KR101669658B1 - Method for separating, concentrating and detecting target material in sample solution - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자, 자성물질이 부착된 자석홀더 및 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법 및 상기 자석홀더 및 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치에 관한 것으로, 본 발명의 상기 방법 및 장치가 종래의 자성입자 기반 방법의 복잡하고 시간 소모적인 방법들에 비해 분리하고자 하는 표적 물질의 분리 및 검출을 간편하고 효율적으로 수행할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.The present invention relates to magnetic particles having a targeting moiety that is specifically bound to a target substance to be separated and bonded to a surface thereof, a magnetic holder having a magnetic substance attached thereto, A method for separating, concentrating and detecting a target substance in a sample solution using a capturing rod of a non-magnetic material capable of capturing the sample, and a device for separating the target substance in the sample solution containing the microorganism, comprising the magnet holder and the collecting rod , The method and apparatus of the present invention can easily and efficiently perform separation and detection of the target material to be separated as compared with the complicated and time consuming methods of the conventional magnetic particle based method, It is possible to use it.
Description
본 발명은 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치 기반의 표적 물질 분리, 농축 및 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자, 자성물질이 부착된 자석홀더 및 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 일괄처리 방법 및 상기 자석홀더 및 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치에 관한 것이다.The present invention relates to a device-based separation, concentration and detection of a target substance composed of a magnet holder and a collecting rod, and more particularly to a method for separating, concentrating and detecting a target moiety that specifically binds to a target substance to be separated, A magnetic holder with a magnetic material attached thereto, and a non-magnetic material collecting rod capable of inserting the magnetic holder and capable of capturing the magnetic particles on the outer surface, to separate, concentrate and detect the target substance in the sample solution And a device for separating a target substance in a sample solution containing microorganisms, comprising the magnet holder and the collecting rod.
식품, 의료 및 환경분야에서 매질 속에 포함된 위해(危害) 미생물을 검출하기 위해서, 그 매질 속에 포함된 미생물만을 선택적으로 분리한 후 극미량 미생물 농도에 따른 검출신호 증가를 위해 일정시간 미생물 배양과정을 거쳐 검출한다. 일반적으로, 미생물 배양시간은 장출혈성 대장균인 경우 12시간 정도이며 미생물에 따라 차이는 있으나 12시간에서 48시간까지 소요된다. 검출시간을 단축시키기 위해, 시료 매질 속 미생물을 신속히 분리하고 농축할 수 있는 기술이 면역자성법을 기반으로 발전하고 있는 추세이다.In order to detect harmful microorganisms contained in the medium in food, medical and environmental fields, only the microorganisms contained in the medium are selectively separated, and microorganisms are cultured for a certain period of time in order to increase the detection signal according to the microbial concentration . Generally, microorganism incubation time is about 12 hours in the case of intestinal hemorrhagic Escherichia coli and varies from 12 to 48 hours depending on the microorganism. In order to shorten the detection time, a technology capable of rapidly separating and concentrating the microorganisms in the sample medium is being developed based on the immunomagnetic method.
면역자성법은 자성을 가지는 나노 또는 마이크로 크기의 입자 표면에 미생물과 선택적으로 반응하는 항체를 고정시켜 항원-항체 반응을 통해 시료기질 속 미생물과 선택적으로 반응하게끔 유도한 후 자석으로 미생물만 분리하는 기술이다. 종래의 면역자성법은 시료기질 속 미생물을 선택적으로 분리하고 농축하는 기술로서 분리된 미생물을 확인하기 위해서는 또 다른 검출법(평판도말, 비색법, 실-시간 PCR, SPR 및 ELISA 등)을 이용하였다. 따라서, 복잡하고 시간 소모적인 상기 종래 방법들을 개선하기 위해 미생물의 분리, 농출 및 검출을 손쉽게 수행할 수 있는 새로운 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.The immune magnetic method is a technique of immobilizing an antibody selectively reacting with microorganisms on the surface of magnetic nano- or micro-sized particles, inducing the antibody to selectively react with the microorganism in the sample matrix through an antigen-antibody reaction, and then separating only the microorganism from the magnet to be. Conventional immunoassay is a technique for selectively isolating and enriching microorganisms in a sample matrix, and another detection method (flat plate, colorimetric, real-time PCR, SPR, ELISA, etc.) was used to identify isolated microorganisms. Therefore, there is an urgent need in the art for a new method that can easily perform the separation, extraction and detection of microorganisms in order to improve the above conventional methods which are complicated and time consuming.
한국공개특허 제2010-0090957호에는 생체물질에 특이적으로 결합된 자성 비드(magnetic bead)를 포집하기 위한 것으로, 자석과 자성 비드를 포함하는 용액이 흐를 수 있는 유로를 제공하는, 자석에 감겨진 튜브를 구비한 자성 비드 포집 장치에 관한 '표적 생체물질의 분리 또는 정제를 위한 자성 비드 포집 장치 및 이를 구비한 미세유동 시스템'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2008-0008668호에는 '자성체 나노입자를 이용하여 단백질을 선택적으로 결합, 분리 또는 정제하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치 기반의 시료용액 내 표적 물질 분리, 농축 및 검출 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.Korean Patent Publication No. 2010-0090957 discloses a method for collecting a magnetic bead specifically bound to a living body, which comprises providing a flow path through which a solution containing a magnet and magnetic beads can flow, Discloses a magnetic bead collecting apparatus for separating or purifying a target biomaterial and a microfluidic system therefor, and Korean Patent Publication No. 2008-0008668 discloses a magnetic bead collecting apparatus having a magnetic nanoparticle Discloses a method for selectively binding, separating, or purifying a protein by using the method of the present invention. However, there is no description about a method for separating, concentrating, and detecting a target substance in a device-based sample solution composed of the magnet holder and the collecting rod of the present invention.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 자성물질이 부착된 자석홀더와 상기 자석홀더가 삽입가능한 유리 재질의 포집봉으로 구성된 장치를 사용하여 미생물 특이적 항체가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 식품 균질화 시료용액 내에 혼합하여 미생물-항체 반응을 유도하고, 특정 미생물이 표면 항체에 결합되어 있는 자성입자를 상기 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치를 사용하여 간단하고 신속하게 분리 및 검출함으로써, 본 발명을 완성하였다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-described needs, and it is an object of the present invention to provide a microorganism-specific antibody, which is combined with a surface of a microorganism using an apparatus comprising a magnetic holder having a magnetic substance attached thereto and a collecting rod made of a glass material into which the magnet holder can be inserted And the magnetic particles having specific microorganisms bound to the surface antibody are separated and detected simply and rapidly using the apparatus composed of the magnetic holder and the collecting rod Thereby completing the present invention.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은In order to solve the above problems,
(a) 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료가 들어있는 시료용기 내에 처리하여 상기 표적 물질과 타겟팅 모이어티의 결합을 유도하는 단계;(a) treating a magnetic particle having a surface-binding targeting moiety that specifically binds to a target substance to be separated in a sample container containing a microorganism-containing sample to remove the target substance and the targeting moiety Inducing binding;
(b) (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계; 및(b) a mechanism composed of (i) a magnet holder with a magnetic substance attached thereto and (ii) a collecting rod of a non-magnetic material into which the magnet holder is insertable and capable of capturing magnetic particles on the outer surface, Immersing the target substance in a reaction sample containing magnetic particles bound to the target substance and collecting the magnetic particles bound to the target substance on the outer surface of the collection rod; And
(c) 상기 (b) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 자성입자, 자석홀더 및 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법을 제공한다.(c) separating the magnet holder and the collecting rod of the step (b) from each other to separate the target material on the collecting rod surface, separating the target material in the sample solution using the magnetic particles, the magnet holder and the collecting rod, Enriched and detected.
또한, 본 발명은 (i) 시료용액 내 자성입자를 포획할 수 있는 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치를 제공한다.The present invention also relates to a magnetic recording medium comprising: (i) a magnetic holder having a magnetic material capable of capturing magnetic particles in a sample solution; and (ii) a magnetic holder capable of capturing the magnetic particles on the outer surface thereof An apparatus for separating a target substance in a sample solution containing a microorganism, which is composed of a collecting rod, is provided.
본 발명에서는 비자성 재질의 포집봉을 사용하여 면역자성법을 수행한 경우, 분리하고자 하는 표적 물질과 결합하고 있는 자성입자가 자석으로부터 쉽고 간단하게 분리할 수 있으며 다량의 부피를 가지는 시료용액에 대해 병렬적으로 처리할 수 있어 기존 면역자성법으로 소요되는 수 시간을 수 분내로 단축시킬 수 있었다. 본 발명의 방법 및 장치가 종래의 자성입자 기반 방법의 복잡하고 시간 소모적인 방법들에 비해 분리하고자 하는 표적 물질의 분리 및 검출을 간편하고 효율적으로 수행할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.In the present invention, when the immobilizing method is performed using a nonporous collecting rod, the magnetic particles bound to the target substance to be separated can be easily and easily separated from the magnet, and the sample solution having a large volume It was possible to shorten the number of hours required by the conventional immunomagnetic method to within a few minutes. The method and apparatus of the present invention can easily and efficiently perform separation and detection of the target material to be separated as compared with the complicated and time consuming methods of the conventional magnetic particle based method, .
도 1은 본 발명의 자성입자 분리 및 정제를 위한 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치의 모식도이다.
도 2는 특정 미생물 및 유전자 결합 자성입자의 모습을 보여주는 도면이다.
도 3은 항체-자성입자 사용에 의한 시료 전처리 및 미생물 검출 과정을 보여주는 도면이다.
도 4는 유전자-자성입자 사용에 의한 시료 전처리 및 미생물의 유전자 검출 과정을 보여주는 도면이다.
도 5는 식품 시료로부터 분리하고자 하는 표적 미생물을 분리 및 농축하는 과정을 나타내는 도식이다.
도 6은 도 5 과정을 거쳐 얻은 농축된 농축미생물로부터 유전자를 검출하는 과정을 나타내는 도식이다.
도 7은 Fe3O4 자성나노입자의 전자현미경 사진이다. 좌측이 TEM 사진이고, 우측이 SEM 사진이다.
도 8은 제작한 Fe3O4 나노입자의 XRD 스펙트럼이다.
도 9는 타겟팅 모이어티가 고정된 자성입자 제작을 위한 모식도이다.
도 10은 포집막을 이용한 자성체 분리(a) 및 시간에 따른 포집 자성체 흡광도 변화(b)를 나타낸다.
도 11은 초음파를 이용한 분산(a) 후 포집 자성체 흡광도 변화(b)를 나타낸다.
도 12는 미생물에 흡착된 자성입자의 현미경 사진이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view of an apparatus composed of a magnetic holder and a collecting rod for magnetic particle separation and purification of the present invention. FIG.
Fig. 2 is a view showing the appearance of specific microorganisms and gene-linked magnetic particles.
FIG. 3 is a view showing a sample pretreatment process using an antibody-magnetic particle and a process of detecting microorganisms.
FIG. 4 is a diagram showing a sample pretreatment process using a gene-magnetic particle and a gene detection process of a microorganism.
5 is a schematic diagram showing a process of separating and concentrating a target microorganism to be separated from a food sample.
FIG. 6 is a diagram illustrating a process of detecting a gene from the concentrated microorganism obtained through the process of FIG. 5.
FIG. 7 is a graph showing the relationship between Fe 3 O 4 An electron micrograph of magnetic nanoparticles. The left side is the TEM photograph and the right side is the SEM photograph.
FIG. 8 is a graph showing the relationship between Fe 3 O 4 XRD spectrum of nanoparticles.
9 is a schematic diagram for producing magnetic particles with a targeting moiety fixed;
Fig. 10 shows the magnetic material separation (a) using the collection membrane and the change (b) of the absorbance of the collected magnetic body with time.
11 shows the absorbance change (b) of the captured magnetic body after dispersion (a) using ultrasonic waves.
12 is a photomicrograph of a magnetic particle adsorbed on a microorganism.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the object of the present invention,
(a) 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료가 들어있는 시료용기 내에 처리하여 상기 표적 물질과 타겟팅 모이어티의 결합을 유도하는 단계;(a) treating a magnetic particle having a surface-binding targeting moiety that specifically binds to a target substance to be separated in a sample container containing a microorganism-containing sample to remove the target substance and the targeting moiety Inducing binding;
(b) (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계; 및(b) a mechanism composed of (i) a magnet holder with a magnetic substance attached thereto and (ii) a collecting rod of a non-magnetic material into which the magnet holder is insertable and capable of capturing magnetic particles on the outer surface, Immersing the target substance in a reaction sample containing magnetic particles bound to the target substance and collecting the magnetic particles bound to the target substance on the outer surface of the collection rod; And
(c) 상기 (b) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 자성입자, 자석홀더 및 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법을 제공한다.(c) separating the magnet holder and the collecting rod of the step (b) from each other to separate the target material on the collecting rod surface, separating the target material in the sample solution using the magnetic particles, the magnet holder and the collecting rod, Enriched and detected.
본 발명의 (a) 단계는 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료가 들어있는 시료용기 내에 처리하여 상기 표적 물질과 타겟팅 모이어티의 결합을 유도하는 단계이다 (도 3의 (2)단계).In the step (a) of the present invention, the magnetic particles having a targeting moiety binding specifically to the target substance to be separated are bonded to the surface of the sample, and the sample is treated in a sample container containing the microorganism, (Step (2) of FIG. 3).
시료 용기 내에는 분리하고자 하는 미생물, 기타 미생물, 식품 기질 등이 포함되어 있으며, 이들 중에 분리하고자 하는 미생물을 분리하기 위해 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료에 처리하면, 상기 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티가 반응하여 표적 물질-타겟팅 모이어티 결합체가 생성이 된다.In order to separate the microorganisms to be separated, a targeting moiety that specifically binds to the target substance to be separated is provided on the surface of the microorganism, When the bonded magnetic particles are treated with a sample containing microorganisms, a targeting moiety that specifically binds to the target substance reacts to generate a target material-targeting moiety conjugate.
또한, 표적 물질이 미생물 내에 존재하는 단백질 또는 유전자인 경우에는 분리하고자 하는 미생물에 외부에너지를 가하여 미생물의 세포벽 및 막을 제거하여 단백질 또는 유전자를 노출시킨 후 동일한 방법으로 타겟팅 모이어티와 반응을 시켜 표적 물질-타겟팅 모이어티 결합체의 생성을 유도할 수 있다. 미생물의 세포벽 및 막을 제거하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 효소 처리(예컨대, lysozyme 등), 열처리, 화학약품(예컨대, NaOH, SDS 등) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.When the target substance is a protein or a gene existing in the microorganism, external energy is applied to the microorganism to be separated to remove the cell wall and membrane of the microorganism to expose the protein or gene, and then react with the targeting moiety in the same manner, - can induce the generation of targeting moiety conjugates. For example, enzymatic treatment (for example, lysozyme, etc.), heat treatment, chemical agents (for example, NaOH, SDS, etc.) can be used as the method for removing the cell walls and membranes of microorganisms But is not limited thereto.
상기 표적 물질은 분리하고자 하는 미생물을 말하며, 바람직하게는 유해 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 유해 미생물 표면, 유해 미생물 내의 단백질 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The target substance refers to a microorganism to be separated, preferably a harmful microorganism, and more preferably, it may be at least one selected from the group consisting of a harmful microorganism surface, proteins and genes in harmful microorganisms, but is not limited thereto.
상기 유해 미생물은 바람직하게는 유해 진핵생물 및 유해 박테리아이고, 예를 들어 대장균(예컨대, E. coli O157:H7), 살모넬라(Salmonella; 예컨대, Salmonella enteritidis , Salmonella typhi), 쉬겔라(Shigella; 예컨대, Shigella dysenteriae), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 슈도모나스(Pseudomonas; 예컨대, Pseudomonas aeruginosa), 모락셀라(Moraxella; 예컨대, Moraxella catarrhalis), 헬리코박터(Helicobacter; 예컨대, Helicobacter pylori), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas; 예컨대, Stenotrophomonas maltophilia) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The microorganisms are preferably bacteria and harmful toxic eukaryotes, such as E. coli (e.g., E. coli O157: H7), Salmonella (Salmonella; e. G., Salmonella enteritidis, Salmonella typhi), Shh Gela (Shigella; e. g., Shigella dysenteriae), Enterobacter bacteria three (Enterobacteriaceae), Pseudomonas (Pseudomonas; e. g., Pseudomonas aeruginosa), morak Cellar (Moraxella; e.g., Moraxella catarrhalis), Helicobacter pylori (Helicobacter; e. g., Helicobacter pylori ), Stenotrophomonas (e.g., Stenotrophomonas maltophilia ), and the like.
용어 "타겟팅 모이어티(targeting moiety)"는 타겟 미생물의 표면에 존재하는 항원 또는 미생물 내의 단백질 또는 유전자에 결합할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 타겟팅 모이어티는 단백질, 단편을 이용한 조립항체, 펩타이드, 항체, 항체 단편 또는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으며, 바람직하게는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "targeting moiety" refers to any substance capable of binding to an antigen or a protein or gene in a microorganism present on the surface of the target microorganism. The targeting moiety according to an embodiment of the present invention may be one or more selected from the group consisting of a protein, an assembling antibody using a fragment, a peptide, an antibody, an antibody fragment or a gene, preferably an antibody, It does not.
본 발명의 타겟팅 모이어티는 항체의 Fab 및 Fc 부위를 포함하며, 이 Fab 부위를 통하여 타겟 미생물의 표면 항원과 비공유결합을 하게 된다. 본 명세서에서 용어 "Fab 부위"는 타겟 미생물의 표면 항원(예컨대, 수용체)과 상호작용하는 항체의 일 부위를 의미한다. 일반적으로, 파파인으로 전장 항체를 절단하면 Fab 부위와 Fc 부위 두 부위를 얻게 된다. 하나의 클래스에서 모든 항체의 Fab 부위는 거의 동일한 특성이 있다.The targeting moieties of the present invention comprise the F ab and F c sites of the antibody, and through this F ab site, non-covalently associated with surface antigens of the target microorganism. As used herein, the term "F ab site" refers to a portion of an antibody that interacts with a surface antigen (e.g., a receptor) of a target microorganism. Generally, when the whole-length antibody is cleaved with papain, two regions of F ab and F c are obtained. The F ab sites of all antibodies in one class have nearly identical properties.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Fab 부위는 IgG의 Fab 부위를 의미한다. 한편, 타겟 미생물의 표면 항원과 결합하는 특성을 갖는 범위 내에서는 Fab 부위는 통상적인 Fab 부위의 일부 서열일 수도 있다.According to a preferred embodiment, F ab and F ab portion means a portion of the IgG. On the other hand, within the range of binding characteristics with the surface antigens of the target microorganism, F ab The site may be a partial sequence of a typical F ab site.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟팅 모이어티는 항체의 Fab 부위를 포함하는 항체, 앱타머, 폴리펩타이드, 펩타이드, 리간드, 렉틴, 당, 지질, 당지질 또는 핵산이며, 보다 바람직하게는, 항체의 Fab 부위를 포함하는 항체, 앱타머 또는 리간드이며, 가장 바람직하게는 항체이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the targeting moiety is an antibody, an aptamer, a polypeptide, a peptide, a ligand, a lectin, a sugar, a lipid, a glycolipid or a nucleic acid comprising the F ab region of the antibody, An aptamer or ligand comprising the F ab site of the antibody, most preferably an antibody.
타겟팅 모이어티가 Fab 부위를 포함하는 항체인 경우에는, 타겟팅 모이어티로서 전장 항체가 이용될 수 있다. 전장 항체는 폴리클론 또는 단일클론 항체를 포함한다. 세포의 특정 표면 분자에 결합하는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원으로서의 세포 표면 분자를 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.If the targeting moiety is an antibody comprising an F ab site, a full length antibody may be used as the targeting moiety. The full-length antibodies include polyclonal or monoclonal antibodies. An antibody that binds to a specific surface molecule of a cell can be prepared by methods conventionally practiced in the art, for example, a fusion method (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976) 222: 58, 1-597 (1991)) and phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol. ). ≪ / RTI > For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known and readily practicable by those skilled in the art. A polyclonal antibody can be obtained by injecting a suitable cell surface molecule as an antigen into an appropriate animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using a known affinity technique.
본 발명의 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법은 자성입자 기반된 방법이다.The method of separating, concentrating and detecting the target substance in the sample solution of the present invention is a magnetic particle-based method.
본 발명의 상기 자성입자는 5 내지 1,000nm의 크기를 가지는 다양한 물질의 입자로, 금속 입자 또는 금속산화물 입자 등일 수 있다. 금속 입자로는 Pd, Pt, Cu, Ni, Co, Fe, Mn, Ru, Rh, Os, Ir 등의 입자일 수 있으며, 금속 산화물 입자는 화학식 MxOy(단, M은 금속으로 Fe, Pt, Ni 또는 Mn이며, O는 산소, x와 y는 정수를 나타낸다)로 나타낼 수 있는 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 금속산화물 Fe2O3 또는 Fe3O4인 자성입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The magnetic particles of the present invention may be particles of various materials having a size of 5 to 1,000 nm, such as metal particles or metal oxide particles. The metal oxide particles may be particles of the formula MxOy (where M is a metal such as Fe, Pt, Ni, Ni, Or Mn, O represents oxygen, and x and y represent an integer), and preferably may be magnetic particles of metal oxide Fe 2 O 3 or Fe 3 O 4 , but are not limited thereto .
본 발명의 상기 자성입자의 표면은 타겟팅 모이어티와의 결합에 이용될 수 있는 물질로 코팅되어 있으며, 상기 코팅 물질로는 머캅도헥사데카노익산(Mercaptohexadecanoic acid, MHDA), 시스타민, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 알부민, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민, 키토산, 히아루론산, 폴리락틱글라이코릭산(PLGA), 폴리락틱산, 폴리락타이드, 폴리글라이콜릭산, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리오써칼본에이트, 폴리칼본에이트, 폴리칼보락톤 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리사카라이드, 폴리케탈, 폴리에테르, 폴리아마이드,폴리말레익안하드라이드, 폴리메틸비닐에테르 또는 상기 고분자의 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The surface of the magnetic particles of the present invention is coated with a material that can be used for bonding with the targeting moiety, and the coating material may include mercaptohexadecanoic acid (MHDA), cystamine, polyethylene glycol PEG), dextran, polyvinylpyrrolidone, albumin, polyvinyl alcohol, polyethyleneimine, chitosan, hyaluronic acid, polylactic glycolic acid (PLGA), polylactic acid, polylactide, polyglycolic acid, polyamino acid , Polyacetal, polyorthocarbonate, polycarbonate, polycarbolactone polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polysaccharide, polyketal, polyether, polyamide, polymaleic anhydride, polymethyl vinyl ether or the polymer But are not limited thereto.
본 발명의 (b) 단계는 (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계이다 (도 3의 (3)단계). 이 단계는 표적 물질이 결합된 자성입자가 자성을 가지므로 자석홀더에 부착된 자성물질에 의해 서로 포집봉 표면에서 결합을 하는 단계이다. 즉, 표적 물질이 결합된 자성입자는 자성물질에 직접 결합하는 것이 아니라, 포집봉의 표면에 일시적으로 결합한 후 포집용기로 옮겨 자성물질을 제거하면 자성입자가 용이하게 분리되는 것이다. 따라서, 포집봉은 자성물질에 결합된 자성입자의 분리를 용이하게 하기 위해 사용되는 것이며, 이러한 목적을 달성하기 위해 포집봉은 비자성 재질이어야 하며, 상기 비자성 재질은 유리, 플라스틱, 세라믹스 또는 오스테나이트계 스테인리스강(Austenitic Stainless Steel)일 수 있으며, 바람직하게는 유리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The step (b) of the present invention is a method for manufacturing a magnetic device, comprising the steps of: (i) a magnet holder having a magnetic material attached thereto; and (ii) a mechanism composed of a nonmagnetic material- (step (3) of FIG. 3) is carried out by immersing the target substance in the reaction sample containing the magnetic particles having the target substance bound thereto in step (a), and collecting the magnetic particles bound to the surface of the collection rod. In this step, the magnetic particles to which the target substance is bound have magnetic properties, so that the magnetic substances attached to the magnet holder are bonded to each other at the surface of the capture rod. That is, the magnetic particles to which the target substance is bound are not bonded directly to the magnetic material but temporarily bonded to the surface of the collecting rod, and then transferred to the collecting container to remove the magnetic material, thereby easily separating the magnetic particles. Accordingly, the collecting bar is used for facilitating the separation of the magnetic particles bonded to the magnetic material. To accomplish this object, the collecting rod should be a non-magnetic material, and the non-magnetic material may be glass, plastic, ceramics or austenite Stainless steel, and may be, but not limited to, glass.
본 발명의 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질을 분리하는 단계이다. 이 단계는 구체적으로 (d) 상기 (b) 단계의 자석홀더-포집봉을 시료용기로부터 분리하여 포집용기로 옮기는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집용기 내로 분산시키는 단계로 이루어질 수 있다. 상기 (d) 단계는 포집봉에 일시적으로 결합된 자성입자를 포집용기에 분산시키기 위해 포집용기로 옮기는 단계이다 (도 3의 (4)단계).In the step (c) of the present invention, the magnet holder and the collecting bar of the step (b) are separated from each other to separate the target material from the surface of the collecting rod. Specifically, (d) separating the magnet holder-collecting rod of the step (b) from the sample container and transferring it to the collecting container; And (e) separating the magnet holder and the collecting rod of the step (d) from each other, and dispersing the magnetic particles having the target material on the collecting rod surface into the collecting container. The step (d) is a step of moving the magnetic particles temporarily bonded to the collecting bar to the collecting container to disperse the magnetic particles in the collecting container (step (4) of FIG. 3).
상기 (e) 단계는 포집봉에 일시적으로 결합된 표적 물질이 결합된 자성입자가 자성물질이 부착된 자석홀더가 포집봉으로부터 분리됨으로 인해 자성물질이 제거되어 포집봉 표면에서 떨어져 나와 포집용기 내로 분산되는 것이다 (도 3의 (5)단계).In the step (e), the magnetic particles to which the target substance temporarily bonded to the collecting bar are bonded are separated from the collecting bar by the magnetic holder having the magnetic material attached thereto, so that the magnetic material is removed from the collecting bar surface and dispersed (Step (5) in FIG. 3).
본 발명의 방법은 상기 (e) 단계의 포집용기 내 분산된 표적 물질을 농축 및 검출하는 단계를 포함할 수 있다 (도 3의 (6)단계). 미생물 또는 유전자를 보다 용이하게 검출하기 위해 미생물 또는 유전자에 결합된 자성입자를 제거할 수도 있다. 표적 물질이 미생물인 경우에는 미생물을 검출하기 위해 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 사용할 수 있으며, 표적 물질이 유전자인 경우에는 PCR 방법 등을 통해 유전자를 증폭하여 검출할 수도 있다. The method of the present invention may include the step of concentrating and detecting the dispersed target substance in the collecting container of step (e) (step (6) of FIG. 3). In order to more easily detect microorganisms or genes, it is possible to remove the magnetic particles bound to microorganisms or genes. When the target substance is a microorganism, a method commonly used in the art may be used to detect microorganisms. If the target substance is a gene, the gene may be amplified and detected by a PCR method or the like.
또한, 본 발명은 (i) 시료용액 내 자성입자를 포획할 수 있는 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치를 제공한다.The present invention also relates to a magnetic recording medium comprising: (i) a magnetic holder having a magnetic material capable of capturing magnetic particles in a sample solution; and (ii) a magnetic holder capable of capturing the magnetic particles on the outer surface thereof An apparatus for separating a target substance in a sample solution containing a microorganism, which is composed of a collecting rod, is provided.
본 발명의 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치는 자석홀더 및 포집봉으로 구성되는데, 자석홀더는 이의 말단에 시료용액 내 자성입자를 포획할 수 있는 자성물질(자석)이 부착되어 있으며, 포집봉에 삽입하거나 포집봉으로부터 분리를 용이하게 하기 위해서 포집봉보다는 길이가 긴 것이 바람직하다. 또한, 자석홀더의 손잡이 부분은 파지를 용이하게 하기 위해, 홈이 형성될 수 있다.An apparatus for separating a target material in a sample solution containing a microorganism according to the present invention comprises a magnet holder and a collecting rod, and a magnetic substance (magnet) capable of capturing magnetic particles in the sample solution is attached to the end of the magnet holder And is preferably longer than the collecting rod in order to be inserted into the collecting rod or to facilitate separation from the collecting rod. Further, the handle portion of the magnet holder may be formed with a groove to facilitate gripping.
포집봉은 자석홀더를 삽입하고 자성 입자를 겉표면에 포획하는 것으로서, 자석홀더보다는 직경이 커야 하며, 길이는 짧아야 한다. 또한, 포집봉은 자성물질에 결합된 자성입자의 분리를 용이하게 하기 위해 비자성 재질이어야 하며, 상기 비자성 재질은 유리, 플라스틱, 세라믹스 또는 오스테나이트계 스테인리스강일 수 있으며, 바람직하게는 유리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The collecting rod is to insert the magnet holder and to capture the magnetic particles on the outer surface. The diameter should be larger than the magnet holder and the length should be short. In addition, the collecting bar should be a non-magnetic material to facilitate separation of the magnetic particles bonded to the magnetic material, and the non-magnetic material may be glass, plastic, ceramics or austenitic stainless steel, , But is not limited thereto.
자석홀더와 포집봉은 원형, 사각형, 삼각형, 기타 다각형 등의 다양한 형태가 가능할 수 있으며, 시료용기에 담구기 위해서 시료용기보다는 직경이 작은 것이어야 한다.Magnet holders and collecting rods may be of various shapes such as round, square, triangular, and other polygons, and should be smaller in diameter than the sample vessels in order to be immersed in the sample vessels.
본 발명의 일 구현 예에 따른 장치에서, 상기 표적 물질은 미생물 표면, 미생물 내에 존재하는 단백질 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
In an apparatus according to an embodiment of the present invention, the target material may be at least one selected from the group consisting of microbial surfaces, proteins and genes existing in microorganisms, but is not limited thereto.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and methods
1. 자성입자의 제작1. Fabrication of magnetic particles
FeFe 33 OO 44 자성나노입자의 제작 Manufacture of magnetic nanoparticles
본 발명에서는 시료 전처리에 응용하기 위하여 외부자장에 강하게 작용하고 외부자장 제거시 이완시간을 최소화할 수 있는 SPIO 특성을 갖는 Fe3O4 자성나노입자를 제작하였다. 상기의 나노입자는 다음과 같은 방법에 의해 제작하였다. 3-넥 라운드 플라스크(500ml)에 0.5M의 NaOH 250ml를 채운 후 0.1M FeCl2·4H2O, 0.2M Fe3Cl6·4H2O, 0.4M HCl 25ml 수용액을 제조한 후 주입하고 기계적 교반기(mechanical stirrer)를 이용하여 1500 rpm의 속도로 교반하며, 용액의 온도는 80℃로 30분간 유지하였다. 자연 냉각 후 영구자석을 이용하여 상층액을 제거하고 pH 2 정도의 HCl 수용액을 이용하여 중화시킨 후 증류수, 에탄올을 사용하여 세척한 후 100ml 증류수에 분산시켜 상온 보관하였다.
In the present invention, Fe 3 O 4 magnetic nanoparticles having a SPIO characteristic capable of minimizing a relaxation time when an external magnetic field is removed are strongly required for sample preparation. The above nanoparticles were prepared by the following method. Necked round-bottomed flask (500 ml) was filled with 250 ml of 0.5 M NaOH, and then an aqueous solution of 0.1 M FeCl 2 .4H 2 O, 0.2 M Fe 3 Cl 6 .4H 2 O and 0.4 M HCl was prepared, the mixture was stirred at a speed of 1500 rpm using a mechanical stirrer, and the temperature of the solution was maintained at 80 ° C for 30 minutes. After cooling, the supernatant was removed using a permanent magnet, neutralized with a HCl aqueous solution of
FeFe 33 OO 44 자성나노입자 특성평가 Characterization of magnetic nanoparticles
제작한 Fe3O4 자성나노입자는 TEM 및 SEM을 통해 입자의 크기 및 분포를 확인하였으며 평균 5 nm 정도, 일부 10 nm 이상 크기도 존재하나 80% 이상 4~6 nm 내에 존재하였다(도 7). 또한 XRD를 통해 Fe3O4 재질 (PDF#19-0629)의 자성입자임을 확인하였다(도 8). 제작한 Fe3O4 자성나노입자의 농도는 약 5 mM 수준이었다.
The prepared Fe 3 O 4 magnetic nanoparticles were observed through TEM and SEM. The size and distribution of Fe 3 O 4 magnetic nanoparticles were found to be about 5 nm or more and 10 nm or more in size, but they were within 4 to 6 nm of 80% or more (FIG. 7) . Also, it was confirmed through magnetic XRD that it was a magnetic particle of Fe 3 O 4 material (PDF # 19-0629) (FIG. 8). The concentration of Fe 3 O 4 magnetic nanoparticles was about 5 mM.
2. 2. 타겟팅Targeting 모이어티가Mighty Tei 고정된 자성입자의 제작 Fabrication of fixed magnetic particles
자성입자를 이용한 시료 중 특정 미생물을 분리/농축하기 위하여 자성입자 표면상에 타겟팅 모이어티로서 항체를 고정시켜야 한다. 타겟팅 미생물로서 E. coliO157:H7을 표적으로 하였으며 그 항체 (antibody E. coli 157:H7, Bac Trace, Kerkegaard & Perry Laboratories Inc.)를 고정시키기 위해 자성입자 표면을 다음과 같은 방법으로 개질하였다. 제조한 수용액 중에 분산된 0.5 mM 자성입자를 원심분리기를 이용하여 에탄올에 재분산시킨 후 APTMS (3-Aminoproplytrimethoxysilane, 97%, Aldrich)를 첨가하여 2시간 반응시켰다. 반응 후 에탄올로 5회 세척한 후 G.A (Glutaric anhydride, 95%, Aldrich)를 자성입자 에탄올 용액에 첨가한 후 2시간 반응시켜 말단 -COOH를 형성하였다. 반응 후 에탄올로 5회 세척, 수용액으로 3회 세척 후 수용액 8 ml에 분산하여 0.4M EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 97%, Aldrich)와 0.1M NHS (N-Hydroxysuccinimide, 98%, Aldrich)를 혼합한 2 ml 수용액을 제조한 후 8 ml 자성입자 수용액에 첨가하여 5분간 반응시켜 자석으로 세척하고, 세척 후 5 ml PBS (pH 7.4) 버퍼에 분산시켰다. E. coli 157:H7의 항체의 배향특성을 고려하기 위하여 프로틴 G (Pro.G, Sigma)를 첨가한 후 4시간 반응시켜 자석을 이용하여 세척 후 1 ml PBS에 분산시켰다. 10 ㎍/ml 농도의 항체를 첨가한 후 2시간 반응시킨 후 자석을 이용하여 세척하고 30 mg/ml BSA (98%, Sigma-Aldirch) 5 ml를 제조한 후 항체가 결합된 자성입자와 1시간 반응시켰으며 자석을 이용하여 세척한 후 PBS 10 ml에 분산시켜 냉장보관하였다.
The antibody should be immobilized as a targeting moiety on the surface of magnetic particles in order to separate / concentrate specific microorganisms in the sample using the magnetic particles. E. coli O157: H7 was targeted as a targeting microorganism and the magnetic particle surface was modified in the following manner to immobilize the antibody (antibody E. coli 157: H7, Bac Trace, Kerkegaard & Perry Laboratories Inc.). 0.5 mM magnetic particles dispersed in the prepared aqueous solution were redispersed in ethanol using a centrifuge and reacted with APTMS (3-Aminoproplytrimethoxysilane, 97%, Aldrich) for 2 hours. After the reaction, the plate was washed five times with ethanol, and GA (Glutaric anhydride, 95%, Aldrich) was added to the ethanol solution of the magnetic particles and reacted for 2 hours to form terminal -COOH. The reaction mixture was washed with
실시예Example 1. 항체인 1. Antibody 타겟팅Targeting 모이어티가Mighty Tei 결합된Combined 자성입자를 이용한 시료 전처리의 특성 평가 Characterization of sample pretreatment using magnetic particles
시료 전처리 특성을 파악하기 위하여 포집막에 자성체 포집 결과(도 3의 (3)), 분산시 분산특성 결과 (도 3의 (6)) 및 분산 후 미생물 검출 결과로부터 제안한 시료 전처리의 특성을 평가하였다. In order to determine the pretreatment characteristics of the sample, the characteristics of the magnetic substance collecting result (FIG. 3 (3)), the dispersive property of dispersing property (FIG. 3 (6)) and the characteristics of the sample pretreatment .
포집봉 대신 시료 전처리 단계 확인을 위하여 자석(네오듐)만을 포집막 (유리튜브) 내 하단부에 위치시킨 후 자성분리 특성을 확인하였으며 자성체 분산을 위해 포집막에서 자석을 분리시킨 후 초음파를 이용하여 2 mL PBS 버퍼 속에 분산시켰다. 도 3의 (3) 과정을 수행한 후 나노입자 자성체가 자석에 흡착된 상태로 이는 도 10(b)에서 알 수 있듯이 5분 이내 90% 이상 흡착됨을 알 수 있다. 또한 최초 주입한 자성체의 농도에서 포집한 자성체를 확인하기 위하여 도 11에서와 같이 포집된 자성체를 분산시켜 그 흡광도를 측정하였을 경우 초음파 분산 후 3분 이내 90% 회수가능함을 알 수 있었다.
In order to confirm the pretreatment stage of the sample instead of the collecting rod, only the magnet (neodymium) was placed in the bottom part of the capture film (glass tube), and the magnetic separation characteristics were confirmed. The magnet was separated from the capture film for dispersing the magnetic material, mL PBS buffer. As shown in FIG. 10 (b), when the nanoparticle magnetic material is adsorbed on the magnet after performing the process of FIG. 3 (3), it can be understood that the nanoparticle is adsorbed by 90% or more within 5 minutes. Also, in order to confirm the magnetic substance collected at the concentration of the initially injected magnetic substance, when the absorbed magnetic substance was dispersed as shown in FIG. 11, 90% of the collected magnetic substance could be recovered within 3 minutes after the ultrasonic dispersing.
실시예Example 2. 2. 포집된Captured 자성체에서의 미생물 확인 Identification of microorganisms in magnetic bodies
제조한 자성체를 이용한 E. coli 157:H7의 포집 특성을 확인하기 위하여 투과전자현미경을 이용, 흡착특성을 확인하였다. 표적미생물인 E. coli 157:H7을 식품 시료 (우유, 양배추) 25g에 10 및 1000 CFU/mL를 오염시킨 후 PBS 버퍼 225mL로 균질화하였다. 이는 식품공전의 미생물 검출을 위한 시료 전처리 방법에 따라 시행되었다. 225 mL의 용액을 29 mL씩 8개 포집 용기로 나눠 균등하게 주입하고 포집봉과 포집막 8개를 이용하여 병렬적으로 처리하였다. 그 결과 도 12의 현미경 사진과 같이 10 CFU/mL E. coli 157:H7의 225 mL PBS 버퍼속에서도 미생물을 분리/농축할 수 있음을 확인하였다. The adsorption characteristics of E. coli 157: H7 were verified by using transmission electron microscopy. The target microorganism, E. coli 157: H7, was contaminated with 10 and 1000 CFU / mL of food samples (milk, cabbage) 25 g and homogenized with 225 mL of PBS buffer. This was carried out according to the sample pretreatment method for microorganism detection of food revolution. 225 mL of the solution was divided equally into 8 collecting vessels in 29 mL increments and treated in parallel using 8 collecting rods and collecting rods. As a result, it was confirmed that the microorganism could be isolated / concentrated in a 225 mL PBS buffer of 10 CFU / mL E. coli 157: H7 as shown in the micrograph of FIG.
Claims (14)
상기 표적 물질은 미생물 표면, 미생물 내의 단백질 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며,
상기 타겟팅 모이어티는 항체, 이의 단편, 단편을 이용한 조립항체 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며,
상기 자성입자는 MxOy(단, M은 금속으로 Fe, Pt, Ni 또는 Mn이며, O는 산소, x와 y는 정수를 나타낸다)이며,
상기 자성입자는 5 내지 1,000nm의 크기를 가지며,
상기 자성입자의 표면은 타겟팅 모이어티와의 결합에 이용될 수 있는 머캅도헥사데카노익산(Mercaptohexadecanoic acid, MHDA), 시스타민, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민, 키토산, 히아루론산, 폴리락틱글라이코릭산(PLGA), 폴리락틱산, 폴리락타이드, 폴리글라이콜릭산, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리오써칼본에이트, 폴리칼본에이트, 폴리칼보락톤 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리사카라이드, 폴리케탈, 폴리에테르, 폴리아마이드, 폴리말레익안하드라이드 또는 폴리메틸비닐에테르로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하며;
(b) (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 유리, 플라스틱, 세라믹스 및 오스테나이트계 스테인리스강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 자석홀더-포집봉을 시료용기로부터 분리하여 포집용기로 옮기는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집용기 내로 분산시키는 단계를 포함하는 자성입자, 자석홀더 및 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.(a) treating a magnetic particle having a surface-binding targeting moiety that specifically binds to a target substance to be separated in a sample container containing a harmful microorganism, to remove the target substance and a targeting moiety Inducing a < RTI ID = 0.0 >
Wherein the target material is at least one selected from the group consisting of microbial surfaces, proteins and genes in microorganisms,
Wherein the targeting moiety is at least one selected from the group consisting of an antibody, a fragment thereof, an assembling antibody using a fragment, and a gene,
Wherein the magnetic particles are MxOy (wherein M is Fe, Pt, Ni or Mn as a metal, O is oxygen, x and y are integers)
The magnetic particles have a size of 5 to 1,000 nm,
The surface of the magnetic particles may be selected from the group consisting of mercaptohexadecanoic acid (MHDA), cystamine, polyethylene glycol (PEG), dextran, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl Polylactic acid, polylactide, polylactide, polyglycolic acid, polyamino acid, polyacetal, polyocarbonate, polycarbonate, polycarboxylic acid, polyacrylic acid, polyacrylic acid, polyglycolic acid, alcohol, polyethyleneimine, chitosan, Tone polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polysaccharide, polyketal, polyether, polyamide, polymaleanhydride or polymethyl vinyl ether;
(b) a magnet holder with (i) magnetic material and (ii) glass, plastic, ceramics and austenitic stainless steels into which the magnet holder is insertable and on which magnetic particles can be captured on the outer surface And the magnetic particles having the target substance bonded thereto are collected on the outer surface of the collecting rod by immersing a mechanism composed of any one of the collecting rods of the non-magnetic material in the reaction sample containing the magnetic particles combined with the target substance in the step (a) step; And
(c) separating the magnet holder-collecting rod of the step (b) from the sample container and transferring it to the collecting container; And
(d) separating the magnet holder and the collecting rod of the step (c) from each other to disperse the magnetic particles having the target material bonded to the surface of the collecting rod into the collecting container, using the magnetic particles, the magnet holder and the collecting rod A method for separating, concentrating and detecting a target substance in a sample solution.
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JP2010133777A (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-17 | Beckman Coulter Inc | Detecting method and detector of target material |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Shu-I Tu et al., Sensors, 9, pp717-730, 2009 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20150068314A (en) | 2015-06-19 |
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