KR101633263B1

KR101633263B1 - 산―염기 혼합촉매를 이용한 목질계 섬유소의 전처리법

Info

Publication number: KR101633263B1
Application number: KR1020140050186A
Authority: KR
Inventors: 김경헌; 정영훈
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2016-06-27
Also published as: KR20150124051A; WO2015163738A1; US11230627B2; US20190300655A1; US20170044329A1; US10364328B2

Abstract

본 발명은 산-염기 혼합촉매를 이용한 목질계 섬유소의 전처리법에 관한 것으로, 산과 염기의 혼합촉매를 이용하여 목질계 섬유소를 전처리함으로써 별도의 중화 과정을 거치지 않고, 전처리 및 동시당화발효를 동일한 단일 반응기 공정으로 수행함으로써 전체 공정을 간소화하고 설비비용과 전체 공정 비용을 줄이면서 목질계 바이오매스에서 우수한 생산수율로 에탄올을 생산하는 효과가 있다.

Description

산―염기 혼합촉매를 이용한 목질계 섬유소의 전처리법{Pretreatment of lignocellulose using acid-base mixture}

본 발명은 목질계 섬유소의 전처리, 당화, 발효의 동일한 단일 반응기(one-pot) 공정을 위해 전처리에 산과 염기의 혼합촉매를 사용한 섬유소 바이오매스의 전처리법에 관한 것이다.

목질계 섬유소, 즉, 리그노셀룰로스(lignocellulose)에서 바이오연료를 생산하기 위하여 리그노셀룰로스 자체의 난분해성은 적절한 물리화학적 전처리를 통하여 완화되어야 한다(Rollin et al., Biotechnol . Bioeng ., 2011, 108, pp. 22-30). 하지만 주요 전처리 공정은 높은 온도와, 강산 또는 강염기 범위의 pH에서 반응이 진행되므로 당 분해산물(푸르푸랄 등)이 발생하고, 이는 당 손실뿐만 아니라, 효모 발효공정의 주요 저해 원인이 된다(Almeida et al ., J. Chem . Technol . Biotechnol., 2007, 82, pp. 340-349).

한편, 리그노셀룰로스에서 바이오연료를 생산하는 공정은, 주로 전처리, 고체/액체 분리, 고체 워싱, 액체 비독성화, 액체중화, 효소당화 및 에탄올 발효공정으로 진행된다. 이 중에서, 저해제를 제거하기 위한 단위 공정인 고체/액체 분리, 고체 워싱, 액체 비독성화, 액체중화 공정은 전체 공정 비용을 상당히 증가시킨다(Houghton et al ., A Joint Research Agenda, U. S. D.o. Energy, 2006, Humbird et al ., Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol : Dilute - Acid Pretreatment and Enzymatic Hydrolysis of Corn Stover, National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO, 2011). 따라서, 저해제에 저항성을 가지는 균주를 개발하거나, 저해제 생성이 없는 새로운 공정 개발이 필요하다.

이러한 노력의 일환으로, 유전자 재조합 미생물을 이용하여 효소생산과 발효를 한 단계에서 진행하는 consolidate bioprocessing(CBP) 공정이 제시되었으나(Lynd et al ., Biotechnol . Prog ., 1999, 15, pp. 777-793), 아직 실현되지 않고 있고, 고체/액체 분리공정 없이 당화 및 발효를 진행하는 전체 슬러리 발효법(Whole slurry fermentation)이 제시되었으나(Jung et al ., Bioresour . Technol., 2013, 132, pp. 109-114), 이 역시, 추가적으로 활성탄 등을 이용하여 저해제를 제거해야 하는 불편함이 발견되었다. 또한 이온성액체를 사용하여 전처리와 가수분해를 결합하는 방법 역시 제시되었으나, 이온성액체의 비용과 독성으로 전처리 후 분리 회수되어야 하고, 다른 일부통합공정의 일환인 동시당화발효공정 자체가 불가능하다는 불편함이 발견되었다(Shi et al., Green Chem., 2013, 15, pp. 2579-2589).

따라서, 전체 공정을 간소화하면서, 전체 공정 비용을 줄이고, 에탄올 생산 수율을 개선할 수 있는 공정 기술 개발이 요구되고 있다.

Lynd et al., Biotechnol. Prog., 1999, 15, pp. 777-793 Jung et al., Bioresour. Technol., 2013, 132, pp. 109-114 Shi et al., Green Chem., 2013, 15, pp. 2579-2589

본 발명의 목적은 리그노셀룰로스를 동일한 단일 반응기 공정으로 전처리, 당화, 발효를 통해 에탄올을 제조하기 위해, 전처리에 산/염기의 혼합촉매를 사용하여 리그노셀룰로스를 전처리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 개선된 전처리 방법을 이용하여 목질계 바이오매스에서 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산과 염기의 혼합촉매를 목질계 바이오매스와 반응시키는 단계를 포함하는 목질계 바이오매스의 전처리 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 산과 염기의 혼합촉매로 목질계 바이오매스를 전처리 하여 얻은 전체 슬러리에 대해 동시당화발효시키는 단계를 포함하는 목질계 바이오매스에서 에탄올을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 목질계 바이오매스를 산과 염기의 혼합촉매로 전처리함으로써 당화효율을 높이고, 이로부터 에탄올 생산수율을 높이는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 목질계 바이오매스의 전처리, 효소적 가수분해, 당화, 발효를 동일한 단일 반응기 공정으로 수행하여, 바이오매스 밀링, 전처리 후 고체/액체 분리, 분리된 고체 워싱, 분리된 액체 비독성화, 전체 슬러리의 pH 중화 등의 과정을 별도로 거치지 않으므로 전체 공정이 간소화되고, 전체 공정 비용을 현저히 줄일 수 있는 효과가 있다.

도 1은 목질계 바이오매스에서 에탄올을 생산하는 종래의 공정과 본 발명에 따른 공정 도식도이다.
도 2는 산, 염기, 산/염기의 혼합촉매, 즉, 0.04M HCl, 0.04M HCl/0.01M NaCl, 0.01M NaOH, 0.01M NaOH/0.01M NaCl, 0.01M NaCl, 0.04M HCl/0.01M NaOH의 볏짚에서의 전처리 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 볏짚 전처리 시 산/염기의 혼합촉매의 pH 범위와 총 농도에서의 효소당화율을 나타낸 것이다.
도 4 내지 6은 산과 염기의 종류 및 혼합 비율을 달리하여 얻은 혼합촉매로 볏짚을 전처리한 후 효소적 가수분해를 통해 얻은 효소당화율을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 산/염기의 혼합촉매를 사용하여 볏짚의 구성성분, 글루칸(A), 자일란(B) 및 리그닌(C) 변화에 따른 효소당화율과의 상관관계를 비교한 결과이다.
도 8은 본 발명의 산/염기의 혼합촉매를 사용하여 전처리하거나 하지 않은 볏짚의 효소적 접근도를 비교한 것이다.
도 9는 볏짚에서 본 발명의 산/염기의 혼합촉매를 이용한 전처리의 효소 당화에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 산/염기의 혼합촉매를 이용하여 전처리된 볏짚의 동시당화발효에 의한 에탄올 생산 수율을 시간 별로 측정한 결과이다.
도 11은 볏짚에서 본 발명의 전체 공정에 따른 에탄올의 질량 수율을 비교한 도식도이다.
도 12는 산과 염기의 종류 별로 혼합촉매를 제조하고, 산, 중성, 염기 조건에서 오일팜잎의 전처리 효과를 측정한 결과이다.
도 13은 산/염기의 혼합촉매의 pH 범위, 총 농도, 전처리 온도(150, 170, 190℃), 미니 열 반응기에서의 전처리 시간(45, 90, 360, 720, 1200, 1440초) 별로 10%(w/v) 기질을 전처리한 후, 전체 슬러리에 대해 효소적 가수분해를 수행하여 얻은 효소당화율을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 산과 염기의 혼합촉매를 목질계 바이오매스와 반응시키는 단계를 포함하는 목질계 바이오매스의 전처리 방법에 관한 것이다.

상기 혼합촉매는 산과 염기를 적정 비율로 혼합하여 목질계 바이오매스와 반응시키는데 사용한다.

혼합촉매에 사용되는 산의 종류로, 황산, 말산, 염산, 질산, 인산, 탄산, 포름산, 아세트산, 플루오르화 수소산, 옥살산, 또는 시트르산 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

혼합촉매에 사용되는 염기의 종류로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화바륨, 수산화암모늄, 탄산칼슘, 탄산칼륨, 또는 암모니아 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 혼합촉매는 목질계 바이오매스의 전처리 후 당화 및 발효를 저해하는 저해제 생산을 최소화하기 위해, 목질계 바이오매스의 전처리 시 산과 염기를 2 내지 4:1의 몰 비율로 혼합하여 총 농도가 0.05 내지 1M이 되도록 하여 사용할 수 있다. 상기 산과 염기의 혼합 비율은 pH 범위가 산성 조건, 즉 1 내지 4의 조건이 되게 하여 기존의 산 촉매로 전처리하는 경우와 pH 범위는 유사하나, 본 발명의 일 구체예에서 보면, 도 2, 7 및 10에서와 같이, 산 촉매로만 전처리하는 경우에 비해 산과 염기의 혼합촉매로 전처리하는 경우 당화율이 높아짐을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 산과 염기를 혼합할 경우 산 또는 염기가 갖는 자체의 촉매 특성을 잃을 것으로 생각되나, 본 발명에서 확인한 바와 같이 특정 혼합비율과 농도를 제공할 경우, 산과 염기의 혼합촉매는 pH 1 내지 4의 범위에서 당화율이 개선될 뿐만 아니라 전처리 후 전체 슬러리 내 pH가 약산성 범위에 해당되어 염기를 이용한 중화과정을 별도로 거칠 필요가 없음을 알 수 있었다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 혼합촉매 사용 시, 아세트산, 푸르푸랄, 히드록시메틸푸르푸랄 등의 저해제 생산이 현저히 감소함을 알 수 있었다.

상기 목질계 바이오매스는 혼합촉매 100ml에 대하여 4 내지 20 %의 농도로 혼합될 수 있다. 고체 로딩양이 20 %를 초과할 경우 물질 및 열 전달에 있어 어려움이 있어 당화 효율이 낮게 될 수 있고, 4 % 미만인 경우 낮은 로딩양으로 인해 최종 산물의 농도가 감소할 수 있다.

전처리를 위한 목질계 바이오매스로, 볏짚, 거대억새, 사탕수수부산물, 옥수수부산물, 스위치그라스, 포플라, 오일팜부산물, 참나무, 에너지작물 등의 목질계 바이오매스를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 이외에, 이러한 전처리는 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌 등으로 이루어진 섬유소계 바이오매스 또는 산업폐기물에서도 유사한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 목질계 바이오매스로 볏짚, 오일팜잎 등을 사용할 수 있고, 볏짚 또는 오일팜잎은 건조된 것으로, 회전식 밀을 이용하여 수 mm 이하의 크기로 분쇄한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 전처리 반응은 100 내지 200℃의 온도에서 60초 내지 2시간 동안 수행할 수 있고, 산과 염기의 혼합촉매를 사용하므로 반응 pH는 약산성을 나타내어 이후 당화 및 발효 공정 전에 수행하는 중화 공정을 별도로 수행할 필요가 없어 전체 공정을 단축하고, 생산 단가를 줄일 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 또한 산과 염기의 혼합촉매로 목질계 바이오매스를 전처리 하여 얻은 전체 슬러리에 대해 동시당화발효시키는 단계를 포함하는 목질계 바이오매스에서 에탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 재생 가능한 임산폐자원인 바이오매스를 이용하는데 가장 많이 드는 비용은 화학적 전처리와 효소를 이용한 당화공정이다. 종래 기술들은 이를 통하여 수율을 올리는데 중점을 두었고, 이외에도, 기존 단위 공정, 예를 들어, 바이오매스 밀링, 전처리 후 고체/액체 분리, 분리된 고체 워싱, 분리된 액체 비독성화, 전체 슬러리의 pH 중화 등의 복잡한 공정이 전체 공정에 포함되어 전체 공정 비용이 상당히 증가하는 단점이 있었다.

반면, 본 발명은 첫째, 산/염기의 혼합촉매를 전처리에 사용한다는 점과, 둘째, 별도의 중화 과정을 거치지 않는다 점과, 전체 공정이 동일한 단일 반응기 공정으로 진행된다는 점에서 종래 기술과 차별화된 특징이 있다.

우선, 산/염기의 혼합촉매를 전처리에 사용하는 경우, 종래에는 산과 염기 촉매 자체의 특성 상 전처리 과정을 분리하여 이용하였으나, 본 발명은 산/염기를 적절한 비율로 혼합하여 pH 1 내지 4의 산성 조건에서 전처리에 사용함으로써, 촉매 사용의 절대량은 감소하였음에도 불구하고, 전체 당화/발효 수율은 그대로 유지할 수 있다. 즉, 바이오매스 투입량 대비 산물 생산량을 높였다는 장점이 있다.

다음으로, 별도의 중화 과정을 거치지 않는데, 기존 촉매들은 강산 또는 강염기 범위의 pH를 적용하므로 추후 당화 발효 공정을 위해서는 중화 과정이 필수적으로 필요하고, 추가적인 염기 또는 산의 투입으로, 당 분해산물이 발생하여 당 손실뿐만 아니라 효모 발효 공정을 저해하는 원인이 되었다. 더욱이, 이러한 염기 또는 산의 투입은 투입 비용 측면에 있어서, 혹은 생성된 염의 제거비용 측면에 있어서 전체 공정의 경제성을 악화시켰다.

반면, 본 발명은 산과 염기의 혼합촉매(pH 1 내지 4)를 전처리에 사용한 후 전체 슬러리의 pH를 확인한 결과 대략 약산성의 범위를 나타내어 미생물 배양을 위한 버퍼 이외에 추가적인 중화제를 투입하지 않아도 된다. 또한, 전처리를 거쳐 얻은 전체 슬러리를 산물 생산에 사용하기 때문에 기존의 고체/액체 분리공정. 고체 워싱, 액체 비독성화 공정, 액체중화 공정을 생략할 수 있고, 이는 바이오연료 및 바이오리파이너리 산업에 있어 상당한 정도의 비용감소를 불러 일으킨다.

마지막으로, 전처리를 거쳐 얻은 전체 슬러리에 대해 동시당화발효를 동일한 단일 반응기 공정으로 수행하므로, 공정 설비에 필요한 비용을 현저히 줄일 수 있다.

본 발명의 목질계 바이오매스에서 에탄올을 제조하는 방법은 도 1의 공정 모식도에 따라 산과 염기의 혼합촉매로 전처리된 목질계 바이오매스의 전체 슬러리에 대해 동시당화발효를 수행하여 에탄올을 제조하는 것을 특징으로 한다.

상기 전체 슬러리는 pH가 약산성 범위에 있어 당화 전에 별도의 중화 과정을 거칠 필요가 없으므로 전체 슬러리에 대해 바로 당화발효를 실시할 수 있다.

일반적으로 당화과정과 발효과정은 각각 별도의 반응기에서 수행하는 분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF) 공정으로 수행될 수도 있고, 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행하는 동시당화발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF) 공정으로 수행될 수 있다. 동시당화발효 공정에서는 당화과정에서 글루코스가 생성되자마자 효모가 발효과정에 의해 글루코스를 바로 제거하고 반응기 내에 당의 축적을 최소화할 수 있으므로, 분리 당화발효 공정에서 나타나는 최종 생성물의 억제작용을 방지할 수 있고 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있다. 또한, 설비비용 저감과 낮은 효소 투입량에 의한 비용절감을 할 수 있고, 반응기 내에 에탄올이 존재하므로 오염문제를 감소시킬 수 있다. 더욱이, 동시당화발효는 전처리 과정이 일어나는 반응기에서 바로 수행할 수 있어, 본 발명의 동일한 단일 반응기 공정을 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 동시당화발효를 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 당화에 사용하는 효소는 셀룰라제(cellulase), α-아밀라제(amylase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 엔도글루카나제(endoglucanase), 자일라나제(xylanase), 베타-글루코시다제, α-아가라제(agarase), β-아가라제 Ⅰ, β-아가라제 Ⅱ, β-갈락토시다제(galactosidase), 네오아가로바이오스(neoagarobiose) 가수분해효소, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 가수분해효소, 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 가수분해효소, α-네오아가로바이오스 하이드롤라제(neoagrobiose hydrolase) 또는 이들의 혼합물 또는 복합체 등을 들 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

또한, 발효에 사용되는 미생물로, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) P2, 브레타노마이세스 커스터시(Brettanomyces curstersii), 사카로마이세스 우브즈런(Saccharomyces uvzrun), 캔디다 브래시카에(Candida brassicae). 벤트리컬리(Sarcina ventriculi), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) IMB3, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이저린키이(Clostridium beijerinckii), 클루이베로마이세스 푸레질리스(Kluyveromyces fragilis), 브레타노마이세스 커스터시이(Brettanomyces custersii), 클로스트리디움 아루란티부틸리컴(Clostriduim aurantibutylicum) 및 클로스트리디움 테타노모품(Clostridium tetanomorphum) 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 동시당화발효를 수행하는 조건은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 초기 글루코스 농도 2 내지 30%(w/v)에서, 25 내지 40℃의 온도, 4.0 내지 8.0의 pH 조건으로 50 내지 250 rpm의 속도로 교반하면서 반응을 수행할 수 있다.

필요에 따라, 당업자는 기타 추가단계 및/또는 공정을 수행할 수 있는 바, 예를 들어, 상기 동시당화발효과정에 의해 수득한 발효액을 당업계에 공지된 방법에 따라, 정제하는 정제과정을 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 볏짚의 전처리에 따른 당화 또는 동시당화발효에 대한 효과

리그노셀룰로스의 대표적 예로 볏짚을 사용하였고, 산물의 대표적 예로 글루코스 및 발효공정을 통한 에탄올 생산을 확인하였다.

먼저, 산/염기의 혼합촉매의 전처리 효과를 알아보기 위하여, 산과 염기의 종류별로 혼합한 혼합촉매, 상기 혼합촉매의 혼합 비율(pH 조건)과 농도를 최적화 하였고, 산/염기의 혼합촉매의 반응 기작 및 기존 산 혹은 염기 단독 촉매와의 차이점을 확인하고자, 바이오매스 성분 및 효소당화율을 비교하였다. 또한 산/염기의 혼합촉매 처리된 바이오매스의 효소적 접근성을 확인하였다. 마지막으로, 산/염기 혼합 촉매 전처리된 바이오매스 전체 슬러리에 대해 고체/액체 분리, 분리된 고체 워싱, 분리된 액체 비독성화, 전체 슬러리의 pH 중화 등의 추가 공정 없이, 전체 슬러리가 포함된 반응기에서 당화 발효를 진행하여, 에탄올 수율을 확인하였다(도 1 참조).

볏짚은 영광(대한민국)에서 수확, 워싱, 건조된 후, 고속 회전 절삭기(MF 10, IKA, Staufen, Germany)를 사용하여 90-1000㎛ 범위로 절단하였다.

염산, 황산, 아세트산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 염화나트륨 등을 적절한 비율로 섞고, 원하는 농도로 희석하여 전처리 과정에 사용하였다. 100ml의 용기에 2g의 건조된 볏짚을 20ml의 촉매에 침지한 후 미니 열 반응기에서 190℃에서 2분 동안 반응시키며, 산/염기의 혼합 비율, 촉매 농도 등을 다양하게 하여 테스트하였다. pH는 산 조건, 중성 조건, 알칼리 조건에서 시행되었으며, 농도는 0-1M이 시험 되었다.

전처리의 완결 후, 성분 분석을 위하여 그 전처리된 슬러리를 여과포(22-25㎛, Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 여과하여 불용성 고체를 회수하였다. 그 후 전처리된 불용성 고체를 세척액체의 pH가 6-7이 될 때까지 약 1L의 증류수로 세척하고, 그 세척된 고체를 3일 이상 45℃에서 진공 건조 오븐에서 건조하였다.

전처리된 바이오매스(전체 슬러리) 또는 미처리된 바이오매스의 성분 분석은 탄수화물 및 산성 불용성 리그닌에 대한 NREL 방법(Sluiter A et al., Laboratory Analytical Procedure : Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass, National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO, 2008)을 사용하여 측정하였다. 바이오매스의 수분 함량은 NREL 방법에 기초하여 측정하였다. 탄수화물 조성 분석에서 당 함량 및 효소 소화능력은 Pb² ⁺를 가지는 이온 교환 컬럼(HPX-87P; Biorad, Hercules, CA)을 사용하여 결정하였고, 당 검출은 시차굴절검출기로 수행하였다. 아세트산, 푸르푸랄, 히드록시메틸푸르푸랄(HMF) 등의 저해제 측정을 위하여 H⁺를 가지는 컬럼(HPX-87H; Biorad, Hercules, CA)를 이용하였고, 역시 시차굴절검출기로 수행하였다. 모든 분석은 3회 반복 수행하였다.

효소적 당화율을 측정하기 위해, 볏짚의 전처리 후 세척된 불용성 고체 또는 전처리하지 않은 볏짚 자체를 7~60FPU의 셀룰라아제/g-글루칸과 같은 첨가량의 Accellerase 1000(Genencor, Rochester, NY)로 효소 가수 분해를 수행하였다. 0.05M 구연산나트륨 완충용액(pH 4.8)에 1% 글루칸에 해당하는 전처리 후 세척된 바이오매스를 포함하는 반응 혼합물을 50℃, 200rpm에서 교반하면서 교반 배양기에서 배양하였다. 포도당의 이론적 최대 수율로 나타내는 효소당화율은 효소 가수분해에 사용된 초기 바이오매스 내의 전체 포도당(g)에서 가수분해에 의하여 생성된 포도당(g)의 비율로서 결정된다.

전처리된 바이오매스의 발효능을 조사하기 위하여, 동시당화발효 실험을 수행하였다. 발효 배지는 0.05M 구연산 완충용액(pH 4.8), 1%(w/v) 효모 추출물 및 2%(w/v) 펩톤으로 구성되어다. 전체 100ml의 배지에 미처리된 기질 혹은 전처리되고 세척된 기질의 경우는 최종 글루칸 농도 3%(w/v)를 전처리되고 중화된 전체슬러리 다발은 최종 기질농도 6%(w/v)를 이용하여 미세호기 조건 및 발효 중 생성된 이산화탄소를 제거하기 위하여 바늘로 관통된 실리콘 마개를 장착한 250ml 플라스크에 첨가하였다. 멸균 후 미리 성장한 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) D₅A(ATCC 200062)를 이용하여 38℃, 170rpm에서 교반하면서 발효를 진행하였다.

전처리된 볏짚의 셀룰로스에 대한 셀룰라아제의 접근성을 분석하기 위하여 클로스트리디움 터모셀럼(Clostridium thermocellum) 유래의 타입 A 표면결합단백질3(CtCBD3)를 이용하여 결합력을 측정하였다. 5mg의 미처리된 혹은 전처리된 바이오매스는 과도한 양의 BSA 단백질 혹은 CtCBD3와 50mM 인산염 완충용액(pH7)에서 배양되었고, 3.5시간 후 원심분리를 통하여 상등액과 펠렛을 분리하였고, Bradford 법을 이용하여 비결합단백질량이 측정되었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 산, 염기, 산/염기의 혼합촉매로 전처리한 결과, 산/염기의 혼합촉매에서 상대적으로 우수한 효소당화율을 나타내었다.

도 3은 볏짚 전처리 시 산/염기의 혼합촉매의 pH 범위와 총 농도에서의 효소당화율을 나타낸 것으로, 미니 열 반응기에서 190℃에서 2분 동안 10%(w/v)의 기질을 로딩하여 전처리한 후 증류수를 이용하여 세척된 바이오매스에 대해 효소적 가수분해를 진행하였고, 15FPU/g 글루칸을 첨가하여 pH4.8, 50℃, 200rpm에서 교반하면서 50시간 진행하였다. 도 3에서 산성 조건은 혼합촉매 내 산의 비율이 높을 때이고, 중성 조건은 산과 염기의 비율이 유사한 경우, 염기 조건은 염기의 비율이 높을 때를 의미하고, 각각 대략 pH 1-4, 4-9 및 8-14의 범위를 의미한다. 또한, 도 3에서 농도 "0"은 물 처리를 한 경우를 의미한다. 이는 도 4와 13에서도 해당된다.

이 과정은 전처리가 제대로 진행되었는지를 확인한 결과로, 산/염기의 혼합촉매로 전처리한 경우, 산성 조건(산의 비율이 높은 pH 1-4의 범위)에서 향상된 전처리 효과를 나타내었고, 혼합촉매의 농도가 증가할수록 향상된 전처리 효과를 나타내었다(도 3B).

도 4 내지 6은 산과 염기의 종류 및 혼합 비율을 달리하여 얻은 혼합촉매로 볏짚을 전처리한 후 효소적 가수분해를 통해 얻은 효소당화율을 나타낸 것으로, 혼합촉매는 190℃에서 0.05M의 산과 0.05M의 염기를 몰 비율로 혼합하고, 미니 열 반응기에서 상기 혼합촉매에 10%(w/v)의 기질을 로딩하고, 190℃에서 2분간 반응시켜 전처리한 후 15 FPU Accellerase 1000/g-glucan(pH4.8, 50℃, 200 rpm에서 교반하면서 50h)로 효소적 가수분해를 실시하여 얻었다.

그 결과, 강산과 강염기의 혼합촉매는 혼합 비율에 따라 유사한 패턴을 나타냈고, 약산과 강염기의 혼합촉매는 산, 중성, 염기조건 조건에서 당화율에 큰 차이가 없었다. 이는 조건 최적화의 필요성을 시사하는 것으로 생각된다.

도 7은 산성 범위의 산/염기의 혼합촉매로 190℃에서 2분 동안 전처리한 후 성분 분석한 데이터와 50℃에서 200rpm으로 교반하면서, 50 시간 동한 가수분해한 데이터의 상관관계를 비교한 결과로, 글루칸과 가수분해율의 상관관계는 0.20, 자일란과 가수분해율의 상관관계는 0.95, 리그닌과 가수분해율의 상관관계는 0.91을 나타내어, 산 용액의 효과인 자일란 제거와 염기 용액의 효과인 리그닌 제거의 공통효과를 보였다.

도 8은 전처리하거나 하지 않은 볏짚의 효소적 접근도를 비교한 것으로, BSA(대조군)와 CtCBD3를 이용하여 50mM 인산염 완충용액에서 pH 7로 4℃에서 3.5시간 동안 볏짚과 결합반응시킨 결과, 셀룰로스에 대한 접근성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

도 9는 산/염기의 혼합촉매를 이용한 전처리의 효소 당화에 대한 효과를 나타낸 것으로, 전처리 시 셀룰라제 처리 농도에서 약 60 ~ 약 80% 정도의 가수분해율을 나타내었지만, 전처리를 수행하지 않는 바이오매스의 경우 20% 이하의 가수분해율을 나타내었다.

도 10은 전처리된 바이오매스의 동시당화발효에 의한 에탄올 생산 수율을 측정한 결과로, 산과 염기의 혼합촉매를 사용한 경우, 산 단독 전처리된 바이오매스에서 보다 17.5%의 향상된 수율을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 혼합촉매로 전처리 후 세척 공정을 거친 경우에 비해 약 20% 정도의 향상된 수율을 나타냄을 알 수 있었다.

마지막으로, 전처리 후 각 공정을 분리하여 진행했을 때 보다, 공정의 통합화를 통하여, 100 g 바이오매스 기준 그리고, 글루코스만을 이용한다는 제한 하에, 3.4g의 에탄올이 더 생산됨을 발견하였다(도 11).

< 실시예 2> 오일팜잎의 전처리에 따른 당화효율 조사

리그노셀룰로스로 오일팜잎(oil palm frond)을 사용하고, 산/염기의 혼합촉매를 사용하여 전처리한 후 효소적 가수분해를 통해 당화율을 측정하였다.

산/염기의 혼합촉매의 전처리 효과를 알아보기 위하여, 산과 염기의 종류별로 혼합한 혼합촉매, 상기 혼합촉매의 혼합 비율(pH 조건)과 농도를 최적화 하였고, 효소당화율을 비교하였다. 전처리 조건과 효소적 가수분해를 수행하는 방법은 상기 실시예 1과 같다.

오일팜잎은 수확, 워싱, 건조된 후, 고속 회전 절삭기(MF 10, IKA, Staufen, Germany)를 사용하여 90-1000㎛ 범위로 절단하였다.

도 12는 산과 염기의 종류 별로 혼합촉매를 제조하고, 산, 중성, 염기 조건에서 오일팜잎의 전처리 효과를 측정한 결과로, 각 혼합촉매는 산 조건에서 높은 효소당화율을 나타내나, 황산과 수산화나트륨 또는 암모니아의 경우 산, 중성, 염기 조건에서의 당화율의 차이는 유의적이지 않았다. 이들 경우에는 전처리 조건, 혼합 농도 등의 조건 최적화가 필요할 것으로 보인다.

도 13은 산/염기의 혼합촉매의 pH 범위, 총 농도, 전처리 온도(150, 170, 190℃), 미니 열 반응기에서의 전처리 시간(45, 90, 360, 720, 1200, 1440초) 별로 10%(w/v) 기질을 전처리한 후, 전체 슬러리에 대해 15FPU/g 글루칸을 첨가하여 pH4.8, 50℃, 200rpm에서 교반하면서 50시간 동안 효소적 가수분해를 수행하여 얻은 효소당화율을 나타낸 것으로, 상술한 볏짚에서와 마찬가지로, 산/염기의 혼합촉매로 전처리할 경우 산 조건에서 혼합촉매의 농도가 증가할 수록 높은 전처리 효과를 나타냈고, 전처리 온도는 190℃에서 가장 효과가 좋았고, 반응 시간은 90초 이상에 효과가 유지되었다.

Claims

pH 1 내지 4인 산-염기 혼합촉매와 목질계 바이오매스를 100 내지 200℃의 온도에서 60초 내지 2시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는 목질계 바이오매스의 전처리 방법
제1항에 있어서,
산은 황산, 말산, 염산, 질산, 인산, 탄산, 포름산, 아세트산, 플루오르화 수소산, 옥살산 및 시트르산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 목질계 바이오매스의 전처리 방법.
제1항에 있어서,
염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화바륨, 수산화암모늄, 탄산칼슘, 탄산칼륨 및 암모니아로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 목질계 바이오매스의 전처리 방법.
제1항에 있어서,
혼합촉매는 산과 염기를 2 내지 4:1의 몰 비율로 혼합하여 총 농도가 0.05 내지 1M인 목질계 바이오매스의 전처리 방법.
제1항에 있어서,
목질계 바이오매스는 혼합촉매 100 ml에 대하여 4 내지 20 g의 농도로 혼합되는, 목질계 바이오매스의 전처리 방법.
제1항에 있어서,
목질계 바이오매스는 볏짚, 거대억새, 사탕수수부산물, 옥수수부산물, 스위치그라스, 포플라, 오일팜부산물 또는 참나무에서 선택된 것인 목질계 바이오매스의 전처리 방법.
삭제
pH 1 내지 4인 산-염기 혼합촉매로 목질계 바이오매스를 100 내지 200℃의 온도에서 60초 내지 2시간 동안 전처리 하여 얻은 전체 슬러리에 대해 동시당화발효시키는 단계를 포함하는 목질계 바이오매스에서 에탄올을 제조하는 방법.
제8항에 있어서,
상기의 전처리 및 동시당화발효는 동일한 단일 반응기(one-pot) 공정으로 수행하는 목질계 바이오매스에서 에탄올을 제조하는 방법.