KR101649145B1 - 뇌에 치료제를 송달하기 위한 캐뉼라의 최적화된 배치 - Google Patents

뇌에 치료제를 송달하기 위한 캐뉼라의 최적화된 배치 Download PDF

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Abstract

송달 캐뉼라의 최적 배치를 제공하는 배치 좌표의 사용에 의한, 뇌의 표적화된 영역에 제제의 개선된 송달을 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 캐뉼라 배치를 최적화함으로써, 뇌의 표적화된 영역에서 주입물의 재현성 있는 분포가 달성되고, 뇌에 치료제의 더욱 효과적인 송달이 가능하게 된다.

Description

뇌에 치료제를 송달하기 위한 캐뉼라의 최적화된 배치{OPTIMIZED PLACEMENT OF CANNULA FOR DELIVERY OF THERAPEUTICS TO THE BRAIN}
대류-촉진 송달(CED;Convection-enhanced delivery)은 중추신경계(CNS)로 제제를 송달하는데 있어서 혈액-뇌 장벽을 우회하는 간질성 중추신경계(CNS) 송달 기술이다. 종래 대부분의 치료제는 뇌로의 국소 송달에 확산을 이용하며, 이것은 농도 구배에 의존한다. 확산 속도는 제제의 크기에 역으로 비례하고, 통상 조직 청소와 관련해서는 속도가 느리다. 따라서, 확산은 대부분의 송달된 치료제를 비균질하게 분포시키며, 공급원으로부터 수 밀리미터에 국한된다. 반면에, CED는 주입 카테테르의 팁에서 확립되는 유체 압력 구배와 벌크 흐름을 이용하여 세포외 유체 공간 내로 물질을 전파한다. CED는 세포외 주입된 재료를 혈관주위 공간과 주입물에 대한 효과적인 동력으로 작용하는 혈관의 규칙적인 수축을 통해 더욱 전파할 수 있다. 결국, 약물의 농도가 높을수록 단순한 주사에서 볼 수 있는 것보다 더 넓은 표적 조직 영역으로 더 균일하게 분포된다. 현재, CED는 파킨슨병(PD) 및 신경종양과 같은 신경변성 질환 분야에서 임상 시험되고 있다. CED를 이용한 실험실 연구는 소 분자, 거대분자, 바이러스 입자, 자기 나노입자 및 리포솜의 송달과 같은 광범한 적용 분야를 포괄한다.
치료제와 동시 주입되는 신규 조영제를 이용한 CED 시각화가 설치류, 비-사람 영장류(NHP) 및 사람에서 조사되었다. CED 동안 주어진 제제의 분포 체적(Vd)은 수력학적 전도도, 혈관 체적분률, 및 세포외 유체분률과 같은 대류되는 조직의 구조적 특성에 의존한다. 또한, 그것은 표적 밖의 영역으로 치료제가 분산되는 것의 제한을 시도하는 동시에 송달 효능을 개선하기 위한 캐뉼라 디자인, 캐뉼라 배치, 주입 부피, 및 주입 속도와 같은 주입 과정의 기술적 변수들에도 의존한다.
영상-유도 뇌항법(Image-guided neuronavigation)은 주촉성(stereotaxis)의 원리를 이용한다. 뇌는 데카르트 좌표계에 기초하여 서로 직교하는 3개의 가상 교차 공간 평면으로 나뉠 수 있는 기하구조적인 체적으로 간주된다(수평, 전두부 및 시상부). 뇌 내의 어떤 지점은 이들 3개의 교차 평면을 따라서 그것의 거리를 측정함으로써 특정될 수 있다. 뇌항법은 컴퓨터-워크스테이션의 콘솔에 표시되는 환자의 3-차원 영상 데이터의 평행좌표계에 뇌의 데카르트 좌표계를 덧붙임으로써 정확한 수술 유도를 제공하며, 이로써 의학적 영상이 뇌 내의 상응하는 실제 위치의 점-대-점 맵으로 표시된다(Golfinos et al., J Neurosurg 1995; 83:197-205 참조). 기능적 영상화 방식, 특히 뇌자도(MEG), 기능적 자기공명영상(fMRI) 및 양전자 방출 단층촬영(PET)를 뇌항법과 통합함으로써 신경학이 상당히 진전될 수 있다.
본 발명의 캐뉼라 배치를 위한 개선된 방법을 제공한다.
뇌의 표적화된 영역으로 치료제의 개선된 송달을 위한 방법 및 시스템이 제공되며, 이것은 최적 배치를 제공하기 위한 송달 캐뉼라의 위치지정에 의한다. 본 발명의 캐뉼라 위치지정을 위한 가이드라인은 뇌에 존재하는 "누출 경로"로 치료제가 송달되는 것을 피하며, 캐뉼라 배치를 위한 가이드라인을 이용함으로써 뇌의 표적화된 영역에 주입물의 재현성 있는 분포가 달성되어, 뇌로 치료제의 더욱 효과적인 송달이 가능해진다. 일반적으로, 누출 경로는 송달 말단부로부터의 거리가 1mm를 초과하는 것이 바람직하다. 표적화를 위한 관심의 영역은, 제한은 아니지만 피각, 시상부, 뇌간 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 수혜자는 영장류, 예를 들어 사람 및 비-사람 영장류이다.
또한, 캐뉼라 배치를 위한 최적의 위치지정을 결정하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 배치는 뇌의 표적화된 영역에 조영제를 송달하는 단계; 주입물의 분포를 결정하는 단계; 및 캐뉼라 배치의 부위와 원하는 분포를 상관시키는 단계의 방법에 의해서 실험적으로 결정되며, 이때 최적 배치는 적절히 구속된 주입물을 가져오는데, 즉 주입물은 원하는 표적 영역을 벗어나서 전파되지 않는다. 다른 구체예에서, 본원에서 제공된 배치 위치지정은 3-차원 모델링 기술을 통해서 한 종으로부터 다른 종을 외삽하여 추정하는데 사용된다.
뇌에 치료제의 송달을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 송달 캐뉼라, 및 최적 캐뉼라 배치를 위한 배치 좌표가 함께 제공되는 입체정위 시스템이 제공된다.
본 발명의 치료제의 투여는 치료제의 송달을 허용하는 임의의 국소화된 송달 시스템을 통해서 이루어질 수 있다. 이러한 송달 시스템의 예는, 제한은 아니지만 CED, 및 뇌내 송달, 특히 CED를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 송달 캐뉼라는 단차를 지날 때마다 유체 흐름의 초기 역류를 제한함으로써 주입 장치를 따라 환류가 감소하는 단차식 캐뉼라이다. 이러한 방법에서, 본 발명의 배치 좌표는, 뇌에서 누출 경로로 작용하는 주변 백색질 신경로, 혈관, 뇌실 등과 같은 뇌의 누출 경로로 치료제가 송달되는 것을 피하는 방식으로, 표적화된 조직 내에서 주입 캐뉼라의 단차 및/또는 말단부의 배치의 최적 부위를 가능하게 한다.
한 양태에서, 본 발명은 신경 사멸 및/또는 기능장애를 특징으로 하는 CNS 장애를 가진 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, CNS 장애는 만성 장애이다. 다른 구체예에서, CNS 장애는 급성 장애이다. 본 발명의 방법에 의해서 치료하기 위한 관심의 CNS 장애는, 제한은 아니지만 헌팅턴병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 두부 외상, 척수 손상, 다발성 경화증, 루이소체 치매, 망막변성, 간질, 정신병, 호르몬 균형 장애, 및 와우변성을 포함한다. 치료 방법은 예방적 방법, 예를 들어 수술전 진단을 수반하는 방법을 포함할 수 있다. 수술전 진단은, 제한은 아니지만 유전자 스크리닝, 신경영상화 등을 포함할 수 있다. 신경영상화는 기능적 신경영상화 또는 비기능적 영상화, 예를 들어 PET, MRI 및/또는 CT를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 CNS 질병의 위험이 있는 환자를 치료하기 위한 예방적 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 캐뉼라 배치 좌표를 이용하여 환자의 반응성 CNS 신경 집단에 제약 조성물을 국소 송달하는 단계를 포함하며, 이때 성장인자의 이러한 투여는 CNS 질병의 개시를 예방하거나 지연시키거나, 또는 일단 그것이 발현된 후라면 CNS 질병의 중증도를 감소시킨다.
본 발명의 이들 및 다른 양태 및 구체예들과 본 발명을 제조 및 사용하는 방법이 이후의 도면 및 본 발명, 실시예, 청구항, 및 도면의 설명을 참조하여 더 상세히 설명된다.
도 1은 공간 좌표와 역류 길이의 상관성을 나타내는 피각에서 MRI 트레이서의 분포를 도시한다.
도 2A는 피각에 단차 캐뉼러가 배치된 도해이다. 각 경우별로 녹색, 청색, 및 적색 구역에 캐뉼러 배치의 단차부와 말단부가 모두 도시된다. 도 2B는 각 구역별로 전체 Vd에 대한 피각 Vd로서 정의된 분포 성공률을 도시한다(p<0.01). 도 2C는 녹색, 청색, 및 적색 구역별로 피각 내의 가도테리돌 분포를 나타낸 대표적인 MR 영상이다. 캐뉼라 배치 및 초기 주입이 각 구역별로 패널 C, D 및 E에 나타난다. 패널 F, G 및 H는 각 RGB 구역에 주입 후 뇌에서의 가도테리돌 분포를 나타낸다. G(청색)에서는 백색질 신경로로의 누출이 최소이고, H(적색)에서는 상당한 누출이 있음이 주지된다. 녹색 구역(F)에 주입한 경우에는 피각에만 미량 분포되었다.
도 3은 동일한 기준을 사용하여 비교된, NHP에서 얻어진 RGB 변수에 기초하여 NHP의 피각(A)과 사람 피각(B)에서 개략된 단차의 RGB 구역을 도시한다.
도 4는 녹색 구역을 3D 재구성한 것으로, NHP(A 및 C)와 사람 피각(B 및 D)에서 "녹색 구역"의 체적이 표시된다. 녹색 구역의 영역은 CC까지 배측으로 적어도 3mm, AC로부터 수직으로 적어도 6mm(캐뉼러 팁에서 AC까지 3mm 더하기 팁 길이 3mm), EC로부터 수평으로 2.75mm 이상, 더 바람직하게는 IC로부터 중앙에서 3mm 이상의 체적으로서 MR 영상으로부터 한정되었다.
도 5는 MRI 트레이서의 부피를 작게 하거나 크게 해서 주입했을 때 피각에서 가도테리올의 분포 및 백색질 신경로로의 누출을 보여주는 대표적인 MR 영상이다.
도 6은 시상부 및 WMT에서 전체 Vd에 대한 시상부 내 Gd의 Vd의 퍼센트를 나타낸다.
도 7은 시상부에서 캐뉼라 배치를 도시한다.
도 8은 시상부 내에 함유된 주입된 트레이서의 퍼센트를 진입점에 대해서 플롯팅한 것이다.
도 9는 시상부 내에 함유된 주입된 트레이서의 퍼센트를 외측 경계에 대해서 플롯팅한 것이다.
도 10은 시상부 구속과 상관되는 캐뉼라 단차로부터 중간선까지의 거리이다.
도 11은 CED 동안 뇌간 내의 가도테리돌의 분포이다.
도 12는 뇌간 내 캐뉼라 단차 배치를 위한 변수들의 측정이다.
도 13은 측정된 변수들에 따른 뇌간 구속을 도시한다.
도 14는 시상부 및 뇌간에서의 Vi 대 Vd를 도시한다.
도 15는 Gd RCD 및 ROI의 3D 재구성을 나타낸 T1-가중된 MR 영상이다. (a)-(e)는 NHP 시상부 주입 시작에서 주입 종료까지 다양한 시간 지점에서 얻어진 관상면의 일련의 실시간 T1-가중된 MR 영상이다. 상응하는 주입 시간 지점에서 주입물의 부피(Vi)가 각 패널의 하단에 표시된다. 스케일 바 = 0.5cm. (f)는 주입이 완료된 후 좌측 시상부에서의 Gd 신호에 기초한 ROI의 3D 재구성을 도시한다. Gd 분포의 체적(Vd)이 패널의 하단에 표시된다. RCD: 실시간 대류 송달. ROI: 관심 영역.
도 16은 AAV2-GDNF/Gd가 주입된 NPH에서 Vi와 Vd 사이의 선형 관계를 나타낸다. 플롯은 NHP에서 Vi과 Vd 사이의 선형 관계(R2=0.904, P<0.0001)를 나타낸다(n = 5). 평균 Vd/Vi 비는 4.68±0.33(평균±SEM)였다. Vi: 주입물 부피. Vd: Gd의 분포 체적.
도 17은 시상부에 AAV2-GDNF를 양측성 주입한 영장류 #1에서 조직학과 MRI의 상관성을 도시한다. (a) 시상부 내 Gd 분포를 보이는 T1-가중된 MR 영상, 녹색 윤곽으로 표시된다. 상응하는 조직학적 구획의 GDNF에 대해 양성 염색된 영역(오렌지색 윤곽)을 MR 영상으로 이전하여 비교했다. 좌측 주입과 우측 주입이 상이한 시간에 완료되었기 때문에, 각 주입별로 MR 영상들의 최종 시리즈를 수집해서 패널 a에서 병합시켰다. 좌뇌 및 우뇌의 주입 부피가 패널의 하단에 표시된다(Vi(L) 및 Vi(R)]. 스케일 바 = 0.5cm. (b) a에서 영상화된 영장류 뇌의 관상 조직학적 구획, Gd를 사용한 MRI 상에서 주지된 것과 유사한 패턴으로 염색된 GDNF가 보인다. 스케일 바 = 1cm. (c) b의 삽입 상자의 고 배율 사진, 시상부 내의 GDNF 양성 세포들을 나타낸다. 스케일 바 = 50mm. (d) 및 (e)는 일련의 MR 영상에서 뇌의 좌측(d) 및 우측(e) 상에서의 Gd 분포 면적과 GDNF 발현을 나타낸다. r. 상관 계수.
도 18은 시상부에 AAV2-GDNF와 AAV2-AADC가 단측성 동시 주입된 영장류 #2에서 조직학과 MRI의 상관성을 도시한다. (a) 시상부 내 Gd 분포를 보이는 T1-가중된 MR 영상, 녹색 윤곽으로 표시된다. 상응하는 조직학적 구획의 GDNF(오렌지색 윤곽) 및 AADC(청색 윤곽)에 대해 양성 염색된 영역을 MR 영상으로 이전하여 비교했다. 스케일 바 = 0.5cm. (b) a에서 영상화된 영장류 뇌의 관상 조직학적 구획, Gd를 사용한 MRI 상에서 주지된 것과 유사한 패턴으로 염색된 GDNF가 보인다. 스케일 바 = 1cm. (c) b에 인접한 AADC 염색된 조직학적 구획, 내인성 AADC 발현과 형질도입된 AADC 발현이 모두 보인다. 형질도입된 AADC는 청색 윤곽으로 나타났다. (d) c에 인접한 AADC 및 TH 동시-표지된 조직학적 구획, AADC에 대한 동시 염색은 갈색으로, 티로신 히드록실라제(TH)에 대한 염색은 적색으로 보여서 내인성 AADC/TH(암적색)와 형질도입된 AADC(갈색)를 구별할 수 있다. 형질도입된 AADC의 발현 패턴은 b에서 GDNF 발현과 거의 동일하다. (e) c의 삽입 상자의 고 배율 사진, 흑색질 내의 내인성 AADC 양성 세포들을 나타낸다. 스케일 바 = 200mm. (f) d의 삽입 상자의 고 배율 사진, 흑색질 내의 AADC/TH 양성 세포들을 나타낸다. 스케일 바 = 200mm. (g) c의 삽입 상자의 고 배율 사진, 피각 내의 내인성 AADC 양성 섬유들을 나타낸다. 스케일 바 = 200mm. (h) c의 삽입 상자의 고 배율 사진, 피각 내의 AADC 양성 세포들을 나타낸다. 스케일 바 = 200mm. (i) d의 삽입 상자의 고 배율 사진, 시상부 내의 AADC 양성 세포들을 나타낸다. 스케일 바 = 200mm. (j) 일련의 MR 영상에서 뇌의 우측 상의 Gd, GDNF 및 AADC 분포 영역을 나타낸다. T1: Gd 면적과 GDNF 발현 사이의 상관 계수. r2: Gd 면적과 AADC 발현 사이의 상관 계수. r3: GDNF 면적과 AADC 발현 사이의 상관 계수.
도 19는 시상부에 AAV2-GDNF와 AAV2-AADC가 양측성 동시 주입된 영장류 #3에서 조직학과 MRI 사이의 상관성을 나타낸다. (a) 시상부 내 Gd 분포를 보이는 T1-가중된 MR 영상, 녹색 윤곽으로 표시된다. 상응하는 조직학적 구획의 GDNF(오렌지색 윤곽) 및 AADC(청색 윤곽)에 대해 양성 염색된 영역을 MR 영상으로 이전하여 비교했다. 스케일 바 = 0.5cm. (b) a에서 영상화된 영장류 뇌의 관상 조직학적 구획, Gd를 사용한 MRI 상에서 주지된 것과 유사한 패턴으로 염색된 GDNF가 보인다. 스케일 바 = 1cm. (c) b에 인접한 AADC 및 TH 동시 표지된 조직학적 구획, AADC에 대한 동시 염색은 갈색으로, 티로신 히드록실라제(TH)에 대한 염색은 적색으로 보인다. (d) 및 (e)는 일련의 MR 영상에서 뇌의 좌측(d) 및 우측(e) 상의 Gd, GDNF 및 AADC 분포 영역을 나타낸다. T1: Gd 면적과 GDNF 발현 사이의 상관 계수. r2: Gd 면적과 AADC 발현 사이의 상관 계수. r3: GDNF 면적과 AADC 발현 사이의 상관 계수.
도 20A-D는 "녹색 구역" 바깥에 캐뉼라 팁이 배치됨으로 인한 CED의 실패를 나타낸다. A. 캐뉼라 팁이 누출 경로(축삭관)에 너무 가깝게 배치되어 피각보다는 전교련(B)에 주입된다. C. 캐뉼라 팁이 누출 경로(혈관)에 너무 가깝게 배치되어 피각보다는 혈관주변 공간(D)에 주입된다.
성장인자, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 등과 같은 뇌 치료제를 영장류의 뇌에 직접 뇌 송달하는 것의 최적 결과는 치료 영역 전체를 아울러 재현성 있는 분포에 의존한다. 표적화된 영역으로 비-사람 영장류 및 사람의 뇌에 주입하기 위한 최적 부위를 한정하는 배치 좌표가 본원에서 제공되며, 이 배치 좌표는, 예를 들어 송달 말단부와 누출 경로 사이에 적어도 1mm, 적어도 1.5mm, 적어도 2mm 또는 그 이상의 거리를 두고 위치지정을 함으로써 뇌의 누출 경로를 우회하는 것을 가능케 한다.
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명의 설명된 특정 구체예들에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 하며, 구체예들은 당연히 변경될 수 있다는 것도 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어들은 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐으로, 제한은 의도하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이다.
값의 범위가 제공될 경우, 문맥상 분명히 다른 의미가 아니라면 해당 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 단위의 1/10까지 중간의 각 값도 역시 구체적으로 개시된 것으로 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 중간의 값과 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간의 값 사이의 더 작은 각 범위도 본 발명에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 해당 범위에 독립적으로 포함되거나 배제될 수 있으며, 더 작은 범위에 어느 한쪽 한계가 포함되거나, 둘 다 포함되지 않거나, 또는 둘 다 포함되는 경우의 각 범위도 역시 본 발명에 포함되며, 이것은 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계가 종속된다. 언급된 범위가 한쪽 한계 또는 양쪽 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 어느 한쪽 또는 둘 다를 배제하는 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술용어와 과학용어들을 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있으며, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다.
본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용된 상황과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해서 본원에 참고자료로 포함된다. 본 명세서는 포함된 간행물의 임의의 내용이 모순된다면 그 내용은 해당되지 않는다.
본원의 명세서와 첨부된 청구항에서 사용된 단수형인 "한" 및 "그"는 문맥상 명확히 다른 의미가 아니라면 복수의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "개체"란 언급은 하나 이상의 개체를 포함하고, "방법"이란 언급은 당업자에게 공지된 동등한 단계들 및 방법들에 대한 언급을 포함한다는 것 등등이다.
본원에서 논의된 간행물들은 본 출원의 제출일 전의 내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 선행 발명 때문에 본 발명이 이러한 간행물보다 시기상 선행하지 않는다는 승인으로서 해석되어서는 안 된다. 더 나아가, 제공된 간행물의 날짜는 실제 간행 날짜와 다를 수 있으며, 이것은 개별적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
정의
입체정위적 송달: 뇌에 포인트들을 정확히 배치하기 위한 컴퓨터-기반 방식. 입체정위적 방법은 뇌 아틀라스(brain atlas)를 이용할 수 있으며, 여러 뇌 아틀라스를 디지털 형태로 이용할 수 있다. 예를 들어, Talairach-Tournoux(TT) 아틀라스를 전자 형식으로 이용할 수 있다(Nowinski (2005) Neuroinformatics 3:293-300 참조). 이 아틀라스는 영상의 신속하고 자동적인 해석을 위한 뇌의 3-차원 표시를 제공한다.
입체정위적 송달은 두개골에 부착되어 고정된 기준점을 제공할 수 있는 프레임을 사용할 수 있다. 이 기준점은 컴퓨터 및 MRI 스캐닝에 의해 제공된 뇌의 3-차원 영상과 조합되어 표적화된 영역의 정확한 지도작성과 시각화를 가능케 한다. 표적 부위로의 정밀한 항행은 프레임에 부착된 다양한 장치를 사용하여 가능하다. 또는 달리, 프레임을 사용하지 않는 입체정위적 송달의 경우, 프레임을 "막대", 플라스틱 안내자, 또는 적외선 마커에 의해 생기는 기준 시스템으로 치환함으로써 정밀한 배치가 제공된다.
기능적 MRI(fMRI)는 뇌의 기능 영역의 위치를 정확히 나타내기 위해서 사용될 수 있다. MRI가 스캐닝하는 동안 환자는 리스트를 읽거나 손가락을 가볍게 부딪치는 등의 일련의 활동 및 운동을 수행하도록 요청된다. 이러한 운동 및 활동과 상관되는 뇌의 영역이 스캔 상에서 "빛을 내어" 영상이 만들어진다. 이 정보가 수술용 항법 컴퓨터에 의해 사용되어 신경학적 손상이 최소화되도록 절개부, 두개골 개방 및 종양 제거가 계획된다. 컴퓨터 단층촬영(CT)은 엑스레이와 컴퓨터를 조합한 스캐닝 도구로, 뇌의 상세한 영상을 얻을 수 있다.
영상화: 주입물의 생체내 분포는 영상화에 의해 결정될 수 있는데, 이때 검출가능한 표지를 가진 분자가 뇌의 표적 영역에 주입되고, 뇌를 통한 전파가 MRI, 양전자 방출 단층촬영(PET) 등에 의해서 결정된다. 선택된 트레이서에 적합한 표지는 분광학적, 광화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해서 검출될 수 있는 임의의 조성물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 표지는 방사성 표지(예를 들어, 18F, 3H, 125I, 35S, 32P 등), 효소, 비색 표지, 형광 염료 등을 포함한다. 표지를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 영상화 기술, 사진 필름 또는 섬광계수기를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 리포솜이, 예를 들어 가도테리돌로 표지되고, MRI에 의해 영상화된다.
기준 좌표: 캐뉼라 배치의 X, Y 및 Z 축 값은 영상화에 의해, 예를 들어 자기공명영상에 의해서 결정되며, 이때 MR 영상이 3-차원(축, 두정부 및 시상부)에서 모두 투영된다. 편의를 위해서 종래의 방법에 따르면, 전교련-후교련(AC-PC) 라인의 중점이 3-차원(3D) 뇌 공간의 제로 포인트(0,0,0)로서 지정된다. AC-PC 라인은 전교련의 윗면에서부터 후교련의 중심부까지 이어진다. MRI의 정중시상면 상에서 AC-PC 라인을 결정한 후, AC-PC 라인의 중점이 결정될 수 있다. AC-PC 라인의 중점을 통과하는 수평면과 수직면을 이용하여 3개 평면이 모두 표시될 수 있고, MRI 관상면 상에서 캐뉼라로부터 중간선까지의 거리(X 값), 앞쪽(또는 뒤쪽)에서 MRI 관상면의 AC-PC 라인의 중점까지의 거리(Y 값), 및 MRI 상에서 AC-PC 라인이 통합되는 축 평면 위(또는 아래의) 거리(Z 값)를 측정함으로써 캐뉼라 위치의 X, Y 및 Z 축 값이 얻어질 수 있다.
누출 경로: 본원에서 사용된 용어 "누출 경로"는 가용성 제제를 수송하는 중추신경계, 특히 뇌에 존재하는 물리적 구조를 말한다. 치료제가 이러한 누출 경로에 근접해 있는 조직에 송달될 경우, 이 치료제는 비-표적화된 영역으로 좋지 않게 수송될 수 있다. CNS에서 누출 경로를 제공하는 해부 구조는, 제한은 아니지만 축삭관, 혈관, 혈관주변 공간, 및 뇌실 공간을 포함한다.
혈액-뇌 장벽: 뇌막을 둘러싼 신경과 세포의 벽. 이 장벽은 보호 기능을 갖는 동시에, 뇌의 표적화된 영역에 효과적으로 도달하는 치료 약물의 능력을 감소시키기도 한다.
피각: 전뇌의 기저부에 위치된 원형 구조(단뇌). 피각과 꼬리핵이 함께 등쪽 선조를 형성한다. 이것은 또한 기저핵을 포함하는 구조 중 하나이다. 다양한 경로를 통해서 피각이 흑질과 담창구에 접속된다. 피각의 주요 기능은 운동을 조절하고, 다양한 종류의 학습을 좌우하는 것이다. 이것은 그 기능을 수행하는데 도파민을 이용한다. 피각은 또한 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경장애에서 어떤 역할을 한다.
뇌간: 뇌간은 소뇌의 앞쪽에 위치하며, 대뇌와 척수를 연결하고, 다양한 자율 기능 및 운동 기능을 통제한다. 이것은 연수, 뇌교, 중뇌 및 그물체로 이루어진다.
소뇌: 뇌의 뒤쪽에 위치하며, 신체 운동, 즉 균형, 보행 등을 통제한다.
대뇌: 뇌의 가장 큰 구획은 좌뇌반구 및 우뇌반구의 2 부분으로 나뉠 수 있다: 이들 반구는 두 절반 간에 "메시지"의 송달을 가능케 하는 뇌량으로 이어져 있다. 뇌의 우측은 신체의 좌측을 통제하고, 뇌의 좌측은 신체의 우측을 통제한다. 각 반구는 또한 전두, 측두, 정수리 및 후두의 4가지 상이한 기능을 책임지는 4개의 뇌엽을 가진다.
두개: 뇌 주변을 덮고 있는 골질. 두개와 안면골은 두개골을 포함한다.
시상하부: 뇌하수체로의 메신저로서 작용하는 뇌 부분으로, 이것은 또한 체온, 수면, 식욕 및 성적 행위에 있어서 통합적 역할을 하기도 한다.
중뇌: 뇌간의 일부로, 이것은 안구 운동과 눈꺼풀 열림을 통제하는 제 3 및 제 4 뇌신경의 기원이다.
뇌교: 뇌간의 이 부분은 4쌍의 뇌신경, 즉 제 5(안면부 감각); 제 6(안구 운동); 제 7(미각, 안면부 표정, 눈꺼풀 닫힘); 및 제 8(듣기 및 균형) 뇌신경의 기원이다.
후두와: 뇌간과 소뇌를 함유하는 두개골 부분.
시상부: 대뇌피질 사이에서 정보를 중계하는 뇌의 작은 영역.
영장류: 영장류는 생물학적 목 영장류의 일원으로, 여우원숭이, 다람쥐원숭이, 로리스원숭이, 갈라고원숭이, 안경원숭이, 꼬리있는원숭이(monkey), 꼬리없는(짧은)원숭이(ape)를 함유하는 그룹이며, 꼬리없는(짧은)원숭이는 대형 원숭이들을 포함한다. 영장류는 원시영장류와 유인원으로 나뉘는데, 유인원은 긴꼬리원숭이와 꼬리없는(짧은)원숭이를 포함한다. 유인원은 광비원류(platyrrhines) 또는 신세계원숭이와 아프리카 및 남동아시아의 협비류 원숭이(catarrhine monkey)의 두 그룹으로 나뉜다. 신세계 원숭이는 꼬리감기원숭이(capuchin), 고함원숭이(howler) 및 다람쥐원숭이(squirrel monkey)를 포함하고, 협비류 원숭이는 개코원숭이(baboon) 및 짧은꼬리원숭이(macaque)와 같은 구세계 원숭이 및 에이프를 포함한다.
본 발명의 방법은 모든 영장류에 적용할 수 있다. 특히 관심 있는 것은 유인원이다. 일부 구체예에서, 방법은 사람에게 적용된다. 다른 구체예에서, 방법은 비-사람 영장류에 적용된다.
평가는 임의의 형태의 측정을 포함하며, 어떤 요소의 존부의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는", "평가하는" 및 "분석하는"은 상호교환하여 사용되며, 정량적 및 정성적 결정을 포함한다. 평가는 상대적 또는 절대적일 수 있다. "..의 존재의 평가"는 존재하는 어떤 것의 양을 결정하는 것, 및/또는 그것의 존부의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는" 및 "분석하는"은 상호교환하여 사용되며, 정량적 결정과 정성적 결정을 모두 포함한다.
본원에서 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 장애의 진행의 억제, 또는 질환 또는 장애의 개시의 지연을 말하며, 인지가능한 증상의 안정화 같은 신체적인 것이든, 생리학적 변수의 안정화 같은 생리적인 것이든, 또는 둘 다이든 관계없다. 본원에서 사용된 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 말한다. 이 효과는 질환이나 상태, 또는 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 측면에서는 예방적일 수 있고, 및/또는 질환이나 장애 및/또는 질환이나 장애로 인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 측면에서는 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유류, 예를 들어 사람에서의 질환 또는 장애의 임의의 치료를 포괄하며, 질환으로 인한 사망 위험의 감소; 질환의 소인은 있을 수 있지만 아직 질환을 가진다고 진단된 적은 없는 피험자에서 질환 또는 장애가 발생하는 것의 예방; 질환 또는 장애의 억제, 즉 그것의 진행의 정지(예를 들어, 질환의 진행 속도의 감소); 및 질환의 완화, 즉 질환의 퇴행 야기를 포함한다. 본 발명의 치료적 이익은, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 파킨슨병과 관련된 질환 또는 상태의 개시의 위험이나 중증도의 감소를 포함한다.
송달 캐뉼라: 본 발명의 방법은 본 분야에 공지된바 같은 임의의 송달 캐뉼라의 정확한 배치를 허용한다. 리뷰를 위해, 예를 들어 본원에 참고자료로 명시적으로 포함되는 Fiandaca et al., (2008) Neurotherapeutics 5(1):123-7; Hunter et al., (2004) Radiographics 24(1):257-85; and Ommaya (1984) Cancer Drug DeNv. 1 (2):169-79를 참조한다.
특히 관심 있는 송달 캐뉼라는 단차식 환류-저항성 캐뉼라인데, 이것은 특히 대류-촉진 송달(CED)에서 사용된다. 이러한 캐뉼라는, 예를 들어 Krauze et al., (2005) J. Neurosurg. 103(5):923-9, 및 공개된 특허출원 US 2007-0088295; 및 US 2006-0135945에 설명되며, 이들은 각각 본원에 참고자료로 명시적으로 포함된다..
환류-저항성 캐뉼라의 배치가 본원에서 참조될 수 있다. MRI 좌표에 기초하여 캐뉼라는 입체정위 홀더 위에 장착되어, 예를 들어 미리 배치된 가이드 캐뉼라를 통해 뇌의 표적화된 영역으로 안내된다. 각 주입 캐뉼라의 길이는 원단부 팁이 각 가이드의 길이를, 예를 들어 약 1mm, 약 2mm, 약 3mm 등 정도 지나서 연장될 수 있도록 조정되었다. 이로써 캐뉼러의 팁이 단차식 디자인으로 되어서 CED 과정 동안 유체 분포는 최대화되고 캐뉼러 관을 따른 환류는 최소화될 수 있다. 캐뉼러 팁으로부터 캐뉼러 외장부까지의 이런 변행부가 본원에서 "단차"로서 언급될 수 있다. 위치지정 데이터는 선택적으로 MRI 상에서의 명백한 가시성으로 인해서 이 단차의 위치로부터 유래되거나, 또는 달리 캐뉼러의 팁이 기준점으로 사용될 수 있다. 위치지정에 임의의 명백한 마커가 이용될 수 있음이 당업자에 의해서 이해될 것이며, 이러한 마커는 송달 캐뉼라 상에 제공될 수 있는데, 예를 들어 영상화 "도트"가 캐뉼러 디자인에 통합될 수 있다.
송달 장치는 삼투 펌프 또는 주입 펌프를 포함할 수 있다. 삼투 펌프와 주입 펌프는 모두 다양한 공급원으로부터, 예를 들어 Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc.(Palo Alto, Calif.)에서 상업적으로 입수할 수 있다.
한 구체예에서, 캐뉼라는 장기 투여에 적합하다. 다른 구체예에서, 단차식 캐뉼라는 급성 투여에 적합하다.
치료제: 본 발명의 방법은 뇌의 표적화된 영역으로 치료제를 송달하는데 적용될 수 있다. 관심의 제제는, 제한은 아니지만 단백질, 약물, 항체, 항체 단편, 면역독소, 화학적 화합물, 단백질 단편 및 독소를 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 치료제의 예는 GDNF 과 리간드, PDGF(혈소판-유래 성장인자) 과 리간드, FGF(섬유아세포 성장인자) 과 리간드, VEGF(혈관내피 성장인자) 및 그것의 상동체, HGF(간세포 성장인자), 미드카인, 플레이오트로핀, 암피레귤린, 혈소판 인자 4, CTGF, 인터류킨 8, 감마 인터페론, TGF-베타 과의 일원, Wnt 과 리간드, WISP 과 리간드(Wnt-유도된 분비된 단백질), 트롬보스폰딘, TRAP(트롬보스폰딘-관련된 무명 단백질), RANTES, 프로퍼딘, F-스폰딘, DPP(데카펜타플레직) 및 Hedgehog 과의 일원을 포함한다. 관심의 특정 제제는 GDNF, 뉴투린, 아테민, 퍼세핀, NG, BDNF, NT3, IGF-1 및 sonic hedgehog를 포함한다. 또한, 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등이 포함되며, 이들은 유전자 구성물의 송달에 유용하다.
치료제는 임의의 유효 농도로 투여된다. 치료제의 유효 농도는 특정한 약리학적 효과의 증가 또는 감소를 가져오는 것이다. 당업자는 본 분야에 공지되고 본원에서 제공된 방법에 따라서 유효 농도를 결정하는 방식을 알고 있을 것이다.
본 발명의 치료제 및 촉진제의 투약량은 치료될 질환 또는 상태, 및 개별 피험자의 상태(예를 들어, 종, 중량, 질환 상태 등)에 의존할 것이다. 또한, 투약량은 투여되는 제제에 의존할 것이다. 이러한 투약량은 본 분야에 공지되어 있거나, 또는 경험상 결정될 수 있다. 또한, 투약량은 치료될 특정 질환이나 상태에 대한 전형적인 투약량에 따라서 조정될 수 있다. 주로 단일 분량이 충분할 수 있지만, 원한다면 해당 분량이 반복될 수 있다. 투약량은 좋지 않은 부작용을 일으킬 만큼 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투약량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 변동될 것이며, 통상의 방법에 따라서 당업자에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 참조). 또한, 투약량은 임의의 합병증의 발생시 각 의사의 판단에 의해 조정될 수 있다.
본 발명의 치료제 및/또는 촉진제는 전형적으로 제약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 각 제제의 유효량을 포함할 수 있으며, 이에 더하여 다른 의학 제제, 제약 제제, 담체, 애쥬번트, 희석제 등을 포함할 수 있다. "제약학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 다른 측면에서 바람직하지 않지 않은 재료를 의미하는데, 즉 그 재료가 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과나, 또는 그것이 함유되는 제약 조성물의 다른 성분들 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용을 일으키지 않고 선택된 제제와 함께 개체에 투여될 수 있다는 의미이다.
임상시험: 이런 연구들은 새로운 치료제 및 치료법의 시험에 환자를 포함시키며, 약물 승인 과정의 일부분이다. 임상시험은 전형적으로 3개 단계, 또는 3개 시기를 가지며, 약물의 안전성, 효능, 투약량 요건, 및 부작용을 평가한다. 환자는 특정 기준을 만족해야 임상시험에 등록될 수 있고(이것은 각 개별 연구마다 결정된다), 연구 참여는 지원 방식이다. 한 세트의 규칙, 또는 프로토콜은 각 시험별로 확립된다.
용어 "기준" 및 "대조군"은 상호교환하여 사용되며, 관찰된 값이 비교될 수 있는 기지의 값 또는 일련의 기지의 값들을 말한다. 본원에 사용된 대로, 이 값은 알고 있는 변수, 예를 들어 트랜스펙션 제제와의 접촉이 없을 때 세포독성 마커 유전자의 발현 수준을 표시한다는 것을 의미한다.
사용 방법
본 발명의 방법에서, 뇌의 표적화된 영역에 치료제의 개선된 송달을 위한 배치 좌표가 제공된다. 송달 캐뉼라를 정확히 위치지정하기 위해서 이 좌표가 입체적위적 방법과 함께 사용된다. 캐뉼라 배치를 위한 좌표와 송달 각도를 활용함으로써, 뇌의 표적화된 영역에 주입물의 재현성 있는 분포가 달성되며, 이로써 뇌에 치료제를 더욱 효과적으로 송달할 수 있다. 표적화를 위한 관심의 영역은, 제한은 아니지만 피각, 시상부, 뇌간 등을 포함한다. 본 발명의 방법은 뇌의 누출 경로로부터 적합한 거리에 있는 표적화된 영역의 구역인 "녹색 구역"으로 제제를 송달하기 위한 안내를 제공한다.
전형적으로, 제제는, 예를 들어 다음과 같이 CED 장치를 통해 송달된다. 카테테르, 캐뉼라 또는 다른 주사 장치가 선택된 피험자의 CNS 조직에 삽입된다. 본원의 교시에 비추어, 당업자는 적절한 표적이 되는 CNS의 일반적인 영역을 쉽게 결정할 수 있다. 입체정위적 지도와 위치지정 장치는, 예를 들어 ASI Instruments, Warren, Mich로부터 입수할 수 있다. 또한, 위치지정은 피험자 뇌의 CT 및/또는 MRI 영상화에 의해서 얻어진 해부학적 지도를 이용하여 수행될 수 있으며, 이들은 선택된 표적으로 주사 장치를 안내하는데 도움이 될 수 있다.
송달 캐뉼라의 정확한 위치가 본 발명의 배치 가이드라인을 이용하여 결정된다. 비-사람 영장류에 대해 실험적으로 표적화된 영역의 좌표를 지도로 그린 다음에, 이들 좌표로부터 사람을 포함하는 다른 영장류에서 바람직한 좌표를 외삽하여 추정하는 것이 바람직할 수 있음이 당업자에 의해서 이해될 것이다.
배치가 실험적으로 결정되는 경우, 실시예에 제시된 방법들이 사용될 수 있다. 뇌의 표적화된 영역에 조영제가 송달되고, 주입물의 분포를 결정하고, 캐뉼라 배치 부위를 바람직한 분포와 상관시키며, 이때 최적 배치를 위한 좌표는 적절히 함유된 주입물을 가져오는 것들, 즉 주입물이 원하는 표적 영역의 바깥으로 산포되지 않는 것들이다. 표적화를 위한 관심의 영역은 피각, 뇌간, 소뇌, 대뇌, 뇌량, 시상하부, 뇌교, 시상부 등을 포함한다.
다른 구체예에서, 본원에서 제공된 좌표를 사용하여 3-차원 모델링 기술을 통해 한 종으로부터 다른 종을 외삽하여 추정할 수 있다.
좌표는 기준 지점, 예를 들어 캐뉼라 팁과 외장부 사이의 변행부, 캐뉼라 팁 등일 수 있는 캐뉼라 "단차"에 대해서 조정된다. 당업자는 상이한 길이의 팁에 대해 쉽게 외삽하여 조정할 수 있거나, 또는 기준 지점은 단차 이외의 다른 대상일 수 있다.
캐뉼라 배치 및 최적 입체정위 좌표의 정의는 표적화된 뇌 영역으로 치료제의 효과적인 송달을 보장하는데 있어서 중요한 관련성을 가진다. 본 발명의 좌표와 함께 통상적인 입체정위적 국소화 과정을 이용함으로써 뇌로 치료제를 더욱 효과적으로 송달할 수 있으며, 이것은 임상 치료법에서 사용되어야 한다.
영장류 뇌에 치료제를 송달하는 많은 방법은 관심의 영역에 제제를 효과적으로 국소화하는 것이 유익하다. 예를 들어, 표적화된 영역으로부터 멀리까지 성장인자가 누출되는 것은 표적화된 영역에 존재하는 제제의 유효량이 감소하고, 동시에 표적화되지 않은 영역이 제제와 접촉한다는 이중의 단점을 가질 수 있다. 본 발명의 방법에서, 표적화된 영역은 일반적으로 균질한 "회색질"로서, 이것은 신경 세포 소체, 뉴로필(덴드라이트, 축삭 말단 및 아교세포 과정), 아교세포(성상아교세포 및 희소돌기아교세포) 및 모세관들이다.
회색질은 신경세포체를 포함한다. 회색질은 대뇌 표면(즉, 대뇌피질)과 소뇌 표면(즉, 소뇌피질)에 분포되고, 대뇌의 배측 영역(예를 들어, 선조체, 꼬리부, 피각, 담창구, 중격의지핵, 중격핵, 시상밑핵); 시상부 및 시상하부의 영역과 핵; 소뇌 심부(예를 들어, 소뇌치상핵, 구상핵, 쐐기핵, 실정핵) 및 뇌간(예를 들어, 흑색질, 적색핵, 뇌교, 올리브핵, 뇌신경핵); 및 척주의 영역(예를 들어, 전각, 측각, 후각)에도 분포되며, 이들 영역 중 어떤 것도 본 발명의 방법에서 표적화하는데 적합하다.
본 발명의 방법에 의해서 표적화되지 않은 영역 및 주입물의 바람직하지 않은 확산과 관련되는 경향이 있는 영역이 누출 경로이고, 누출 경로는 백색질을 포함한다. 백색질은 대부분 미엘린화된 축삭관들, 예를 들어 뇌량(CC), 전교련(AC); 해마교련(HC); 외부 캡슐(EC), 내부 캡슐(IC), 및 대뇌각(CP)을 함유한다.
출원인은 회색질 표적화된 영역에 제제의 대류-촉진 송달에 의해 송달된 주입물의 구속은 송달 캐뉼라의 배치에 백색질 또는 뇌 영역의 경계, 예를 들어 외측 경계 또는 중간선에 관해 "녹색 구역"을 필요로 한다는 것을 발견했다. 본 발명의 방법에서, 송달 캐뉼라는 캐뉼라의 팁이 녹색 구역, 즉 주입된 재료가 표적화된 영역 내에 함유되는 구역 내에 있도록 위치지정된다.
대류-촉진 송달(CED) 주입은 뇌의 표적화된 영역에서의 분포에 대해서 조영제의 자기공명영상(MRI)에 의해서 소급하여 분석되었다. 주입된 체적(Vi)이 표적 영역 내의 총 분포 체적(Vd)과 비교되었다. 조영제의 우수한 분포를 제공하는 주입은 최적 표적 체적, 또는 "녹색" 구역을 한정하는데 사용되었다. 인접한 해부학적 구조로의 누출이 있는 부분적 분포 내지는 불량한 분포를 가져오는 주입은 각기 덜 바람직한 "청색" 및 "적색" 구역을 한정하는데 사용되었다. 원하는 좌표 내에 송달 캐뉼라를 배치함으로써, 뇌의 표적화된 영역 내에 주입물의 적어도 약 90%, 주입물의 적어도 약 95%, 주입물의 적어도 약 98%, 또는 그 이상의 정량적 구속이 달성된다. 이들 결과를 사용하여 영장류 뇌의 표적화된 영역에 주입을 위한 최적 부위를 한정하는 배치 기준을 결정했다.
송달 캐뉼라가 녹색 구역에 배치된 경우, 약 30μL 부피 미만의 적은 부피, 및 최대 약 100μL, 및 약 100μL에서 약 250μL, 또는 그 이상의 큰 부피 모두에서 표적 영역 내에 주입물의 우수한 구속이 얻어질 수 있다. 반면에, 녹색 구역을 벗어난 캐뉼라 배치는 주입 부피가 늘어날수록 주입물의 분포의 증가와 관련된다. 이들 데이터에 의해서 캐뉼라 배치에 기초하여 최적 주입이 얻어질 수 있음이 확인되었다.
다음에, 녹색 구역은 표적화된 영역의 3-차원 질량으로, 여기에 송달 캐뉼라의 팁이 배치된다. 녹색 구역은 주입물을 함유하기에 충분한 너비의 "외피"로 둘러쌓인 내부 영역이다.
일반적으로, 송달 캐뉼라 팁의 위치지정을 위한 "녹색 구역"은 누출 경로를 우회하기 위해서 충분히 표적화된 회색질 내에 충분히 들어간다.
예를 들어, 표적화된 영역이 대뇌 내에, 즉 대뇌피질, 선조체, 피각, 꼬리부 등에 있는 경우, 배치 좌표는 축삭관들, 예를 들어 뇌량(CC), 전교련(AC); 외부 캡슐(EC), 및 내부 캡슐(IC)에 관해 지도화될 수 있고, 이때 녹색 구역은 적어도 약 2mm, 적어도 약 2.5mm, 일반적으로 적어도 약 3mm의 거리이며, 충분한 크기의 표적 영역에서 녹색 구역은 적어도 약 3.5mm, 적어도 약 4mm일 수 있고, 각 거리는 실시예 1에 나타낸 대로 축삭관, 예를 들어 백색질로부터 측정된다.
표적화된 영역이 시상부 또는 시상하부인 경우, "녹색 구역"은 표적화된 영역의 경계에 의해 한정되며, 예를 들어 실시예 2에 나타낸 대로, 진입점까지 적어도 2.5mm, 적어도 2.8mm, 적어도 3.0mm; 외측 경계로부터 적어도 1.8mm, 적어도 2.0mm, 적어도 2.2mm; 그리고 중간선으로부터 적어도 4.5mm, 적어도 4.75mm, 적어도 5mm 이다.
표적화된 영역이 뇌간 내에, 예를 들어 흑색질, 적색핵, 뇌교, 올리브핵, 뇌신경핵 등에 있는 경우, "녹색 구역"은 표적화된 영역의 경계에 의해 한정되며, 예를 들어 실시예 2에 나타낸 대로, 진입점까지 적어도 2.8mm, 적어도 3.0mm, 적어도 3.5mm; 뇌간 외측 경계로부터 적어도 2.5mm, 적어도 2.75mm, 적어도 2.92mm; 그리고 중간선으로부터 적어도 1.25mm, 적어도 1.5mm, 적어도 1.6mm이다.
캐뉼라 팁의 길이는 바람직하게 적어도 약 1mm, 적어도 약 1.5mm, 적어도 약 2mm, 적어도 약 2.5mm, 적어도 약 3mm, 적어도 약 3.5mm, 적어도 약 4mm, 적어도 약 4.5mm, 적어도 약 5mm, 또는 그 이상이다.
상기 지정된 좌표에 송달 캐뉼라를 배치함으로써, 주입물의 적어도 약 90%, 주입물의 적어도 약 95%, 주입물의 적어도 약 98%, 또는 그 이상이 뇌의 표적화된 영역 내에 정량적 구속이 달성된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 뇌의 표적화된 영역에 약물 송달 캐뉼라의 정확한 배치를 위한 시스템이 제공된다. 이러한 시스템은 입체정위 송달 시스템에 있어서 본원에 제시된바 같은 좌표 정보를 포함한다. 이러한 시스템은 송달 캐뉼라, 펌프, 및 치료제 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
분자 및 세포 생화학에서의 일반적 방법들은 다음의 표준 참고서들에서 찾을 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods(Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al., eds., Academic Press 1999); Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual(I. Lefkovits ed, Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). 본 명세서에서 언급된 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech와 같은 상업적 판매자들로부터 입수할 수 있다.
이후의 실시예들은 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방식에 대한 완벽한 개시와 설명을 제공하기 위해서 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 언급한 것의 범위를 제한하거나, 이하의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 표시하는 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 기하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는다면, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각 개별 간행물이나 특허 출원이 구체적으로 그리고 독립적으로 참고자료로 포함된다고 표시된 것처럼 참고자료로 본원에 포함된다.
본 발명은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 포함하는 본 발명자에 의해 발견된 또는 제안된 특정 구체예들에 관하여 설명되었다. 본 명세서에 비추어 본 발명의 의도된 범위로부터 벗어나지 않고 예시된 특정한 구체예들에 다수의 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에게 인정될 것이다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다.
실험
실시예 1
사람 및 비-사람 영장류에서 치료제의 영상-유도 대류-촉진 송달을 위한 피각의 최적 영역
재료 및 방법
실험 피험자 및 연구 설계: 11마리 레서스 마카크(수컷 7마리, 암컷 4마리, 8-18세, 평균 11.9세, 4-9.4kg)와 2마리 사이노몰거스 멍키(수컷 1마리, 암컷 1마리, 둘 다 7세, 각기 5kg, 7kg)를 포함하는 13마리의 정상 성체 NHP가 본 연구 대상이었다. 실험은 국립 건강지침 협회 및 샌프란시스코 대학(San Francisco, CA)과 Valley Biosystems(Sacramento, CA)의 동물 관리사용 위원회에서 승인된 프로토콜에 따라서 수행했다. 13마리의 동물에는 GDL(2mM) 또는 자유 가도테리돌(2mM, Prohance; Bracco Diagnostics, Princeton, NJ)을 총 25회 두개내 주입하여 피각에 투여했다. NHP에 대해 앞서 확립된 CED 기술에 따라서 주입을 행했다(Bankiewicz, Eberling et al. 2000). GDL은 앞서 설명된 대로 제조했다(Fiandaca, Varenika et al., 2008; Krauze, McKnight et al., 2005).
주입 과정: 해부학적 표지를 시각화하고, 각 동물에 대해 제안된 표적 주입 부위의 입체정위 좌표를 생성하기 위해서 수술 전에 영장류는 베이스라인 MRI를 받았다. NHP는 피각 위에 MRI-적합성 가이드 캐뉼라를 배치하기 위한 신경수술 과정을 받았다. 각 맞춤형 가이드 캐뉼라를 명시된 길이로 절단하고, 두개골 내에 만들 둔 기계 구멍을 통해 그것의 표적으로 입체정위적으로 안내한 후, 치과용 아크릴로 두개골에 고정했다. 가이드 캐뉼라 조립체의 상부를 스타일릿 스크류로 봉쇄하여 주입 과정 동안 간단히 접근할 수 있도록 했다. 동물을 적어도 2주간 회복시킨 후에 주입 과정을 개시했다. 실시간 MRI 데이터를 취득하는 동안 동물을 이소플루란(Aerrane; Ohmeda Pharmaceutical Products Division, Liberty Corner, NJ)으로 마취했다. 각 동물의 머리를 MRI-적합성 입체정위 프레임에 배치하고 베이스라인 MRI를 수행했다. 과정 내내 심박수 및 PO2와 같은 바이탈사인을 모니터했다.
간단히 말해서, 주입 시스템은 로딩 라인(GDL 또는 자유 가도테리돌 함유)에 접속된 융합 실리카 환류-저항성 캐뉼라(Fiandaca, Varenika et al. 2008; Krauze, McKnight et al., 2005), 오일을 함유한 주입 라인, 및 트리판 블루 용액을 함유한 또 다른 주입 라인으로 구성되었다. 1mL 주사기(트리판 블루 용액 충전)가 마이크로주입 펌프(BeeHive, Bioanalytical System, West Lafayette, IN) 위에 장착되고, 이 펌프가 시스템을 통한 유체의 흐름을 조절했다. MRI 좌표에 기초하여 캐뉼라를 입체정위 홀더 위에 장착했고, 미리 배치된 가이드 캐뉼라를 통해 뇌의 표적화된 영역으로 손으로 안내했다. 각 주입 캐뉼라의 길이는 원단부 팁이 각 가이드의 길이를 3mm 지나서 연장될 수 있도록 조정했다. 이로써 캐뉼러의 팁이 단차식 디자인으로 되어서 CED 과정 동안 유체 분포는 최대화되고 캐뉼러 관을 따른 환류는 최소화될 수 있다. 융합 실리카 팁으로부터 융합 실리카 외장부까지의 이런 변행부를 "단차"라고 하며, 모든 위치지정 데이터는 MRI 상에서의 명백한 가시성으로 인해서 이 단차의 위치로부터 유래된다.
주입 캐뉼라의 배치를 고정한 후, CED 과정을 개시하여 실시간 MRI 데이터를 취득했다(실시간 대류 송달, RCD). 본 연구 내내 주입된 모든 NHP에 대해서 동일한 주입 변수들을 사용했다. 주입 속도는 다음과 같았다: 표적화된 영역으로 캐뉼라를 하강시킬 때는 0.1μl/분을 적용하고, 10분 간격으로 0.2, 0.5, 0.8, 1.0, 및 2.0μl/분으로 증가시켰다. 주입 후 대략 15분 뒤에 뇌로부터 캐뉼라를 철수시켰다. 4마리의 동물은 다중 주입을 받았다. 각 동물은 각 주입 과정 사이에 적어도 4주의 간격이 있었다.
자기공명영상(MRI): NHP를 케타민(Ketaset, 7mg/kg, 1M)과 크실라진(Rompun, 3mg/kg, 1M)의 혼합물로 진정시켰다. 진정 후, 각 동물을 MRI-적합성 입체정위 프레임에 배치했다. 귀쪽 봉과 눈쪽 봉의 치수를 기록하고 정맥내 라인을 확립했다. MRI 데이터를 얻은 다음, 동물을 우리 안에서 바로 설 수 있을 때까지 면밀히 관찰하면서 회복되도록 두었다. 9마리 NHP에서 뇌의 MR 영상을 1.5T Siemens Magnetom Avanto(Siemens AG, Munich, Germany)에서 취득했다. 반복 시간(TR) = 2110ms, 에코 시간(TE) = 3.6ms, 및 플립 각도 15도, 여기수(NEX) = 1(3회 반복), 매트릭스 = 240 x 240, 시야(FOV) = 240 x 240 x 240, 및 슬라이스 두께 = 1mm로 3-차원 래피드 그래디언트 에코(MPRAGE) 영상을 얻었다. 이들 파라미터에서 1㎣ 복셀 체적이 만들어졌다. 스캐닝 시간은 약 9분이었다. 4마리 NHP에서 피험자 머리 위의 5인치 표면 코일을 바닥과 평행하게 해서 1.5T Sigma LX 스캐너(GE Medical Systems, Waukesha, WI)를 사용하여 MR 영상을 취득했다. 스포일드 그래디언트 에코(SPGR) 영상은 T1-가중되었으며, 스포일드 그래스 순서, TR = 2170ms, TE = 3.8ms, 및 플립 각도 15도, NEX = 4, 매트릭스 = 256 x 192, FOV = 16cm x 12cm, 슬라이스 두께 = 1mm에서 얻어졌다. 이들 파라미터에서는 0.391㎣ 복셀 체적이 만들어졌다. 스캐닝 시간은 약 11분이었다.
4마리 NHP에서 피험자 머리 위의 5인치 표면 코일을 바닥과 평행하게 해서 1.5T Sigma LX 스캐너(GE Medical Systems, Waukesha, WI)를 사용하여 MR 영상을 취득했다. 스포일드 그래디언트 에코(SPGR) 영상은 T1-가중되었으며, 스포일드 그래스 순서, TR = 2170ms, TE = 3.8ms, 및 플립 각도 15도, NEX = 4, 매트릭스 = 256 x 192, FOV = 16cm x 12cm, 슬라이스 두께 = 1mm에서 얻어졌다. 이들 파라미터에서는 0.391㎣ 복셀 체적이 만들어졌다. 스캐닝 시간은 약 11분이었다.
NHP 뇌에서 체적 및 거리 측정: 각 실시간 대류 송달(RCD)로부터 MR 영상을 얻었고, 이것을 사용하여 캐뉼라 단차로부터 뇌량(CC), 내부 캡슐(IC) 및 외부 캡슐(EC)까지 거리를 측정했다. OsiriX® Medical Image 소프트웨어(v.2.5.1)를 사용하여 애플 매킨토시 G4 컴퓨터에서 측정을 수행했다. OsiriX 소프트웨어는 로컬 영상 저장전송 시스템(PACS; local picture archiving and communication system)을 통해 얻어진 MR 영상 형식의 DICOM(의학용 디지털 영상화 및 통신)로부터의 모든 데이터 항목을 판독한다. 캐뉼라 단차로부터 각 상기 언급된 구조까지의 거리를 수동으로 한정한 다음, 이 소프트웨어로 계산했다. 모든 거리는 MRI 구획 상에서 동일한 방식으로 측정했다.
녹색 구역에 있는 캐뉼라 단차 위치의 X, Y 및 Z 축 값을 OsiriX 소프트웨어에 의해 생성된 2D 직교 MR 영상을 이용하여 결정했으며, 이때 MR 영상은 3-차원에서 모두 투영되었다(축, 두정부 및 시상부). 우리는 3-차원(3D) 뇌 공간의 제로 포인트(0,0,0)로서 전교련-후교련(AC-PC) 라인의 중점을 사용했다. 간단히 말해서, AC-PC 라인을 MRI의 정중시상면 상에 그리고 AC-PC 라인의 중점을 결정했다. 다음에, AC-PC 라인의 중점을 통과하는 수평면과 수직면을 얻었고, 이들은 3개 평면 상에 모두 동시에 표시될 수 있었다. MRI 관상면 상에서 캐뉼라 단차로부터 중간선까지의 거리(X 값), 앞쪽(또는 뒤쪽)에서 MRI 관상면의 AC-PC 라인의 중점까지의 거리(Y 값), 및 MRI 상에서 AC-PC 라인이 통합되는 축 평면 위(또는 아래의) 거리(Z 값)를 측정함으로써 캐뉼라 단차의 X, Y 및 Z 축 값이 얻어질 수 있다. 모든 거리는 각 사례별로 MRI 구획 상에서 동일한 방식으로 측정되었다(mm).
또한, MR 영상을 사용하여 가도테리돌의 분포를 체적 정량했다. 각 피험자의 뇌 내에서 가도테리돌의 Vd를 또한 애플 매킨토시 G4 컴퓨터로 정량했다. 피각 및 백색질 관에서 유래된 ROI를 손수 한정한 다음, 소프트웨어로 각 MR 영상으로부터 면적을 계산하고, 한정된 면적에 슬라이스 두께를 곱한 값에 기초하여 ROI의 체적으로 확립했다(PACS 체적). 각 분포의 경계면을 일련의 MRI 구획들에서 동일한 방식으로 한정했다. 분석될 특정 분포에 대한 PACS ROI 체적들(평가된 MRI 슬라이스의 수)의 합계로 측정된 구조 체적을 결정했다. BrainLAB 소프트웨어(BrainLAB, Heimstetten, Germany)를 사용해서 한정된 ROI 체적에 기초하여 3D 영상을 재구성할 수 있었다. MRI의 평가와 모든 측정은 서로 모르는 2명의 독립된 관찰자에 의해서 수행되었다. NHP에서 2명의 관찰자에 의해서 측정된 거리의 예비 비교에서는 얻어진 평균값들에 유의한 차이가 없었다.
통계적 분석: 상이한 구역에 단차가 위치되었을 때 얻어진 캐뉼라 단차로부터 뇌량, 내부 캡슐 및 외부 캡슐까지의 거리들을 스튜던트 t-테스트에 의해서 피험자 그룹들간 비교했다. 모든 시험에 대한 통계적 유의성의 기준은 p<0.05였다.
결과
본 연구에서는 13마리의 NHP가 25회의 피각 주입을 받았다. 각 RCD로부터 NHP 뇌의 실시간 MR 영상을 얻어서 가도테리돌의 분포를 평가하고, 캐뉼라 단차의 위치에 기초하여 피각 내의 캐뉼라 단차로부터 CC, IC 및 EC까지의 거리를 측정했다. 우리는 일부 주입은 피각 내에 트레이서의 불량한 구속을 가져왔고, 이 경우 뇌량(CC)의 인접한 백색질 관(WMT)과 때로는 내부 캡슐(IC) 및 외부 캡슐(EC)에도 유의한 분포가 있었지만, 다른 경우에는 피각에만 트레이서가 분포되었음을 관찰했다(표 1). 피각 내에 함유된 주입된 트레이서의 퍼센트를 각 변수에 대해 플롯팅한 경우(도 1), 캐뉼라를 따른 환류가 피각(PUT) 내 주입물 분포의 가파른 하강과 상관된다는 것이 분명해 보인다(도 1A). 95%를 초과하는 피각(PUT) 내 트레이서의 구속은 약 5mm 미만의 역류와 함께 달성될 수 있다. 이들 실험에서 팁 길이는 3mm였다. 이어서, PUT 적용범위와 해부학적 좌표들 간의 상관성은 또한 또 다른 핵심 변수가 뇌량(CC)으로부터 캐뉼라 단차까지의 거리임을 분명히 드러냈다(도 1B). 피각 구속이 95%를 초과했던 8번의 주입에서, 캐뉼라 단차-CC 거리는 3.14mm 내지 3.76mm 범위였고, 평균 거리는 3.35±0.08mm, 캐뉼라 단차-IC 거리는 2.13mm 내지 5.65mm 범위였고, 평균 거리는 4.01±0.42mm, 캐뉼라 단차-EC 거리는 1.98mm 내지 3.28mm 범위였고, 평균 거리는 2.75±0.17mm였다.
우리는 피각 내에 주입물의 최적 구속을 위해서는 캐뉼라 단차-CC 거리가 약 3mm를 초과해야 한다는 결론을 내렸다. 캐뉼라 단차로부터 IC 및 EC까지의 거리는 피각 구속과 그다지 관련되지 않았다(도 1C, 1D). 우리는 본질적으로 정량적인 트레이서의 피각 구속을 "녹색 구역"으로 정의했다. 상응하는 "청색 구역"은 79% 내지 94%, 평균 87%±3%의 트레이서의 피각 구속과 관련되며, CC로의 소량의 누출을 시사하고, 4건의 사례에서 정의되었다. 여기서, 캐뉼라 단차-CC 거리는 2.74mm 내지 2.88mm 범위였고, 평균 거리는 2.81±0.04mm; 캐뉼라 단차-IC 거리는 3.26mm 내지 4.86mm 범위였고, 평균 거리는 4.18±0.37mm; 캐뉼라 단차-EC 거리는 1.92mm 내지 3.43mm였고, 평균 거리는 2.68±0.36mm였다.
유사하게, "적색 구역"이 13건의 사례에서 정의되었는데, 이 경우 트레이서는 PUT의 31% 내지 67% 범위, 평균 49%±0.05%로 PUT에 불량하게 구속되었으며, 이것은 CC, EC 및 IC로의 다량의 누출을 시사한다. 이들 주입에서, 캐뉼라 단차-CC 거리는 0.12mm 내지 1.99mm 범위였고, 평균 거리는 1.26±0.16mm; 캐뉼라 단차-IC 거리는 0.65mm 내지 4.08mm 범위였고, 평균 거리는 2.63±0.27mm; 캐뉼라 단차-EC 거리는 0.85mm 내지 4.25mm였고, 평균 거리는 1.88±0.25mm였다.
뇌에서 가도테리돌의 분포 체적: 8건의 사례에서 단차가 "녹색 구역"에 배치되었을 때, 피각 내에서 가도테리돌의 우수한 Vd가 얻어졌으며, 체적 범위는 52.9 내지 174.1㎣이고, 평균 체적은 116.4±0.04㎣였다(도 2A 및 2B). 2건의 사례에서는 주입 마지막에 CC로 가도테리돌의 미미한 누출이 있었으며, 백색질 관(WMT) 내에서 이들의 Vd는 각각 2.7 및 6.1㎣였다. 대표적인 MRI를 도 2C 및 2F에 나타낸다.
청색 구역 내 단차가 배치되었던 4건의 사례에서는 피각 내 가도테리돌의 Vd가 40.7 내지 261.9㎣였고, 평균 체적은 139.6±0.05㎣였다(도 2A 및 2B). 4건의 사례 모두에서 CC로의 누출이 있는 것으로 밝혀졌다. 처음 누출이 보였을 때 주입 부피는 4.7 내지 10.5μL였고, 평균 부피는 6.9±0.9μL였다. WMT 내의 최종 Vd는 6.3 내지 40.7㎣였고, 평균 체적은 19.4±0.01㎣였다. 대표적인 MRI를 도 2D 및 2G에 나타낸다.
13건의 사례에서 "적색 구역" 내 단차의 배치는 17.7 내지 97.5㎣의 가도테리돌의 Vd를 생성했으며, 평균 체적은 62.1±0.01㎣였다(도 2A 및 2B). 13건의 사례 모두에서 CC로의 상당한 누출이 있는 것으로 밝혀졌고, IC와 EC로의 누출은 가변적이었다. 처음 누출이 보였을 때 주입 부피는 1.6 내지 21.8μL였고, 평균 부피는 7.9±1.7μL였다. WMT 내의 최종 Vd는 26.7 내지 152.2㎣의 범위였으며, 평균 체적은 66.8±0.01㎣였다. CED 동안 비교적 큰 누출이 있었던 17건의 사례 중에서, CC로의 누출은 17건 모두에서 발견되었고(100%, IC로의 누출은 3건(17.6%)에서, EC로의 누출은 1건(5.9%)에서 발견되었다. 대표적인 MRI를 도 2E 및 2H에 나타낸다.
NHP에서 3D 뇌 공간의 피각 내 녹색 구역의 좌표: AC-PC 라인의 중점이 3D 뇌 공간의 제로 포인트(0,0,0)로서 정의되었다. MRI에 의한 캐뉼라 단차의 좌표 계산에 기초하여, 피각 내 녹색 구역 표적은 측면으로 9.57-14.95mm, 평균 거리는 11.85±0.56mm(X 좌표), 앞쪽에서 AC-PC 중점까지 5.88-8.93mm, 평균 거리는 7.36±0.49mm(Y 좌표), 위쪽에서 AC-PC 축의 면까지 1.64-4.47mm, 평균 거리는 3.62±0.40mm(Z 좌표)의 범위였다.
NHP의 피각에서 캐뉼라 단차를 위한 RGB 구역: 이들 분석에 기초하여, 우리는 피각 주입을 위한 좌표를 한정했고, 바람직한 캐뉼라 특징과 뇌 내의 주요 구조들로부터의 최적 거리를 확인한다(RBG 구역). "녹색 구역"은 CC까지 배측으로 적어도 3mm, AC로부터 수직으로 적어도 6mm(캐뉼러 팁에서 AC까지 3mm 더하기 팁 길이 3mm), EC로부터 수평으로 2.75mm 이상, 더 바람직하게는 IC로부터 중앙에서 3mm 이상의 체적으로서 한정된다. 담창구가 포함된다면, IC로부터 최적 거리는 4.01mm 이상이다. "청색 구역"은 "녹색 구역"을 둘러싼 두꺼운 외피로서 한정되며, "청색 구역"의 바깥쪽 경계는 녹색 구역의 바깥쪽 가장자리로부터 약 0.5mm에 있다. 마지막으로, "적색 구역"은 청색 구역의 바깥쪽 경계로부터 피각의 변연부까지의 영역으로서 한정된다. 이들 변수에 기초하여, NHP 피각에서 캐뉼라 배치를 위한 RGB 구역이 MRI 상에서 한정되었다(도 3A). 다음에, 우리는 또한 "녹색 구역"만의 윤곽을 그렸으며, 그 다음 녹색 구역의 체적을 계산한바, 10.3㎣이었고, 앞-뒤 길이는 8.5mm였다(도 4A).
NHP 뇌각에서 구속 대 분포: 상기 연구에서, 단지 소량(<30μL)의 트레이서만 주입되었으며, 이것은 PUT, CC, IC 및/또는 EC로의 주입물의 상대적 분배를 정립하기에 충분하다. 그러나, 우리는 녹색 구역에 더 큰 부피를 주입했을 때도 좋지 않은 비-피각 분포 없이 PUT로 충실히 분포될 수 있다는 것을 보여주고 싶었다. NHP에서 다른 피각 주입에 대한 소급적 시험에 의해서, 우리는 캐뉼라가 녹색 구역에 배치되었던 동물에서 적은 부피(<30μL) 및 큰 부피(>100μL)에서 PUT 내에 주입물의 우수한 구속을 볼 수 있었다는 것을 발견했다(도 5). 반면에, 청색 구역에 캐뉼라를 배치하는 것은 주입 부피가 커짐에 따라 WMT로의 주입물 분포가 증가하는 것과 관련되었다. 이런 대표적인 데이터에 의해서 연구중인 한정된 RBG 구역 시스템을 사용해서 최적 캐뉼라 배치에만 기초하여 최적 주입을 확인할 수 있음을 확인되었다.
사람 뇌의 피각의 RBG 구역: 우리는 NHP로부터 얻어진 RBG 구역에 대한 변수를 사용하여 사람 뇌의 피각에서 RBG 구역을 예측했으며(도 3B, 도 4), 이것을 유전자 전달이나 단백질 투여와 같은 국소 치료법을 임상 치료법으로 이행할 때 사람 PUT에서 RGB 구역까지의 안내자로서 사용한다. 또한, 우리는 일련의 MR 영상 상에서 녹색 구역의 윤곽을 그린 다음, 각 MR 영상으로부터 면적을 계산하여 녹색 구역의 체적이 239.5㎣이고, 앞-뒤 거리가 19.7mm라는 것을 예측했다. 또한, NHP와 사람의 PUT에서 캐뉼라 단차를 위한 RBG 구역을 도 3에 나타낸 대로 동일한 규모에서 비교한다.
본 연구에서, 우리는 NHP의 PUT에서 주입 캐뉼라의 정밀한 입체정위적 배치를 PUT로의 MRI 트레이서 분포의 효능과 상관시켰다. 분명히, 일부 주입은 트레이서의 우수한 구속과 관련되었으며, 다른 것들은 다소 덜 효과적이었고, 일부는 환류의 증거가 나타났다. 그러나, 많은 주입이 PUT 내에 불량하게 함유되었으며, 주로 뇌량 WMT로의 트레이서의 누출과 관련되었다. 이들 데이터의 분석(도 1)은 피각 구속의 가장 큰 결정인자가 되는 변수가 캐뉼라 팁의 길이와 뇌량까지의 캐뉼라 단차의 거리였음을 시사했다. 내부 캡슐 및 외부 캡슐까지 단차의 거리는 구속과 그다지 관련이 없었다. 캐뉼라의 입체정위 좌표와 결과적으로 얻어진 트레이서의 PUT:WMT 분배 간의 상관성을 활용하여 캐뉼라 배치가 최적이고, 피각으로 주입물의 대류가 최적인 3D 공간인 피각의 "녹색 구역"을 한정할 수 있었다. 유사하게, "청색 구역"은 아-최적으로서 정의되었지만, 일부 사례에서만 허용될 수 있었고, "적색 구역"은 허용될 수 없는 결과와 관련되었다. 또한, 우리는 "녹색 구역"이 PUT로의 효과적인 Vd를 예측하고, 이 경우 WMT로의 주입물의 좋지 않은 누출이 회피될 수 있음을 보였다.
캐뉼라 관의 환류는 압력 구배를 파괴하고, 이것은 PUT에서 주입물의 분포를 손상시켜 Vd의 감소를 가져온다. CC로의 주입물의 누출이 가장 흔히 발생하는데, 이것은 우리가 본 보고서에서 보인바 대로 CC까지의 단차에 주로 좌우된다. 이 단차가 CC에 가깝다면, 캐뉼라 축이 그것을 통과하여 지나간다는 사실을 같이 생각하면, 환류는 항상 캐뉼라 축의 방향으로 발생할 것이다.
우리는 NHP "녹색 구역"을 사용하여 사람의 PUT에서 상응하는 구역을 예측했다. 우리의 컴퓨터 분석은 사람은 NHP와 비교하여 비례적으로 더 큰 녹색 구역을 가진다는 것과, 이미 나타낸 대로 녹색 구역 체적의 23배의 차이가 NHP와 사람 PUT의 크기 차이로 인한 것임을 나타냈다(Yin et al., 2009 J. Neurosci. Methods 176 (2):200-5). 분명한 크기 차이와는 별도로, 녹색 구역의 전체적인 형태는 매우 유사하다. 이런 지식은 주변의 해부학적 구조로의 유의한 누출 없이 환자의 피각에서 치료제의 우수한 Vd를 얻는데 중요하다.
사람의 신경 질환의 치료에서 CED의 사용이 더욱 폭넓어지는 것과 함께, 이미 설명된 대로(Eberling et al., 2008 Neurology 70(21):1980-3), 뇌 구조들 내에 치료제의 제어된 분포는 유전자 또는 분자 치료법을 이용하는 임의의 접근법에 필수적이다. 뇌의 인접한 영역이나 CSF 경로를 우회하면서 표적화된 치료 체적의 전체를 커버하는 효능을 최적화하는 것이 중요하다. 이런 환경에서 최적 캐뉼라 배치에 대한 이해의 부족으로 인해서 CED에 의해 송달되는 치료제의 분포를 예측하는 것은 매우 어렵다. 이것은 뇌 종양에 화학치료제를 송달하는 것과 PD 환자에 성장인자, 효소 및 바이러스 벡터를 주입하는 것에 대해서도 마찬가지이다.
PD에서 DBS 자극 전극의 MRI-안내된 배치와 같은 기능적 신경수술 치료 중재의 수술중 영상화를 위한 iMRI 기술의 출현(Larson et al., 2008 Stereotact Funct Neurosurg 86(2):92-100; Martin et al., 2009 Top Magn Reson Imaging 19(4):213-21)이 뇌에 영상-안내되는 치료법을 적용하는 또 다른 예이다. CED를 위한 "녹색 구역"의 정밀한 표적화는 두개골에 장착된 보조 장치와 iMRI 유닛의 사용에 의해서 달성될 수 있다. 주입 캐뉼라의 정확한 배치의 시각화에 더하여, 치료제의 원하는 분포가 CED의 시각화와 그에 따른 주입 과정의 제어에 의해서 달성될 수 있다.
요약하면, 본 연구는 캐뉼라 배치 및 가도테리돌의 분포에 대해 MRI에 의한 1차 정량 분석을 제공하며, NHP 피각에서 RBG 구역의 정의를 도입한다. 또한, MRI에 의한 캐뉼라 배치의 실시간 시각화와 그에 따른 가도테리돌 분포의 범위에 대한 정밀한 제어는 중요한 안전성 문제를 다루며, 특히 큰 체적의 간질성 주입이 필요하거나, 또는 누출이나 과도한 분포가 바람직하지 않을 수 있을 때 적용된다. 우리의 이행성 비-사람 영장류 연구로부터 개발된 RGB 구역에 캐뉼라를 배치하는 것은 PD를 위해 피각에 다양한 치료제를 CED로 투여하는 것을 특징으로 하는 임상시험과 상당한 관련성을 가진다. 유사한 RBG 구역들이 시상부 및 뇌간과 같은 다른 뇌 영역에 대해서도 한정될 수 있으며, 이로써 치료소에서 치료제의 신경외과적 주입을 위한 신뢰성 있는 좌표가 확립된다.
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표 1: 단차로부터 CC, IC 및 EC까지의 거리, 역류 길이 및 피각에서 MRI 트레이서의 분포 퍼센트의 측정. 역류 길이 및 피각 내 트레이서의 구속 퍼센트와 상관된 공간 좌표. PUT Vd 대 누출 Vd의 비는 피각 내 트레이서의 분포 체적을 백색질 관으로 누출된 트레이서의 체적으로 나눔으로써 얻어졌다. CC, 뇌량; IC, 내부 캡슐; EC, 외부 캡슐; PUT, 피각; 및 Vd, 분포 체적.
실시예 2
자기공명영상에 의한 비-사람 영장류에서 시상부 및 뇌간에 가도테리돌 송달의 실시간 시각화 및 특성화
본 연구에서는 6마리의 NHP를 대상으로 하여 시상부 및 뇌간에 22회 주입했다. 각 RCD로부터 NHP 뇌의 실시간 MR 영상을 얻어서 Gd의 분포를 평가하고, 캐뉼라 단차의 위치에 기초하여 시상부 또는 뇌간 내의 캐뉼라 단차로부터 중간선, 외측 경계 및 표적화된 구조를 향한 캐뉼라 진입점까지의 거리를 측정했다.
실험 피험자 및 연구 설계
4마리 사이노몰거스 멍키(수컷 2마리, 암컷 2마리, 7-8세, 평균 8.2세, 5-12.8kg)과 2마리 레서스 마카크(수컷 1마리, 10세, 12.2kg; 암컷 1마리, 8세, 6kg)를 포함하는 6마리의 정상 성체 NHP가 본 연구에 등록되었다. 실험은 샌프란시스코 대학(San Francisco, CA)과 Valley Biosystems(Sacramento, CA)의 동물 관리사용 위원회에서 승인된 프로토콜 하에 국립 건강지침 협회에 따라서 수행했다. 이들 동물에는 가도테리돌(Gd, 2mM)을 시상부와 뇌간에 총 22회 두개내 주입하여 투여했다. NHP에 대해 앞서 확립된 CED 기술에 따라서 주입을 행했다.
주입 과정: 해부학적 표지를 시각화하고, 제안된 주입 표적 부위의 입체정위 좌표를 생성하기 위해서 수술 전에 영장류는 베이스라인 MRI를 받았다. NHP는 시상부 및 뇌간으로의 CED를 위한 MRI-적합성 플라스틱 가이드 캐뉼라 어레이(12mm 직경 x 14mm 높이, 27개의 접근 구멍 함유)의 입체정위적 배치를 거쳤다. 각 가이드 캐뉼라 어레이를 플라스틱 스크류와 치과용 아크릴로 두개골에 고정했다. 가이드 캐뉼라 어레이의 배치 후, 동물을 적어도 2주간 회복시킨 후에 주입 과정을 개시했다. 주입일에 동물을 이소플루란(Aerrane; Ohmeda Pharmaceutical Products Division, Liberty Corner, NJ)으로 마취했다. 다음에, 각 동물의 머리를 MRI-적합성 입체정위 프레임에 배치하고 베이스라인 MRI를 수행했다. 과정 내내 맥박 및 PO2와 같은 바이탈사인을 모니터했다.
간단히 말해서, 주입 시스템은 로딩 라인(Gd 함유)에 접속된 융합 실리카 환류-저항성 캐뉼라, 오일을 함유한 주입 라인, 및 트리판 블루 용액을 함유한 또 다른 주입 라인으로 구성되었다. 1mL 주사기(트리판 블루 용액 충전)가 Harvard MRI-적합성 주입 펌프(Harvard Bioscience Company, Holliston, Massachusets) 위에 장착되고, 이 펌프가 송달 캐뉼라를 통한 유체의 흐름을 조절했다. MRI 좌표에 기초하여 캐뉼라를 미리 배치된 가이드 캐뉼라 어레이를 통해 뇌의 표적화된 영역에 삽입했다.
각 주입 캐뉼라의 길이는 원단부 팁이 캐뉼라 단차를 지나 3mm 연장될 수 있도록 조정했다. 이로써 캐뉼러의 팁의 근처가 단차식 디자인으로 되어서 CED 동안 유체 대류가 최대화되고 캐뉼러 관을 따른 환류는 최소화될 수 있다. 본 텍스트에서는 융합 실리카 팁으로부터 융합 실리카 외장부까지의 이런 변행부를 "단차"라고 하며, 모든 위치지정 데이터는 MRI 상에서의 명백한 가시성으로 인해서 이 단차의 위치로부터 유래된다. 뇌에 주입 캐뉼라를 삽입하는 동안에는 주입 캐뉼라 내에 양압을 유지하여 캐뉼라 삽입 동안 가능한 말단부 폐색을 최소화했다. 주입 캐뉼라의 배치를 고정한 후, CED 과정을 개시하여 실시간 MRI 데이터를 취득했다(실시간 대류 송달, RCD). 본 연구 내내 주입된 모든 NHP에 대해서 동일한 주입 변수들을 사용했다. 주입 속도는 다음과 같았다: 표적화된 영역으로 캐뉼라를 하강시킬 때는 0.1μl/분을 적용하고(조직이 팁 안으로 들어가는 것을 방지한다), 표적에 도달하면 10분 간격으로 0.2, 0.5, 0.8, 1.0, 및 2.0μl/분으로 증가시켰다. 주입 후 대략 15분 뒤에 뇌로부터 캐뉼라를 철수시켰다. 4마리의 동물은 다중 주입을 받았다. 각 동물은 각 주입 과정 사이에 적어도 4주의 간격이 있었다.
자기공명영상(MRI): NHP를 케타민(Ketaset, 7mg/kg, 1M)과 크실라진(Rompun, 3mg/kg, 1M)의 혼합물로 진정시켰다. 진정 후, 각 동물을 MRI-적합성 입체정위 프레임에 배치했다. 귀쪽 봉과 눈쪽 봉의 치수를 기록하고 정맥내 라인을 확립했다. MRI 데이터를 얻은 다음, 동물을 우리 안에서 바로 설 수 있을 때까지 면밀히 관찰하면서 회복되도록 두었다. 4마리 NHP를 대상으로 한 14회의 CED에서 뇌의 MR 영상을 1.5T Siemens Magnetom Avanto(Siemens AG, Munich, Germany)에서 취득했다. 반복 시간(TR) = 2110ms, 에코 시간(TE) = 3.6ms, 및 플립 각도 15도, 여기수(NEX) = 1(3회 반복), 매트릭스 = 240 x 240, 시야(FOV) = 240 x 240 x 240, 및 슬라이스 두께 = 1mm로 3-차원(3D) 래피드 그래디언트 에코(MPRAGE) 영상을 얻었다. 이들 파라미터에서 1㎣ 복셀 체적이 만들어졌다. 스캐닝 시간은 약 9분이었다.
2마리 NHP를 대상으로 한 8회의 CED에서 피험자 머리 위의 5인치 표면 코일을 바닥과 평행하게 해서 1.5T Sigma LX 스캐너(GE Medical Systems, Waukesha, WI)를 사용하여 MR 영상을 취득했다. 스포일드 그래디언트 에코(SPGR) 영상은 T1-가중되었으며, 스포일드 그래스 순서, TR = 2170ms, TE = 3.8ms, 및 플립 각도 15도, NEX = 4, 매트릭스 = 256 x 192, FOV = 16cm x 12cm, 슬라이스 두께 = 1mm에서 얻어졌다. 이들 파라미터에서는 0.391㎣ 복셀 체적이 만들어졌다. 스캐닝 시간은 약 11분이었다.
NHP 뇌에서 체적 및 거리 측정: 각 RCD로부터 MR 영상을 얻었고, 이것을 사용하여 캐뉼라 단차로부터 중간선(단차-중간선), 표적 영역(시상부 및 뇌간)을 향한 캐뉼라 진입점(단차-진입), 및 표적 영역의 외측 경계(단차-외측)까지의 거리를 측정했다. OsiriX® Medical Image 소프트웨어(v.2.5.1)를 사용하여 애플 매킨토시 G4 컴퓨터에서 측정을 수행했다. OsiriX 소프트웨어는 로컬 영상 저장전송 시스템(PACS; local picture archiving and communication system)을 통해 얻어진 MR 영상 형식의 DICOM(의학용 디지털 영상화 및 통신)로부터의 모든 데이터 항목을 판독한다. 각 진입점을 선택한 후, 캐뉼라 단차로부터 각 상기 언급된 진입점까지의 거리를 수동으로 한정하고, 이 소프트웨어로 계산했다. 모든 거리는 모든 MRI 구획 상에서 동일한 방식으로 측정했다.
녹색 구역에 있는 각 캐뉼라 단차 위치의 X, Y 및 Z 좌표 값을 OsiriX 소프트웨어에 의해 생성된 2D 직교 MR 영상을 이용하여 결정했으며, 이때 MR 영상은 3개 평면 모두에 투영되었다(축, 두정부 및 시상부). 우리는 3-차원(3D) 뇌 공간에서 제로 포인트(0,0,0)로서 전교련-후교련(AC-PC) 라인의 중점인 중간 교차점(MCP)을 사용했다. 간단히 말해서, AC-PC 라인을 정중시상면 상에 그리고 MCP를 한정했다. 다음에, MCP를 통과하는 직교 수평면(축)과 수직면(관상면)을 결정했으며, 축 평면은 정중시상면과 함께 AC-PC 라인을 함유한다. MRI 관상면 상에서 캐뉼라 단차로부터 중간선까지의 거리(X 값), 앞쪽(또는 뒤쪽)에서 MRI 축면의 MCP까지의 거리(Y 값), 및 시상부 MRI 상에서 AC-PC 라인 위(또는 아래의) 거리(Z 값)를 측정함으로써 캐뉼라 단차의 X, Y 및 Z 값이 얻어질 수 있다. 모든 거리는 각 사례별로 MRI 구획 상에서 동일한 방식으로 측정되었다(mm).
또한, MR 영상을 사용하여 가도테리돌(Gd)의 분포를 체적 정량(Vd)했다. 각 피험자의 뇌 내에서 가도테리돌의 Vd를 또한 애플 매킨토시 G4 컴퓨터로 정량했다. 시상부 또는 뇌간에서, 그리고 주변 구조에서 증대한 주입 면적의 윤곽을 그려서 관심 영역(ROI)를 손수 한정했다. Osirix 소프트웨어로 각 MR 영상으로부터 면적을 계산하고, 한정된 면적에 슬라이스 두께를 곱한 값에 기초하여 ROI의 체적으로 확립했다(PACS 체적). 각 분포의 경계면을 일련의 MRI 구획들에서 동일한 방식으로 한정했다. 분석될 특정 분포에 대한 PACS ROI 체적들(평가된 MRI 슬라이스의 수)의 합계로 측정된 체적을 결정했다. 한정된 ROI 체적에 기초하여 BrainLAB 소프트웨어(BrainLAB, Heimstetten, Germany)를 사용해서 3D 영상을 재구성할 수 있었다.
통계적 분석: Gd 분포 및 거리 변수(캐뉼라 단차에서 중간선까지; 캐뉼라 단차에서 영역 진입점까지; 캐뉼라 단차에서 각 영역의 외측 경계까지)를 스튜던트 t-테스트에 의해서 피험자 그룹들간 비교했다. 모든 시험에 대한 통계적 유의성의 기준은 p<0.05였다.
결과
CED 동안 시상부 내 가도테리돌 분포: 시상부에 수행된 14회의 주입 중 8건의 사례에서 우수한 Gd 분포가 달성되었고(57.1%), 이들의 Vd는 159.1 내지 660.3㎣ 범위였으며, 평균 체적은 405.6±66.6㎣였다. 도 6은 시상부와 WMT의 총 Vd에 대한 시상부 내 Gd의 Vd의 퍼센트를 나타내며, 이것은 8건의 사례에서 모두 100%로서, WMT로의 Gd 누출이 없다는 것을 시사한다.
6건의 사례에서(42.9%)는 시상부 내 Gd의 양호한 분포가 얻어졌는데, 이 경우 5건에서는 WMT로의 누출이 있었고, 4건에서는 렌즈 다발(Lenf)로의 누출이 있었다. 시상부 내 Gd의 Vd는 58.5 내지 267.6㎣ 범위였고, 평균 체적은 191.3±38.1㎣였다. 시상부에서 Vd의 퍼센트는 86.0% 내지 93.1%였고, 평균은 89.0%±1.3%였는데(도 6), 이것은 주변 구조들로의 일부 누출을 시사한다. 누출 Vd는 8.3 내지 43.7㎣ 범위였고, 평균 체적은 24.3±7.0㎣였다. 우수한 Vd와 누출이 있는 양호한 Vd 사이에는 시상부 내 Gd의 분포에 유의한 차이가 있었다. 대표적인 MRI는 시상부 내의 캐뉼라 단차 배치(도 6B 및 6F)와 Gd 분포(도 6C 내지 6E 및 6G 내지 6I)를 보여준다.
시상부 내 캐뉼라 단차 배치를 위한 변수들의 측정: 우리는 일부 주입은 인접한 WMT 및 Lenf로 일부 분포되면서 시상부 내에 트레이서의 양호한 구속을 가져왔지만, 다른 주입의 경우에는 시상부에만 트레이서가 분포된 것을 관찰했다. CED 동안 주어진 제제의 Vd는 많은 요인들에 의존한다. 우리의 경험에서 성공적인 CED의 중요한 요소는 캐뉼라 배치인 것 같다. 따라서, MR 영상을 사용하여 캐뉼라 단차로부터 중간선(단차-중간선), 외측 경계(단차-외측 경계) 및 시상부의 캐뉼라 진입점(단차-진입점)까지의 거리를 측정했다. 시상부 내의 캐뉼라 배치를 도 7에 나타낸다.
시상부 내에 Gd의 우수한 구속을 나타낸 7건의 사례에서, 단차-중간선 거리는 4.99-7.73mm 범위였고, 평균 거리는 6.24±0.36mm, 단차-진입점 거리는 2.82-4.59mm 범위였고, 평균 거리는 3.96±0.29mm, 단차-외측 경계 거리는 2.16-6.95mm 범위였고, 평균 거리는 3.58±0.63mm였다. 캐뉼라와 수평선 사이의 각도는 58.85 내지 66.67도 범위였고, 평균은 63.90±1.02도였다.
시상부 내에 Gd의 우수한 구속과 주변 구조로의 일부 누출을 보인 5건의 사례에서, 단차-중간선 거리는 5.92-7.69mm 범위였고, 평균 거리는 7.18±0.27mm였으며, WMT로의 누출을 보인 4건의 사례에서 단차-진입점 거리는 1.26-2.18mm 범위였고, 평균 거리는 1.79±0.19mm, Lenf로의 누출을 나타낸 3건의 사례에서 단차-외측 경계 거리는 1.33-1.88mm 범위였고, 평균 거리는 1.67±0.19mm였다. 우수한 Vd 그룹과 누출이 있는 양호한 Vd 그룹 사이에는 단차-진입점 및 단차-외측 경계에 유의한 차이가 있었다. 캐뉼라와 수평선 사이의 각도는 61.08 내지 69.89도 범위였고, 평균은 64.65±1.46도였다.
시상부 내에 함유된 주입된 트레이서의 퍼센트를 각 변수에 대해 플롯팅한 경우, 캐뉼라 단차로부터 그것의 진입점 또는 시상부의 외측 경계까지의 거리가 시상부 내 주입물 분포의 가파른 하강과 상관된다는 것이 분명해 보인다(도 8 및 9). MWT로의 누출을 보인 4건의 주입에서 캐뉼라 단차는 시상부의 캐뉼라 진입점 근처에 배치되었고, 평균 거리는 1.79mm였다(도 8A). Lenf로의 누출을 보인 3건의 주입에서 캐뉼라 단차는 시상부의 외측 경계 근처에 배치되었고, 평균 거리는 1.67mm였다(도 9A). 우리는 시상부 내에 주입물의 최적 구속을 위해서는 단차-진입점 거리 및 단차-외측 경계 거리가 각각 약 2.8mm 및 2.2mm를 초과해야 한다는 결론을 내렸다. 캐뉼라 단차로부터 중간선까지의 거리는 피각 구속과 그다지 관련되지 않았다(도 10).
CED 동안 뇌간에서 가도테리돌의 분포: 뇌간에서 수행된 8회의 주입에서 모두(100%) Gd의 우수한 분포가 달성되었으며, Vd는 224.3-886.3㎣ 범위였고, 평균 체적은 585.2±75.4㎣였다. 단지 1건의 사례에서만 주입 마지막에 시상부에서 매우 적은 양의 Gd 누출이 발견되었으며, 시상부에서 그것의 Vd는 30.5㎣였다. 뇌간과 시상부의 총 Vd에 대한 뇌간 내 Gd의 Vd의 퍼센트는 7건의 사례에서는 100%였고, 1건에서만 95.6%였다(도 11A). 뇌간 내 주입은 본 연구에서 사용된 212μL 미만의 주입 부피에서 잘 함유되었다. 뇌간 주입은 중앙 뇌 및 꼬리부와 연수를 향해 부리쪽으로 분포되었다. 소뇌로의 분포는 보이지 않았다. 대표적인 MRI는 뇌간 내의 캐뉼라 단차 배치(도 11B)와 Gd 분포(도 11C 내지 11E)를 보여준다.
뇌간 내에 캐뉼라 단차 배치를 위한 변수들의 측정: 도 12는 우수한 Gd 분포를 보인 8건의 사례에서 뇌간 내 캐뉼라 배치를 보여준다. 단차-중간선 거리는 1.56-3.88mm 범위였고, 평균 거리는 2.58±0.30mm, 단차-진입점 거리는 3.55-12.63 mm 범위였고, 평균 거리는 7.29±0.97mm, 단차-외측 경계 거리는 2.87-5.09mm 범위였고, 평균 거리는 4.14±0.25mm였다. 캐뉼라와 수평선 사이의 각도는 60.89 내지 67.26도 범위였고, 평균은 64.27±0.83도였다. 뇌간 내에 함유된 주입된 트레이서의 퍼센트를 각 변수에 대해 플롯팅한 경우, 뇌간 내에 주입물의 최적 구속이 얻어지도록 적절히 캐뉼라가 배치되었음이 분명해 보인다(도 13).
시상부 및 뇌간 내 Gd 분포 체적의 3-차원 재구성: MRI 상에 보이는 Gd 신호에 따라서 BRainLab 소프트웨어를 사용하여 윤곽을 그리고, 시상부(녹색) 및 뇌간(적색)의 Vd를 3D 재구성했다. 이것은 시상부 및 뇌간 내에 확실히 분포된 Gd 분포의 구조-관련된 체적을 나타낸다. 시상부와 뇌간 내 분포 체적을 주입 부피(Vi)에 대해서 플롯팅했다. 선형 경향의 라인은 우수한 Vd(R2=0.997) 및 누출이 있는 양호한 Vd(R2=0.996)를 보인 경우 시상부에서, 그리고 뇌간(R2=0.992)에서 Vi와 Vd의 강한 상관성을 드러냈다. 이런 발견에 따라서, Vi보다 3-4배 큰 Vd가 시상부에서는 최대 158μL의 Vi에서, 그리고 뇌간에서는 212μL의 Vi에서 예상될 수 있었다. 본 연구에서 주입된 구조들 중에서도 리포솜의 전체적 Vd/Vi 비는 시상부에서 3.2, 뇌간에서 3.9였다. 시상부 내 최대 분포는 158μL에서 약 660.3㎣를 제공했으며, 이때 분포 비는 417.9%였고, 뇌간에서는 212μL에서 약 695.6㎣를 제공했고, 분포 비는 328.1%였다.
NHP의 시상부 및 뇌간에서 캐뉼라 단차를 위한 녹색 구역: 이런 분석에 기초하여, 우리는 시상부와 뇌간 내 주입을 위한 좌표를 한정했고, 바람직한 캐뉼라 특징과 뇌 내의 주요 구조들로부터의 최적 거리를 확인한다.
캐뉼라가 적절한 각도로 배치된 경우, 시상부의 "녹색 구역"은 진입점까지 적어도 2.8mm, 시상부의 외측 경계로부터 2.2mm 이상, 중간선으로부터 5mm 이상으로 한정된다. 유사하게, 캐뉼라가 적절한 각도로 배치된 경우, 뇌간의 "녹색 구역"은 진입점까지 적어도 3.5mm, 뇌간의 외측 경계로부터 2.9mm 이상, 중간선으로부터 1.6mm 이상으로 한정된다.
실시예 3
MRI 는 AAV2 - GDNF 의 대류-촉진 송달 후 NHP 뇌에서 GDNF 의 분포를 예측한다
대류-촉진 송달(CED)을 이용하는 유전자 치료법은 약물 주입을 거의 실시간으로 모니터링하여 약물 분포를 정확히 예측하는 것이 필요할 것이다. 조영제(가도테리돌, Gd) MRI를 사용하여 CED 주입을 모니터링했고, 아교 셀라인-유래 신경영양 인자(GDNF)를 암호화하는 치료제인 아데노-관련 바이러스 타입 2(AAV2) 벡터의 발현 패턴을 예측했다. 비-사람 영장류(NHP) 시상부를 이용해서 주입을 모델링하여 임상적으로 관련 있는 큰 부피의 송달을 가능하게 했다. 방향족 L-아미노산 데카르복실라제(AADC)를 암호화하는 세포내 분자 AAV2를 AAV2-GDNF/Gd와 동시 주입하여 AAV2 형질도입 대 세포외 GDNF 확산이 구별되도록 했다. Gd(Vd)의 분포 체적은 Vi과 선형 관련되었으며, Vd/Vi의 평균 비는 4.68±0.33였다. Gd 분포와 AAV2-GDNF 또는 AAV2-AADC 발현 사이에는 우수한 상관성이 있었고, GDNF 또는 AADC 대 Gd의 발현 영역의 비는 둘 다 1에 근접했다. 우리의 데이터는 조영제(Gd) MRI를 사용하여 CED를 통해 AAV2 주입을 모니터하여 AAV2 형질도입의 분포를 예측할 수 있음을 뒷받침한다.
본 연구의 목표는 표적 영역에 AAV2-기반 유전자 치료 벡터를 송달하는 것에 있어서 증진된 안전성 및 예측성을 위한 방법을 개발하는 것이었다. 구체적으로, 본 연구는 MRI 트레이서인 다도테리돌(Gd, Prohance)의 동시 주입을 이용하여 사람 선조체에서 AAV2-매개 GDNF 발현 체적 및 패턴을 예측하는 방법에 중점을 둔다. GD와 AAV2-GDNF의 동시 주입에 의해서 반복적인 MRI T1 순서를 이용하여 주입을 실시간 모니터링할 수 있다. MRI-안내된 모니터링 시스템의 개발은 우리의 전임상 AAV2-GDNF 유전자 치료법 프로그램을 임상 현실에 이행시키는데 있어서 중요하다.
나이 든 파킨슨병에 걸린 비-사람 영장류(NHP)에 대류-촉진 송달(CED)을 통해서 AAV2-GDNF를 피각 송달하는 것의 전임상 연구는 피각이 이 유전자 치료 전략의 이상적인 송달 영역임을 증명했다. 그러나, PD 환자의 피각은 파킨슨병 NHP 피각보다 약 5배 정도 더 크기 때문에, 임상시험에서 사람 피각에 필요한 적용범위를 모델링하기 위해서는 주입 부피의 규모를 크게 해야 한다. 그러나, NHP 피각은 그것을 둘러싼 백색질관으로 주입물이 넘쳐 들어가기 때문에 30-40μL를 초과하지 않는 부피로만 주입될 수 있다. 사람 피각의 적용범위를 최대화하는데 연관된 주입 임상 변수를 더 잘 근사하기 위해서, 우리는 NHP 피각의 약 1.4배 크기이지만, 주변 구조에의 근접성에 관해서는 피각과 유사한 NHP 시상부를 표적으로 했다. 따라서, 본 연구에서는 NHP 시상부에 임상적으로 관련 있는 부피(약 150μL)로 AAV2-GDNF 벡터를 주입함으로써 Gd 분포의 패턴과 후속되는 조직학적 구획 상의 GDNF 발현을 상관시켰다.
선행 연구는 뇌내 AAV2-GDNF 주입이 세포내 신경체와 섬유 염색뿐만 아니라, 세포외 면역반응성을 가져왔음을 나타냈으며, 이것은 형질도입된 GDNF 단백질이 세포외 공간으로 방출된다는 것을 시사한다. 이것은 세포외 GDNF 단백질이 농도-구배 매개 확산을 통해 산포될 수 있다는 가능성을 높인다. 따라서, GDNF의 분포는 AAV2 벡터 대류 및 형질도입에 의해서만 아니라, 아마도 세포외 GDNF 단백질 확산에 의해서도 영향을 받을 수 있을 것이다. 바이러스 형질도입 대 GDNF 단백질 확산을 더 잘 구별하기 위해서, 우리는 AAV2-GDNF/GD와 함께 제 2 AAV2 벡터를 동시 주입하여 비-분비형 세포내 분자인 방향족 L-아미노산 데카르복실라제(AADC)를 발현시켰다. 내인성 AADC는 정상적으로는 NHP 시상부에 부재하므로, 시상부에서 형질도입된 AADC의 발현은 AAV2 벡터 형질도입과 분포의 경계면에 대해 신뢰할 만한 예측성을 제공할 것이다.
방법 및 재료
실험 피험자 및 연구 설계: 3마리의 정상 성체 NHP가 본 연구 대상이었다. 실험은 국립 건강지침 협회 및 샌프란시스코 대학(San Francisco, CA)의 동물 관리사용 위원회에서 승인된 프로토콜에 따라서 수행했다. 3마리의 동물에는 AAV2 벡터와 자유 가도테리돌(1mM Gd, Prohance; Brancco Diagnostics, Princeton, NJ)를 시상부에 투여했다. NHP에 대해 앞서 확립된 CED 기술에 따라서 주입을 행했다.
주입 제제: 가도테리돌(Gd, C17H29N4O7Gd, Prohance)은 Baracco Diagnostics Inc.(Princeton, NJ)에서 구입했다. 시토메갈로바이러스 프로모터의 제어하에 사람 GDNF(AAV2-GDNF) 또는 사람 AADC(AAV2-AADC) 중 어느 하나에 대한 cDNA 서열을 함유하는 AAV2 벡터를 3중-트랜스펙션 기술을 이용하여 필라델피아 아동병원의 AAV 임상 벡터 코어로 포장하고, 이어서 CsCl 구배 원심분리에 의해 정제했다. AAV2-GDNF/AAV2-AADC 스톡을 정량 PCR에서 결정된 대로 mL 당 2 x 1012 벡터 게놈(vg)까지 농축한 다음, 사용하기 직전에 인산염-완충 식염수(PBS)-0.001%(v/v) Pluronic F-68 중에서 1-1.2 x 1012 벡터 게놈(vg/mL)으로 희석했다.
주입 과정: NHP는 시상부 위에 MRI-적합성 가이드 어레이를 배치하기 위한 신경수술 과정을 받았다. 각 맞춤형 가이드 캐뉼라를 명시된 길이로 절단하고, 두개골 내에 만들 둔 기계 구멍을 통해 그것의 표적으로 입체정위적으로 안내한 후, 치과용 아크릴로 두개골에 고정했다. 어레이의 더 큰 직경의 줄기는 각각 0.53mm 및 0.45mm의 외경 및 내경을 가졌다. 팁 부분의 외경 및 내경은 각각 0.436mm 및 0.324mm였다. 가이드 어레이 조립체의 상부를 스타일릿 스크류로 봉쇄하여 주입 과정 동안 간단히 접근할 수 있도록 했다. 동물을 적어도 2주간 회복시킨 후에 주입 과정을 개시했다.
NHP를 케타민(Ketaset, 7mg/kg, 1M)과 크실라진(Rompun, 3mg/kg, 1M)의 혼합물로 진정시키고, 이소플루란(Aerrane;Ohmeda Pharmaceutical Products Division, Liberty Corner, NJ)으로 마취시켰다. 각 동물의 머리를 MRI-적합성 입체정위 프레임에 배치하고, 주입 전에 베이스라인 MRI를 수행하여 해부학적 표지를 시각화해서 각 동물에 대해 제안된 표적 주입 부위의 입체정위 좌표를 생성했다. 과정 내내 심박수 및 PO2와 같은 바이탈사인을 모니터했다. 간단히 말해서, 주입 시스템은 로딩 라인(벡터 및 Gd 함유)에 접속된 3mm 단차를 가진 융합 실리카 환류-저항성 캐뉼라, 오일을 함유한 주입 라인, 및 트리판 블루 용액을 함유한 또 다른 주입 라인으로 구성되었다. 1mL 주사기(트리판 블루 용액 충전)가 마이크로주입 펌프( BeeHive, Bioanalytical System, West Lafayette, IN) 위에 장착되고, 이 펌프가 시스템을 통한 유체의 흐름을 조절했다. MRI 좌표에 기초하여 캐뉼라를 미리 배치된 가이드 캐뉼라를 통해 뇌의 표적화된 영역으로 손으로 안내했다. CED 과정 동안 유체 분포를 최대화하고, 캐뉼라 관을 따른 환류를 최소화하기 위해서 캐뉼라의 팁에 3mm 단차가 있도록 설계했다. 주입 캐뉼라의 배치를 고정한 후, CED 과정을 개시하여 실시간 MRI 데이터를 취득했다(실시간 대류 송달, RCD). 연구 내내 주입된 모든 NHP에 대해서 동일한 주입 변수를 사용했다. 주입 속도는 다음과 같았다: 표적화된 영역으로 캐뉼라를 하강시킬 때는 0.1μl/분을 적용하고, 20-30분 간격으로 1.5 및 2.0μl/분으로 증가시켰다. 주입 후, 뇌로부터 캐뉼라를 철수하고, 동물을 우리 안에서 바로 설 수 있을 때까지 면밀히 관찰하면서 회복하도록 두었다.
자기공명영상(MRI): 뇌의 MR 영상을 1.5T Siemens Magnetom Avanto(Siemens AG, Munich, Germany)에서 취득했다. 반복 시간(TR) = 17ms, 에코 시간(TE) = 4.5 ms, 및 플립 각도 15도, 여기수(NEX) = 1(3회 반복), 매트릭스 = 256 x 256, 시야(FOV) = 240 x 240 x 240, 및 슬라이스 두께 = 1mm로 3-차원 래피드 그래디언트 에코(MPRAGE) 영상을 얻었다. 이들 파라미터에서 1㎣ 복셀 체적이 만들어졌다. 스캐닝 시간은 약 9분이었다. 4마리 NHP에서 피험자 머리 위의 5인치 표면 코일을 바닥과 평행하게 해서 1.5T Sigma LX 스캐너(GE Medical Systems, Waukesha, WI)를 사용하여 MR 영상을 취득했다. 스포일드 그래디언트 에코(SPGR) 영상은 T1-가중되었으며, 스포일드 그래스 순서, TR = 2170ms, TE = 3.8ms, 및 플립 각도 15도, NEX = 4, 매트릭스 = 256 x 192, FOV = 16cm x 12cm, 슬라이스 두께 = 1mm에서 얻어졌다. 이들 파라미터에서는 0.391㎣ 복셀 체적이 만들어졌다. 스캐닝 시간은 순서 당 약 5분이었고, 주입 과정 내내 연속 스캐닝했다.
MR 영상으로부터 Gd 분포의 체적 및 면적 정량: 각 주입된 뇌 영역 내에 분포된 Gd의 체적을 OsiriX Medical Image 소프트웨어(v.3.6)를 사용하여 정량했다. 이 소프트웨어는 MR 영상으로부터 모든 데이터 항목을 판독한다. Gd 신호의 픽셀 역치를 정의한 후, 소프트웨어는 정의된 역치를 넘는 신호를 계산하고, 각 MRI 시리즈별로 관심 영역(ROI)의 면적을 확립하여, NHP 뇌에 대한 ROI의 분포 체적 Vd를 산정한다. 이로써 임의의 주어진 시간 지점에서 Vd가 결정될 수 있고, 3-차원 영상으로 재구성될 수 있다.
조직학적 과정: 동물을 나트륨 펜토바르비탈(25mg/kg, i.v.)로 깊게 마취시키고, 벡터 투여 후 약 5주 뒤에 안락사시켰다. 뇌를 수거해서 뇌 매트릭스와 함께 관상 슬라이스로 만들었다. 뇌 블록을 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 후, 저온유지장치에서 40μm 관상 절편으로 절단했다. 절편을 면역조직화학(IHC) 염색을 위해 처리했다. 일련의 절편을 아교-유래 신경영양 인지(GDNF)와 방향족 사람 1-아미노산 데카르복실라제(hAADC)에 대해 염색했다. 모든 20개 절편을 인산염-완충 식염수(PBS)로 세척하고, 20분간 1% H2O2 중에서 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단했다. PBS 세척 후, 절편을 실온에서 차단 용액인 Sniper® 차단 용액(Biocare Medical, Concord, CA) 중에서 30분 인큐베이션한 다음, 실온에서 1차 항체(GDNF, 1:500, R&D Systems, Minneapolis, MN; AADC, 1:1000, Chemicon, Billerica, MA; TH, 1:10000, Chemicon)와 함께 하룻밤 Da Vinci® 희석액(Biocare Medical) 중에서 인큐베이션했다. 실온에서 PBS로 각 5분씩 3회 헹군 후, 절편을 실온에서 1시간 동안 Mach 2 또는 염소 HRP 중합체(Biocare Medical) 중에서 인큐베이션하고, 그 다음 몇 번 세척해서 색을 전개시켰다(DAB; Vector Laboratories, Burlingame, CA; Vulcan Fast Red; Biocare Medical). 면역염색된 절편을 슬라이드 위에 장착하고, Cytoseal®(Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI)로 밀봉했다.
GDNF 및 AADC 발현의 면적 정량: GDNF 및 AADC 발현의 분석을 Zeiss 광 현미경을 사용하여 수행했다. GDNF- 및 AADC-양성 영역은 저 배율에서 확인되었고, 고 배율에서는 양성으로 염색된 세포들이 확인되었다. 저 배율의 GDNF 염색된 영상을 ImageJ 소프트웨어로 분석했고, 양성 염색된 영역을 역치 함수를 사용하여 확인했다. 고 배율 현미경 영상에 기초하여 AADC-IR 면적의 윤곽을 손수 그렸다. Gd 분포를 나타내는 MR 영상을 기준으로 삼지 않고 OsiriX 소프트웨어를 사용하여 상응하는 베이스라인 MRI 영상 상에 손수 양성 영역의 윤곽을 그려서 GDNF 또는 AADC에 대해 양성으로 염색된 영역을 상응하는 영장류 MRI로 이전했다.
통계적 분석: Gd 분포, GDNF 또는 AADC 발현의 면적을 스튜던트 t-테스트 및 피어슨 상관 테스트에 의해 비교했다. 모든 시험에 대한 통계적 유의성의 기준은 p<0.05였다.
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결과
시상부 내 Gd 분포: 본 연구에서는 3마리의 레서스 영장류에 약 150μL(Vi)의 AAV2-GDNF/Gd(1-1.2 x 1012vg/ml, n=5)를 시상부에 주입했다. 이런 주입들 중 3가지는 AAV2-AADC(1 x 1012vg/ml, n=3)를 포함했다(표 1). 주입 전과 주입 동안 자기공명영상(MRI)을 수행했고, 1cm 간격마다 관상 뇌 영상을 얻어서 Gd(Vd)의 분포를 평가했다.
5분 간격으로 T1-가중된 MRI를 수행했으며, 영상은 Gd가 주입된 해부학적 영역이 주변의 비-주입된 조직으로부터 명확히 구별될 수 있었음을 나타냈다(도 15a-15e). 주입 처음에는 Gd 분포의 원통형 고리가 캐뉼라 팁의 둘레에 형성되었다(도 15a). 주입은 Vi이 증가함에 따라 더욱 구형인 패턴을 나타내면서 방사상으로 확장되었다(도 15b-15e). 주입 마지막에 OsiriX 소프트웨어로 Gd 분포를 3D 재구성하자 눈물방울 모양의 신호가 나타났다(도 15f).
다양한 시간 지점에서 Gd 분포의 체적(Vd)을 OsiriX 소프트웨어로 정량했다. 주입 동안의 그로스 MR 영상화 모습(도 15a-15e)과 일치하여, Gd의 Vd는 Vi과 함께 선형 증가했고(R2=0.904, P<0.0001)(도 16), 최종 체적은 700 내지 900㎣ 범위였으며, 이것은 NHP 시상부의 총 체적의 약 70-90%를 커버했다. 각 주입 부위에 대해 Vd/Vi의 비는 일정하게 유지되었고, 평균값은 4.68±0.33였다.
Gd와 GDNF 조직학의 상관성: 5주 후에 동물을 마취하고, 시상부를 함유하는 뇌 블록을 고정한 후 관상 절편으로 잘랐다. 0.8mm씩의 일련의 절편 세트를 GDNF에 대한 항체로 염색했다. 면역조직화학 분석은 주입 주위에서 GDNF 단백질의 발현 패턴이 Gd 분포와 유사했음을 증명했다(도 17a 및 17b). 정량 분석은 GDNF 발현 영역이 Gd 분포 영역과 상당히 상관되었음을 나타냈다(도 17d 및 17e). GDNF 염색 영역 대 Gd 분포 영역의 평균 비는 1.08±0.17였다. 고 배율 현미경 영상은 GDNF 영상이 신경세포의 세포질과 세포외 공간에서 관찰되었음을 나타냈으며, 염색 패턴은 세포외 매트릭스와의 GDNF 결합을 시사한다(도 17c).
시상부 AAV2-GDNF 주입 후 모든 동물에서 바늘관으로부터 먼 분리된 피질 영역들에서 강한 GDNF 염색이 관찰되었다(도 17b, 18b 및 19b). 또한, 우리는 AAV2-AADC를 동시 주입한 NHP의 피질에서 AADC 염색을 발견했다(도 18c 및 19c). 피질에 GDNF 또는 AADC 단백질의 존재는 시상부로부터의 축삭 수송으로 인한 것이었다. 따라서, 본 연구에서는 유전자 발현의 측정된 영역으로부터 시상부-피질 섬유와 피질의 염색을 배제함으로써 시상부 내의 직접 대류 송달로부터 주로 유래된 GDNF 또는 AADC 발현과 Gd 분포를 더 잘 비교할 수 있도록 했다.
GDNF와 AADC 조직학의 상관성: AAV2-GDNF의 시상부 송달은 확고한 세포내 및 세포외 GDNF 면역반응성을 가져왔다. MRI 트레이서 Gd의 넓은 분포를 가정하면, 본 연구에서 상당한 GDNF 분포는 주입된 벡터의 부피(약 150μL)의 분산으로 인한 것일 수 있다. 그러나, GDNF의 세포외 확산의 수준도 역시 분포에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 유전자 발현의 총 면적에 대한 세포외 확산의 효과를 평가하기 위해서, AAV2-AADC를 동시 주입한 동물에서 GDNF 발현 영역을 세포내 분자 AADC 발현 영역과 비교했다. 이 방식으로 세포 형질도입 대 유전자 산물의 분비와 확산이 구별될 수 있다.
2마리의 영장류(#2 및 #3)에 AAV2-GDNF와 AAV2-AADC를 시상부에 동시 주입했다; 한 마리는 단측성 주입되었고, 나머지 한 마리는 양측성 주입되었다. 시상부 주입을 함유하는 인접한 뇌 구획을 각각 GDNF와 AADC로 염색했다. 또한, AADC 면역염색이 NHP에서 형질도입된 AADC와 내인성 AADC를 둘 다 모두 검출할 수 있기 때문에(도 18c 및 18e), 우리는 TH-양성 프로파일과 동시 국소화되는 내인성 AADC로부터 형질도입된 AADC를 구별하기 위한 이중 발색성 염색 방법을 개발했다. 구획들을 AADC에 대해서는 연갈색으로, 내인성 티로신 히드록실라제(TH)에 대해서는 밝은 적색으로 이중으로 표지했다(도 18d). 내인성 AADC를 함유한 거의 모든 뉴런은 TH에 대해 양성이었다. 따라서, 내인성 AADC와 TH를 함유하는 세포들은 이중 표지되었고 암적색으로 염색되었으며(도 18f), 외인성 AADC로 형질도입된 뉴런들만 단일 발색체로 염색되었고 연갈색을 나타냈다(도 18i). 인접한 AADC 염색된 구획들을 AADC/TH 이중 염색된 구획들과 겹쳐 놓음으로써, 형질도입된 AADC 발현의 경계면의 윤곽을 나타낼 수 있었다(도 18c, 청색 라인).
한 영장류(#2)의 시상부에 AAV2-GDNF 및 AAV2-AADC의 단측성 동시 주입에서는 내인성 및 형질도입된 AADC를 용이하게 구별할 수 있었는데, 이것은 뇌의 주입된 측에서만 형질도입된 AADC가 관찰되었기 때문이다. 반면에, TH와 동시 국소화되었던 내인성 AADC는 꼬리부, 피각 및 흑색질에서 양측에 존재했다(도 18d). 바로 이 영장류에서는 시상부 주입이 피각의 중앙부까지 연장됨에 따라, 내인성 AADC 양성 섬유만을 함유한 좌측 피각과 대조적으로(도 18g), 중앙 피각의 가장자리에서 AADC 양성 세포들이 발견되었다(도 18h). 우측 피각의 이런 AADC 양성 세포들은 청색으로 윤곽이 표시된바 같은 영역 측정에 포함되었다(도 18h). 우측 피각과 꼬리부에서 전체적인 AADC 염색 강도는 좌측에 비하여 더 강하게 보였다(도 18c, 18g 및 18h). 우리는 또한 GDNF 염색 구획에서도 유사한 패턴을 관찰했다(도 18b). 우측 피각과 꼬리부에서 AADC 또는 GDNF의 증진된 면역활성은 이 영장류에서 주입이 연장된 곳인 등쪽 흑질부로부터 발현된 유전자 산물의 선행성 수송으로 인한 것일 가능성이 가장 높다. 따라서, 이들 영역은 직접 벡터 형질도입 영역으로 포함되지 않았다.
인접한 GDNF 및 AADC/TH 염색된 구획을 비교함으로써 시상부에서는 GDNF 및 외인성 AADC의 발현 패턴이 거의 동일하다는 것을 알았다. 또한, GDNF 및 AADC 발현은 MRI Gd 분포와 실질적으로 중복되었다(도 18a). 일련의 MRI 관상면들에서 Gd, GDNF 및 AADC 분포의 영역은 서로 상당히 관련되었다(도 18j). AADC 염색 영역 대 Gd 분포 영역의 평균 비는 1.07±0.06이었으며, 이것은 GDNF 대 GD(1.08±0.17)와 동일하다. 모든 이들 데이터는 AADC와 GDNF 분포의 우수한 일치를 강하게 시사했다.
나머지 영장류(#3)의 시상부에 AAV2-GDFN 및 AAV2-AADC의 양측성 동시 주입에서 우리의 발견이 더 검증되었다(도 19). 형질도입된 GDNF 및 AADC 단백질의 대부분은 시상부의 양측에 국한되었으며(도 19b 및 19c), 이때 발현 패턴은 Gd 분포와 상당히 상관되었다(도 19a, 19d 및 19e).
본 연구에서는 MRI 조영제를 사용하여 근-실시간으로 주입을 시각화함으로써 치료제인 AAV2-GDNF의 분포를 예측할 수 있었다. NHP 시상부를 이용해서 사람 피각에서의 주입을 모델링하여 임상적으로 관련 있는 부피의 송달을 가능하게 했다. 환류나 누출 없이 CED에 의해서 시상부에 약 150μL의 Vi로 벡터를 투여할 수 있었다. Gd의 Vd는 Vi와 선형 관련되었고, Vd/V의 평균 비는 4.68±0.33이었다. Gd 분포와 AAV2-GDNF와 AAV2-AADC 발현 사이에는 우수한 상관성이 있었으며, GDNF 또는 AADC 대 Gd의 발현 영역의 비는 둘 다 1에 근접했는데, 이것은 AAV2 형질도입의 분포와 후속되는 유전자 발현을 조영제(Gd) MRI를 사용하여 예측할 수 있음을 시사한다. 또한, GDNF 및 AADC의 발현 패턴이 거의 동일하기 때문에 AAV2-GDNF 형질도입 후에 GDNF 단백질의 검출가능한 확산은 없었다. 따라서, 이후의 임상시험에서 AAV2-GDNF를 받은 환자에서 예상되는 GDNF 발현은 형질도입된 영역으로부터 GDNF의 확산으로 인한 어떤 추가의 적용범위 없이 동시 주입된 Gd의 Vi보다 대략 4-5배 더 클 것으로 기대될 수 있다. 이런 정보는 임상 연구에서 AAV2-GDNF 벡터의 용량을 정확히 선택하는데 중요하다.
CED를 사용하여 질환 부위로 직접 강력한 치료제를 뇌내 주입하는 것은 신경 장애를 치료하기 위한 효과적인 전략을 제공한다. 본 연구에서 MRI 조영촉진제인 Gd와 치료제인 AAV2-GDNF를 CED를 사용하여 동시 주입하는 것이 주입을 모니터링하고, 치료제 분포를 추정하는데 유용한 것으로 증명되었다. Gd를 사용한 실시간 MR 영상화는 주입 영역을 드러내었으며, 주변 조직으로부터 쉽게 구분될 수 있었다(도 15a-15e). 이런 잘-한정된 주입 영역은 주입 파라미터 및 정밀한 체적 분석의 근-실시간 조정을 가능하게 했다.
CED 주입 동안 Gd와 AAV 벡터의 분포 차이는 오히려 미미하며, 이것은 아마도 농도 구배-매개 확산보다는 오히려 압력 구배-매개 유체 수평류의 지배적인 추진력으로 인한 것 같다. 따라서, MRI Gd 신호는 주입 동안 AAV2 벡터의 분포를 신뢰성 있게 의태한다. 주입 완료 후 더 긴 시간 규모 동안 AAV2 벡터와 뇌의 형질도입된 세포에 의해 방출된 세포외 GDNF의 분포는 농도 구배와 조직에서 주입물의 확산성에만 의존할 수 있다. 우리는 주입 동안 근-실시간 MRI에 기초한 Gd의 분포가 주입 후 5주 뒤에 GDNF 발현과 상당히 상관되었고, Gd 대 GDNF의 비는 1에 근접했음을 발견했다. 또한, GDNF의 분포는 세포내 분자인 AADC와 거의 동일했다. 이런 발견은 선행 연구와 일치했으며, 주입이 중단된 후 AAV2 벡터 또는 GDNF의 제한된 확산을 강하게 시사했다. 따라서, Gd의 CED 주입의 분포는 AAV2-GDNF 둘 다의 분포를 긴 시간 기간에 걸쳐 예리하게 효과적으로 예측할 수 있다.
Gd의 분포(Vd)는 주입물의 부피(Vi)와 함께 선형 증가했고, Vd 대 Vi의 비는 4.68±0.33였으며, 이것은 선행 연구(약 4-5)의 비교적 좁은 범위 내이다. MRI-안내된 CED 송달 플랫폼에서 Vd와 Vi의 이런 일정한 선형 관계는 AAV2-GDNF 벡터의 임상 용량을 계획하기 위한 근거가 되며, PD 환자에서 이 치료제 및 다른 치료제의 분포의 예측을 가능하게 할 수 있다.
요약하면, 실시간 MRI 영상화를 사용하여 CED를 통해 표적화된 뇌 영역에 정확히 AAV2-GDNF 벡터를 주입할 수 있다. 또한, 조영제 MRI는 AAV2 벡터 주입을 안내하고 AAV2-GDNF 발현을 신뢰성 있게 예측할 수 있는 귀중한 도구를 제공하며, 이로써 PD 환자에 이 벡터를 사용할 때의 안전성, 정밀성 및 피각의 임상적으로 관련성 있는 적용범위가 증대될 수 있다.

Claims (25)

  1. 영장류 뇌의 표적화된 영역에 치료제를 송달하는 시스템으로서,
    상기 시스템은 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라와 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라의 팁 및 단차의 각각의 위치를 누출 경로로부터 적어도 3mm 떨어져서 있도록 조절하는 수단을 포함하고,
    상기 누출 경로가 뇌량(CC), 전교련(AC), 외부 캡슐(EC) 및 내부 캡슐(IC)로부터 선택된 축삭로를 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 영장류 뇌의 표적화된 영역에 치료제를 송달하는 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 치료제가 대류-촉진 송달에 의해 송달되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 영장류가 비-사람 영장류인 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 영장류가 사람인 것을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 뇌의 표적화된 영역이 대뇌 내부인 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 누출 경로는 혈관, 혈관주위강 및 심실공간으로부터 선택된 1종 또는 그 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 뇌의 표적화된 영역이 선조체, 꼬리부, 피각, 담창구, 중격의지핵, 중격핵 및 시상밑핵으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제 7 항에 있어서, 표적화된 영역이 피각인 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 뇌의 표적화된 영역이 시상부 또는 시상하부인 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라 팁의 배치가, 진입점으로부터 적어도 2.5mm; 외측 경계로부터 적어도 1.8mm; 및 중간선으로부터 적어도 4.5mm에 있도록 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라 팁의 배치가, 진입점으로부터 적어도 3mm; 외측 경계로부터 적어도 2.2mm; 및 중간선으로부터 적어도 5mm에 있도록 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 뇌의 표적화된 영역이 뇌간 내부인 것을 특징으로 하는 시스템.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라 팁의 배치가, 진입점으로부터 적어도 2.8mm; 외측 경계로부터 적어도 2.5mm; 및 중간선으로부터 적어도 1.25mm에 있도록 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라 팁의 배치가, 진입점으로부터 적어도 3.5mm; 외측 경계로부터 적어도 2.92mm; 및 중간선으로부터 적어도 1.6mm에 있도록 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  15. 제 14 항에 있어서, 표적화된 영역이 흑색질, 적색핵, 뇌교, 올리브핵 및 뇌신경핵으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 중추신경계 장애를 치료하는 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라의 팁 및 단차의 각각의 위치를 조절하는 수단이, 뇌에 있어서의 지점의 정확한 배치를 위한 컴퓨터-기반 방식 및 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라를 위치지정하기 위한 좌표세트를 포함하는 소프트웨어로 이루어지는 입체정위 시스템을 포함하며, 상기 좌표 세트가 영장류의 표적화된 영역에 주입물의 정량적 구속을 제공하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  18. 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라 위치지정을 위해서 영장류 뇌의 표적화된 영역에 녹색 구역을 결정하기 위한 시스템으로서, 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라가, 녹색 구역 내에 배치될 때에 상기 표적화된 영역에 주입물의 정량적 구속을 제공하며, 상기 시스템이
    삽입부위에서 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라를 통해 뇌의 표적화된 영역에 조영제를 송달하는 수단;
    주입된 조영제의 분포를 결정하는 수단; 및
    상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라의 삽입 부위를 주입된 조영제의 분포와 상관시켜서, 최적 배치를 위한 좌표의 세트를 얻는 수단을 포함하고,
    상기 최적 배치가, 녹색 구역내에 상기 환류-저항성 단차식 송달 캐뉼라가 위치지정되고 거기로부터의 송달이 적절히 구속된 주입물을 제공하는 녹색 구역을 형성하는 것을 특징으로 하는 영장류 뇌의 표적화된 영역에 녹색 구역을 결정하기 위한 시스템.
  19. 제 18 항에 있어서, 뇌의 상기 표적화된 영역에 대해서 상이한 영장류 종들에서 녹색 구역을 3-차원 모델링함으로써 결정하는 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
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