KR101671404B1

KR101671404B1 - 항암 효과, 방사선 병용치료 효과 및 당뇨병 치료 효과를 갖는 피리미딘 유도체 및 이의 의학적 용도

Info

Publication number: KR101671404B1
Application number: KR1020140116316A
Authority: KR
Inventors: 홍성희; 홍다원; 이기호; 박정완
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2016-11-02
Also published as: KR20160028057A

Abstract

본 발명은 항암 효과, 방사선 병용치료 효과 및 당뇨병 치료 효과를 갖는 피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학조성물에 관한 것으로, 상기 피리미딘 유도체들은 PPAR-γ 리간드이면서, 각종 암에 대한 항암 활성을 가질 뿐만 아니라 암세포에 대해 선택적인 세포 독성을 가지므로 부작용을 최소화할 수 있는 항암제로서 작용할 수 있다. 또한, 암에 대한 방사선 치료에 있어서 방사선 치료 민감제로서 작용할 수 있으며, 당뇨병 치료제로서도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암 효과, 방사선 병용치료 효과 및 당뇨병 치료 효과를 갖는 피리미딘 유도체 및 이의 의학적 용도{Pyrimidine derivatives having anti-cancer effect, combination therapeutic effect with radiation, and anti-diabetic effect, and PPAR activity, and medical use thereof}

본 발명은 항암 효과, 방사선 병용치료 효과 및 당뇨병 치료 효과를 갖는 퓨린 유도체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.

최근 암 발생률은 산업의 급격한 발달, 지구 생태계 및 식생활의 변화 등으로 과거에 비해 급격히 증가하고 있으나, 아직도 암의 발생기전이 불명확하여 난치성 질병으로 알려져 있다. 현재 사용되고 있는 항암제들은 효소 제제나 백신 등의 생물학적 제제, 순수 합성 의약품, 및 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있는데, 항암제는 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료시 문제가 되고 있다. 또한, 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상 세포에 대해서 독성을 나타내기도 한다. 따라서, 많은 학자들은 보다 효과적이면서 정상세포에 대한 독성을 최대화할 수 있는 항암제의 개발을 위해 노력해 오고 있다.

폐암은 위암에 이어 두 번째로 많은 부분을 차지하고 있으며, 예후가 불량하여 전체 암 사망률 중에서 폐암으로 인한 사망률은 2000년부터 1위를 차지하고 있다. 폐암은 조직학적으로 소세포성 폐암과 비소세포성 폐암으로 구분되며 소세포성 폐암의 경우 화학적 치료와 방사선 치료가 권장되고 비소세포폐암은 근치적 절제술이 최선의 방법으로 알려져 있다. 폐암은 종양의 국소적인 제어가 어렵고 진단 당시 영상검사로는 발견하기 어려운 미세 전이 암세포가 존재한다. 따라서, 폐에 국한된 방사선 요법 시행 후 원격 장기에서의 재발을 초래하는 경우가 있어 방사선 단독요법으로는 5 년 생존률이 10% 미만으로 좋지 않다. 따라서, 이러한 원격 장기에서의 재발을 막기 위해 다양한 방법으로 항암 화학요법이 방사선 치료와 병용되고 있고, 이러한 병용 치료가 방사선 단독 치료보다 우수함이 밝혀지고 있다.

한편, PPARs(peroxisome proliferator activated receptors)는 스테로이드/갑상선 호르몬/레티로이드 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 핵수용체로, 여러 종류의 리간드에 의해 활성이 조절되는 전사인자이다. 또한, 당과 지질대사를 조절하는 핵심인자이며, 여러 조직에서 세포분열, 분화, 그리고 세포사를 조절한다고 알려져 왔다. PPAR의 활성화는 각종 항암활성이 있는 것으로 알려져 있다.

그리고, 트로글리타존(troglitazone, TGZ), 시글리타존(ciglitazon), 로시글리타존(rosiglitazone) 또는 피오글리타존(pioglitazone)을 포함한 티아졸리딘디온(thiazolidinediones) 당뇨병 치료제는 합성 PPARγ 효능제이고 TGZ는 또한 사람의 대장암, 유방암, 간암, 폐암, 신장암 그리고 전립선암 등 다양한 암에 대해 세포독성효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Nat Med. 4(9): 1046-52, 1998; Proc Natl Acad Sci U S A. 95(15): 8806-11, 1998).

PPAR β/δ 활성은 폐암을 약화시킬 수 있다고 알려진 바 있으며, 고친화성(high-affinity) 합성 PPAR β/δ의 리간드인 L165041은 사람 폐암의 세포증식을 억제하고, PPAR β/δ유전자 발현을 제거한 형질전환 마우스(transgenic mouse)에서 폐암을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 그리고, 예후가 나쁜 폐암환자들에서 PPARγ의 발현이 감소하고(J Clin Oncol. 25(12): 1476-81, 2007), 내인성 효능제와 합성 효능제에 의한 PPAR-γ의 활성은 폐암세포의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다(Biochem Biophys Res Commun. 270(2): 400-5, 2000). 비소세포폐암에 PPAR-γ 활성물질을 처리하면 아팝토시스와 분화를 유도한다고 보고되었다(Cancer Res. 60(4): 1129-38, 2000). 또한, 시글리타존이 누드 마우스에서 A-549로부터 유도된 종양을 억제한다고 보고되었다(J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci. 26(1): 36-39, 2006).

당뇨병을 치료하기 위하여 PPAR-γ 효능제인 티아졸리딘디온을 투여한 환자는 폐암발달 확률이 현저히 낮았고(J Clin Oncol. 25(12): 1476-81, 2007), 또한 PPAR-γ 리간드에 의한 반응이 폐암으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다고 알려져 있다(Clin Cancer Res. 14(20): 6478-86, 2008; J Investig Med. 56(2): 528-33, 2008).

PPAR-γ 리간드는 PPAR-γ에 의존적인 경로 이외에도 PPAR-γ와는 독립적인 경로를 통해 항암 작용한다는 보고가 있으며, 실제로 PPAR-γ 리간드는 독립적인 경로와 폐암과의 관련성이 알려져 있다(Prostagladins & other Lipid Mediators 94: 104-111, 2011).

본 발명의 목적은 PPAR-γ 리간드로서 작용할 수 있으며, 항암 효과, 방사선 병용치료 효과 및 당뇨병 치료 효과를 갖는 피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피리미딘 유도체들은 PPAR-γ 리간드이면서, 각종 암에 대한 항암 활성을 가질 뿐만 아니라 암세포에 대해 선택적인 세포 독성을 가지므로 부작용을 최소화할 수 있는 항암제로서 작용할 수 있다. 또한, 암에 대한 방사선 치료에 있어서 방사선 치료 민감제로서 작용할 수 있으며, 당뇨병 치료제로서도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 CB13을 3T3-L1 세포에 10 μM 처리하여 48시간 동안 지방세포로의 분화를 유도한 다음 Oil-Red-O 염색법으로 분화유도 정도를 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 2는 도 1의 염색된 3T3-L1 세포에서 이소프로판올로 Oil-Red-O을 추출한 후, 510 nm에서 흡광도를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 CB13 0, 5, 10, 20, 30 및 40 μM을 비소폐암 세포주인 A549 및 H460과 사람 정상 폐세포인 MRC5에 첨가하고 배양한 다음 WST-1 방법으로 각각의 세포 생존율을 산정한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 CB13 30μM을 H460 및 A549 세포주에 48시간 동안 처리하여 배양한 다음 sub-G1기 세포를 유세포 측정 방법으로 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 CB13 30μM을 H460 및 A549 세포주에 48시간 동안 처리하여 배양한 다음 아넥신 V-FIPC 염색 후 유세포 측정 방법으로 CB13에 의한 아폽토시스를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 A549 및 H460 세포에 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 CB13 30μM을 24시간 동안 처리하여 배양한 세포로부터 추출한 단백질을 SDS-PAGE를 실시하여 분리한 다음 웨스턴 블랏팅한 결과이다.
도 7은 폐암세포주인 H460과 A549에 CB13 10, 20 및 30 μM 단독 처리 또는 1 및 2 Gy 방사선 조사와 함께 처리한 후 각각의 폐암세포 주의 세포 생존율을 WST-1 방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 3T3-L1 세포에 CB13를 10 μM 농도로 처리하여 분화시킨 뒤 추출한 RNA를 아가로스젤 전기영동을 실시하여 분리한 다음 Et-Br로 염색한 결과를 촬영한 사진이다.
도 9는 CB13 처리에 따른 지방세포에서 세포내로의 포도당 이동 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 1]

삭제

상기 피리미딘 유도체는 1-벤질-5-(4-메틸페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-2,4(1H,3H)-디온일 수 있다.

상기 암은 구체적으로는 방광암, 위암, 대장암, 식도암, 췌장암, 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 피부암,피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문부근암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 결장암, 뇌암, 백혈암, 전립선암, 식도암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 또는 뇌하수체 선종 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암 또는 백혈암이고, 더욱 구체적으로는 상기 암은 비소세포폐암이다.

또한 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 1]

삭제

또한 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 1]

삭제

또한, 상기 피리미딘 유도체는 당뇨병 특히, 내장비만과, 비알코올성 지방질환, 관절염, 제2형 당뇨병과 같은 인슐린 저항성 당뇨병에 효과적인 치료 효과를 나타낸다.

상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 유효성분인 피리미딘 유도체의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 100mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 본 발명에 따른 피리미딘 유도체의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학조성물은 피리미딘 유도체를 전체 약학조성물 총 중량에 대해 약 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 피리미딘 유도체는 약학조성물 외 건강식품으로 활용할 수도 있다. 상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 유효성분인 본 발명에 따른 퓨린 유도체 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 참조예는 본 발명에 따른 각각의 실험예에 공통적으로 적용되는 참조예를 제공하기 위한 것이다.

< 참조예 1> 화학 물질

프로피디움 아이오다이드 (Propidium iodide; PI); 사이클로스포린 A (cyclosporin A; CsA); 항산화제가 포함된 아세틸시스테인(Nacetylcysteine; NAC); 퀘세틴(quercetin) 및 4, 5-디하이드록시-1, 3-벤젠다이설포닉 산(tiron)을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였으며, 시글리타존(Ciglitazone); 선택적 PPAR-γ길항제(antagonist) 및 GW9662는 Cayman (Ann Arbor, MI)에서 구입하여 사용하였다.

또한 PPAR 작용제 후보물질인 CB13(1-벤질-5-(4-메틸페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-2,4(1H,3H)-디온)은 Chembridge chemical에서 구입하여 사용하였다.

< 참조예 2> 세포 배양 및 화학물질 처리

American type culture collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입한 사람 비소세포 폐암 세포 주인 H406 및 A549를 10% 태아소혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)배지에 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

시글리타존 10 mM 및 CB13 50 mM을 각각 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 녹여 스톡으로 준비하여 시글리타존 10 μM 또는 CB13 다양한 농도로 배양 배지에 첨가하였다. 또한 PPAR-γ 리간드를 세포 시에는 0.2% 태아소혈청(FBS)가 포함된 배양 배지를 이용하여 세포에 처리하였다.

< 실험예 1> PPAR -γ 리간드 검증 분석

CB13이 PPAR-γ 리간드 활성을 갖고 있는지 여부 지방세포 분화유도 능력을 통해 검증하기 위해 PPAR-γ길항제 GW9662, 시글리타존 및 신규한 PPAR-γ 작용제인 CB13을 각각 3T3-L1 세포에 처리하여 지방세포로의 분화를 유도하였다.

먼저, 3T3-L1 세포를 6-well 플레이트에 한 well당 10% 태아소혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)배지에 2×10⁴ 세포로 접종한 후 세포가 80% 성장할 때까지 48시간 동안 배양하였다. 그 후 10% 태아소혈청(FBS), 1μM 덱사메타손(Dex, Sigma-Aldrich), 0.5 mM 3-아이소부틸-1-메틸-크산틴(IBMX, Sigma-Aldrich), 5 μg/mL 인슐린(Sigma-Aldrich)이 포함된 배지로 교체하여 48시간 동안 배양하였다.

그 후 3T3-L1 세포에 CB13을 10 μM 및 양성대조군으로 시글리타존 10 μM을 각각 단독으로 처리하고, GW9662 10 μM과 CB13 10 μM을 함께 처리하여 분화를 유도하였다. 분화가 유도된 후에는 48시간 마다 10% 태아소혈청(FBS) 및 5 μg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 배양하였다.

3T3-L1 세포의 분화 6일 후 각각의 세포를 Oil-Red-O 염색법(Lin et al., 2007; Ramirez-Zacarias et al., 1992)으로 염색하여 CB13의 지방세포 분화 유도 정도를 단계-위상차 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)분석하고 이소프로필 알콜로 Oil-Red-O 염색된 세포를 용해시켜 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 1과 같이 CB13 및 시글리타존을 처리한 3T3-L1 세포에서는 분화가 확인된 반면, PPAR-γ 길항제인 GW9662를 CB13와 함께 처리한 3T3-L1 세포에서는 분화 억제가 확인되었다. 또한 도 2의 흡광도 분석 결과를 참고하면, CB13은 PPAR-γ 리간드의 특성인 지방세포 분화를 유도함에 있어서 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서, CB13은 PPAR-γ 리간드인 것으로 확인되었다.

< 실험예 2> 암세포 생장 억제 효능 분석

PPAR-γ 리간드로 검증된 화합물 CB13의 암세포 생장 억제 효능을 측정하기 위해, 사람 비소폐암 세포주인 A549 및 H460와 사람 정상 폐 세포인 MRC5에서 CB13에 의한 생장 억제 효능을 WST-1(4-[3-(4-아이도도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 다이설포네이트) 분석을 통해서 측정하였다.

먼저 WST-1 분석을 위해, 각각의 세포들을 96 웰 플레이트에 5 x 10³/웰 씩 분주하고 하룻밤 동안 배양한 후 시글리타존 10 μM과 CB13 0. 5. 10. 20, 30 및 40 μM을 각각 첨가하고 24시간, 48시간, 및 72시간 동안 배양하였다. 각각의 세포를 세척한 후 각 웰 마다 10 μl의 WST-1 용액을 첨가하고 37℃에서 1 시간 배양시킨 후 450 nm에서 측정하여, CB13 처리에 의한 세포생존율을 확인하였다.

그 결과, 도 3과 같이 PPAR-γ 리간드인 CB13의 농도 및 시간의존적으로 사람 비소폐암 세포주의 생장 억제 효능이 탁월하였으며, 암세포주가 아닌 정상 폐세포에 대해서는 세포 성장 억제 효과가 나타나지 않았다. 따라서 CB13은 암세포주에만 선택적으로 세포 성장 억제 효능을 갖고 있음을 확인되었다.

< 실험예 3> 피리미딘 유도체의 아폽토시스 연관성 분석

PPAR-γ 리간드의 아폽토시스 유도 효과를 유세포 측정 방법(flow cytometry) 및 웨스턴 블롯 분석을 통하여 확인하였다.

1. sub - G1 기 세포수의 변화에 미치는 CB13 의 영향 확인

CB13에 의해 유도되는 아폽토시스 세포 사멸을 확인하기 위해 sub-G₁ 기 세포를 측정하였다. 먼저, H460 및 A549 세포를 각각 60 mm 플레이트 당 3.0×10⁵ 세포로 접종하여 24시간 동안 배양한 후 CB13 30 μM를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 그 후 각각의 세포를 회수하여, 차가운 70% 에탄올로 -20℃에서 하룻밤 동안 고정하고 Dulbecco's PBS (DPBS)로 두 번 수세한 후, PI (50 μg/mL; Sigma-Aldrich) 및 RNase A (50 μg/mL; Sigma-Aldrich)가 포함된 DPBS로 실온에서 암 조건으로 30분간 염색하였다.

상기 방법으로 염색된 세포의 sub-G₁ 기의 세포수을 FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 측정하고 그 데이터를 CellQuest Pro software (Becton Dickinson)을 사용하여 분석하였다.

그 결과, 도 4와 같이 PPAR-γ 리간드인 CB13이 48시간 처리된 실험군에서 sub-G₁기 H460 및 A549 세포가 CB13을 처리하지 않은 대조군보다 상대적으로 2 내지 4배 증가되었다.

상기 결과로부터, CB13는 H460 및 A549 세포의 아폽토시스를 통하여 세포사멸이 이루어지고 있는 것을 제안할 수 있다.

2. CB13 처리에 의한 비소폐암 세포사멸 확인

상기 결과의 정확한 확인을 위하여 아넥신 V 어세이(annexin V assay)를 수행하여 아폽토시스를 확인하였다. 먼저, H460 및 A549 세포를 60 mm 플레이트 당 3.0×10⁵ 세포로 접종하여 24시간 동안 배양한 후 CB13 30 μM를 처리하여 40시간 동안 배양한 후 세포를 회수하여 Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (BioVision, CA, USA)를 이용하여 제조사의 설명서대로 아넥신 V/PI로 5분간 암 조건에서 염색한 후 CB13이 처리된 H460 및 A549 실험군에서 아폽토시스된 세포의 수를 FACSCalibur system을 통하여 확인하였다.

그 결과, 도 5와 같이 PPAR-γ 리간드인 CB13이 처리된 세포군에서 아넥신 V 양성 세포의 증가가 확인됨에 따라 CB13는 아폽토시스 매카니즘을 통하여 암세포의 세포 사멸이 유도되는 것임을 확인하였다.

3. 비소폐암 세포사멸 관련 단백질 확인

상기 실험들을 통하여 피리미딘 유도체인 CB13의 세포 사멸 기작이 아폽토시스를 통하여 이루어진다는 것을 알 수 있었으므로, 세포사멸 과정 중 세포 내의 아폽토시스 관련 단백질의 변화와 아폽토시스의 반응 기작을 정확히 밝혀내고자 다음과 같이 웨스턴블라팅을 수행하였다.

사람 비포폐암 세포인 H460 및 A549에 CB13 30 μM를 처리하여 48시간 동안 배양한 후 트립신 처리하여 세포를 회수하고 프로테아제 억제제(Sigma-Aldrich)가 포함된 RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Na3VO4, 10 g/mL aprotinin, 10 g/mL leupeptin, 1 g/mL pepstatin A, 0.1 mM PMSF 및 1 mM DTT)를 사용하여 얼음에서 20분 동안 세포를 용해시킨 후 용액상 단백질 농도를 Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 측정하였다. 상기 농도가 측정된 단백질 시료를 각 레인당 20 μg으로 분주한 후 SDS-PAGE에 전기영동하였다. 그 후 SDS-PAGE 단백질을 폴리비닐리딘 플로오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF) 멤브레인(NEN; PerkinElmer, Wellesley, MA)으로 옮긴 후 멤브레인을 blocking buffer (1 X TBS, 0.1% Tween-20, 5% skim milk)로 blocking한 후 도 6과 같은 1차 항체를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고 호래디쉬 퍼옥시다아제(HRP) 결합을 가진 2차 항체를 사용하여 다시 1 시간 동안 반응시킨 뒤 ECL 또는 ECL-plus(Amersham Biosciences) 시스템을 이용하여 발색시키고 필름에 감광시켰다.

그 결과, 도 6과 같이 CB13이 처리된 세포에서 분열된 caspase-3, caspase-7 및 caspase-PARP가 처리되지 않은 대조군보다 증가하였다.

상기 결과들로부터 PPAR-γ 작용제인 CB13의 항증식 효과는 아폽토시스를 유도를 통한 것임이 확인되었다.

< 실험예 4> 방사선 민감성 측정

폐암세포주인 H460와 A549 세포를 60 mm 세포배양 플래이트에 500개씩 부유시킨 다음, 24시간 동안 배양하였다. 세포가 바닥에 잘 붙어 안정된 것을 확인한 후, 0, 10, 20 및 30 μM CB13을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후에, 1 및 2 Gy 세기로 γ-조사(3.2 Gy/min, Gammacell 3000; Atomic Energy of Canada, Ltd., Mississauga, ON, Canada)을 조사하였다. 48시간 동안 배양한 후, 세포 생존율을 WST-1 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 7과 같이 방사선 조사와 함께 처리된 CB13의 방사선 민감제로서의 효능을 폐암세포주인 H460와 A549의 세포 생존율 확인을 통해 얻은 결과, 최대농도인 CB13 30μM을 단독으로 처리한 경우, H460세포의 생존율은 61%, A549 세포의 생존율은 68%로 나타난 반면, 방사선 조사와 함께 30μM CB13을 처리할 경우, H460세포의 생존율은 41%, A549 세포의 생존율은 34%로 나타내었다. 상기 결과로부터 CB13은 매우 높은 방사선 민감제로서의 효능을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5> 지방세포 분화 메커니즘 규명

앞의 실험을 통하여 CB13의 화합물이 PPAR-γ 리간드로서 지방세포 분화를 유도하는 것을 알 수 있었으므로, 지방세포 분화 과정 중 세포 내의 분화유발 관련 유전자의 변화를 정확히 밝혀내고자 RT-PCR 실험을 실시하였다.

즉, 3T3-L1 세포에 CB13 10μM을 3시간 동안 처리하여 분화 유도한 뒤 Trizol^TM을 처리하여 RNA를 추출하였다. 이렇게 획득한 RNA로부터 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 형성하였고, 합성한 cDNA를 기반으로 지방세포 분화와 관련한 다양한 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 지방세포 분화 마커인 PPAR-γ, C/EBPα, aP2 와 인슐린 신호전달과정에 관련하여 세포내로 포도당을 이동시키는 GLUT4, 항당뇨와 관련된 유전자인 아디포넥틴(adiponectin)의 발현양을 확인하였다. 아가로스 젤 전기영동법을 이용하여 유전자를 분리시킨 뒤 각각 유전자의 발현양을 Et-Br로 염색하여 UV로 확인하였다.

그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이 분화마커로 알려진 PPAR-γ, C/EBPα, aP2의 발현증가를 확인할 수 있었고, 인슐린 신호전달과정을 통해 포도당을 세포내로 이동시키는 GLUT4의 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한 지방세포에서 분비되는 아디포카인인 아디포넥틴의 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

아디포넥틴은 내장비만 및 인슐린 저항성(비알코올성 지방질환, 관절염, 제 2형 당뇨병)을 가진 개체에서는 현저히 감소한다. 즉 인슐린 저항성과 아디포넥틴의 혈중 함량과는 반비례 관계이다. 따라서, CB13 화합물이 이러한 특징을 가진 아디포넥틴의 발현을 증가시키기 때문에, CB13 화합물은 제2형 당뇨의 개선 효과가 있음을 확인하였다.

< 실험예 6> 지방세포에서 세포내로의 포도당 이동 분석

3T3-L1 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 후 CB13 10 μM을 시간별로 처리하여 분화시켰다. 대조군으로 인슐린을 처리하지 않은 실험군과 인슐린을 처리한 실험군을 준비한 뒤 2-데옥시글루코스가 세포 내에 축적되는 정도를 측정하여 세포내로의 포도당 이동을 분석하였다.

그 결과, 도 9와 같이 CB13을 10 μM 농도로 처리한 경우 인슐린이 없는 조건에서는 뚜렷한 차이를 나타내지 않지만 인슐린이 처리된 조건에서는 대조군에 비해 CB13에 의해 포도당이 세포내로 활발히 이동하였음을 알 수 있다. 이 결과를 통해 CB13은 인슐린이 유도하는 포도당의 이동을 증가시킴으로서 인슐린 민감성을 증가시킴을 확인하였다.

< 실험예 7> 인슐린 저항성 개선 효과

3T3-L1 지방세포에 덱사메타손(dexamethasone)을 48시간 동안 처리하여 인슐린 저항성 모델을 제작하였다. 그런 다음 CB13을 24시간 처리하여 Trizol^TM을 처리하여 총 RNA를 추출한 뒤 PPAR-γ, C/EBPα, GLUT4, 아디포넥틴, GAPDH의 프라이머를 사용하여 RT-PCR를 수행하여 각각의 유전자의 발현량을 분석하였다.

그 결과, 덱사메타손으로 유발된 인슐린 저항성 모델에서 감소된 PPPAR-γ, C/EBPα, GLUT4, 아디포넥틴 유전자의 발현양이 10 μM CB11로 처리한 경우 다시 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 CB13 화합물은 인슐린 저항성을 개선시켜 인슐린 민감성을 다시 회복시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

하기에 본 발명에 따른 CB13을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 처방예 1> 약학조성물의 처방예

<처방예 1-1> 산제의 제조

CB13 20 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<처방예 1-2> 정제의 제조

CB13 20 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<처방예 1-3> 캅셀제의 제조

CB13 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<처방예 1-4> 주사제의 제조

CB13 10 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<처방예 1-5> 연고제의 제조

CB13 10mg, PEG-4000 250mg, PEG-400 650mg, 백색바셀린 10mg, 파라옥시안식향산메칠 1.44mg, 파라옥시안식향산프로필 0.18mg 및 잔량의 정제수를 혼합한 후 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.

< 처방예 2> 건강보조식품

<처방예 2-1> 건강식품의 제조

CB13 1 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<처방예 2-2> 건강음료의 제조

CB13 1 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 1-벤질-5-(4-메틸페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-2,4(1H,3H)-디온, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학조성물:
[화학식 1]
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청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암 또는 백혈암에서 선택된 암 치료용 약학조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 1-벤질-5-(4-메틸페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-2,4(1H,3H)-디온, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학조성물:
[화학식 1]
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청구항 5에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암 또는 백혈암에서 선택된 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 1-벤질-5-(4-메틸페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-2,4(1H,3H)-디온, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 용매화물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학조성물:
[화학식 1]
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