valid values.
표 2. EBV 검출용 키트의 재현성을 평가하기 위해, 농도별로 3번 반복 실험하여 획득한 Ct값을 나타낸 것이다.Table 2 shows the Ct values obtained by repeating the experiment three times for each concentration in order to evaluate the reproducibility of the EBV detection kit.
실시예 6. EBV 검출용 키트의 정밀도 평가Example 6. Evaluation of precision of EBV detection kit
본 발명에 따른 EBV 검출용 키트의 정밀도를 평가하기 위해서 3단계의 주형 DNA 농도를 103, 105, 107 copies/reaction으로 선택하고 시험내분석(intra-assay), 시험간분석(inter-assay), 제품간분석(inter-batch) 및 8일 반복 검사를 통하여 Ct의 표준편차(STDEV) 및 변동계수(CV)를 계산하여 정밀도를 평가하였다.(표 3 참조)In order to evaluate the accuracy of the EBV detection kit according to the present invention, the template DNA concentration in the three stages was selected as 10 3 , 10 5 , and 10 7 copies / reaction, and intra-assay, inter- (STDEV) and coefficient of variation (CV) were calculated and evaluated for accuracy (see Table 3), using the inter-assay, inter-batch and 8-
시험내 분석(intra-assay)은 동일 실험자가 동일 배치(batch)로 생산된 키트를 이용하여 1회 실험할 때 4번 반복하여, 3회 분석하였으며, 시험간 분석(inter-assay)는 상기 시험내 분석과 동일한 방법으로 서로 다른 3인의 실험자가 분석하였고, 제품간 분석(inter-batch)은 키트의 생산 배치 서로 다른 것을 이용하여 동일 실험자가 분석하였다.
The intra-assay was repeated three times when the same experiment was performed once using the same batch of the kit, and the inter-assay was carried out in the same manner as described above In the same way as my analysis, three different experimenters were analyzed, and inter-batch analysis was performed by the same experimenter using different production batches of the kit.
표 3. EBV 검출용 키트의 정밀도 평가를 위한 시험내 분석(intra-assay), 시험간 분석(inter-assay), 제품간 분석(inter-batch) 및 8일 반복 검사를 통하여 획득된 Ct의 표준편차(STDEV)와 변동계수(CV, %)를 나타낸 표이다.Table 3. Standard of Ct obtained through intra-assay, inter-assay, inter-batch and 8-day repeated testing for the precision evaluation of EBV detection kit (STDEV) and coefficient of variation (CV,%).
실시예 7. EBV 검출용 키트의 검출한도 평가Example 7. Detection limit of EBV detection kit
본 발명 EBV 검출용 키트의 '검출한도'를 평가하기 위해서 'The 1st WHO international Standard for Epstein-Barr virus (EBV)' 패널을 이용하여 높은 농도에서 낮은 농도로 단계 희석하여 준비하였다. 실시 예 3의 과정과 동일하게 증폭 구성물을 준비하고 각 농도의 패널을 주입하여 형광값을 측정하였으며, 통계 분석을 위하여 각 농도별로 32 반복 검사를 수행하였다. 실험을 통하여 얻어진 결과값을 프로빗(Probit) 분석을 통하여 통계 분석을 수행하였고, 95% 이상 측정 검출 가능한 농도를 검출 한도로 정하였다. (도 4 참조)
In order to evaluate the 'detection limit' of the EBV detection kit according to the present invention, it was prepared by diluting the EBV with a high concentration at a low concentration using a 'The 1st WHO International Standard for Epstein-Barr virus (EBV)' panel. Amplification constructs were prepared in the same manner as in Example 3, fluorescence values were measured by injecting panels of respective concentrations, and 32 repeated tests were performed for each concentration for statistical analysis. The results obtained from the experiment were analyzed by Probit analysis, and the detection limit of 95% or more was defined as the detection limit. (See Fig. 4)
실시예 8. EBV 검출용 키트의 보관 안정성 평가Example 8. Evaluation of Storage Stability of EBV Detection Kit
본 발명에서 제공하는 EBV 검출용 키트의 보관 안정성을 평가하기 위해서 상기 실시예 5와 동일하게 주형 DNA 농도를 103, 105, 107 copies/reaction으로 선택하고 7일간 40℃의 온도에서 보관한 후 1일 간격으로 실시예 3과 동일한 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하여 성능을 평가하였다. 본 실험과정에서 얻은 결과는 제품의 보관 온도조건을 위한 가속 안정성을 위해서는 아레니우스 식(Arrhenius equation)에 기반하여 예측되는 보관 안정성을 확인하였다. 본 발명 키트는 -20℃ 이하 보관 시 유효기간이 1년으로 채택되었다.
In order to evaluate the storage stability of the EBV detection kit provided in the present invention, the template DNA concentration was selected as 10 3 , 10 5 , and 10 7 copies / reaction in the same manner as in Example 5 and stored at a temperature of 40 ° C. for 7 days And the performance was evaluated by performing a real-time PCR in the same manner as in Example 3 at intervals of one day. The results obtained in this experiment confirmed the storage stability predicted based on the Arrhenius equation for the accelerated stability for the storage temperature condition of the product. The kit of the present invention was adopted for a period of one year when stored below -20 ° C.
비교예 1. 본 발명에 따른 EBV 검출을 위한 프라이머 및 프로브로 선정되지 않은 비교군 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄 반응Comparative Example 1. Real-time polymerase chain reaction (PCR) using primers and probes of Comparative Group not selected as primers and probes for EBV detection according to the present invention
비교예에 사용된 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄 반응은 실시예 4와 동일한 구성 및 방법으로 실시하여 결과를 비교하였다. The real-time PCR reaction using primers and probes used in the comparative examples was carried out by the same constitution and method as in Example 4, and the results were compared.
비교예에서 사용된 프라이머 및 프로브 서열은 하기와 같다. 본 비교에서는 프라이머와 프로브로서의 조건을 만족하여 디자인된 서열을 비교예로서 사용하였다. 본 발명에서 채택된 프라이머와 프로브와 비교하면 비교예의 Ct 값과 curve의 강도(intensity)가 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다. (도 5 참조)
The primer and probe sequences used in the comparative examples are as follows. In this comparison, a designed sequence satisfying the conditions as a primer and a probe was used as a comparative example. Compared with the primers and probes adopted in the present invention, it was confirmed that the Ct value of the comparative example and the intensity of the curve were inferior. (See Fig. 5)
표 4. 비교예로 사용된 올리고뉴클레오티드 서열.Table 4. Oligonucleotide sequences used as comparative examples.
<110> Bioneer
<120> olignucleotide kit for detecting Epstein-bar virus and EBV
deteting methods using the same
<130> 12P0430
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA primer
<400> 1
gcgagcaatc ggacatttg 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA primer
<400> 2
ggtagccgtt cgtgtgataa tga 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA probe
<400> 3
ttggcacggc ccccaagaca 20
<110> Bioneer
<120> olignucleotide kit for detecting Epstein-bar virus and EBV
deteting methods using the same
<130> 12P0430
<160> 3
<170> Kopatentin 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA primer
<400> 1
gcgagcaatc ggacatttg 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA primer
<400> 2
ggtagccgtt cgtgtgataa tga 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA probe
<400> 3
Claims (7)
상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응법에 이용되는 반응 완충용액, DNA 중합효소, dNTP, 내열성 피로포스파타아제, PPi 및 안정화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트. The method according to claim 1,
Wherein the kit further comprises at least one selected from a reaction buffer solution, DNA polymerase, dNTP, heat-resistant pyrophosphatase, PPi, and a stabilizer used in a real-time PCR.
상기 프로브의 양 말단은 염색시약으로 표지된 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트.The method according to claim 1,
Characterized in that both ends of the probe are labeled with a staining reagent.
상기 염색시약은 FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, HEX, JOE, VIC, TET, Alexa Fluor647, Alexa Fluor660, Texas Red, Bodipy630/650, ROX 또는 BHQ1 중에서 2종이 선택되며, 각각은 프로브의 5′ 말단 및 3′ 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트.The method of claim 3,
Two of the above dyeing reagents are selected from FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, HEX, JOE, VIC, TET, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Texas Red, Bodipy 630/650, ROX or BHQ1, 3 ' terminal of said Epstein-Barr virus.
상기 프로브의 5′ 말단은 형광시약(reporter dye)인 FAM 또는 TAMRA으로 표지되고, 3′ 말단은 켄쳐시약(quencher dye)인 BHQ1로 표지되는 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트. 5. The method of claim 4,
Wherein the 5 'end of the probe is labeled with a reporter dye, FAM or TAMRA, and the 3' end is labeled with a quencher dye, BHQ1.
(b) 상기 (a) 단계에서 획득된 DNA 및 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 DNA를 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 바이러스 DNA의 발현량을 분석하여 EBV 감염정도를 판별하는 단계;를 포함하는 엡스타인-바 바이러스의 검출방법.(a) extracting and quantifying DNA from a specimen;
(b) amplifying the DNA by real-time PCR using the DNA obtained in step (a) and the kit for detecting Epstein-Barr virus according to any one of claims 1 to 5; And
(c) analyzing the expression level of the amplified virus DNA to determine the degree of EBV infection.
상기 검체는 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스의 검출방법.The method according to claim 6,
Wherein the specimen is plasma or serum.
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