KR101654313B1

KR101654313B1 - 혼합 미셀을 이용한 시토크롬 p450(cyp)의 정제 방법

Info

Publication number: KR101654313B1
Application number: KR1020140134817A
Authority: KR
Inventors: 안태호; 윤철호; 배춘식
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2014-10-07
Publication date: 2016-09-22
Also published as: KR20160041245A

Abstract

본 발명은 시토크롬 P450(CYP)의 정제 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 대표적인 단백질 정제 방법인 친화성-태그 및 크로마토그래피 등을 이용하지 않고, 혼합 미셀을 이용하여 원-스텝 방식으로 시토크롬 P450을 간편하고 신속하게 고효율 및 고순도로 정제할 수 있다. 본 발명은 혼합 미셀 및 아비딘-비드를 포함하는 시토크롬 P450(CYP) 정제용 조성물을 제공한다.

Description

혼합 미셀을 이용한 시토크롬 P450(CYP)의 정제 방법{Purification Method for Cytochrome P450 Using Mixed Micelle}

본 발명은 혼합 미셀을 이용한 시토크롬 P450(CYP)의 정제 방법에 관한 것이다.

시토크롬 P450(CYP 또는 P450) 효소는 주로 생체 이물 화합물(xenobiotic chemicals) 및 내인성 기질의 산화에 관여하며[1], 다양한 형태의 P450이 포유동물에 존재한다[2]. 인간 및 소장에서 가장 풍부하게 존재하는 P450 효소인 인간 CYP3A4는 약 50%의 효소 치료제에 대한 대사를 촉매하는 것으로 알려져 있어 큰 관심을 모은다[3]. 인간 CYP1A2는 대부분 간에 위치하며, 발암성 아릴기 및 헤테로사이클릭 아민 활성화를 포함하는 다양한 화합물의 대사에 중요한 역할을 한다[4]. 고순도로 정제된 재조합 단백질의 생산은 단백질 연구 영역에서 매우 중요하다. 이를 위해, FLAG, HA, GST 및 폴리-His와 같은 친화성-태그가 개발되고 있다[5]. 이러한 친화성-태그 시스템은 크로마토그래픽 캡처 및 용출 과정을 통해 다양한 단백질의 빠른 분리(보통 원-스텝)가 가능하며, 그로 인해 단백질 정제에 널리 적용되고 있다. 그러나, 각 친화성-태그 정제 방법은 관심 단백질에 영향을 미칠 수 있는 특이적 버퍼 조건하에서 실시된다. 또한, 융합 단백질의 3차 구조 및/또는 생물학적 활성은 아미노산 조성물과 같은 그들의 화합물 특성에 의존적인 태그에 의해 변화될 수 있다[6]. 더욱이, 태그는 적합한 절단 방법(예컨대, 단백질의 결정화)을 통해 제거해야하는 불편함이 있다. 재조합 인간 P450 효소는 약물 대사 연구에 유용한 것으로 알려져 왔으며, 그에 따라 상기 효소에 대한 이종숙주 발현 및 정제 방법에 대한 많은 연구가 수행되고 있다[7]. 또한, 인위적 또는 자연적 지질을 이용하여 P450을 막으로 재구성 시키기 위한 다양한 어세이 시스템이 개발되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종래의 단백질 정제 방법인 친화성-태그(affinity-tag) 및 크로마토그래피 등을 이용하지 않으면서 효율적으로 시토크롬 P450을 정제할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 혼합 미셀(mixed micelle)을 이용하여 원-스텝 방식으로 시토크롬 P450을 정제할 수 있는 신규한 정제 프로토콜을 개발하였고, 이 정제 프로토콜에 의해 시토크롬 P450을 간편하고 신속하게 고효율 및 고순도로 정제할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 시토크롬 P450(CYP)의 정제 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 시토크롬 P450(CYP)의 정제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 시토크롬 P450(CYP)의 정제 방법을 제공한다:

(a) 시토크롬 P450을 발현하는 세포로부터 막단백질을 포함하는 막 분획을 수득하는 단계;

(b) 상기 막 분획을 가용화하는 단계;

(c) 상기 가용화된 막 분획에 혼합 미셀(mixed micelle)을 첨가하는 단계;

(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 아비딘-비드(avidin-beads)를 첨가하는 단계; 및

(e) 상기 단계 (d)의 결과물을 원심분리하여 결과물로서 시토크롬 P450을 수득하는 단계.

본 발명자들은 종래의 단백질 정제 방법인 친화성-태그(affinity-tag) 및 크로마토그래피 등을 이용하지 않으면서 효율적으로 시토크롬 P450을 정제할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 혼합 미셀(mixed micelle)을 이용하여 원-스텝 방식으로 시토크롬 P450을 정제할 수 있는 신규한 정제 프로토콜을 개발하였고, 이 정제 프로토콜에 의해 시토크롬 P450을 간편하고 신속하게 고효율 및 고순도로 정제할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 시토크롬 P450의 정제방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 시토크롬 P450을 발현하는 세포로부터 막 분획 수득

본 발명에 따르면, 우선 시토크롬 P450을 발현하는 세포로부터 막단백질을 포함하는 막 분획을 수득한다.

본 발명에서 이용되는 시토크롬 P450을 발현하는 세포는 대장균, 포유류 세포, 식물세포 또는 곤충세포일 수 있다.

본 발명의 시토크롬 P450을 발현하는 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 적합한 발현 컨스트럭트를 갖는 벡터를 세포에 형질전환 시켜 상기 세포를 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 시토크롬 P450을 발현하는 세포는 적절한 발현 컨스트럭스트를 갖는 벡터에 의해 인간 시토크롬 P450 cDNA가 형질전환된 대장균이다.

상기 인간 시토크롬 P450 cDNA는 바람직하게는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 올리고뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 인간 시토크롬 P450 cDNA가 형질전환된 대장균의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 대장균의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하다.

인간 시토크롬 P450 cDNA가 형질전환된 대장균을 배양하여 인간 시토크롬 P450의 발현을 유도한 후, 막단백질을 포함하는 막 분획을 수득한다. 대장균으로부터 막 분획을 수득하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

단계 (b): 막 분획 가용화

상기 단계에 의해 얻어진 막 분획으로부터 막 단백질인 시토크롬 P450을 분리하기 위해 막 분획을 가용화한다.

막 분획의 가용화 방법은 당업계에 공지된 다양한 프로토콜을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 막 분획의 가용화를 위해 수득한 막 분획과 엔-옥틸글루코시드 및 비이온 투석가능 세제(nonionic dialyzable detergent)를 혼합하고 바스(bath) 초음파기에서 25-35℃ 온도 조건으로 5분-20분 동안 배양한다.

단계 (c): 혼합 미셀 첨가

상기 단계에 의해 가용화된 막 분획에 혼합 미셀을 첨가한다.

본 발명에서 이용되는 혼합 미셀은 (i) 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine; lyso-PC); (ⅱ) 비오티닐-PE; 및 (ⅲ) 포스파티드산(phosphatidic acid; PA) 또는 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS)의 조합으로 제조한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀은 리소포스파티딜콜린 39-59 mol%, 비오티닐-PE 0.1-5 mol% 및 포스파티드산 또는 포스파티딜세린이 40-60 mol% 비율로 혼합하여 제조한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀은 리소포스파티딜콜린 44-54 mol%, 비오티닐-PE 0.1-3 mol% 및 포스파티드산 또는 포스파티딜세린 45-55 mol% 비율로 혼합하여 제조한다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀은 리소포스파티딜콜린 49 mol%, 비오티닐-PE 1 mol% 및 포스파티드산 또는 포스파티딜세린 50 mol% 비율로 혼합하여 제조한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀에 포함되는 리소포스파티딜콜린은 탄소 길이가 2 내지 12개인 리소포스파티딜콜린이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀에 포함되는 리소포스파티딜콜린은 8:0 리소포스파티딜콜린, 10:0 리소포스파티딜콜린 또는 11:0 리소포스파티딜콜린이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀에 포함되는 리소포스파티딜콜린은 10:0 리소포스파티딜콜린이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀에 포함되는 포스파티드산은 16:0-18:1 포스파티드산이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 미셀에 포함되는 포스파티딜세린은 16:0-18:1 포스파티딜세린이다.

가용화된 막 분획에 상기 혼합 미셀을 첨가한 후, 막 분획 내 시토크롬 P450과 혼합 미셀이 결합할 수 있도록 25-35℃ 온도 조건에서 약하게 진탕하면서 10분-1시간 동안 배양한다.

단계 (d): 아비딘-비드 첨가

상기 단계의 결과물에 아비딘-비드를 첨가한다.

아비딘-비드는 시토크롬 P450과 혼합 미셀 결합물을 침전시켜 분리 정제하기 위해 첨가된다. 아비딘-비드는 혼합 미셀과 결합하며 원심분리 시 침전된다.

비드에 고정화된 아비딘을 상기 단계 (c)의 결과물에 첨가하고 25-35℃ 온도 조건에서 10분-1시간 동안 배양한다.

단계 (e): 시토크롬 P450 수득

상기 아비딘-비드 첨가에 의해 얻어진 시토크롬 P450을 포함하는 미셀-비드 복합체를 원심분리하여 시토크롬 P450을 수득한다.

미셀 및/또는 아비딘-비드에 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해 원심분리, 상층액 제거 및 반응 버퍼로 부유시키는 과정을 포함하는 세척단계를 추가적으로 반복 실시할 수 있다.

시토크롬 P450을 포함하는 미셀-비드 복합체를 원심분리하고 상등액을 제거하여 최종적으로 시토크롬 P450을 수득한다.

본 발명에 따르면, 혼합 미셀 및 아비딘-비드를 이용하여 친화성 태그를 사용하지 않고도 고순도의 시토크롬 P450를 수득할 수 있다.

본 발명의 방법은 시토크롬 P450 패밀리에 속하는 다양한 시토크롬 P450, 바람직하게는 CYP3A4 및 CYP1A2의 정제에 매우 유효하다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 혼합 미셀 및 아비딘-비드를 포함하는 시토크롬 P450(CYP) 정제용 조성물을 제공한다:

(a) 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine; lyso-PC)

(b) 비오티닐-PE; 및

(c) 포스파티드산(phosphatidic acid; PA) 또는 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 정제 방법을 실시하기 위한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 시토크롬 P450(CYP)의 정제 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에 따르면 대표적인 단백질 정제 방법인 친화성-태그 및 크로마토그래피 등을 이용하지 않고, 혼합 미셀을 이용하여 원-스텝 방식으로 시토크롬 P450을 간편하고 신속하게 고효율 및 고순도로 정제할 수 있다.

(ⅲ) 본 발명은 혼합 미셀 및 아비딘-비드를 포함하는 시토크롬 P450(CYP) 정제용 조성물을 제공한다.

도 1은 P450 3A4 및 1A2에 해당되는 각 cDNA를 포함하는 pCW 플라스미드에 대한 모식도이다.
도 2a는 정제된 P450 3A4 및 1A2의 SDS-PAGE 분석 결과이고, 도 2b는 PA 농도에 따른 정제도를 나타낸 그래프이며, 도 2c는 lyso-PC 탄소 길이에 따른 효소 정제도를 나타낸 그래프이다.
(a)에서 혼합 미셀(약 2.7 μg)에 결합된 단백질을 10%(w/v) 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동한 다음, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염료로 염색하였다. 레인 1 및 2는 각각 정제된 CYP3A4 및 CYP1A2를 나타낸다. 화살표 및 숫자는 분자량 마커를 나타낸다.
(b)에서 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:018:1 PA로 구성된 미셀을 사용할 경우, 정제도는 1로 설정하였고 상대값은 다양한 PA 농도에 대해 도시하였다. 50 mol% 16:018:1 PA를 포함하는 혼합 미셀을 사용한 경우, P450 3A4 및 1A2 각각의 정제도는 ^#,+p-값 <0.05로 유의적인 차이를 나타냈다.
(c)에서 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE 및 50 mol% 16:018:1 PA로 구성된 혼합 미셀을 사용한 경우, 정제도는 1로 설정하였고 상대값은 lyso-PC의 다양한 탄소 길이에 대해 도시하였다. 10:0 lyso-PC를 포함하는 혼합 미셀을 사용한 경우, P450 3A4 및 1A2 각각의 정제도는 ^#,+p-값 <0.05로 유의적인 차이를 나타냈다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

재료

NADP+, 글루코오스-6-포스페이트, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로제나아제, 테스토스테론, 7-에톡시레소루핀, 6β-하이드록시테스토스테론 및 옥틸-b-D-글라이코피라노사이드(n-옥틸글루코시드)는 Sigma Chemical Co.(미국)으로부터 구입하였다. 6% 아가로오스 비드에 고정화된 아비딘 및 스트렙타비딘이 코팅된 96-웰 플레이트는 Pierce Biotechnology(미국)로부터 구입하였다. 바이오티닐-PE를 포함하는 모든 인지질은 Avanti Polar Lipids(미국)로부터 구입하였다. 재조합 랫트 NADPH-P450 환원효소는 대장균에서 발현시킨 다음, [8]에 설명된 바와 같이 정제하였다.

혼합 미셀 및 지방 이중층 제조

49 mol% lyso-PC(8:0, 10:0, 11:0 또는 12:0 lyso-PC), 1 mol% 16:0 바이오티닐-PE 및 50 mol% 16:018:1 인지질(16:018:1 PA, 16:018:1 PS 또는 16:018:1 PC)을 표준 혼합 미셀 성분으로 사용하였다. 16:018:1 인지질을 제외시키는 경우, 99 mol% 10:0 lyso-PC 및 1 mol% 16:0 바이오티닐-PE로 구성된 지질 조성물이 사용된다. P450 3A4 및 1A2 정제에 있어서 지질 이중층을 갖는 인위적인 멤브레인의 효과를 조사하기 위해, 99 mol% 16:018:1 인지질 및 1 mol% 16:0 바이오티닐-PE를 포함하는 지질 혼합물을 사용하였다. 적정량의 지질을 클로로포름에 녹인 후, 아르곤 가스 증기 하에서 용매를 증발시켰다. 혼합 미셀을 준비하기 위해, 건조 지질을 버퍼 용액(25 mM TrisHCl, pH 7.4, 100 mM NaCl)에서 볼텍싱 혼합하고, 프로브-타입 초음파 분쇄기에서 간단히 분쇄(30초간)하여 수화시켰다. 99 mol% 16:018:1 인지질 및 1 mol% 16:0 바이오티닐-PE로 구성된 LUV를 [11]에 기술된 압출 방법을 이용하여 준비하였다.

P450 효소의 발현 및 정제

인간 간(liver) P450 3A4 및 1A2에 해당되는 각 cDNA를 포함하는 pCW 플라스미드(도 1)로 형질전환된 대장균에서 발현을 유도하였다[12, 13].

상세하게는 먼저, P4501A2와 3A4 유전자를 포함하는 플라스미드를 대장균 DH5α F'-IQ 세포주에 도입하여 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 세포를 앰피실린이 100 μg/ml 농도로 포함된 고체 Luria-Bertani 배지에서 12시간 배양하여 콜로니를 얻었다. 콜로니의 일부를 취하여 100 μg/ml의 앰피실린, 1.0 mM 티아민, 50 μM FeCl₃, 1 mM MgCl₂, 2.5 mM(NH₄)₂SO₄가 포함된 TB(Terrific broth) 배양액 250 mL에 접종하고 600 nm에서의 흡광도 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양액에 이소프로필-1-티오-D-갈락토-피라노사이드와 δ-ALA(aminoevulinic acid)를 각각 최종 농도 1 mM와 0.5 mM이 되도록 첨가한 후 37℃에서 6시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000xg, 4℃에서 30분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 침전된 세포를 50 mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.4)에 현탁시킨 후, 재원심분리하여 세포를 침전시켰다.

세포막을 분리하기 위해 배양액 1 L로부터 단백질이 발현된 세포를 얻은 후, 10 mM 인산칼륨(pH 7.5), 1 mM EDTA, 20% 글리세린 완충용액 30 mL에 현탁시킨 다음 French Pressure Cell에 18,000 psi 압력으로 통과시켰다. 12,000xg, 4℃에서 15분간 원심분리하여 세포 파편을 침전시킨 다음, 침전물을 제거하고 상등액만을 취한 후, 140,000xg, 4℃에서 2시간 동안 초원심분리하여 세포막을 침전시켰다. 세포막 침전물에 50 mM 인산칼륨(pH 7.4), 100 mM KCl, 1 mM EDTA 완충용액 20 mL에 재현탁시켜 세포 막 분획을 수득하였다.

막 분획을 가용화하기 위해 샘플을 비이온성 투석이 가능한 n-옥틸글루코시드 1%(w/v, 최종 농도)[14]와 혼합하고, 바스(bath) 초음파 분쇄기에서 30℃ 조건으로 10분간 배양하였다. 재조합 P450 효소를 분리하기 위해, 혼합 미셀 또는 리포좀(최종 포스페이트 농도 1.5 mM)을 가용화 분획(총 단백질 농도, ~12 mg/mL)에 가하고, 약하게 진탕하면서 샘플을 30℃ 조건에서 20분간 배양하였다. 엔-옥틸글루코시드는 단백질 용액과 미셀(또는 리포좀)을 혼합하여 0.15%(w/v) 까지 희석하였다. 비드에 고정화된 아비딘(베드 볼륨 50 μl)을 1 mL의 샘플에 첨가하고, 30℃ 조건에서 20분간 배양하였다. 샘플을 원심분리(10,000 ×g, 30℃, 5분)한 후, 펠렛을 반응 버퍼(100 mM 인산칼륨, pH 7.4, 100 mM NaCl)로 재분산시켰다. 미셀(또는 리포좀) 및/또는 비드에 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해, 세척 단계(원심분리, 상층액 제거 및 반응 버퍼로 샘플 재분산)를 실시하였다. 재분산시킨 샘플에서 단백질 농도를 측정하였고, 단백질 정제를 확인하기 위해 10% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 또한, 샘플은 비드 제거 없이 P450 촉매 활성을 측정하는데 사용되었다. 통계적 유의성이 있는 촉매 활성에 의한 정제도(fold-purification)를 계산하기 위해, 스트렙타비딘이 코팅된 96웰 플레이트를 사용하였다: 플레이트에서 샘플(막 분획 및 지질)을 약하게 진탕하면서 30℃ 조건으로 20분간 배양하였다. 샘플을 원심분리(10,000 ×g, 30℃, 5분)한 후 상등액을 제거하였다. 상술한 세척단계를 2회 반복하였다.

정제도(fold-purification)는 다음 단계를 통해 계산한다:

1. 각 단계에서 단백질 양을 정량한다.

2. P450 1A2와 3A4 효소의 활성을 측정한다.

3. 2의 활성을 단백질 양으로 나눈다.

4. 단위: 생성물 nmol/min/mg 단백질

5. 단계 1의 정제도를 1로 정하고 이후 단계 3, 4의 수치를 기준으로 상대값을 정한다.

최종 단계에서 수득한 P450 단백질-미셀-비드는 서로 결합된 상태에서 효소 활성을 나타내기 때문에 단백질만을 분리할 필요가 없다. 또한, 단백질이 미셀과 분리된 상태에서는 활성을 나타내지 않기 때문에 반드시 결합된 상태로 활성 측정 및 기타 다른 연구를 실시한다.

촉매 활성 어세이

[15]에 기재된 바와 같이, 테스토스테론 6β-히드록실화 활성은 막 분획 및 정제 단백질에 포함된 CYP3A4에 대해 결정하였다. 활성 어세이는 슬러리 비드 및 96웰 플레이트에 대한 두 경우 모두 200 μl의 총 샘플 부피를 갖는 반응 버퍼에서 실시하였다. CYP3A4(P450 농도 0.4 μM)를 포함하는 미셀-비드 복합체 및 NADPH-시토크롬 P450 환원효소(2 μM)는 기질인 테스토스테론의 존재 하에 혼합하였다. 반응은 NADPH-생성 시스템을 추가함으로써 시작되었다. 샘플을 약하게 교반하면서 30℃ 조건으로 20분간 배양한 다음, 2.0 M NaCl을 포함하는 1.0 N NCl 20 μl를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 결과물을 추출하고 240 nm의 UV로 HPLC 분석하였다. CYP1A2의 촉매 활성은 [16]에 기재된 바와 같이, 에톡시레소루핀 o-디에틸화 활성으로 측정되었다. 활성 어세이는 CYP3A4 활성을 측정하는데 사용된 것과 동일한 버퍼 및 어세이 조건을 이용하여 실시하였다. 반응은 기질인 7-에톡시레소루핀의 존재 하에서 NADPH-생성 시스템을 추가함으로써 시작되었다. 샘플을 30℃ 조건으로 10분간 배양한 다음, 차가운 메탄올 200 μl과 반응 샘플을 혼합하여 반응을 정지시켰다. 레소푸린 생성은 분광형광계로 모니터링하였다[16].

다른 방법들

전체 세포 및 막 분획에서 P450의 농도는 [17]에 기재된 바와 같이, Fe²⁺-CO에 대한 Fe²⁺ 분광차이로 정량하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 결정하였다[18]. 포스포글리세리드 농도는 포스포러스 어세이로 결정하였다[19]. 통계학적 데이터는 다섯 번의 독립적 실험에 대한 평균 ± 표준 오차로 표현하였으며, 분석은 스튜던트 t-검정을 이용하여 실시하였다. p-값 <0.05는 유의성을 갖는 것으로 간주되었다.

실험결과

음이온성 인지질을 포함하는 혼합 미셀을 이용한 CYP3A4의 정제

폴리-His, HA 또는 FLAG과 같은 친화성-태그를 갖지 않는 과발현된 CYP3A4 또는 CYP1A2를 포함하는 대장균 막 분획을 lyso-PC 및 음이온성 인지질을 포함하는 혼합 미셀과 배양하였다. 비오티닐-PE는 미셀을 침전 및 회수하기 위해 포함되었다.

아비딘을 포함하는 매트릭스를 미셀과 함께 풀다운한 다음, 결합된 CYP3A4의 양과 효소 활성을 측정하였다. 먼저, 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 바이오티닐-PE, 및 50 mol% 16:018:1 PA로 구성된 혼합 미셀을 사용한 경우, CYP3A4의 정제도는 약 854였다(표 1). 폴드(fold) 계산을 위해, 통계학적 결과는 스트렙타비딘이 코팅된 96웰 플레이트를 이용하여 수득하였다. 동일 비율의 아비딘/총 단백질 양을 사용하는 웰 플레이트 대신 슬러리 상태에서 아비딘-비드로 정제를 반복하는 경우, 증가값은 통계학적으로 96웰 플레이트의 증가값 오차 범위 내에 있었지만 폴드는 평균 1048까지 증가되었다. 정제도에서 이러한 증가는 재조합 단백질 정제를 위해 보편적으로 실시하는 친화성-태그 및 컬럼 크로마토그래피의 조합을 사용하지 않고 원-스텝 과정으로 효소를 막 분획으로부터 분리할 수 있다는 중요한 의미를 갖는다. 혼합 미셀을 사용하는 다른 이점은 효소의 정제 및 재구성 과정이 부수적으로 진행된다는 것이며, 이는 종래의 방법에서 별도로 실시된다. 높은 정제도를 얻는 것은 P450 효소가 농축되어 있고 전체 세포 추출물 보다 상대적으로 적은 단백질을 포함하는 박테리아 막 분획을 사용하는 것에서 기인할 수 있다. 그러나, P450 효소를 정제하는데 있어서 PI 및 PIP2와 같은 다른 음이온성 인지질의 효과는 아직 조사되지 않았다. 음이온성 인지질의 중요성을 더욱 자세히 알아보기 위해, PA 대신 50 mol% 16:018:1 PS를 혼합 미셀에 포함시키고 효소의 촉매 활성을 측정하였다. PS도 정제도를 증가시켰으나 PA 보다 덜 효과적이었고, 정제도 값은 웰 플레이트 및 슬러리 비드를 사용하였을 경우, 각각 약 523 및 607이었다(표 1).

재조합 P450 3A4 및 1A2의 정제

분획	특이적 활성(nmol min^-1 mg^-1 단백질)	정제(x-fold)	수율(총 활성%)
CYP3A4
대장균 막	0.5	1	100
미셀-PA	415.9	854 ± 102 (1048 ± 178)	21
미셀-PS	254.7	523 ± 79 (607 ± 129)	13
미셀-PC	39.9	82 ± 42	2
미셀-PC*	65.3	134 ± 35	3
리포좀-PA	109.1	224 ± 52	5
리포좀-PS	62.3	128 ± 40	2
리포좀-PC	20.5	42 ± 16	1
CYP1A2
대장균 막	0.2	1	100
미셀-PA	146.9	720 ± 122 (874 ± 161)	19
미셀-PS	88.3	433 ± 64 (474 ± 59)	11
미셀-PC	12.0	59 ± 21	1
미셀-PC*	19.0	93 ± 34	2
리포좀-PA	31.4	154 ± 38	4
리포좀-PS	24.5	120 ± 42	3
리포좀-PC	11.0	54 ± 27	1

미셀-PA: 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:0.18:1 PA.

미셀-PS: 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:0.18:1 PS.

미셀-PC: 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:0.18:1 PC.

미셀-PC.: 99 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE.

리포좀-PA: 49 mol% 16:0.18:1 PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:0.18:1 PA.

리포좀-PS: 49 mol% 16:0.18:1 PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:0.18:1 PS.

리포좀-PC: 99 mol% 16:0.18:1 PC 및 1 mol% 비오티닐-PE.

괄호는 슬러리 상태에서 아비딘-비드를 이용한 정제도를 나타낸다.

음이온성 인지질을 포함하는 혼합 미셀을 사용한 CYP1A2의 정제

CYP3A4는 CYP1A2 분리와 비슷한 결과를 보였는데 음이온성 인지질의 존재 하에서 혼합 미셀을 사용하여 정제도가 증가하였고, 정제에서 PS 보다 PA에서 보다 효과적이었다. 또한, CYP1A2에 대한 폴드 증가는 CYP3A4와 유사하였고, 그 값은 96웰 플레이트 및 슬러리 비드를 사용하였을 경우, 각각 약 720 및 874였다. 이러한 결과는 PA가 P450 3A4 및 1A2와 막의 결합 및 촉매 활성의 자극에 보다 효과적이라는 본 발명자들의 연구 결과와도 일치하는 것이다[11, 20]. 그러나, 음이온성 인지질이 부재 시, PC를 포함하는 혼합 미셀, 중성 인지질(49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% biotinyl-PE, 및 50 mol% 16:0.18:1 PC)은 두 효소의 정제에서 미미한 폴드 증가를 유도하였다. 음이온성 인지질이 없는 대조군 실험에서 99 mol% 10:0 lyso-PC 및 1 mol% 비오티닐-PE(표 1에서 미셀-PC*)로 구성된 미셀은 혼합 미셀(표 1에서 미셀-PC)을 포함하는 PC 보다 높은 정제도 값을 보였음에도 불구하고 효소를 정제하는데 있어서는 효과적이지 않았다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 효소의 헴(heme) 그룹이 CO(carbon monoxide)에 결합한 경우, P450은 450 nm에서 최대흡수 파장을 나타낸다. CO-결합에 따라 450 nm에서 흡수 피크를 생성하는 P450의 능력은 활성 효소 함량을 측정하는데 사용된다[17]. 이러한 분광 특성에 기초하여, mg/L 배양 수준으로 Fe²⁺CO에 대한 Fe²⁺ 분광차를 변환하여 전체 세포에서 발현된 P450, 막 분획 및 정제된 샘플의 양을 표 2에 요약하였다. 전체 발현 단백질의 약 45-47%는 두 개의 P450을 갖는 박테리아 막에 포함되었다. 효소의 양을 pmol/mg 단백질로 표시하였을 경우, P450 3A4 및 1A2는 각각 약 3배 및 2배 막 분획에 농축되었다. 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE 및 50 mol% 16:018:1 PA로 구성된 혼합 미셀 및 슬러리 상태의 아비딘 비드를 사용하는 경우, 막에서 P450의 71-75%는 원-스텝 과정에 의해 정제될 수 있다.

재조합 P450 3A4 및 1A2의 발현 및 정제 수율

-	발현 레벨		mg/L 배양
-	전체 세포	막	정제 수율
CYP3A4	12.6 ± 2.7^a (105 ± 24)	5.9 ± 0.6 (370 ± 41)	4.4 ± 0.3^b
CYP1A2	7.8 ± 1.6 (81 ± 17)	3.5 ± 0.4 (196 ± 22)	2.5 ± 0.2

괄호는 P450 양을 pmol/mg 단백질로 나타낸 것임.

a. 결과는 5회의 독립적인 실험값에 대한 평균 ± 표준 오차로 나타냄.

b. 재조합 P450을 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:018:1 PA로 구성된 혼합 미셀 및 슬러리 상태의 아비딘-비드를 이용하여 정제함.

P450 정제에 있어서 이중층 구조를 갖는 막의 효과

표 1은 비오티닐-PE를 제외한 16:0, 18:1 인지질로 구성된 막을 이용한 정제도를 나타낸다. 혼합 미셀과 같은 지질 이중층은 P450 3A4 및 1A2에 대한 정제도를 증가시킨다. 그러나, 효율은 혼합 미셀 카운터파트보다 훨씬 낮았다. 종래 연구에서, 본 발명자들은 P450 3A4 및 1A2의 막 결합은 동일한 실험 조건 하에서, 지질 이중층의 직경에 반비례하는 것을 발견하였다(데이터 미발표). 예를 들어, 직경 100 nm의 막은 400 nm의 막보다 많은 양의 효소를 흡수한다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 막 곡률(curvature)이 효소와의 상호작용에 중요한 역할을 하며, 이중층의 가파른 곡률은 적어도 P450 3A4 및 1A2에서 효소 결합에 유리할 것이라고 예상하였다. 상기 이유(들)를 나타내는 실험을 실시한 것은 아니지만, 동일한 논리를 혼합 미셀 및 막 간의 정제도 차이에 적용할 수 있다. 막-결합 단백질 및 막 곡률 사이의 상호작용에 대해서 여러 연구들이 발표되었다[22, 23]. 촉매 활성 측정을 통해 얻은 결과를 확인하기 위해, 50 mol% PA를 포함하는 혼합 미셀을 사용한 SDS-PAGE를 통해 분리된 P450 효소의 순도를 분석하였다. 도 1A는 2개 효소에 대한 단일 단백질 밴드를 보여준다.

P450 정제에 있어서 음이온성 인지질 농도의 효과

다양한 PA 양을 포함하는 혼합 미셀을 이용하여 정제도를 계산하였다. 본 실험에서 조성물은 70 mol% 16:018:1 PA를 포함하는 미셀을 제외하고 항상 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE 및 50 mol% 16:018:1 인지질이었다. 예를 들어, PA의 양이 30 mol%일 경우, 16:018:1 인지질의 최종농도를 50 mol%로 맞추기 위해 미셀에 20 mol% 16:018:1 PC를 포함시켰다. 도 1B는 두 효소에서 정제도가 농도에 의존적으로 PA 의 약 50 mol%까지 증가하였다. 반면, 50 mol%와 비교하였을 때, 지질 mol%(70 mol% PA)의 증가는 폴드를 현저하게 감소시켰다. 이러한 결과는 혼합 미셀-기반 P450 효소의 정제에서 음이온성 인지질의 중요성을 나타내며(표 1), 본 발명의 정제 방법에 대한 적정 PA 농도와 같은 실험 조건을 명확히 한다. 실험을 실시하지는 않았으나, PA로부터 얻은 결과에 기초하여 혼합 미셀에서 다양한 PS 농도는 정제도에 있어서 유사한 효과를 나타낼 것으로 예상할 수 있다.

P450 정제에 있어서 lyso-PC 탄소 길이의 효과

표 1의 결과에 근거하여, 미셀과 막 사이의 곡률 차이는 P450 효소 정제에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 미셀의 곡률은 lyso-PC 탄소의 가변 길이에 의해 변화될 수 있다. 이러한 가능성을 시험하기 위해 음이온성 인지질의 고정 농도(50 mol% PA)에서 8:0, 10:0, 11:0, 또는 12:0 lyso-PC를 미셀에 포함시키고, 96웰 플레이트를 이용하여 정제 과정을 반복하였다. 8:0, 10:0 및 11:0 lyso-PC는 유사한 정제도를 나타내었으나, 12:0 lyso-PC를 사용한 경우 정제도 값은 통계학적으로 유의하게 감소하였다(도 1C). 따라서, 12 이하의 탄소 길이를 갖는 lyso-PC는 효소의 친화성 정제에 유용할 것으로 생각된다.

결론

본 발명에서 본 발명자들은 P450 3A4 및 1A2에 대한 편리한 정제 방법 및 실험 조건을 확립하고자 노력하였다. 종합하면, 본 발명의 결과들은 음이온성 인지질을 포함하는 혼합 미셀이 선택적으로 재조합 P450 3A4 및 1A2를 흡수한다는 것을 나타내며, 효소에 대한 정제 툴(tool)로서 이용될 수 있다. 또한, 최근 정제 방법에 따르면 고속 대량 방식으로 같은 스트렙타비딘-코팅 96웰 플레이트에서 P450 3A4 및 1A2에 대한 정제, 재구성 및 촉매 어세이를 실시할 수 있다. 종래의 방법들은 일반적으로 재조합 단백질을 정제하는데 채택될 수 없었으나, 본 발명자들은 혼합 미셀 시스템이 다른 P450 효소 및 특정 지질과 상호작용하는 막결합 단백질의 정제에 사용될 수 있다고 예상한다. 또한, 혼합 미셀은 막 단백질 정제에 대한 선행 단계 및/또는 종래의 컬럼 크로마토그래피 단계의 대안으로 이용될 수 있다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, CHONNAM UNIVERSITY <120> Purification Method for Cytochrome P450 Using Mixed Micelle <130> PN140467 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3127 <212> DNA <213> P450 1A2 cDNA <400> 1 gaagctccac accagccatt acaaccctgc caatctcaag cacctgcctc tacagttggt 60 acagatggca ttgtcccagt ctgttccctt ctcggccaca gagcttctcc tggcctctgc 120 catcttctgc ctggtattct gggtgctcaa gggtttgagg cctcgggtcc ccaaaggcct 180 gaaaagtcca ccagagccat ggggctggcc cttgctcggg catgtgctga ccctggggaa 240 gaacccgcac ctggcactgt caaggatgag ccagcgctac ggggacgtcc tgcagatccg 300 cattggctcc acgcccgtgc tggtgctgag ccgcctggac accatccggc aggccctggt 360 gcggcagggc gacgatttca agggccggcc tgacctctac acctccaccc tcatcactga 420 tggccagagc ttgaccttca gcacagactc tggaccggtg tgggctgccc gccggcgcct 480 ggcccagaat gccctcaaca ccttctccat cgcctctgac ccagcttcct catcctcctg 540 ctacctggag gagcatgtga gcaaggaggc taaggccctg atcagcaggt tgcaggagct 600 gatggcaggg cctgggcact tcgaccctta caatcaggtg gtggtgtcag tggccaacgt 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Claims

다음 단계를 포함하는 시토크롬 P450(CYP)의 정제 방법:
(a) 시토크롬 P450을 발현하는 세포로부터 막단백질을 포함하는 막 분획을 수득하는 단계;
(b) 상기 막 분획을 가용화하는 단계;
(c) 상기 가용화된 막 분획에 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:0-18:1 PA 또는 49 mol% 10:0 lyso-PC, 1 mol% 비오티닐-PE, 및 50 mol% 16:0-18:1 PS로 구성된 혼합 미셀(mixed micelle)을 첨가하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 아비딘-비드(avidin-beads)를 첨가하는 단계; 및
(e) 상기 단계 (d)의 결과물을 원심분리하여 결과물로서 시토크롬 P450을 수득하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 시토크롬 P450(CYP)은 CYP3A4 또는 CYP1A2인 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 막 분획 가용화는 엔-옥틸글루코시드(n-octylglucoside)를 첨가하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음을 포함하는 혼합 미셀 및 아비딘-비드를 포함하는 시토크롬 P450(CYP) 정제용 조성물:
(a) 49 mol% 10:0 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine; lyso-PC)
(b) 1 mol% 비오티닐-PE; 및
(c) 50 mol% 16:0-18:1 포스파티드산(phosphatidic acid; PA) 또는 50 mol% 16:0-18:1 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS).
제 9 항에 있어서, 상기 시토크롬 P450(CYP)은 CYP3A4 또는 CYP1A2인 것을 특징으로 하는 조성물.
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