KR101669368B1

KR101669368B1 - 얼시노익산 유도체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101669368B1
Application number: KR1020150102302A
Authority: KR
Inventors: 김경규; 이진아; 데 데보죠티
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2016-10-25
Anticipated expiration: 2035-07-20

Abstract

본 발명은 얼시노익산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물 및 이의 용도 등에 관한 것이다 본 발명에 따른 줄기세포 분화 유도용 조성물은 종래에 알려진 분화방법에 비하여 저렴하고 효율적으로 줄기세포로부터 기능성을 가진 심근세포로 분화를 유도할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 기존에 알려진 심근세포 분화 유도물질과 비교하여 향상된 분화효율을 가지는 천연물 유래 저분자 화합물인 얼시노익산 유도체를 포함하므로, 인체 독성이 없이 안전하게 다양한 타입의 줄기세포 분화 유도에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

얼시노익산 유도체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이의 용도{Composition comprising Ursinoic acid derivatives for inducing the differentiation of stem cell and uses thereof}

본 발명은 얼시노익산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포에서 심근세포로의 분화 유도용 조성물 및 이의 용도 등에 관한 것이다.

심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 2009년 통계청에 따르면 심장질환을 포함하는 순환기계통 질환은 악성 종양 다음으로 높은 사망원인 중 하나로 그 중요성이 더욱 커지고 있으나, 발병률은 지속적으로 증가하고 있는 추세이다.

이러한 심혈관계 질환은 심근육의 손실에 기인하거나 심근육에 심각한 손상을 유발하지만 심근육은 자체적으로 재생이 어렵기 때문에 심장이식을 제외하고는 주요 병인들을 근본적으로 치료할 수 있는 치료법이 없는 상태이다. 따라서 종래 치료법의 한계를 극복하기 위하여 줄기세포를 이용한 치료법 개발이 2000년대 초반부터 이루어지고 있다.

심혈관계 질환에 대한 줄기세포 치료제 개발을 위해 다양한 타입의 줄기세포를 심근세포로 분화시킬 수 있는 방법들이 연구되고 있다. 예컨대, 화학물질의 처리, 특정 전사인자의 과발현, 또는 전사 억제인자(transcription repressors)의 저해와 같은 방법들이 보고되었다. 그러나 상기 방법들은 심근세포로의 분화 효율이 떨어지기 때문에 기능적인 심근세포를 얻기 위한 추가적인 정제과정이 요구된다. 이에 따라 분화 효율을 높이기 위해 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)가 심근세포로 분화하는 동안 자연적으로 발생하는 발달 신호를 모방하는 방법이 제안되었다. 분화배지에 FGF2, VEGF, 및 DKK-1과 같은 성장인자를 첨가하는 경우 분화효율이 증가됨이 보고된바 있으며, 이와 유사하게 activing-nodal, BMP, WNT 및 FGF와 같은 초기 중배엽 유도신호 노출에 이어 WNT, TGF-β 및 BMP의 억제를 포함하는 심장 특이적 신호에 노출시키는 방법이 보고되었다. 그러나 상기 방법들은 분화효율이 보다 높은 반면 복잡한 분화과정과 높은 비용이 요구되는 단점이 있다. 또한 바이러스를 이용한 심근세포의 분화방법은 바이러스 자체에 의한 부작용 및 암 유발 가능성 때문에 임상적용에 어려움이 있다.

따라서 저렴한 비용과 높은 효율로 심근세포를 대량으로 분화시킬 수 있는 안정성 높은 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 얼시노익산은 당귀 종에 속하는 안젤리카 얼시나(Angelica ursina)라고 불리는 식물의 뿌리에서 분리된 화합물로써, 얼시노익산 및 이의 유도체에 대하여 세포의 분화 또는 이와 관련된 활성에 대해서 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명자들은, 종래의 문제점을 해결하기 위하여 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리로부터 줄기세포에서 심근세포로 분화를 유도할 수 있는 물질을 스크리닝한 결과, 세포를 얼시노익산 존재하에서 배양하였을 때 높은 효율로 심근세포로 분화되는 것을 관찰함으로써 얼시노익산의 분화유도와 관련한 신규한 용도를 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 얼시노익산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물, 이를 이용한 심근세포로의 분화 유도방법, 및 상기 방법에 의해 분화가 유도된 심근세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 얼시노익산(Ursinoic acid) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 심근세포(cardiomyocyte)로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R은 X(R’)_n, 할로겐, CN, NO₂, C₁-C₁₀ 알킬, C₃-C₁₀ 시클로알킬, C₆-C₂₀ 아릴, 또는 C₅-C₂₀헤테로아릴이고,

X는 O, S, 또는 N이고,

R’는 H, 할로겐, CN, NO₂, C₁-C₁₀알킬, C₃-C₁₀ 시클로알킬, C₆-C₂₀ 아릴, 또는 C₅-C₂₀ 헤테로아릴이고,

n은 1 또는 2이다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 얼시노익산 유도체는 하기 화학식 2로 표시되는 얼시노익산인 것을 특징으로 한다.

[화학식 2]

본 발명의 다른 구현예로, 상기 얼시노익산은 당귀 종인 안젤리카 얼시나(Angelica ursina)에서 분리된 화합물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 심장줄기세포, 또는 유도만능줄기세포이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 심근세포로의 분화 유도방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 심장줄기세포, 또는 유도만능줄기세포이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화가 유도된, 심근세포를 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포 분화 유도용 조성물은 종래에 알려진 분화방법에 비하여 저렴하고 효율적으로 줄기세포로부터 기능성을 가진 심근세포로 분화를 유도할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 기존에 알려진 심근세포 분화 유도물질과 비교하여 향상된 분화효율을 가지는 천연물 유래 저분자 화합물인 얼시노익산 유도체를 포함하므로, 인체 독성이 없이 안전하게 다양한 타입의 줄기세포 분화 유도에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, 심근세포로의 분화를 확인하기 위해 제작한 P19 리포터 세포주의 리포터 구조를 그림으로 도시한 것이다.
도 2는, 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리를 이용한 심근세포로의 분화 유도물질 스크리닝 과정을 그림으로 도시한 것이다.
도 3A는, 얼시노익산에 의한 심근세포로의 분화효율을 검증하기 위하여 beating colony 수를 측정한 결과이며, 도 3B 및 3C는, 분화된 심근세포로부터 발현되는 mCherry의 형광강도 정량결과 및 형광현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는, 얼시노익산에 의한 심근세포로의 분화효율을 검증하기 위하여 면역염색법을 통해 심근세포의 발현마커인 Mef2c 및 α-Actinin(sarcomeric)의 발현정도를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리로부터 줄기세포에서 심근세포로 분화를 유도할 수 있는 물질을 스크리닝한 결과 분화 유도물질로써 얼시노익산(Ursinoic acid)의 신규한 용도를 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 얼시노익산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo)에서 줄기세포의 심근세포(cardiomyocyte)로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R은 X(R’)_n, 할로겐, CN, NO₂, C₁-C₁₀ 알킬, C₃-C₁₀ 시클로알킬, C₆-C₂₀ 아릴, 또는 C₅-C₂₀헤테로아릴일 수 있고,

X는 O, S, 또는 N일 수 있고,

R’는 H, 할로겐, CN, NO₂, C₁-C₁₀알킬, C₃-C₁₀ 시클로알킬, C₆-C₂₀ 아릴, 또는 C₅-C₂₀ 헤테로아릴일 수 있고,

n은 1 또는 2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 얼시노익산 유도체는 하기 화학식 2로 표시되는 얼시노익산 일 수 있으며, 상기 얼시노익산은 당귀 종인 안젤리카 얼시나(Angelica ursina)에서 분리된 것으로써 알칼로이드계에 속하는 화합물이다.

[화학식 2]

상기 얼시노익산 화합물 및 이의 유도체들은 천연물로부터 직접 추출할 수 있으며, 화학적으로 합성된 것도 추출된 것과 동일한 심근세포로의 분화 유도효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 사용되는 용어, “유도체”란 어떤 화합물을 모체로 하여 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등을 통하여 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 화합물을 의미하며, 모체 화합물의 구조와 성질이 대폭 변하지 않는 한도에서 변화된 유사한 화합물이다. 보통은 화합물 중의 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 말한다. 따라서 본 발명의 상기 얼시노익산 유도체는 얼시노익산과 유사하게 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도효과를 가지고 있는 화합물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “분화”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화 하는 현상을 의미한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체 발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명의 상기 줄기세포는 심근세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 포유류 유래 세포일 수 있고, 보다 구체적으로는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 또는 다양한 조직 유래 중간엽줄기세포 및 심장줄기세포를 포함하는 심근세포로의 분화능력을 지닌 성체줄기세포일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 P19 세포를 사용하였으나, 그 종류에 제한이 없으며 당업자가 적절히 선택하여 사용 가능하다.

상기 P19 세포는 미분화된 마우스 배아 기형암종 세포주로써 외배엽, 중배엽, 내배엽 모두로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)을 가진 세포이다. 더욱이, P19 세포는 일반적인 배아줄기세포의 공통적인 분화기전을 공유하므로 P19 세포를 이용하여 개발된 분화방법을 다른 종류의 줄기세포에 적용하여 쉽게 대체 가능하다.

상기 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 상기 얼시노익산 유도체는 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리를 이용한 심근세포로의 분화 유도물질 스크리닝을 통해 동정되었다.

본 발명의 일실시예에서는, 심근세포로의 분화를 민감하고 효율적으로 확인하기 위한 방법으로써 심근세포 특이적인 α-MHC(myosin heavy chain) 프로모터에 의해 mCherry 형광단백질을 발현하는 P19 리포터 세포주를 구축하였다. 상기 α-MHC 유전자는 심근육 세포의 발달에 있어서 매우 중요한 역할을 하며, 성체 심근세포에서 발현되고 심장박동 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 심근세포의 초기단계에서 발현하는 마커로 알려져 있으므로 분화 유도물질의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 스크리닝을 통해 심근세포로의 분화 유도물질로써 얼시노익산을 동정하였으며(실시예 2 참조), 얼시노익산의 분화효율을 검증하기 위하여 분화된 심근세포에서 beating colony 수 및 mCherry의 형광 강도를 측정한 결과 종래에 알려진 심근세포 분화 유도물질인 옥시토신보다 더 높은 분화효율을 나타냄을 확인하였다(실시예 3 참조). 또한 심근세포의 마커인 Mef2c 및 α-Actinin(sarcomeric)의 발현을 통해서도 얼시노익산에 의한 높은 분화효율을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 심근세포로의 분화 유도방법을 제공한다.

상기 줄기세포를 배양하는 조건에는 제한이 없으나, 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 혈청, 완충액, 항산화제, 항생제 등을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 또한 상기 줄기세포를 배양하는 시간은 분화세포가 형성될 수 있는 시간이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 3일 내지 15일이다.

본 발명의 줄기세포 분화 유도용 조성물은 얼시노익산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 본 발명의 줄기세포 분화 유도용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 줄기세포 배양용 배지, 기존에 알려진 분화 유도제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도방법에 의해 분화가 유도된 심근세포를 제공한다.

상기 심근세포는 다양한 심장질환의 세포치료제로써 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 세포배양

마우스 배아 기형암종 세포주인 미분화된 P19 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)(GIBCO, Invitrogen, MA, USA)과 1% penicillin/streptomycin(Welgene, Gyeongsangbuk-do, Republic of Korea)이 포함된 α-modified Eagle’s MEM(GIBCO, Invitrogen, MA, USA) 배지로 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대배양 하였다. HEK293T 세포는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 포함된 high glucose DMEM(Welgene, Gyeongsangbuk-do, Republic of Korea) 배지로 상기와 같은 조건에서 배양하였다.

1-2. 렌티바이러스 패키징 및 세포주 제작

상기 P19 세포가 심근세포로 분화되었을 때 이를 확인할 수 있는 P19 리포터 세포주(reporter cell line)를 제작하고자 하였다. 이를 위해, 심근세포에서 발현되는 myosin heavy chain(a-MHC) 프로모터에 mCherry 형광 단백질을 발현하는 유전자가 연결된 렌티바이러스(lentivirus) SIN18.WPRE 벡터를 이용하였으며, mCherry 단백질을 안정하게 발현할 수 있는 세포를 선별하기 위해 상기 벡터에 전분화능(pluripotency) 특이적 프로모터 REX 및 이의 하위에 블라스티시딘(blasticidin) 저항성 유전자를 포함하도록 하였다.

aMHC-mCherry 렌티바이러스 파티클은 종래에 보고된 방법에 따라 HEK293T 세포에서 생산하였다. 보다 구체적으로, aMHC-mCherry 발현벡터, 패키징 플라스미드 dvpr(Addgene), 및 VSV-G 엔벨로프 단백질 발현 플라스미드(Addgene)를 turbofect(Thermo Scientific, MA, USA) 시약을 이용하여 HEK293T 세포에 5:4:1의 비율로 동시에 트랜스펙션하였다. 48시간 후 생산된 렌티바이러스가 포함된 배지를 원심분리한 후 상층액을 회수하여 -80℃에 보관하였다.

상기 방법을 통해 생산된 렌티바이러스의 형질도입을 위하여, P19 세포를 150 mm 디쉬에 분주하고 24시간 후 바이러스가 포함된 상층액을 7.5 ㎎/㎖의 polybrene(SIGMA, MO, USA)과 혼합하여 세포에 처리한 후 배양하였다. 24시간 후 바이러스가 포함되지 않은 새로운 배양배지로 교체해주었으며, 10 ㎍/㎖의 블라스티시딘(SIGMA, MO, USA)을 이용한 선택(selection)과정을 수행하여 mCherry 형광 단백질을 안정하게 발현하는 세포주만을 선별하였으며, 이를 αMHC-mCherry P19 세포로 명명하였다.

상기 방법을 통해 세포가 심근세포로 분화되었을 때 α-MHC 프로모터에 의해 mCherry 형광 단백질을 발현하는 P19 리포터 세포주(reporter stable cell line)를 구축하였으며, 상기 리포터 구조는 도 1에 그림으로 도시하였다.

1-3. 천연물 유래 화합물 라이브러리를 이용한 심근세포 분화물질의 스크리닝

800여종의 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids), 및 스테롤(sterols) 계열 등의 화합물을 포함하는 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리는 MicroSource Discovery System, USA로부터 공급받았으며, 상기 화합물들은 10 mM의 농도가 되도록 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시켜 준비하였다.

스크리닝을 위해, 상기 실시예 1-2의 방법으로 제작된 αMHC-mCherry P19 세포를 low-attachment 96 well 플레이트에 각 well 당 5X102개씩 분주하였고, 이때 각 well에는 상기 라이브러리의 화합물 각각을 1 uM이 처리되도록 하였으며, 2일 동안 세포를 부유배양하여 배아체가 형성되도록 하였다. 이후 배아체를 형성한 세포들을 일반 96 well 플레이트로 옮겨 부착배양 시켰으며, 격일로 배양배지를 교체해주었다. 배양 6일째에 multimode microplate reader(TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 각 well에서 mCherry 형광강도를 측정하였다.

1-4. 면역염색법

상기 실시예 1-2의 방법으로 제작된 αMHC-mCherry P19 세포를 화합물이 처리되거나 처리되지 않은 상태로 3일 동안 부유배양 시킨 후 일반 배양 플레이트로 옮겨 7일 동안 부착배양하였다. 상기 세포를 회수하여 인산완충액(phosphate buffered saline; PBS)으로 2회 세척한 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 15분 동안 고정하였다. 고정된 세포에 0.5% Triton X-100을 처리하고 상온에서 15분 동안 반응시킨 후 5% FBS 및 0.15% Triton X-100이 포함된 블로킹 용액을 1시간 동안 처리하여 비특이적인 반응을 방지하는 블로킹(blocking) 과정을 수행하였다. 이후 블로킹 용액에 1:200의 비율로 희석된 Mef2c(Ab64644, Abcam, MA, USA) 또는 sarcomeric actinin(A7732, Sigma-Aldrich, MI, USA) 1차 항체를 세포에 처리하여 4℃에서 밤새 반응시키고, 인산완충액으로 3회 세척한 후 1:200의 비율로 희석된 alexa 488(A11001, Invitrogen, CA, USA) 또는 alexa 563(A21428, Invitrogen, CA, USA) 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 또한, 세포에 1 ㎎/㎖의 DAPI(Sigma-Aldrich, MI, USA) 용액을 상온에서 5분 동안 처리하여 세포핵을 염색하였으며, 형광현미경으로 세포를 관찰하였다.

실시예 2. 스크리닝을 통한 얼시노익산의 동정

αMHC-mCherry P19 세포를 심근세포로 분화시킬 수 있는 화합물을 규명하기 위하여, 약 800개의 천연물 유래 저분자 화합물이 포함된 라이브러리를 이용하여 실시예 1-3의 방법으로 스크리닝을 수행하였다.

그 결과, 1차 스크리닝을 통하여 대조군에 비하여 높은 효율로 심근세포로의 분화를 유도한 19개의 화합물을 발견하였다. 이에 더하여, 상기 19개의 화합물을 이용하여 심근세포로의 분화실험을 수행하였으며, 이때 양성대조군으로 종래에 알려진 심근세포 분화 유도물질인 옥시토신(oxytocin)을 이용하여 세포에서의 mCherry 형광강도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 옥시토신의 경우 분화 유도물질을 처리하지 않은 경우에 비하여 23.9% 증가된 효율로 심근세포로의 분화를 유도한 반면, 상기 화합물 중 하나인 얼시노익산의 경우 50.5% 증가된 분화효율을 나타내었다.

따라서 상기 결과를 통해, 매우 높은 분화효율을 보인 알칼로이드 계열의 천연물 유래 화합물인 얼시노익산을 동정하였으며, 분화 유도물질로써 얼시노익산의 분화 효율을 검증하기 위한 실험을 추가로 수행하였다.

실시예 3. 얼시노익산에 의한 심근세포로의 분화효율 증가 확인

3-1. beating colonies의 수 및 mCherry 형광강도 측정

얼시노익산에 의한 심근세포로의 분화 효율을 정량적으로 평가하기 위하여, 105개의 αMHC-mCherry P19 세포를 이용하여 심근세포로의 분화를 진행한 후 beating colonies의 수 및 mCherry 형광강도를 측정하였다.

그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, 옥시토신을 처리한 경우 약 83±10개의 beating colonies가 관찰된 반면, 얼시노익산을 처리한 경우 약 117±15개의 beating colonies가 생성된 것을 확인하였다. 이를 통해 얼시노익산을 이용한 경우 옥시토신과 비교하여 심근세포로의 분화 효율이 약 40% 증가하였음을 알 수 있었다.

또한, 형광현미경 관찰을 통해 mCherry 형광강도를 측정한 결과, 도 3B 및 3C에 나타낸 바와 같이, 옥시토신을 처리한 경우와 비교하여 얼시노익산의 경우 형광 이미지 및 정량결과를 통해 mCherry의 형광강도가 약 23.4% 더 높게 측정된 것을 확인하였다.

3-2. 심근세포 마커의 발현 확인

얼시노익산에 의한 심근세포로의 분화 효율을 검증하기 위하여, 분화된 심근세포에서 초기 발현마커인 a-MHC와 달리 후기에 발현하는 마커인 Mef2c 및 α-Actinin(sarcomeric)의 발현량을 면역염색법을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군 및 옥시토신을 처리하여 심근세포로 분화시킨 경우와 비교하였을 때 얼시노익산을 처리한 경우 분화된 심근세포에서 Mef2c 및 α-Actinin(sarcomeric) 마커가 더 많이 발현하는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통해 얼시노익산이 높은 분화 효율로 심근세포로의 분화를 유도할 수 있는 효율적인 분화 유도물질임을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기 화학식 2로 표시되는 얼시노익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 심근세포(cardiomyocyte)로의 분화 유도용 조성물.
[화학식 2]
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제 1 항에 있어서,
상기 얼시노익산은 당귀 종인 안젤리카 얼시나(Angelica ursina)에서 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 심장줄기세포, 또는 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물.
제 1 항의 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 심근세포로의 분화 유도방법.
제 5 항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 심장줄기세포, 또는 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는, 분화 유도방법.
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