KR101632552B1 - 상처의 치료 또는 흉터 생성의 방지를 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FGF7 단백질 및 콜라겐을 포함하는 조성물의 특정 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 조성물은 상처의 초기 치료 속도를 증가시켜 상처를 보다 유의적으로 치료하는 약학적 용도 뿐만 아니라, 상처의 초기 치료 속도를 증가시켜 보다 유의적으로 흉터의 생성을 방지하는 화장학적 용도를 제공한다.

Description

상처의 치료 또는 흉터 생성의 방지를 위한 조성물{COMPOSITION FOR TREATING WOUND OR PREVENTING SCAR FORMATION}
본 발명은 FGF7 단백질 및 콜라겐을 포함하는 조성물의 특정 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 조성물은 상처의 초기 치료 속도를 증가시켜 상처를 보다 유의적으로 치료하는 약학적 용도 뿐만 아니라, 상처의 초기 치료 속도를 증가시켜 보다 유의적으로 흉터의 생성을 방지하는 화장학적 용도를 제공한다.
피부는 외부의 자극으로부터 신체를 보호하며, 수분의 손실 방지, 체온의 유지, 감염의 방지 등 다양한 역할을 수행한다. 이러한 피부에서 정상적인 조직이 물리·화학적으로 또는 세균감염에 의해 파괴된 것을 일반적으로 상처라고 지칭한다.
상처의 치유는 손상된 피부나 조직을 정상적인 상태로 복원하기 위하여 복잡한 과정을 거치는데, 이러한 과정은 크게 염증기(inflammatory phase), 증식기(proliferative phase), 재구성기(remodeling phase)의 3단계로 분류되는 것으로 당업계에 널리 알려져 있다(예컨대, Doaa Mohamed Hasan 등의 2012년 문헌 [The Effect of Tamoxifen on Healing of Skin Wounds in Senile, Adult Ovariectomized and Adult Nonovariectomized Female Rats] 등 참조).
상기 염증기(inflammatory phase)는, 혈액이 응고되면서 지혈이 이루어지며, 생체 조직의 손상에 반응하여 발생하는 염증이 상처 내의 이물질 또는 손상된 조직 등을 제거하고 상처 복원 전에 상처를 클리어링하는 단계라고 알려져 있다.
상기 증식기(proliferative phase)는, 새로운 혈관이 형성되고 콜라겐 생산이 이루어지면서 육아조직을 형성하는(granulation) 단계라고 알려져 있다. 또한, 상처 주변의 피부와 조직이 수축되고, 상처의 가장자리로부터 상피세포가 증식해나가면서, 피부 또는 조직에서 손상된 부분의 크기가 감소되는 현상이 관찰된다고 보고되었다.
상기 재구성기(remodeling phase)는 상처 치유의 마지막 단계로서, 증식된 상피세포들이 성숙해지고(maturation), 섬유조직형성, 혈관생성, 재상피화, 세포외기질 합성 등이 나타난다.
따라서, 상처를 치료함에 있어서 가장 중요한 점은 두 가지로 요약해볼 수 있다.
첫째, 상처의 초기 치료 속도를 증가시켜야 한다. 만일 상처가 최종적으로 완치되는 시점이 동일하여 상처의 전체 치료 기간이 같다고 할지라도, 초기 치료 속도가 높지 않고 후기 치료 속도가 높다면, 초기에 상처의 면적이 신속하게 수축되지 못하는 문제가 발생하고 이로 인해 세균 등에 의한 이차 감염의 가능성이 더욱 높아지게 된다.
둘째, 상처가 치료된 시점에 새롭게 재생된 피부 또는 조직의 배열 및 구성이 정상적이어야 한다. 상처 부위에 새롭게 재생된 표피가 배열이 불규칙하거나 정상 피부와 다른 구조를 가진다면, 이는 섬유종 또는 흉터로 남게 된다.
현재까지 다양한 종류의 상처 치료제 또는 흉터 생성 억제용 제제들이 많이 개발되고 시판되어 왔다. 예를 들어, 본 발명의 조성물에 필수적으로 포함되는 유효성분들 중 콜라겐은 공개특허공보 제10-2002-0087210호(공개일: 2002.11.22) 등에서 상처를 치료하는 용도가 알려져 있다. 그러나, 전술한 바와 같이 이차 감염을 최대한 방지하기 위하여 상처의 초기 치료 속도를 높일 필요성이 명백하게 존재하며, 상처를 외형적으로 없애는 것만으로는 부족하고 재생된 표피가 정상 표피처럼 규칙적으로 배열될 수 있도록 치료하는 것이 중요함에도 불구하고, 이에 초점을 맞추어 개발된 제제는 아직까지 존재하지 않았다.
공개특허공보 제10-2002-0087210호 (2002.11.22)
상처가 치료되는 것은 상피세포의 재생과 수축이라는 서로 다른 기전에 의해 유도되는 현상이기 때문에, 상처의 면적이 감소되는 것을 확인하는 것만으로는 상처가 유효적절하게 치료되었는지 판단하기 어렵다. 예를 들어, 상처 부위에 표피화가 진행됨에 따라 상처가 비슷한 시점에 치료된 것으로 보일지라도, 조직병리학적으로 분석해보면 새롭게 재생된 표피가 배열이 불규칙하거나 정상 피부와 다른 구조를 가질 수 있다.
이에, 본 발명자들은 다양한 유효성분들의 조합들에 대해 동물 모델을 이용하여 임상증상, 체중, 일일 사료 및 음수 섭취량, 상처 수축률, 혈중 백혈구 및 적혈구의 수, 상처 부위에서 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양, 조직병리학적 소견 등을 종합적으로 분석하고 평가하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 특정 유효성분의 조합을 포함하는 조성물을 개발하기에 이르렀다.
본 발명에 따른 조성물은 FGF7 단백질 및 콜라겐을 필수적으로 포함한다. 이는 실제 적용 분야에 따라 상처 치료에 중점을 둘 경우 약학 조성물로서 적용되며, 흉터 생성 억제에 중점을 둘 경우 화장품 조성물로서 적용된다.
특히, 본 발명의 조성물은 상처의 치유 과정 중 염증기(inflammatory phase) 및 증식기(proliferative phase)의 기간을 단축시킴으로써, 상처의 초기 치료 속도를 유의적으로 증가시킨다. 바람직하게는, 상기 상처의 초기 치료 속도는 상처 발생일로부터 7일 내지 10일 동안의 치료 속도를 나타내며, 더 바람직하게는 7일 동안의 치료 속도를 나타낸다. 이와 같이 본 발명의 조성물에 의해 상처의 초기 치료 속도가 유의적으로 증가될 수 있으므로, 상처 발생일로부터 적어도 7일 동안 본 발명의 조성물이 상처에 적용된다면 원하는 최소한의 효과를 얻을 수 있게 될 뿐만 아니라 이차 감염의 가능성도 유의적으로 낮출 수 있다.
바람직하게는, 상기 FGF7 단백질은 글루타민과 MTX(methotrexate: 메토트렉세이트)를 보충한 무혈청 CD OptiCHO 배지(GIBCO사)에서 단일클론으로 증식시킨 CHO 세포에 의해 생산된 것이다. 이와 같은 특이적 단계에 의해 생산된 FGF7 단백질은 혈청 함유 배지 또는 여기에 함유된 바이러스 등으로 인해 유래될 수 있는 단백질의 변성 위험이 없다는 점에서 유리하다.
본 발명의 조성물은 대상체에게 다양한 비경구 경로로 투여될 수 있다. 상처에 직접적으로 경피투여되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상처의 면적보다 더 넓은 부위에 투여된다.
본 발명의 조성물은 비경구 경로로 투여하기 위한 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 분말, 연고, 크림, 겔, 액상, 패치 등의 제형이 고려될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물의 투여량은 상처의 중증도 및 범위, 상처가 발생된 이후 경과된 시간, 치료 기간 등을 고려하여 당해 기술분야의 의사 또는 약사가 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 투여 기간은 상처의 중증도와 치료 경과에 따라 달라질 수 있지만 후술하는 바와 같이 상처 발생일로부터 7일 동안만 지속하더라도 원하는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "상처"는 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미를 가지며, 물리적 또는 화학적으로 외부의 압력에 의해 피부 또는 조직의 연속성이 파괴되거나 손상된 상태를 뜻한다. 여기에는 예를 들어 찰과상, 타박상, 열상, 칼날에 의한 절창, 자창, 할창, 총창, 폭창, 교창 등이 포함된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 본 발명의 조성물을 대상체의 상처 부위에 투여함으로써 상처를 호전, 역전, 완치 또는 개선시키는 모든 행위들을 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "방지"는, 본 발명의 조성물을 대상체의 상처 부위에 투여함으로써 상처가 치료된 후에 흉터가 남는 것을 막고 예방하는 모든 행위들을 의미한다.
본 발명에서, "대상체"라는 용어는 인간 등의 포유류를 포함한 동물을 나타낸다.
세포 재생에 활성을 나타내거나 상처 치유력을 갖는 것으로 알려져 있는 성분이 본 발명의 유효성분인 FGF7 단백질 및 콜라겐의 병용효과를 감쇠시킨다거나 부작용을 나타내지 않는다는 조건을 충족시킨다면, 본 발명의 조성물은 필요에 따라 상기 성분을 1종 또는 그 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 FGF7 단백질 및 콜라겐을 동시에 포함하는 하나의 제형으로서 키트에 포함될 수 있다. 선택적으로, FGF7 단백질 및 콜라겐은 서로 다른 제형으로서 키트에 포함되어 있고, 사용 직전에 혼합하여 상처에 적용하거나 또는 하나의 유효성분을 상처에 적용하고 다른 유효성분을 순차적으로 적용하는 것이 바람직하다.
FGF7 단백질을 단독투여하는 경우 7일째에 비로소 음성대조군에 비해 상처 수축률이 증가하는 반면, FGF7 단백질과 콜라겐을 병용투여하는 경우 3일째에 이미 음성대조군에 비해 약 2배에 가까운 상처 수축률을 나타낸다. 뿐만 아니라, 상처 치유 과정의 증식기에서 과발현되는 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현량이 7일째에는 유의적으로 증가되는 반면, 14일째에는 오히려 감소된다.
이와 같은 실험적 자료들은 본 발명에 따른 조성물이 상처의 치유 과정 중 염증기(inflammatory phase) 및 증식기(proliferative phase)의 기간을 단축시켜 상처의 초기 치료 속도를 증가시키는 것을 뒷받침한다.
이로 인해, 이차감염의 가능성이 최소화될 수 있을 뿐만 아니라, 섬유종 또는 콜라겐의 과다형성으로 인해 흉터가 형성되는 것 또한 최대한 억제시킬 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 조성물이 적용됨에 따라 상처 부위에서 새롭게 재생된 표피는 규칙적인 구조로 정상 표피에 매우 가까운 양상으로 나타난다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따른 조성물은 상처를 입은 대상체에게 독성이나 원치 않는 부작용을 나타내지 않는다.
도 1은 제1군(음성대조군: NC), 제2군(마데카솔 처리군), 제3군(FGF7 처리군) 및 제4군(FGF7+CP 처리군)에서 day 0(시험개시일), day 2, day 6, day 9 및 day 13에 SD 래트의 체중(g)을 평균±표준편차로 도시한 그래프이다.
도 2는 4개의 군에서 day 1 및 day 8에 SD 래트의 일일 사료 섭취량(g)을 평균±표준편차로 도시한 그래프이다.
도 3은 4개의 군에서 day 1 및 day 8에 SD 래트의 일일 음수 섭취량(g)을 평균±표준편차로 도시한 그래프이다.
도 4는 4개의 군에서 day 0(시험개시일), day 3, day 7, day 10, day 12 및 day 14에 SD 래트의 상처를 각각 동일한 조건하에 촬영한 사진이다.
도 5는 4개의 군에서 day 0(시험개시일), day 3, day 7, day 10, day 12 및 day 14에 SD 래트의 상처 수축률(%)을 평균±표준편차로 도시한 그래프이다. 구체적인 수치 데이터는 표 2 및 3에 기재되어 있다.
도 6은 4개의 군에서 day 7 및 day 14에 SD 래트의 혈중 백혈구(WBC) 및 적혈구(RBC)의 수를 평균±표준편차로 도시한 그래프이다. 구체적인 수치 데이터는 표 4 및 5에 기재되어 있다.
도 7은 4개의 군에서 day 7에 SD 래트의 상처 부위에서 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양을 비교한 것이다. 도 7의 상단부는 β-액틴의 발현양과 비교하여 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양을 각각 나타낸 것이다. 도 7의 하단부는 제1군(음성대조군: NC)을 기준으로 설정하고, 이에 대한 제2군, 제3군 및 제4군에서의 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양을 상대비율로 도시한 그래프이다. 구체적인 수치 데이터는 표 6 내지 8에 기재되어 있다.
도 8은 도 7과 유사하게 day 14에 있어서 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양을 비교한 것이다. 구체적인 수치 데이터는 표 9 내지 11에 기재되어 있다.
도 9는 조직병리학적 검사를 목적으로 4개의 군에서 day 7에 SD 래트의 상처 부위를 광학 현미경으로 촬영한 사진이다. 도 9의 상단부(a, b, c, d로 표시됨)는 저배율에서 촬영되고, 도 9의 하단부(A, B, C, D로 표시됨)는 고배율에서 촬영된 것이다.
도 10은 조직병리학적 검사를 목적으로 4개의 군에서 day 14에 SD 래트의 상처 부위를 광학 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 10의 a는 상처 부위에 표피화가 진행된 결과 상처가 거의 치유된 것으로 보이지만, 새롭게 재생된 표피가 비후되어 있을 뿐만 아니라 그 두께가 불규칙하게 구성되어 있다는 것을 확인할 수 있다.
반면, 도 10의 d는 새롭게 재생된 표피가 일정한 두께로 형성되어 있으며, 이는 조직병리학적 소견상 정상적인 피부의 표피에 매우 근접한 양상을 나타낸다.
본 발명에 대해서는 하기의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위 내에서 본 발명에 대해 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.
1. 실험 동물의 준비
본 발명에서 수행된 모든 실험들은 동물보호법에 근거하여 충북대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다(승인번호: CBNUA-780-15-01).
Sprague dawley 래트는 상처 치유 시험에 있어서 널리 연구되고 사용되는 모델이다. 이에, 본 발명자들은 (주)대한바이오링크로부터 SD 래트 수컷을 67마리 구입하였다. 상기 SD 래트는 모두 구입당시에 5주령이고 체중 범위는 132.30±9.01 g이었다.
본 실험을 수행하는데 적합하고 건강한 SD 래트를 선별하기 위하여 동물 사육실에서 1주 동안의 순화 기간을 거쳤다. 상기 동물 사육실의 환경은 온도 20.66℃ ~ 22.19℃, 습도 39.45% ~ 46.20%, 12시간 간격(08:00~20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하였다. 상기 1주 동안의 순화 기간 동안 이상이 없는 SD 래트 48마리를 선별하였다. 선별시에 SD 래트는 6주령이 되었으며, 체중 범위는 209.59±8.09 g이었다.
이어서, 상기 48마리의 SD 래트를 체중에 기초하여 4개의 군으로 분리하였으며, 각각의 군은 12마리로 구성되었다.
시험개시일(day 0)에 SD 래트에게 Zoletil 30 mg/kg 및 Rompun 10 mg/kg을 복강주사하여 마취하였다. 그 후, 전기 이발기(ER143, Panasonic, Japan)를 이용하여 SD 래트의 등 부위를 제모하고 70% 알코올로 소독하였다. 이어서, 수술용 가위로 전층 피부를 제거하여, SD 래트의 등 부위에 원형의 창상(면적 약 500 mm2, 직경 2.5 cm)을 형성하였다. 상기 상처 부위가 실험 기간 동안 다른 동물에 의해 이차적으로 손상되는 것을 방지하기 위하여, SD 래트는 폴리설폰 케이지에 1마리씩 수용되었다. 또한, 상기 상처 부위의 이차 감염을 막기 위하여, 동물 사육실 내에서 사용되는 모든 기기와 자재들을 121℃에서 20분 동안 고압 증기멸균하였다.
2. 본 발명에 따른 조성물의 준비
본 발명에 따른 조성물은 필수적인 유효성분으로서 FGF7 단백질 및 콜라겐을 포함한다. 특히, 본 발명에 사용되는 FGF7 단백질은 다음과 같은 과정을 거쳐 수득되었다.
FGF7 발현 벡터를 형질도입시킨 CHO 세포를 8mM 글루타민 및 2μM MTX(methotrexate: 메토트렉세이트)를 보충한 CD OptiCHO 배지(GIBCO사)에서 배양하였다. 이때, 상기 배지에는 혈청이 포함되어 있지 않다.
그 후, 배양된 여러 개의 단일클론 세포들 중에서 FGF7 단백질의 생산성과 세포 생존율이 가장 우수한 단일클론 세포를 선별하고 이를 대량증식한 후, FGF7 단백질을 생산하였다. 세포 배양배지에 혈청이 포함되어 있지 않으므로, FGF7 단백질은 혈청 또는 여기에 함유되어 있는 바이러스 등으로 인해 변질되거나 돌연변이될 가능성을 근본적으로 차단할 수 있었다.
3. 실험군 및 대조군의 설계
각각 12마리의 SD 래트로 이루어진 4개의 군은 다음과 같이 구성되었다.
제1군은 음성대조군으로서, 용매인 완충액(buffer)을 1일 1회 250 μl/래트의 용량으로 상처 부위에 경피투여하였다. 상기 완충액은 3 중량%의 만니톨, 1 중량%의 수크로스, 1 중량%의 NaCl, 2.5 중량%의 글리신, 0.01 중량%의 Tween80을 포함하며, 나머지는 정제수로 구성된 pH 7.2의 용매이다.
제2군은 마데카솔 처리군으로서, 동국제약에서 시판되는 마데카솔® 케어 연고 제품을 1일 1회 150 mg/래트의 용량으로 상처 부위에 경피투여하였다. 상기 마데카솔® 케어 연고 제품은 현재까지 국내에서 상처를 치유하는 상업적 제품으로서 매우 성공적으로 시판되어오고 있다. 연고 1g 중 센텔라아시아티카정량추출물 10mg 및 네오마이신황산염 3.5mg이 포함되어 있으며, 특히 상기 센텔라아시아티카정량추출물은 피부내 콜라겐의 생합성을 유도하여 흉터를 최소화하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
제3군은 FGF7 처리군으로서, 앞서 미리 제조한 FGF7 단백질을 1일 1회 250 μl 완충액 중 50 μg/래트의 용량으로 상처 부위에 경피투여하였다.
제4군은 FGF7+CP 처리군으로서, 전술한 바에 따라 제조된 FGF7 단백질 50 μg을 완충액 중에 용해시켜 250 μl로 만든 후, 콜라겐 패치(CP)에 담지시켰다. 이와 같이 제조된 콜라겐 패치를 래트의 상처 부위에 부착하였으며, 매일 1회 교환해주었다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상처 치유의 초기 효능을 확인하기 위하여 각 군마다 6마리는 7일째에 안락사시켜 부검을 하였으며, 각 군의 나머지 6마리는 14일째에 안락사시켜 부검을 하였다.
SD 래트의 번호 안락사 시점
제1군
(음성대조군)		 1 ~ 6 day 7
7 ~ 12 day 14
제2군
(마데카솔 처리군)		 13 ~ 18 day 7
19 ~ 24 day 14
제3군
(FGF7 처리군)		 25 ~ 30 day 7
31 ~ 36 day 14
제4군
(FGF7+CP 처리군)		 37 ~ 42 day 7
43 ~ 48 day 14
하기에서는 시험개시일(day 0)부터 시작하여 특정일에 측정된 데이터 값들을 항목을 나누어 기재하고 평가하였다. 각각의 표에는 측정된 데이터 값, 및 이로부터 산출된 평균, 표준편차(SD)와 표준오차(SE)를 나타내었다. 모든 데이터들에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위하여 레빈(Levene) 등분산 검정을 수행하였으며, 분산이 동질성을 갖는 경우 일원 변량 분석(ANOVA)을 수행하여 유의성이 관찰되면 각 군별로 상호 유의성을 비교하기 위해 스튜던트 t-검정을 수행하였다.
4. 임상증상의 관찰
4개 군의 SD 래트를 안락사시키기 전까지 매일 1회 이상 임상증상을 관찰하였다. 실험 기간 동안에 걸쳐 특이적인 이상은 발견할 수 없었다. 이는 본 발명에 따른 조성물이 상처를 입은 대상체에게 투여되더라도, 특이적인 독성이나 부작용을 유발하지 않는다는 것을 보여준다.
5. 체중의 변화
day 0(시험개시일), day 2, day 6, day 9 및 day 13에 SD 래트의 체중을 측정하였다.
그 결과, 제1군(음성대조군), 제2군(마데카솔 처리군), 제3군(FGF7 처리군) 및 제4군(FGF7+CP 처리군)에서, 각각 day 0일 때 체중은 209.95±9.04 g, 209.49±8.22 g, 209.44±8.09 g, 208.88±8.94 g이었으며, day 2일 때 체중은 185.77±12.70 g, 183.06±10.39 g, 187.89±9.90 g, 179.98±12.62 g이었으며, day 6일 때 체중은 205.58±13.19 g, 203.33±8.82 g, 207.21±10.71 g, 197.15±17.55 g이었으며, day 9일 때 체중은 224.61±13.31 g, 218.64±11.53 g, 221.06±11.65 g, 217.04±21.51 g이었으며, day 13일 때 체중은 249.99±16.74 g, 239.88±14.84 g, 245.18±11.08 g, 241.34±22.38 g이었다. 상기 데이터는 도 1에 그래프로 나타내었다.
4개의 군 모두에서 유의적인 차이는 발견되지 않았다. 4개의 군 모두에서 day 2의 체중이 day 0의 체중보다 더 감소하는 현상이 관찰되었는데, 이는 상처의 형성으로 인한 통증 및 식욕부진 때문인 것으로 여겨진다.
6. 사료 섭취량의 변화
SD 래트의 일일 사료 섭취량을 측정하기 위하여, day 0(시험개시일) 및 day 7에 각각 사료 공급량을 체크하고, 24시간이 경과한 후 사료 잔여량을 체크하였다. 이어서, (사료 공급량 - 사료 잔여량)에 의해 일일 사료 섭취량을 산출하였다.
그 결과, 제1군(음성대조군), 제2군(마데카솔 처리군), 제3군(FGF7 처리군) 및 제4군(FGF7+CP 처리군)에서, day 1일 때 일일 사료 섭취량은 각각 15.25±2.70 g, 16.87±3.28 g, 16.26±2.12 g, 15.76±2.10 g이었으며, day 8일 때 일일 사료 섭취량은 각각 18.09±4.07 g, 20.08±3.57 g, 21.40±2.24 g, 20.17±2.86 g이었다. 상기 데이터는 도 2에 그래프로 나타내었다.
day 1 및 day 8에 산출하였을 때, 4개의 군 모두에서 SD 래트의 사료 섭취량은 유의적인 차이를 보이지 않았다.
7. 음수 섭취량의 변화
SD 래트의 일일 음수 섭취량을 측정하기 위하여, day 0(시험개시일) 및 day 7에 각각 음수 공급량을 체크하고, 24시간이 경과한 후 음수 잔여량을 체크하였다. 이어서, (음수 공급량 - 음수 잔여량)에 의해 일일 음수 섭취량을 산출하였다.
그 결과, 제1군(음성대조군), 제2군(마데카솔 처리군), 제3군(FGF7 처리군) 및 제4군(FGF7+CP 처리군)에서, day 1일 때 일일 음수 섭취량은 각각 21.15±5.00 g, 21.13±4.61 g, 22.94±3.55 g, 20.35±2.41 g이었으며, day 8일 때 일일 음수 섭취량은 각각 34.06±2.11 g, 31.70±2.21 g, 31.43±2.06 g, 33.66±5.79 g이었다. 상기 데이터는 도면 3에 그래프로 나타내었다.
day 1 및 day 8에 산출하였을 때, 4개의 군 모두에서 SD 래트의 음수 섭취량은 유의적인 차이를 보이지 않았다.
이와 같이 SD 래트의 사료 및 음수 섭취량에 있어서 유의적인 차이를 보이지 않았다는 것은, 본 발명에 따른 조성물이 상처를 입은 대상체에게 특이적인 독성이나 부작용을 유발하지 않는다는 것을 나타낸다.
8. 상처 수축률
day 0(시험개시일), day 3, day 7, day 10, day 12 및 day 14에 디지털 카메라(Canon EOS 30D, Canon, Japan)를 이용하여 SD 래트의 상처 부위를 사진 촬영하였다.
이로부터 획득한 이미지 파일을 대상으로 Image Analysis Software(ImagePartner, SaramSoft, Korea)를 이용하여 상처의 면적을 측정하였다. 상처 수축률은 하기 식에 의해 산출되었다.
Figure 112015096844742-pat00001
상처 수축률, 이로부터 산출된 평균, 표준편차(SD) 및 표준오차(SE)는 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.
day 0(시험개시일), day 3 및 day 7에서의 상처 수축률(%)
래트
번호 		Day 0 Day 3 Day 7
상처
면적
(cm 2 ) 		상처
수축률
(%) 		상처
면적
(cm 2 ) 		상처
수축률
(%) 		상처
면적
(cm 2 ) 		상처
수축률
(%)





제1군
(음성대조군)		 1 4.99 0.00 4.19 16.03 2.29 54.11
2 5.24 0.00 4.49 14.31 2.27 56.68
3 5.58 0.00 4.98 10.75 2.18 60.93
4 4.77 0.00 4.43 7.13 2.51 47.38
5 5.81 0.00 5.80 0.17 2.89 50.26
6 5.59 0.00 3.88 30.59 2.10 62.43
7 4.77 0.00 4.27 10.48 2.23 53.25
8 5.03 0.00 4.56 9.34 2.61 48.11
9 4.51 0.00 4.28 5.10 1.64 63.64
10 4.86 0.00 4.50 7.41 2.73 43.83
11 5.22 0.00 4.05 22.41 2.86 45.21
12 6.18 0.00 4.00 35.28 2.05 66.83
평균 5.21 0.00 4.45 14.08 2.36 54.39
SD 0.49 0.00 0.52 10.48 0.37 7.72
SE 0.14 0.00 0.15 3.03 0.11 2.23





제2군
(마데카솔 처리군)		 13 5.56 0.00 3.53 36.51 2.00 64.03
14 5.71 0.00 5.23 8.41 2.75 51.84
15 5.04 0.00 4.77 5.36 2.58 48.81
16 5.40 0.00 3.61 33.15 1.82 66.30
17 4.89 0.00 3.83 21.68 2.28 53.37
18 5.18 0.00 4.00 22.78 2.52 51.35
19 5.05 0.00 5.01 0.79 2.93 41.98
20 5.83 0.00 4.77 18.18 2.37 59.35
21 5.59 0.00 5.39 3.58 2.79 50.09
22 5.86 0.00 5.46 6.83 2.61 55.46
23 6.25 0.00 5.46 12.64 3.97 36.48
24 5.69 0.00 4.82 15.29 2.44 57.12
평균 5.50 0.00 4.66 15.43 2.59 53.01
SD 0.40 0.00 0.73 11.47 0.54 8.45
SE 0.12 0.00 0.21 3.31 0.16 2.44





제3군
(FGF7 처리군)		 25 5.74 0.00 5.18 9.76 2.47 56.97
26 5.20 0.00 4.08 21.54 2.47 52.50
27 6.00 0.00 5.16 14.00 1.75 70.83
28 5.40 0.00 4.86 10.00 2.58 52.22
29 5.36 0.00 3.64 32.09 1.98 63.06
30 5.59 0.00 4.38 21.65 2.28 59.21
31 5.87 0.00 5.40 8.01 2.39 59.28
32 5.33 0.00 5.00 6.19 2.30 56.85
33 5.39 0.00 4.70 12.80 2.97 44.90
34 5.57 0.00 4.18 24.96 2.00 64.09
35 5.57 0.00 4.43 20.47 2.02 63.73
36 5.00 0.00 4.53 9.40 2.18 56.40
평균 5.50 0.00 4.63 15.90 2.28 58.34
SD 0.28 0.00 0.52 8.06 0.33 6.76
SE 0.08 0.00 0.15 2.33 0.09 1.95





제4군
(FGF7+CP 처리군)		 37 5.46 0.00 4.04 26.01 2.48 54.58
38 5.29 0.00 4.48 15.31 1.78 66.35
39 5.19 0.00 3.57 31.21 1.87 63.97
40 6.01 0.00 3.72 38.10 1.44 76.04
41 5.73 0.00 4.94 13.79 2.31 59.69
42 5.37 0.00 3.80 29.24 1.78 66.85
43 5.05 0.00 4.67 7.52 2.43 51.88
44 4.76 0.00 2.57 46.01 1.90 60.08
45 5.90 0.00 3.76 36.27 2.24 62.03
46 4.80 0.00 4.53 5.62 2.40 50.00
47 5.14 0.00 3.82 25.68 2.41 53.11
48 5.92 0.00 3.64 38.51 2.00 66.22
평균 5.39 0.00 3.96 26.11 2.09 60.90
SD 0.43 0.00 0.63 13.03 0.34 7.61
SE 0.12 0.00 0.18 3.76 0.10 2.20
day 10, day 12 및 day 14에서의 상처 수축률(%)
래트
번호 		Day 10 Day 12 Day 14
상처
면적
(cm 2 ) 		상처
수축률
(%) 		상처
면적
(cm 2 ) 		상처
수축률
(%) 		상처
면적
(cm 2 ) 		상처
수축률
(%)





제1군
(음성대조군)		 1 - - - - - -
2 - - - - - -
3 - - - - - -
4 - - - - - -
5 - - - - - -
6 - - - - - -
7 1.04 78.20 0.84 82.39 0.71 85.12
8 1.41 71.97 1.23 75.55 0.99 80.32
9 1.84 59.20 1.21 73.17 0.87 80.71
10 1.92 60.49 1.39 71.40 0.90 81.48
11 1.52 70.88 1.14 78.16 1.05 79.89
12 1.26 79.61 1.08 82.52 0.75 87.86
평균 1.50 70.06 1.15 77.20 0.88 82.56
SD 0.34 8.62 0.18 4.67 0.13 3.21
SE 0.14 3.52 0.07 1.90 0.05 1.31





제2군
(마데카솔 처리군)		 13 - - - - - -
14 - - - - - -
15 - - - - - -
16 - - - - - -
17 - - - - - -
18 - - - - - -
19 2.14 57.62 1.84 63.56 1.30 74.26
20 1.47 74.79 1.24 78.73 1.03 82.33
21 1.77 68.34 1.71 69.41 1.04 81.40
22 1.44 75.43 1.00 82.94 0.85 85.49
23 3.16 49.44 2.66 57.44 1.73 72.32
24 1.46 74.34 1.13 80.14 0.98 82.78
평균 1.91 66.66 1.60 72.04 1.16 79.76
SD 0.67 10.80 0.62 10.21 0.32 5.23
SE 0.27 4.41 0.25 4.17 0.13 2.14





제3군
(FGF7 처리군)		 25 - - - - - -
26 - - - - - -
27 - - - - - -
28 - - - - - -
29 - - - - - -
30 - - - - - -
31 1.88 67.97 1.35 77.00 1.21 79.39
32 1.45 72.80 1.01 81.05 0.60 88.74
33 2.70 49.91 1.51 71.99 1.29 76.07
34 1.37 75.40 1.12 79.89 0.83 85.10
35 1.69 69.66 0.78 86.00 0.68 87.79
36 1.28 74.40 1.18 76.40 0.85 83.00
평균 1.73 68.36 1.16 78.72 0.91 83.35
SD 0.52 9.47 0.26 4.76 0.28 4.91
SE 0.21 3.86 0.10 1.94 0.11 2.01





제4군
(FGF7+CP 처리군)		 37 - - - - - -
38 - - - - - -
39 - - - - - -
40 - - - - - -
41 - - - - - -
42 - - - - - -
43 1.40 72.28 1.24 75.45 0.75 85.15
44 1.45 69.54 1.00 78.99 0.55 88.45
45 1.29 78.14 1.10 81.36 0.57 90.34
46 1.60 66.67 1.23 74.38 0.65 86.46
47 1.81 64.79 1.72 66.54 1.09 78.79
48 1.33 77.53 1.13 80.91 0.81 86.32
평균 1.48 71.49 1.24 76.27 0.74 85.92
SD 0.19 5.54 0.25 5.55 0.20 3.94
SE 0.08 2.26 0.10 2.26 0.08 1.61
마데카솔 처리군은 7일째까지는 음성대조군과 상처 수축률 측면에서 거의 차이가 없었으며, FGF7 처리군은 7일째에 비로소 음성대조군에 비해 상처 수축률이 유의적으로 증가하였음을 알 수 있다. 반면, FGF7+CP 처리군은 3일째에 이미 음성대조군에 비해 2배에 가까운 상처 수축률을 나타낸다.
상처를 치유하는 과정에 있어서, 염증기(inflammatory phase)와 증식기(proliferative phase)는 마지막 단계에 해당하는 재구성기(remodeling phase)에 비해 그 중요도가 매우 크다.
그 이유는 상처가 발생한 후 이를 초기에 치유하지 못한다면 상처의 면적이 처음과 비슷하게 여전히 넓은 상태로 잔존하게 되는데, 이로 인해 세균 등에 의한 이차감염의 가능성이 훨씬 더 높을 뿐만 아니라 물리력에 의해 상처가 더 찢어질 수 있는 가능성도 역시 높아지기 때문이다. 더욱이, 상처의 초기 수축 속도가 느린 경우 완치 시점은 서로 동일하더라도 상처 발생 초기에 침착된 섬유조직으로 인해 흉터가 더 크고 더 넓게 남게 된다.
따라서, 동일한 시점에 상처가 완치되더라도 상처의 초기 치유 속도는 2차 감염을 막고 흉터 발생 가능성을 낮춘다는 점에서 중요하게 작용하는데, FGF7 단백질을 콜라겐과 병용하여 투여할 때 놀랍게도 상처의 초기 수축률이 매우 높게 나타난다는 점이 실험적으로 입증되었다.
9. 혈중 적혈구 및 백혈구의 수
6마리는 day 7에 16시간 동안 사료 공급을 중단시켰으며, 나머지 6마리는 day 14에 16시간 동안 사료 공급을 중단시켰다. 이어서, 디에틸 에테르를 이용해 마취하고 개복한 후, 복대동맥에서 혈액을 채취하였다. 획득한 혈액은 EDTA 튜브에 보관하고, 자동혈구계수장비(ADVIA 2010, SIEMENS, Germany)를 이용하여 백혈구(WBC) 및 적혈구(RBC)의 수를 측정하였다.
그 결과, day 7 및 day 14에 혈중 백혈구의 수 및 적혈구의 수는 4개의 군 모두에서 통계학적으로 유의적인 차이를 보이지 않았다.
day 7에 측정한 백혈구의 수 및 적혈구의 수, 이로부터 산출된 평균, 표준편차(SD) 및 표준오차(SE)는 하기 표 4에 나타내었다. 또한, day 14에 측정한 값과 산출한 값은 하기 표 5에 나타내었다.
day 7에서의 혈중 백혈구 수 및 적혈구 수
래트 번호 WBC (10 3 /μl) RBC (10 6 /μl)



제1군
(음성대조군)		 1 9.68 7.3
2 9.93 6.44
3 8.11 6.46
4 8.52 6.83
5 6.23 7.16
6 6.54 6.16
평균 8.17 6.73
SD 1.54 0.45
SE 0.63 0.18



제2군
(마데카솔 처리군)		 13 5.41 6.68
14 5.35 6.24
15 11.3 5.56
16 7.52 6.63
17 9.67 6.22
18 10.14 7.44
평균 8.23 6.46
SD 2.53 0.63
SE 1.03 0.26



제3군
(FGF7 처리군)		 25 6.43 5.58
26 9.87 5.71
27 11.69 7.01
28 11.87 6.27
29 8.02 7.09
30 8.31 6.3
평균 9.37 6.33
SD 2.17 0.63
SE 0.88 0.26



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 37 8.47 6.67
38 9.82 5.56
39 7.43 7.42
40 8.88 6.72
41 6.29 6.27
42 7.83 7
평균 8.12 6.61
SD 1.22 0.64
SE 0.50 0.26
day 14에서의 혈중 백혈구 수 및 적혈구 수
래트 번호 WBC (10 3 /μl) RBC (10 6 /μl)



제1군
(음성대조군)		 7 5.96 7.19
8 11.45 7.09
9 8.19 6.82
10 8.3 6.81
11 5.52 7.01
12 7.36 7.12
평균 7.80 7.01
SD 2.12 0.16
SE 0.87 0.07



제2군
(마데카솔 처리군)		 19 6.73 7.29
20 6.51 7.55
21 10.19 7.24
22 4.35 7.15
23 7.37 6.61
24 4.51 7.38
평균 6.61 7.20
SD 2.14 0.32
SE 0.87 0.13



제3군
(FGF7 처리군)		 31 4.66 5.84
32 5.75 4.77
33 8.61 6.49
34 6.82 6.12
35 6.06 7.16
36 8.84 7.43
평균 6.79 6.30
SD 1.65 0.96
SE 0.67 0.39



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 43 6.89 6.63
44 4.89 6.28
45 4.39 6.74
46 9.12 7.42
47 6.99 7.07
48 5.68 6.36
평균 6.33 6.75
SD 1.72 0.43
SE 0.70 0.18
10. 상처 부위 조직 내 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양
day 7 및 day 14에 안락사시킨 SD 래트에서 상처 부위의 조직을 절취하여 2개의 부분으로 나누었다. 첫번째 조직 부분은 동결한 후, 본 실험에서 웨스턴 블롯팅에 사용하였다. 두번째 조직 부분은 여과지(Watman No.2 185mm, Watman, Germany)상에 펼쳐진 상태로 10% NBF(Neutral Buffered Formalin)에서 1~2일 동안 고정시킨 후, 후술하는 조직병리학적 검사에 사용하였다.
상처의 치유가 진행되는 조직에서는 TGF-β1(transforming growth factor β1: 형질변환성장인자 β1), VEGF(vascular endothelial growth factor: 혈관내피성장인자), FGF(fibroblast growth factor: 섬유아세포성장인자) 등과 같은 단백질들이 정상 조직에 비해 더 많이 발현된다. 상기 상처 부위에서 발견되는 TGF-β1는 세포의 성장, 분화 및 세포외기질 형성 등에 관여하고 조직 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 콜라겐의 합성을 유도함으로써 피부조직의 재상피화와 회복을 조절하는 중요한 요소 중 하나이다. 상기 상처 부위에서 발견되는 VEGF는 대식세포와 근아세포에 의해 분비되며 신생혈관생성을 촉진시키는 단백질로서, 상처 조직으로부터 분비되어 내피세포의 이주와 증식, 혈관 투과성을 증가시키며 상피화와 콜라겐 침착을 자극시키는 역할을 한다. 상기 상처 부위에서 발견되는 FGF는 대식구, 비만세포, T 림프구에서 분비되어 상처 부위에서 수가 증가하고, 육아조직의 발달 과정에서 섬유모세포와 상피세포, 카라틴 세포의 성장을 촉진하며, 혈관생성, 상피화 촉진 및 콜라겐을 형성하여 상처치유를 촉진한다.
따라서, 웨스턴 블롯팅을 통해 상처 부위의 조직 내에서 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양을 측정한다면, 상처 치유의 진행 정도를 그룹마다 상대적으로 비교해볼 수 있다.
먼저, 상기 동결시킨 첫번째 조직은 용해 완충액(Translab, Korea)에 침지시켜 균질화한 후, 4℃에서 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 획득한 상청액은 실험에 사용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다. 분리된 단백질의 농도는 Bradford법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 우선 4~20%, 10%, 15%의 SDS-PAGE 겔에서 단백질을 전기영동하고, PVDF 막에 단백질을 이동시켰다. 단백질이 이동된 막을 블로킹 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후, 1차 항체로서 β-액틴(Santa cruz, USA), VEGF(abcam, UK), TGF-β1(cell sinaling, USA), FGF(abcam, UK) 항체를 이용하여 상온에서 4~5시간 동안 배양하였다. 이어서, 2차 항체로서 HRP-컨쥬게이팅된 이차 항체(Santa cruz, USA)를 이용하여 상온에서 1시간 후 ECL 용액으로 단백질의 발현을 확인하였다.
β-액틴, TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양은 image j 프로그램을 이용하여 각각 수득하였다. 이어서, β-액틴 발현양에 대한 TGF-β1 단백질 발현양의 비율, β-액틴 발현양에 대한 VEGF 단백질 발현양의 비율, β-액틴 발현양에 대한 FGF 단백질 발현양의 비율을 산출하였다.
이와 같이 제2군, 제3군, 제4군에서 수득된 상기 비율을 음성대조군의 비율로 나눔으로써, TGF-β1, VEGF 및 FGF 발현양의 상대비율을 얻을 수 있었다. 이는 상처 부위의 조직 내 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양을 각 군마다 상대적으로 비교할 수 있도록 해준다.
day 7에서 상처 부위의 조직 내 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질의 발현양은 하기 표 6, 7 및 8에 나타내었으며, day 14에서의 발현양은 하기 표 9, 10 및 11에 나타내었다.
day 7에서 상처 부위 조직 내 TGF-β1 단백질의 발현양
래트
번호 		β-액틴 발현양에 대한 TGF-β1 발현양의 비율 　제1군(음성대조군)에 대한 TGF-β1 발현양의 상대비율



제1군
(음성대조군)		 1 0.688 1.000
2 0.516 1.000
3 0.431 1.000
4 0.351 1.000
5 0.481 1.000
6 0.543 1.000
평균 0.501 1.000
SD 0.114 0.000
SE 0.047 0.000



제2군
(마데카솔 처리군)		 13 0.679 1.353
14 0.336 0.671
15 0.679 1.355
16 0.698 1.392
17 0.487 0.972
18 0.668 1.332
평균 0.591 1.179
SD 0.147 0.294
SE 0.060 0.120



제3군
(FGF7 처리군)		 25 0.823 1.642
26 0.316 0.630
27 0.811 1.617
28 0.731 1.459
29 0.738 1.472
30 0.902 1.798
평균 0.720 1.436
SD 0.208 0.414
SE 0.085 0.169



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 37 0.652 1.301
38 0.620 1.236
39 1.139 2.271
40 0.664 1.323
41 0.707 1.411
42 1.121 2.235
평균 0.817 1.630
SD 0.244 0.486
SE 0.100 0.199
day 7에서 상처 부위 조직 내 VEGF 단백질의 발현양
래트
번호 		β-액틴 발현양에 대한 VEGF 발현양의 비율 　제1군(음성대조군)에 대한 VEGF 발현양의 상대비율


제1군
(음성대조군)		 1 0.612 1.000
2 0.702 1.000
3 0.977 1.000
4 1.378 1.000
5 1.127 1.000
6 1.107 1.000
평균 0.984 1.000
SD 0.286 0.000
SE 0.117 0.000



제2군
(마데카솔 처리군)		 13 0.993 1.009
14 1.011 1.028
15 0.908 0.923
16 1.362 1.384
17 0.787 0.800
18 1.142 1.160
평균 1.034 1.051
SD 0.199 0.202
SE 0.081 0.083



제3군
(FGF7 처리군)		 25 1.306 1.328
26 0.981 0.997
27 1.097 1.115
28 1.791 1.821
29 1.294 1.315
30 0.940 0.956
평균 1.235 1.255
SD 0.313 0.318
SE 0.128 0.130



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 37 0.936 0.951
38 1.161 1.181
39 1.525 1.550
40 1.838 1.869
41 2.007 2.040
42 1.241 1.262
평균 1.451 1.475
SD 0.414 0.421
SE 0.169 0.172
day 7에서 상처 부위 조직 내 FGF 단백질의 발현양
래트
번호 		β-액틴 발현양에 대한
FGF 발현양의 비율 		　제1군(음성대조군)에 대한 FGF 발현양의 상대비율



제1군
(음성대조군)		 1 1.063 1.000
2 1.053 1.000
3 0.928 1.000
4 1.147 1.000
5 0.900 1.000
6 0.696 1.000
평균 0.964 1.000
SD 0.160 0.000
SE 0.065 0.000



제2군
(마데카솔 처리군)		 13 1.408 1.460
14 1.234 1.280
15 0.778 0.807
16 1.031 1.070
17 0.546 0.566
18 0.599 0.621
평균 1.332 0.967
SD 0.334 0.362
SE 0.137 0.148



제3군
(FGF7 처리군)		 25 1.582 1.640
26 1.008 1.045
27 1.039 1.077
28 1.414 1.466
29 1.052 1.091
30 0.588 0.610
평균 1.114 1.155
SD 0.348 0.361
SE 0.142 0.147



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 37 1.245 1.291
38 1.507 1.562
39 1.501 1.557
40 1.588 1.646
41 1.462 1.516
42 0.691 0.717
평균 1.332 1.382
SD 0.334 0.347
SE 0.137 0.142
day 14에서 상처 부위 조직 내 TGF-β1 단백질의 발현양
래트
번호 		β-액틴 발현양에 대한 TGF-β1 발현양의 비율 　제1군(음성대조군)에 대한 TGF-β1 발현양의 상대비율



제1군
(음성대조군)		 7 1.219 1.000
8 0.786 1.000
9 0.579 1.000
10 2.397 1.000
11 1.281 1.000
12 0.138 1.000
평균 1.067 1.000
SD 0.777 0.000
SE 0.317 0.000



제2군
(마데카솔 처리군)		 19 1.193 1.118
20 0.647 0.606
21 0.716 0.671
22 1.463 1.372
23 0.489 0.459
24 0.606 0.568
평균 0.852 0.799
SD 0.385 0.361
SE 0.157 0.148



제3군
(FGF7 처리군)		 31 0.415 0.389
32 0.858 0.805
33 0.764 0.717
34 0.901 0.845
35 0.801 0.751
36 0.508 0.477
평균 0.708 0.664
SD 0.199 0.186
SE 0.081 0.076



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 43 0.622 0.583
44 0.627 0.588
45 0.921 0.863
46 0.983 0.922
47 0.793 0.744
48 0.410 0.384
평균 0.726 0.681
SD 0.214 0.201
SE 0.087 0.082
day 14에서 상처 부위 조직 내 VEGF 단백질의 발현양
래트
번호 		β-액틴 발현양에 대한 VEGF 발현양의 비율 　제1군(음성대조군)에 대한 VEGF 발현양의 상대비율



제1군
(음성대조군)		 7 0.993 1.000
8 0.804 1.000
9 0.639 1.000
10 1.054 1.000
11 0.719 1.000
12 0.965 1.000
평균 0.862 1.000
SD 0.166 0.000
SE 0.068 0.000



제2군
(마데카솔 처리군)		 19 1.246 1.445
20 0.830 0.963
21 0.817 0.947
22 0.942 1.093
23 1.047 1.215
24 1.082 1.255
평균 0.994 1.153
SD 0.164 0.191
SE 0.067 0.078



제3군
(FGF7 처리군)		 31 0.565 0.656
32 0.992 1.151
33 0.816 0.947
34 0.835 0.969
35 0.776 0.901
36 0.811 0.940
평균 0.799 0.927
SD 0.137 0.159
SE 0.056 0.065



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 43 0.682 0.791
44 0.658 0.763
45 0.933 1.083
46 0.847 0.983
47 0.444 0.515
48 0.767 0.890
평균 0.722 0.837
SD 0.171 0.198
SE 0.070 0.081
day 14에서 상처 부위 조직 내 FGF 단백질의 발현양
래트
번호 		β-액틴 발현양에 대한
FGF 발현양의 비율 		　제1군(음성대조군)에 대한 FGF 발현양의 상대비율



제1군
(음성대조군)		 7 1.429 1.000
8 0.832 1.000
9 1.973 1.000
10 1.662 1.000
11 2.870 1.000
12 - -
평균 1.753 1.000
SD 0.751 0.000
SE 0.336 0.000



제2군
(마데카솔 처리군)		 19 2.220 1.266
20 3.913 2.231
21 1.217 0.694
22 1.573 0.897
23 - -
24 - -
평균 2.231 1.272
SD 1.196 0.682
SE 0.598 0.341



제3군
(FGF7 처리군)		 31 2.461 1.404
32 1.566 0.893
33 0.813 0.464
34 1.482 0.845
35 - -
36 - -
평균 1.581 0.902
SD 0.677 0.386
SE 0.338 0.193



제4군
(FGF7+CP 처리군)		 43 1.323 0.754
44 0.526 0.300
45 1.026 0.585
46 2.727 1.556
47 - -
48 - -
평균 1.400 0.799
SD 0.944 0.538
SE 0.472 0.269
상기 표 6에서 보는 바와 같이, day 7에 FGF7+CP 처리군에서 상처 부위내 TGF-β1의 수준은 음성대조군 및 마데카솔 처리군과 비교할 때 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 뿐만 아니라, 상기 표 7 및 8에서 보는 바와 같이, day 7에 FGF7+CP 처리군에서 상처 부위내 VEGF 및 FGF의 수준은 음성대조군 및 마데카솔 처리군과 각각 비교할 때 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
한편, 상기 표 9에서 보는 바와 같이, day 14에 상처 부위에서 TGF-β1의 수준은 음성대조군과 비교하여 마데카솔 처리군, FGF7 처리군, FGF7+CP 처리군 모두에서 감소하는 경향을 나타내었다. 특히, FGF7+CP 처리군은 마데카솔 처리군에 비해서도 TGF-β1의 발현량이 감소되었다.
상기 표 10 및 11에서 보는 바와 같이, day 14에 상처 부위에서 VEGF 및 FGF의 수준은 음성대조군과 비교하여 마데카솔 처리군에서는 증가하는 경향을 보인 반면, FGF7+CP 처리군에서는 VEGF 및 FGF의 발현량이 모두 유의적으로 감소되었다(p<0.05).
상기 표 6 내지 11의 정량데이터와 이들을 도시한 도 7 및 8을 종합하여 고려해볼 때, FGF7+CP 처리군에서 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질들은 상처 치유의 초기 단계에 더 많이 발현되는 반면, 상처 치유의 후기 단계에서는 오히려 더 적게 발현된다는 점을 확인할 수 있다. 이와 같이 특이적으로 나타나는 현상은 FGF7+CP 처리군에서 상처의 초기 치유 속도가 가장 신속하다는 것을 의미한다. 즉, FGF7 단백질과 콜라겐의 병용투여는 상처 치유 과정의 증식기(proliferative phase)를 촉진시킨다.
11. 조직병리학적 검사
앞서 10% NBF에 고정시킨 SD 래트의 상처 부위 조직을 0.5cm x 2.5cm로 트리밍하여 스트립을 획득하였다. 상기 스트립에 대해 조직처리기기(Sakura Finetek VIP-5 Jr., Japan)를 이용하여 단계별로 알코올, 크실렌, 파라핀으로 처리하였으며, 4 μm 두께로 조직 절편을 제작하였다. 이와 같이 제작된 조직 절편은 탈파라핀, 함수 과정을 거쳐 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
염색한 슬라이드는 광학 현미경(JP/BX51, Olympus, Japan)을 이용하여 피부조직내 염증세포의 침윤 정도, 섬유아세포의 증식 정도, 신생모세혈관의 생성 정도, 생성된 표피의 두께 등을 관찰하였다.
조직병리학적 소견상, day 7에 부검한 SD 래트의 상처 부위 조직은 음성대조군에 비해 FGF7+CP 처리군에서 염증세포의 침윤이 더 적게 관찰되었으며, 섬유아세포는 더 많이 증식되었으며, 신생 모세혈관은 더 많이 생성되었다(도 9 참조).
day 14에 부검한 SD 래트의 상처 부위 조직은 4개의 군간에 조직병리학적 소견에서 큰 차이를 보이지 않았으며, 상처 부위에서 표피화가 진행되었음이 관찰되었다. 그러나, 도 10의 a에서 확인할 수 있는 바와 같이 음성대조군의 경우 상처 부위에서 재생된 표피는 그 배열이 불규칙하고 비후되어 있는 것이 관찰된 반면, 도 10의 d에서 확인할 수 있는 바와 같이 FGF7+CP 처리군에서는 상처 부위에서 재생된 표피의 배열이 규칙적이고 정상 피부의 표피와 유사한 양상으로 관찰되었다.
12. 결론
본 발명에 따른 조성물을 투여할 경우 특이적인 임상증상이 관찰되지 않았으며, 대상체의 체중, 일일 사료 및 음수 섭취량, 혈중 백혈구 및 적혈구의 수에 큰 변화를 나타내지 않았다는 점에서, 상기 조성물은 독성이나 원치 않는 부작용을 나타내지 않는다.
또한, FGF7 단백질을 단독으로 투여한 경우에는 7일째에야 비로소 음성대조군에 비해 상처 수축률이 증가하였음을 고려해본다면, FGF7 단백질과 콜라겐을 병용하여 투여한 경우 3일째에 이미 음성대조군에 비해 약 2배에 가까운 상처 수축률을 나타낸다는 것은 매우 주목할만한 놀라운 효과임이 명백하다.
뿐만 아니라, 상처의 치유가 진행되는 조직에서는 정상 조직에 비해 더 많이 발현되는 TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질들이 FGF7 단백질과 콜라겐을 병용하여 투여한 경우 7일째에 유의적으로 증가된 수준으로 발현되고 있다. 반면, 14일째에는 오히려 음성대조군보다 상기 단백질들의 발현량이 감소된 경향을 나타낸다. TGF-β1, VEGF 및 FGF 단백질들은 상처 치유 과정에서도 특히 증식기(proliferative phase)와 관련된 역할을 행하는바, FGF7 단백질과 콜라겐의 병용투여는 상처 치유 과정에 있어서 증식기(proliferative phase)의 도래를 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.
마지막으로, 조직병리학적 검사에서 FGF7 단백질과 콜라겐을 병용하여 투여한 경우 상처 부위에서 새롭게 재생된 표피가 규칙적이고 정상 표피에 거의 유사한 양상으로 나타난다.

Claims (9)

  1. FGF7(fibroblast growth factor 7: 섬유아세포성장인자 7) 단백질 및 콜라겐을 포함하는 상처 치료용 약학 조성물로서,
    상기 조성물은 상처의 치유 과정 중 염증기(inflammatory phase) 및 증식기(proliferative phase)를 촉진시켜 상처의 초기 치료 속도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 상처의 초기 치료 속도는 상처 발생일로부터 7일 동안의 상처 치료 속도인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상처 발생일로부터 적어도 7일 동안 상처에 경피투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. FGF7(fibroblast growth factor 7: 섬유아세포성장인자 7) 단백질 및 콜라겐을 포함하는 상처의 흉터 생성 방지용 화장품 조성물로서,
    상기 조성물은 상처의 치유 과정 중 염증기(inflammatory phase) 및 증식기(proliferative phase)를 촉진시켜 상처의 초기 복원 속도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 상처의 초기 복원 속도는 상처 발생일로부터 7일 동안의 상처 복원 속도인 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 상처 발생일로부터 적어도 7일 동안 상처에 경피투여되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  7. FGF7 단백질 및 콜라겐을 하나의 제형으로 포함하거나, 또는 FGF7 단백질 및 콜라겐을 독립적인 별도의 제형으로 포함하는, 상처 치료용 키트로서,
    상기 키트는 상처의 치유 과정 중 염증기(inflammatory phase) 및 증식기(proliferative phase)를 촉진시켜 상처 발생일로부터 7일 동안의 상처 초기 치료 속도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. FGF7 단백질 및 콜라겐을 하나의 제형으로 포함하거나, 또는 FGF7 단백질 및 콜라겐을 독립적인 별도의 제형으로 포함하는, 상처의 흉터 생성 방지용 키트로서,
    상기 키트는 상처의 치유 과정 중 염증기(inflammatory phase) 및 증식기(proliferative phase)를 촉진시켜 상처 발생일로부터 7일 동안의 상처 초기 복원 속도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 삭제
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KR20020087210A (ko) 2001-05-14 2002-11-22 (주)엘피스바이오텍 상처치유 조성물
KR20150103014A (ko) * 2013-01-09 2015-09-09 인터내셔날 스템 셀 코포레이션 피부 재생을 촉진시키는 소분자

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