KR101675814B1 - 체세포배 유도 기술을 이용한 루브라참나무의 무성번식 방법 - Google Patents

체세포배 유도 기술을 이용한 루브라참나무의 무성번식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 채취한 루브라참나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계 및 상기 유도된 체세포배를 뿌리 유도용 배지에서 배양하여 체세포배를 발아시켜, 뿌리 발아체를 발생시키는 단계를 포함하는 루브라참나무의 무성번식 방법에 관한 것으로, 본 발명의 무성번식 방법에 의하면, 단시간 내에 루브라참나무의 클론묘 생산이 가능하고, 차후에는 병충해 등에 강한 외래 유전자의 삽입 방식으로 루브라참나무의 신품종 육종에도 동일하게 적용될 수 있다.

Description

체세포배 유도 기술을 이용한 루브라참나무의 무성번식 방법{Method for vegetative propagation of Quercus rubra using somatic embryogenesis technique}
본 발명은 루브라참나무의 무성번식 방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 채취한 루브라참나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계 및 상기 유도된 체세포배를 뿌리 유도용 배지에서 배양하여 체세포배를 발아시켜, 뿌리 발아체를 발생시키는 단계를 포함하는 루브라참나무의 무성번식 방법에 관한 것이다.
우리나라는 전국토의 64%를 차지할 정도로 많은 산림면적을 보유하고 있으며, 참나무류는 활엽수 가운데 우리나라에서 가장 넓게 분포하는 향토 수종으로 우리나라 전체 산림면적의 28%에 해당하는 170만ha의 분포면적을 차지하고 있다.
우리나라의 참나무류 가운데 해발 300m 이하에 분포하는 상수리나무와 굴참나무는 재질적으로는 용재로 이용할 수 없는 수종으로 알려져 있으나 표고 자목용으로는 가장 선호되는 수종이다.
반면에, 해발 300m 이상에서 분포하는 신갈나무, 졸참나무 및 갈참나무는 각종 목공예 등 가공용재로 이용이 가능하나, 줄기가 통직하지 못하고 대경재로의 생산이 어려워, 국내 참나무류를 목재로 이용하는 양은 그리 많지 않은 실정이다.
전 세계적으로 중부 온대지방을 중심으로 생육하고 있는 참나무류는 380여종이 알려져 있으며, 이중 북미에서 분포하는 참나무류는 78종이 있다. 이들 가운데 부가가치가 높은 무늬목, 가구재, 마루판재 등 특수목재로 사용되는 수종은 북미의 루브라참나무 (Quercus rubra L.)와 알바참나무 (Q. alba), 유럽의 로보어참나무 (Q. robur)와 패트리아참나무 (Q. petraca L.) 등 4개 수종에 불과하다.
이들 가운데 루브라참나무는 미국 중동부 및 캐나다 온타리오주 남동쪽의 해발 1,700m까지 분포하는 낙엽활엽수로 빠른 생장과 입지 적응력이 뛰어난 수종으로서, 추위에도 강하여 40℃ 이상에서도 잘 견디며, 원산지 적지에서는 수고 40m, 흉고 직경 1.5m까지 자라는 거목으로 천연림에서 벌채목의 평균 수고는 20∼30m, 흉고 직경은 50∼90cm에 이른다.
또한, 루브라참나무는 큰 나무를 이식해도 활착율이 높은 것은 물론이고, 단풍이 아름다워 조경수나 환경수로도 적합한 수종으로 알려져 있다.
루브라참나무의 조직배양 연구는 그리 많지 않은데, 3개월생 실생묘와 30~40년생 성목가지의 눈으로부터 새로운 신초지 유도 (Tree Physiol 12: 107-117, 1993), 성목으로부터 유도된 신초지로부터 발근유도 (Tree Physiol 16: 673-680, 1996), 8주 실생묘의 자엽절간조직으로부터 신초지유도 및 발근 (In Vitro Cell Dev Biol-Plant 45: 474-482, 2009) 및 6~7년생의 나무로부터 신초지 유도 (Plant Cell Tiss Org Cult 98: 135-145, 2009) 등의 기관유도에 관한 논문이 보고 되었다.
한편, 체세포배 발생에 관한 연구 보고는 현재까지 단 두 편만이 보고되었는데, 그중 한편은 실생묘의 엽절편으로부터 체세포배를 유도하고 그로부터 발아시켜 신초만을 유도하였고 (Plant Growth Reg. 20: 67-73, 1996), 다른 한편은 미숙구과의 배를 배양하여 체세포배를 유도하고 식물체까지 재분화에 성공하였다 (Plant Cell Tiss. Org. Cult. 7: 141-149, 2009).
그러나, 위의 두 편의 연구보고 외에는 더 이상의 체세포배 발생에 관한 연구보고는 없는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 체세포배의 유도를 통하여 우수한 형질의 루브라참나무를 대량생산할 수 있는 루브라참나무의 무성번식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 채취한 루브라참나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, (b) 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계, 및 (c) 상기 유도된 체세포배를 뿌리 유도용 배지에서 배양하여 체세포배를 발아시켜, 뿌리 발아체를 발생시키는 단계를 포함하는 루브라참나무의 무성번식 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법은 단시간 내에 루브라참나무의 클론묘 생산이 가능하고, 차후에는 병충해 등에 강한 외래 유전자의 삽입 방식으로 루브라참나무의 신품종 육종에도 동일하게 적용될 수 있다.
도 1은 루브라참나무 미숙종자를 7월8일에 채취하여 양분한 상태를 나타내는 사진이다.
도 2는 루브라참나무 미숙종자를 7월20일에 채취하여 양분한 상태를 나타내는 사진이다.
도 3은 다양한 형태로 유도된 체세포배를 나타낸 사진이다.
본 발명은 (a) 채취한 루브라참나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, (b) 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계, 및 (c) 상기 유도된 체세포배를 뿌리 유도용 배지에서 배양하여 체세포배를 발아시켜, 뿌리 발아체를 발생시키는 단계를 포함하는 루브라참나무의 무성번식 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법에서, 상기 루브라참나무 종자의 채취는 경기도 수원 지방을 기준으로, 7월 15일~7월 25일, 바람직하게는 7월 20일경에 수행할 수 있다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법에서, 상기 (a) 단계는 상기 채취한 루브라참나무 종자의 표면 살균을 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법에서, 상기 표면 살균은 상기 종자의 표면을 세척한 후, 에탄올에 0.5분~5분간 침지한 다음, 상기 종자의 표면을 화염살균하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법에서, 상기 체세포배 유도용 배지는 하기 표 1과 같은 성분 및 함량으로 조성되는 MS(Murashige and Skoog) 기본 배지에, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 또는 인돌부틸산(IBA) 0.1mg/L~1.5mg/L 및 6-벤질아미노퓨린 0.1mg/L~1.0mg/L을 포함할 수 있다.
Figure 112014063503118-pat00001
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법에서, 상기 2,4-디클로로페녹시아세트산은 0.1mg/L~1.0mg/L 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법에서, 상기 인돌부틸산은 0.5mg/L~1.5mg/L 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법에서, 상기 뿌리 유도용 배지는 상기 MS(Murashige and Skoog) 기본 배지에, 인돌부틸산 0.1mg/L~1.5mg/L 및 6-벤질아미노퓨린 0.1mg/L~1.0mg/L을 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법은 상기 (c) 단계에 의해 발생된 뿌리 발아체를 토양에 이식하여 재분화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 루브라참나무의 무성번식 방법에 의해 무성번식된 루브라참나무를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 종자의 채취
실험 재료인 루브라참나무 종자의 미숙자엽은 국립산림과학원 수원 클론보존원에서 육성중인 루브라참나무 4 개체를 대상으로 하였으며, 종자의 채취는 7월 8일 및 7월 20일에 각각 이루어졌다.
<실시예 2> 배양을 위한 표면살균
종자의 표면 세척은 먼저 주방용 세재를 3-4방울 첨가한 수돗물로 종자를 표면 세척한 다음, 무균대로 가져와 95%(w/v) 에탄올에 침지한 후 핀셋을 이용하여 한 개씩 꺼내어 종자 표면의 화염 살균을 실시하였다.
그 후 21호 수술용 메스날을 이용하여 미숙배가 포함되어 있는 부위만을 남기고 나머지는 버린 후 다시 11호 매스날을 이용하여 미숙배 만을 추출하여 체세포배의 유도에 사용하였다.
<실시예 3> 체세포배의 유도를 위한 배지 조성 및 조제
하기 표 3에서 보는 바와 같이, 체세포배 유도를 위한 배지는 상기 표 1과 같은 조성의 MS(Murashige and Skoog) 기본 배지에, 옥신(auxin)으로 2,4-D 및 인돌부틸산(IBA) 및 사이토키닌(cytokinin)으로 6-벤질아미노퓨린(BA)을 첨가한 총 4 조합의 배지를 조제하였다.
이때, 슈크로즈 30g/L를 각각 첨가하였고, 겔화제로는 0.3%(w/w) gelrite(Duchefa)를 사용하였으며, 상기 각 조합의 배지는 121℃에서 고압 살균한 후, 페트리 디쉬(87× 15 mm)에 20㎖씩 분주하였다.
<실시예 4> 체세포배의 유도
상기 실시예 3에서 조제한 체세포배 유도용 배지에 10개의 자엽 절편체(0.5× 0.5cm)를 치상하였고, 각 호르몬 조합당 5반복으로 하여 25± 1 ℃의 유도 조건으로 암배양 하였다.
상기에서 배양된 절편체로부터 탄닌과 같은 페놀성 물질이 분비되어 갈변화 징후가 보이면, 즉시 새 배지로 옮겨 4주간 배양한 후, 절편체를 식물 생장조절물질이 없는 각각의 기본 배지로 옮겨 배양하여, 총 6주를 암배양하였다.
<실시예 5> 뿌리 발아체의 유도
상기 실시예 4에서 유도된 체세포배 괴(somatic embryos cluster) 중에서 발달 단계가 자엽형을 보이는 체세포배 만을 선별하여, 하기 표 4와 같이, 상기 실시예 3의 배지와 동일한 배지에 치상하고, 24℃의 온도, 3,000 룩스의 조명도 하에서, 16시간의 명주기, 8시간의 암주기의 광주기 조건에서 배양하여, 뿌리 발아체를 유도하였다.
<실험예 1> 종자채취 시기에 따른 미숙 종자배의 출현율 조사
상기 실시예 1과 같이, 7월 8일 및 7월 20일에 채취한 루브라참나무 종자의 미숙 종자배의 출현율을 조사한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2 및 도 1을 참조하면, 7월 8일에 채취한 종자는 미숙 종재배의 발생이 이루어지지 않아, 미숙 종자배를 추출하기에는 너무 이른 것으로 나타났다.
반면에, 표 2 및 도 2를 참조하면, 7월 20일에 채취한 모든 미숙 종자에서는 어뢰 모양의 상층 말단 부위에 노란색을 띤 미숙 종자배가 형성
되었음을 알 수 있다.
Figure 112014063503118-pat00002
< 실험예 2> 식물생장 조절물질의 종류 및 농도에 따른 체세포배의 유도율 조사
상기 실시예 4에 의한 체세포배 유도율을 조사한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3을 참조하면, 루브라참나무의 미숙배로부터 체세포배 발생율은 0.5mg/L 또는 1.0mg/L의 인돌부틸산(IBA) 및 0.5mg/L의 6-벤질아미노퓨린(BA)를 첨가한 처리구에서 91.1 및 92.4%로 가장 높았다.
그러나, 0.1mg/L 및 0.5mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 처리구에서는 다소 낮은 88.3 및 71.9%의 체세포배 발생율을 나타내어 IBA 첨가구보다는 다소 낮았음을 알 수 있다.
Figure 112014063503118-pat00003
< 실험예 3> 식물생장 조절물질의 종류 및 농도에 따른 뿌리 유도율 조사
상기 실시예 5에 의한 뿌리 유도율을 조사한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4에서 보는 바와 같이, 뿌리 유도율은 1.0mg/L의 인돌부틸산(IBA) 및 0.5mg/L의 6-벤질아미노퓨린(BA) 처리구에서 41.6%로 가장 높고, 그 다음으로는 0.5mg/L의 IBA 및 0.5mg/L의 BA 처리구에서 38.1%로 나타났다.
그러나, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 처리구에서는 0.1mg/L의 2,4-D 처리구는 28.2%, 0.5mg/L의 2,4-D 처리구에서는 12.8%를 보여 2,4-D 첨가보다는 IBA 첨가가 뿌리 발생에는 훨씬 효과적이라는 것을 알 수 있다.
Figure 112014063503118-pat00004
이상에서 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.
본 발명에 의한 루브라참나무의 무성번식 방법은 단시간 내에 루브라참나무의 클론묘 생산이 가능하고, 차후에는 병충해 등에 강한 외래 유전자의 삽입 방식으로 루브라참나무의 신품종 육종에도 동일하게 적용될 수 있다. 아울러 이 기술의 개발로 산림수종의 품종화를 통한 산림 생산성 증진 등의 산림 자원화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. (a). 채취한 루브라참나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계;
    (b). 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계; 및
    (c). 상기 유도된 체세포배를 뿌리 유도용 배지에서 배양하여 체세포배를 발아시켜, 뿌리 발아체를 발생시키는 단계를 포함하는 루브라참나무의 무성번식 방법에 있어서,
    상기 체세포배 유도용 배지는 MS(Murashige and Skoog) 기본 배지에, 인돌부틸산 0.1mg/L~1.5mg/L 및 6-벤질아미노퓨린 0.1mg/L~1.0mg/L을 포함하고,
    상기 뿌리 유도용 배지는 MS(Murashige and Skoog)기본 배지에, 인돌부틸산 0.1mg/L~1.5mg/L 및 6-벤질아미노퓨린 0.1mg/L~1.0mg/L을 포함하는 것을 특징으로 하는 루브라참나무의 무성번식 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 루브라참나무 종자의 채취는 경기도 수원 지방을 기준으로, 7월 15일~7월 25일에 수행하는 것을 특징으로 하는 루브라참나무의 무성번식 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 채취한 루브라참나무 종자의 표면 살균을 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 루브라참나무의 무성번식 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표면 살균은 상기 종자의 표면을 세척한 후, 에탄올에 0.5분~5분간 침지한 다음, 상기 종자의 표면을 화염 살균하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 루브라참나무의 무성번식 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 인돌부틸산은 0.5mg/L~1.5mg/L 포함되는 것을 특징으로 하는 루브라참나무의 무성번식 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에 의해 발생된 뿌리 발아체를 토양에 이식하여 재분화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 루브라참나무의 무성번식 방법.
  10. 삭제
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