KR101667901B1 - 왜성정향나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 왜성정향나무로부터 추출한 추출물 및 상기 추출물로부터 분리한 화학식 1의 시린진(Syringin)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 개선용 조성물에 관한 것이다.

(화학식 1)
본 발명에 의한 왜성정향나무의 추출물 및 상기 추출물로부터 분리한 시린진(Syringin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 개선용 조성물은 부작용이 없으면서도 표피뿐만 아니라 진피까지 침투하여 독소를 제거하고 아토피 피부염을 개선할 수 있다는 장점이 있다.

Description

왜성정향나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 개선용 조성물{Compositions Containing Extract of Syringa velutina var. kamibayashii for Improvement of Atopy}

본 발명은 왜성정향나무(Syringa velutina var. kamibayashii) 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라일락의 일종인 왜성정향나무의 잎과 줄기를 용매를 사용하여 얻은 추출물로부터 분리한 시린진(Syringin)과 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 개선용 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염은 주로 유소아기에 시작되는 만성적이고, 치료 이후에도 재발 가능한 알러지성 및 염증성 피부질환으로서, 소양증(가려움증)과 피부건조증, 특징적인 습진을 동반한다. 유아기에는 얼굴과 팔다리의 펼쳐진 부분에 습진으로 시작되지만, 성장하면서 특징적으로 팔이 굽혀지는 부분과 무릎 뒤의 굽혀지는 부위에 습진의 형태로 나타나게 되며, 많은 경우에는 성장하면서 자연스럽게 호전되는 경향을 보인다. 성인의 경우 팔 또는 무릎 뒤의 접히는 부위의 피부가 두꺼워지는 태선화(lichenification)가 나타나고, 얼굴에 습진이 생기는 경우가 많다. 아토피 피부염은 세계적으로 증가하는 추세이며 선진국인 산업국가에서는 유병률이 인구의 20%라는 보고도 있다.

아토피 피부염의 발병 원인은 아직 확실하게 알려져 있지 않은 상태이고, 임상증상도 피부건조증, 습진 등으로 다양하게 나타나기 때문에 발병 원인이 어느 한가지로만 설명될 수는 없지만, 환경적인 요인과 유전적인 소인, 면역학적 반응 및 피부보호막의 이상 등이 주요 원인으로 여겨지고 있다. 환경적인 요인으로는 산업화로 인한 매연 등 환경 공해, 식품첨가물 사용의 증가, 서구식 주거 형태로 인한 카펫, 침대, 소파의 사용 증가, 실내 온도 상승으로 인한 집먼지, 진드기 등의 알레르기를 일으키는 원인 물질인 알레르겐의 증가 등이 있다. 또한 실내에서 애완동물을 키우는 일이 많아지면서 피부질환을 일으키는 원인 물질에 노출되는 것도 원인이 된다.

아토피를 치료 및 개선과 관련한 종래기술로서, 하기 특허문헌 0001에는 “컬러감자의 두께 5㎜ 이하의 외피 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물”이 개시되어 있다. 그러나 상기 조성물은 혈중 IgE 함량 및 TSLP(Thymic Stromal Lymphopoientin) 레벨을 감소시키고, 혈중 TH2 사이토카인 레벨을 감소시킴으로써 아토피 증상을 완화하는 효과를 나타낸다고 하나, 그 효과가 만족스러운 수준에 이르지 못하고, 컬러감자 가공과정에서 발생되는 껍질 폐기물을 소재로 활용할 수 있는 장점이 있을 뿐이다.

또한 하기 특허문헌 0002에는 “빈랑자 열수 추출물 및 정향수피 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는, TSLP 저해능에 의한 아토피 피부염 개선능을 가지는 화장료 조성물”이 개시되어 있다. 그러나 상기 조성물은 아토피 피부염의 병리적 면역기전인 TSLP의 작용을 길항하므로 그 면역반응을 개선하며, 천연 추출물을 이용하므로 인체에 장기간 적용해도 부작용이 없는 효과가 있다고 하나, 이 또한 그 효과는 만족스러운 수준에 이르지 못하고, 정향은 왜성정향나무와는 전혀 수종이 다른 것이다.

또한 하기 특허문헌 0003에는 “미역귀 추출물과 멍게껍질 정제물의 혼합물 추출액을 포함하는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물”이 개시되어 있다. 그러나 상기 조성물은 미역귀 추출물의 항염증 효과와 멍게껍질 정제물의 세포재생 효과가 상호 상승작용을 통해 아토피성 피부염의 개선효과를 나타낸 것으로 사이토카인의 생성억제에는 관여하지는 않는 것이다.

따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 부작용이 없으면서 독소를 제거하여 아토피를 개선할 수 있는 천연물을 연구하던 중 왜성정향나무의 추출물이 항 아토피 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

국내 등록특허공보 제10-1114506호(2012. 02. 02. 등록) 국내 등록특허공보 제10-1491927호(2015. 02. 03. 등록) 국내 등록특허공보 제10-1484587호(2015. 01. 14. 등록)

본 발명은 부작용이 없으면서 독소를 제거하여 아토피를 개선할 수 있는 왜성정향나무의 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 왜성정향나무로부터 추출한 추출물로부터 분리한 시린진(Syringin)과 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 개선용 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.

본 발명에 의한 왜성정향나무의 추출물로부터 분리한 시린진(Syringin)과 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 개선용 조성물은 부작용이 없으면서도 표피뿐만 아니라 진피까지 침투하여 독소를 제거하고 아토피 피부염을 개선할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 왜성정향나무 추출물에 대한 RBL-2H3 세포주의 세포독성 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 왜성정향나무 추출물로부터 분리한 시린진에 대한 RBL-2H3 세포주의 세포독성 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 왜성정향나무 추출물과 시린진에 대한 RBL-2H3 세포주로부터 IL-31 유전자 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 4, 도 5는 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 피부염증 사진 및 피부임상지수를 나타낸 것이다.
도 6은 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 등피부 조직에서 IL-5, IL-13 mRNA 유전자 발현을 나타내는 것이다.
도 7은 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 등피부 조직에서 IL-31 mRNA 유전자 발현을 나타내는 것이다.
도 8, 도 9는 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 혈청내 IgE의 수준 및 히스타민 분비량을 나타내는 것이다.
도 10 내지 도 13은 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 혈장과 비장세포 내의 싸이토카인 수준을 나타내는 것이다.
도 14, 도 15는 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 ALN에서 총 절대 세포수 변화를 나타내는 것이다.
도 16은 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 등피부 조직에서 총 절대 세포수 변화를 나타내는 것이다.
도 17, 도 18은 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림 제형에 의한 피부 조직에 미치는 영향을 나타내는 것이다.
* 도 3 내지 도 18에서 DNCB-SYR(0.2%), DNCB-SV KBS(2.0%), DNCB-SV KBS(0.5%)는 각각 0.2% 시린진, 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물, 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물을 의미한다.

이하에서는 본 발명을 실시예, 실험예, 도면 등을 참고하여 상세하게 설명하기로 한다.

먼저, 본 발명에 의한 아토피 개선용 조성물은 왜성정향나무로부터 추출한 추출물로부터 분리한 화학식 1의 시린진(Syringin)과 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

(화학식 1)

본 발명은 상기 아토피 개선용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 추출물 이외에 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올 아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 죄제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분 및 광물유 등이 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파리핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 왜성정향나무 잎과 줄기 추출물은 각 재료를 유기용매로써 추출하여 얻을 수 있는데, 그 종류로서는 저급 알코올, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 그 중 에탄올이 가장 바람직하고, 그 농도는 95%의 것을 사용할 수 있다.

한편, 왜성정향나무 추출물을 제조하는 방법에 대하여 설명하면, 구체적으로는 왜성정향나무의 잎과 줄기를 음건(陰乾) 세절하여 95% 에탄올에 3일간 침지한 후에 50℃에서 20분간 추출할 수 있다. 이어서 추출액을 여과하고 감압 건조하여 얻어진 추출여액을 Freezing dryer(Biotrn Co., USA)에서 cold trap 70℃와 chamber 온도 40℃에서 24시간 동안 동결 건조하여 왜성정향나무 추출물을 얻을 수 있다.

계속하여 왜성정향나무 추출물 분석을 위한 HPLC(Waters 2695 system, Waters Co. USA)는 Agilent 1200 시리즈로서 autosampler, column oven, binary pump, DAD detector(Agilent Technologies, Germany), degasser(Agilent Technologies, Japan)를 사용할 수 있으며, 소프트웨어는 Agilent사의 Chemstation software(Agilent Technologies, USA)를 사용한다. HPLC 조건으로 컬럼 오븐의 온도는 25℃, 분석파장은 250㎚, 유속은 0.3㎖/min를 사용하고, 컬럼은 Luna C18 column(250㎜ⅹ4.6㎜ particle size 5㎛, Phenomenex, USA)를 사용한다. 용매로서는 100% 3차 증류수 및 100% 아세토니트릴에 각각 0.1% 포름산을 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명자들은 먼저 제품 표준화를 위해 지표성분의 함량을 조사하였다. 구체적으로, 왜성정향나무 잎과 줄기를 95% 에탄올에서 3일간 침지한 후에 50℃에서 20분간 추출한 다음 이어서 추출액을 여과하고 감압 건조하여 얻어진 추출여액을 Freezing dryer(Biotrn Co., USA)에서 cold trap 70℃와 chamber 온도 40℃에서 24시간 동안 동결 건조하여 왜성정향나무 추출물을 얻을 수 있다.

나아가 왜성정향나무의 추출물로부터 화학식 1의 시린진(Syringin)을 분리하는 방법은 1) 왜성정향나무의 잎과 줄기를 에탄올에 3일간 침지한 후에 50℃에서 20분간 추출하는 제 1단계; 2) 제 1단계에서 추출 후 여과하고 감압 건조하여 추출여액을 얻는 제2단계; 3) 제 2단계에서 얻어진 추출여액을 동결 건조하여 추출물을 얻는 제 3단계; 4) 제 3단계에서 얻어진 추출물을 크로마토그래피로 분리하여 시린진을 얻는 제 4단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하에서는 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐이고, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질이 변하거나 범위가 축소되는 것은 아니다. 하기 실시예에서 제시되지 않은 여러 가지 실시예 및 적용예들이 가능함은 당업자에게 있어 당연할 것이다.

왜성정향나무 추출물의 제조

왜성정향나무에서 음건(陰乾)된 잎과 줄기 총 200g을 적절한 크기로 세절하고 나서 추출기(ASE 300, DIONEX Co., USA)에 투입하여 95% 에탄올 1.5L에 3일간 침지한 후에 50℃에서 20분간 추출하여 추출액을 얻었다. 이어서 상기 추출액을 종이 필터인 Watman #2로 여과하고 감압 건조하여 얻어진 추출여액을 Freezing dryer(Biotrn Co., USA)에서 cold trap 70℃와 챔버 온도 40℃에서 24시간 동안 동결 건조하여 왜성정향나무 추출물 28.81㎎/g을 얻었다.

지표성분의 규격, 실험방법 및 결과

(1) 지표성분의 규격

지표성분은 시린진(Eleutheroside B)을 설정하였다. 실험에 사용한 왜성정향나무(분양번호 003-088, Syringa velutina var. kamibayashii 'Miss Kim', SV_KBS)는 한국생명공학연구원의 한국식물추출물은행으로부터 분양받은 시료로서, 2001년 4월19일에 채집된 물푸레나무과 식물인 왜성정향나무의 잎과 줄기 추출물이다.

(2) 지표성분의 실험방법

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 왜성정향나무의 추출물 성분은 표준물질의 동정으로 함유된 지표성분량을 분석하였다. 상기 추출물의 주요성분으로는 시린진과 이수리엔틴표준시료 시린진 (Eleutheroside B), Cat No.90974 sigma-aldrich, 이수리엔틴 Cat No.78109 sigma-aldrich이 알려져 있고, 그 중 항아토피 개선 활성성분 함량분석을 위하여 HPLC-DAD를 통해서 머무름시간(Rt)을 비교 분석함으로써 항아토피 개선 활성성분의 패턴을 확인하여 표준물질을 동정하였다.

(3) 분석장비

왜성정향나무 추출물 분석을 위한 HPLC(Waters 2695 system, Waters Co. USA)는 Agilent 1200 시리즈로서 autosampler, column oven, binary pump, DAD detector(Agilent Technologies, Germany), degasser(Agilent Technologies, Japan)를 사용하였으며, 소프트웨어는 Agilent사의 Chemstation software(Agilent Technologies, USA)를 사용하였다.

HPLC 조건으로 컬럼 오븐의 온도는 25℃, 분석파장은 250㎚, 유속은 0.3㎖/min를 사용하였고, 컬럼은 Luna C18 column(250㎜ⅹ4.6㎜ particle size 5㎛, Phenomenex, USA)을 사용하였다. 용매로서는 100% 3차 증류수 및 100% 아세토니트릴에 각각 0.1% 포름산을 첨가하여 사용하였다. 지표성분으로 시린진(Eleutheroside B)과 이수리엔틴을 표준시료(시린진, Eleutheroside B, Cat No.90974 sigma-aldrich, 이수리엔틴 Cat No.78109 sigma-aldrich)와 왜성정향나무 추출물에서의 성분분석을 하였다.

(4) 분석 결과

상기 추출물 성분에 함유된 표준물질의 동정에 있어 HPLC-DAD를 통해서 머무름시간(Rt)의 일치를 통하여 표준물질인 왜성정향나무 추출물의 패턴과 시린진을 확인하여 동정하였으며, 왜성정향나무 추출물의 시린진 함량은 15.252㎎/ｇ이고, 미리 표준분석에 의하여 동정한 이수리엔틴은 왜성정향나무 추출물에서의 함량이 6.06 ㎎/ｇ으로 분석되었다.

<실험예> 시험관 실험 및 동물 실험

<실험예 1> 시험관 실험

(1) RBL-2H3 세포주 배양

RBL-2H3 비만세포주(ATCC, USA)를 10% FBS, 10% T-stim, 0.05mM 2-머캅토에탄올, 2mM L-글루타민(Sigma-Aldrich, USA) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에 10⁵cells/㎖ 농도로 맞추어 96 well plate에 분주하였다.

(2) 세포 독성 측정

세포독성은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide]법으로 시험을 실시하였다. MTT assay는 세포내 미토콘드리아의 디하이드로게나제(dehydrogenase)에 의해 생성되는 포마잔(formazan) 측정을 통해 세포의 증식이나 독성을 조사하는 방법으로서, 즉, 배양한 RBL-2H3 비만세포를 배양접시에 5x10⁴cells/㎖의 농도로 시딩(seeding)하여 60∼70%의 세포배양용기에 채워질 때까지 배양하였다. 성장배지를 제거하고 FBS를 포함하지 않는 유지배지에 희석한 각각의 왜성정향나무 추출물의 최종 농도 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25㎍/㎖과 시린진의 최종 농도 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56㎍/㎖의 농도로 희석하여 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 1㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 가하고 4시간 반응시킨 후, 배지를 제거하고 생성된 포마잔의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 판정하였다.

<실험예 2> 동물 실험

(1) 실험동물

실험동물은 수컷으로 7주령의 20~22g NC/Nga 생쥐(SLC, Inc, Japan)를 중앙실험동물(주)에서 공급받았다. 동물은 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22℃, 습도 55%, 12시간 light-dark cycle의 환경을 유지하며 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 그리고 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대전대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: DJUARB2015-039)을 받았다.

(2) DNCB 유도 피부염 유발

7주령의 NC/Nga 생쥐를 1 주일 동안 적응시킨 후 상기 생쥐의 등(귀 하단부에서부터 꼬리 상단부)을 제모하고 24시간 방치 후 1%의 디니트로클로로벤젠(DNCB)이 들어 있는 아세톤 : 올리브오일(3 : 1) 200㎕를 제모 부위에 도포하고, 3일 후 2차 도포하였다. 1차 도포 후 7일째부터는, 1주일에 3회씩 3주간 0.4% DNCB 용액 150㎕를 3차 도포(10주령 ∼13주령)하여 아토피 피부염을 유발시켰으며(Scheme 1), 피부발진 육안 평가는 야마모토의 평가항목을 참고하여 홍반/출혈, 건조/흉터, 부종, 박리/짓무름, 태선화의 5가지 항목으로 하고 육안 평가하여 아토피 피부발진을 판단하였다.

(3) 약물처리 및 치료평가

시료 도포는 0.4% DNCB를 2주간 최종 도포한 후에 0.2% 시린진, 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물, 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물, 그리고 양성대조군으로 0.3% FK506(tacrolimus)을 각각 크림형으로 제조하여 각각 3주간(12~15주령) 오전 11시에 1회씩 등 부분에 골고루 도포하여 실험군으로 설정하였고, 양성 대조 약물로 FK506 0.3%를 주 5회 발진된 등 부위에 도포하여 양성대조군으로 설정하였다. 그리고 시료 도포 종료한 다음 혈액을 채혈하고 등 부위의 피부를 절제하여 10% 포르말린 용액에 담아 보관하였다.

(4) 왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림제형 제조

왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림제형은 수상, 유상, 안정제에 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물, 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물, 0.2% 시린진, 그리고 대조군으로 0.3% FK506의 제형을 혼합하여 제조하였으며 구성성분은 다음과 표와 같다.

왜성정향나무 추출물과 시린진의 크림제형

구성성분		시린진/왜성정 향나무추출물1	시린진/왜성정 향나무추출물2	시린진	대조군 FK 506
수상	글리세린	10.00	10.00	10.00	10.00
	실리콘 유도체	0.20	0.20	0.20	0.20
	Microcide-C	0.20	0.20	0.20	0.20
	EDTA-2Na	0.01	0.01	0.01	0.01
	Keltrol F(1%)	5.00	5.00	5.00	5.00
	Sepiplus 400	0.30	0.30	0.30	0.30
유상	Lanette O	2.00	2.00	2.00	2.00
	Olive M 1000	1.00	1.00	1.00	1.00
	Tego care 450	2.00	2.00	2.00	2.00
	Puresyn 4	2.00	2.00	2.00	2.00
	TCG-M	3.00	3.00	3.00	3.00
	DC 200/6cs	2.50	2.50	2.50	2.50
	Lipex Shea	1.00	1.00	1.00	1.00
	비타민 E	0.50	0.50	0.50	0.50
	D-P	0.10	0.10	0.10	0.10
	BHT	0.02	0.02	0.02	0.02
안정제	TEA	0.10	0.10	0.10	0.10
	Di water	2.00	2.00	2.00	2.00
유효성분	시린진	0.2	0.2	0.2	-
	추출물	2.0	0.5	-	-
	FK 506	-	-	-	0.3
정제수		잔량	잔량	잔량	잔량
합 계		100중량%	좌동	좌동	좌동

상기 성분들을 사용하여 크림 제조를 위한 화장품 제조분야에서의 통상적인 방법에 따라 제조하였다.

(5) 통계 분석

각 실험군 결과값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을 사용하여 통계

처리하였으며, p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001)

<실험 결과>

<실험예 1> 시험관 실험

(1) RBL-2H3 세포주의 세포생존 능력

왜성정향나무 추출물과 시린진에 대한 항아토피 개선 효과를 측정하기 위하여 RBL-2H3 세포주의 세포독성을 확인한 결과, [도 1]에서처럼 왜성정향나무 추출물은 6.25~200㎍/㎖ 처리농도에서는 세포독성이 없었고, 200~400㎍/㎖에서 세포독성이 나타났다. 또한 시린진은 [도 2]에서처럼 1.56~100㎍/㎖의 모든 농도에서 세포 독성이 거의 나타나지 않았다.

(2) RBL-2H3 세포에서 IL-31 유전자 발현의 정향나무 추출물과 시린진 효과

RBL-2H3 세포를 48-well plate에 5×10⁵/㎖로 1㎖씩 분주하고 24시간 동안 배양한 후에 왜성정향나무 추출물 200, 100, 50, 25, 12.5㎍/㎖와 양성대조군으로 CsA 10㎍/㎖를 처리하고 1시간 후에 PMA 50ng/㎖와 이오노마이신 0.5μM으로 자극한 뒤 6시간 후에 세포를 얻었다. [도 3]에서처럼 비만세포에서 소양증의 원인이 된다고 보고되고 있는 IL-31 mRNA 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, RBL-2H3 세포에 CsA와 다양한 농도의 왜성정향나무 추출물과 시린진을 처리한 후 PI로 자극한 뒤 6시간 후 실시간 PCR로 mRNA 유전자 발현을 분석한 결과에서 IL-31 mRNA 유전자 발현은 정상군에 비하여 PI만으로 자극한 대조군 (PI-CT)이 각각 현저한 유전자 발현의 증가가 나타났고, CsA 처리 두 PI로 자극한 양성대조군은 대조군 (PI-CT)에 비하여 56% 이상 IL-31 mRNA 유전자 발현을 억제하였다. 실험군에서는 왜성정향나무 추출물 처리 200㎍/㎖과 100㎍/㎖에서, 그리고 시린진 처리 100㎍/㎖, 50㎍/㎖ 농도 의존적으로 대조군에 비하여 각각 16.2%, 29.5%, 49.9%. 38.1% 나 유전자 발현을 크게 억제하였다(도 3 참조).

<실험예 2> 동물 실험

(1) 피부임상지수

디니트로클로로벤젠(DNCB)을 도포한 대조군에서 긁는 행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 증상이 확인되었다. 대조군에 비하여 0.3% FK506을 도포한 양성대조군은 피부 발진/피부발진점수가 줄어들었으며, 그리고 실험군인 피부 발진/피부발진점수는 0.2% 시린진, 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군도 등 피부의 홍반/출혈, 건조/흉터, 부종, 박리/짓무름, 태선화가 감소하였다[도 4, 5]. 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군은 등 피부의 홍반/출혈, 건조/흉터 등은 감소하였지만, 피부염증 등은 대조군과 차이가 없었다[도 4, 5].

(2) 등 피부조직에서 IL-5, IL-13, IL-31 mRNA 유전자 발현 분석

[도 6]에서 보듯이 등피부 조직(dorsal skin tissue)에서 IL-5와 IL-13 mRNA 유전자 발현은 정상군은 각각 0.239과 0.371이었고, 대조군(DNCB-CT)은 각각 0.951과 1.121로 정상군에 비하여 각각 약 3.9배와 3.0배 이상 유전자발현이 증가하여 나타났다. 실험군인 0.3% FK506 도포군(p<0.001), 0.2% 시린진 (p<0.001)(p<0.05), 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군(p<0.001)(p<0.05)에서는 IL-5와 IL-13 mRNA 유전자 발현이 각각 통계학적으로 유의성 있게 억제하였다. 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군은 대조군과 차이가 없었다[도 6].

최근 피부 소양증의 마커로 IL-31 기전이 많이 밝혀져 있어 IL-31 mRNA 유전자 발현을 피부에서 관찰하였다. 그 결과 [도 7]처럼 IL-31 mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.215이었고, 대조군은 1.379로 정상군에 비하여 약 6.4배 유전자발현이 증가하여 나타났다. 실험군인 0.3% FK506 도포군 (p<0.05), 0.2% 시린진 도포군 (p<0.05), 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군 (p<0.05)에서는 IL-31 mRNA 유전자 발현이 각각 통계학적으로 유의성 있게 억제하였다. 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군은 대조군과 차이가 없었다[도 7].

(3) 혈청 IgE에 미치는 영향

혈청내 IgE의 수준은 11주차에 정상군에서 109.4pg/㎖로 자연적으로 증가되었고, 14주차에서 대조군(DNCB-CT)에서 251.7pg/㎖로 정상군에 비하여 현저하게 증가하였으며, 0.3% FK506 양성대조군에서는 157.2pg/㎖로 대조군에 비하여 약 37.4%이상 유의성 있게 감소되었으며(p<0.05), 0.2% 시린진 도포군에서는 156.8pg/㎖로 대조군에 비하여 약 37.5% 이상 통계학적으로 유의성 있게 감소되었고(p<0.01), 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군에서 175.2pg/㎖로 대조군에 비하여 약 30.1% 이상 유의성 있게 감소되었다(p<0.01). 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군은 대조군과 차이가 없었다[도 8].

그리고 혈청내 히스타민 분비량은 정상군에 비하여 대조군이 약 7배 이상 현저하게 증가하였으며, 0.3% FK506 양성대조군 도포군과 0.2% 시린진 도포군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되었고(p<0.001), 또한 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군에서는 대조군에 비하여 통계학적 유의성 있게 감소되었다(p<0.01). 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군은 대조군과 차이가 없었다[도 9].

(4) 혈장과 비장세포 내의 싸이토카인 수준

혈청 내 TNF-α 생산량은 [도 13]에서처럼 정상군에서는 197.3pg/㎖이었으며, 대조군(DNCB-CT)에서는 313.5pg/㎖로 정상군에 비하여 증가하였고, 0.3% FK506 양성대조군에서는 202.5pg/㎖로 대조군에 비하여 유의성 있게 TNF-α 생산을 억제하였으며 (p<0.01), 실험군인 0.2% 시린진와 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군에서는 각각 228.0pg/㎖, 211.5pg/㎖로 대조군에 비하여 TNF-α 생산을 통계학적으로 유의성 있게 억제하였다. [도 10], [도 12]에서는 α-CD3 mAb로 자극한 배양상층액 내의 Th2싸이토카인인 IL-4와 IL-13 생산량은 정상군에서는 각각 189.2pg/㎖와 196.4pg/㎖이였으며, 대조군에서는 각각 324.5pg/㎖와 269.8pg/㎖로 정상군에 비하여 현저한 증가를 나타내었다. 0.3% FK506 도포군에서는 각각 85.5pg/㎖와 220.3pg/㎖으로 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 IL-4 (p<0.001)와 IL-13(p<0.001) 생산을 억제하였다.

실험군인 0.2% 시린진 도포군에서의 IL-4와 IL-13 생산량은 각각 195.7pg/㎖와 230.8pg/㎖으로 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 IL-4 (p<0.001)와 IL-13 (p<0.05) 생산을 억제하였다[도 10], [도 12]. 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군에서의 IL-4와 IL-13 생산량은 각각 202.4pg/㎖와 233.4pg/㎖으로 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 IL-4 (p<0.001)와 IL-13 (p<0.01) 생산을 억제하였다. 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군에서의 IL-4와 IL-13 생산량은 대조군과 차이가 없었다[도 10], [도 12].

[도 11]에서 α-CD3 mAb로 자극한 배양상층액 내의 Th1 싸이토카인인 IFN-γ 수준은 정상군, 대조군, 0.3% FK506도포군, 그리고 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군에서 무자극 실험군과 큰 차이 없이 비슷한 결과를 나타냈지만, 실험군인 0.2% 시린진 도포군(p<0.01)과 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군 (p<0.01)에서의 IIFN-γ 생산량은 각각 1758.3pg/㎖와 2331.2pg/㎖로 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 각각 4.19배, 5.55배 이상 생산을 억제하였다.

(5) 면역형광염색에 의한 세포 함량 변화

1) ALN에서 총 절대 세포수 변화

[도 14A], [도 14B]에서처럼 CD4+Th 총 절대세포수는 정상군에서 3.6±1.07(×10⁵)이며, 대조군에서 29.9±5.08(×10⁵)로 정상군에 비하여 약 8.3배 증가하였고, 0.3% FK506 도포군에서 5.4±1.92(×10⁵)로 대조군에 비하여 약 5.5배 유의성 있게 감소하였으며 (p<0.001), 0.2% 시린진 도포군(p<0.001)과 2% 왜성정향나무 추출물 도포군(p<0.001)에서는 대조군에 비하여 각각 약 3.6배 이상 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다. [도 15C], [도 15D]에서처럼 B세포 활성세포인 B220+CD23+ 총 절대세포수는 정상군에서 5.06±0.7(×10⁵)이며, 대조군에서 46.3±11.5(×10⁵)로 정상군에 비하여 약 9.1배 증가하였고, 0.3% FK506 도포군에서 7.69±2.66(×10⁵)로 대조군에 비하여 약 6.0배 유의성 있게 감소하였으며(p<0.01), 0.2% 시린진 도포군(p<0.01)과 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군 (p<0.05)에서는 대조군에 비하여 각각 약 2.7배 이상 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다.

2) 등피부 조직에서 총 절대 세포수 변화

[도 16A], [도 16B]는 등피부 조직세포 중에서 Gr-1+CD11b+총 절대세포수는 정상군에 비하여 대조군이 현저하게 증가하였고, 0.3% FK506 도포군, 0.2% 시린진 도포군, 그리고 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군에서 대조군에 비하여 Gr-1+CD11b+총 절대세포수가 감소하였으나, 통계학적으로 유의성은 없었다. 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군은 대조군과 차이가 없었다[도 16A], [도 16B].

(6) 등피부 조직 검사 및 분석

H&E 염색 결과, 정상군[도 17]의 피부조직에 비해 대조군(DNCB-CT)은 표피의 두께가 과형성, 확장되어(녹색 화살표로 표시) 그 주변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증, 비만세포의 침윤 등이 증가하였고, 0.3% FK506 도포군의 일부는 대조군에 비하여 정상군에 가깝게 표피의 두께가 줄어들었으며, 그 주변에 세포변형과 각화증상, 비만세포 침윤 등이 감소하였다. 실험군인 0.2% 시린진 도포군은 대조군에 비하여 표피의 두께가 정상군에 가깝게 현저하게 줄어 그 주변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증, 비만세포의 침윤 등이 감소하였으며, 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군은 대조군에 비하여 표피의 두께가 약간 줄어들었고, 그 주변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증, 비만세포의 침윤 등이 감소하였다.

비만세포의 침윤정도를 알 수 있는 톨루이딘 염색 결과, [도 18]과 같이 대조군은 표피 주변에 비만세포(화살표로 표시)가 많이 침윤되었으나(톨루이딘 블루염색), 0.3% FK506 도포군, 0.2% 시린진 도포군 및 0.2% 시린진 + 2% 왜성정향나무 추출물 도포군에서는 대조군에 비하여 비만세포가 감소하였다. 그러나 0.2% 시린진 + 0.5% 왜성정향나무 추출물 도포군은 대조군과 차이가 없었다.

결론적으로 피부조직검사와 혈청 IgE 수준에서 보듯이 왜성정향나무 추출물과 항아토피의 활성성분이 시린진 도포가 디니트로클로로벤젠(DNCB)으로 유도된 아토피성 피부발진 모델에서 과다형성에 의한 표피 두께의 확장과 비만세포의 침윤 감소 및 혈중 IgE 수준을 감소시켰다.

상기 실시예 등은 본 발명을 보다 상세히 설명하고자하는 예시적인 것일 뿐이고, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질이 변하거나 범위가 축소되는 것은 아니다. 상기 실시예에서 제시되지 않은 여러 가지 실시예 및 적용예들이 가능함은 당업자에게 있어 당연할 것이다.

Claims (5)

1. 왜성정향나무의 잎과 줄기로부터 추출한 추출물로부터 분리한 화학식 1의 시린진(Syringin)과 상기 추출물을 0.2 : 2.0중량%의 비율로 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 개선용 조성물.
   

   

   (화학식 1)
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물과 시린진은 에탄올로 추출된 것을 특징으로 하는 아토피 개선용 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
   상기 조성물은 크림, 클렌징 크림, 영양 크림, 맛사지 크림, 아이 크림 중에서 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 아토피 개선용 조성물.
   

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