KR101631591B1

KR101631591B1 - 미세조류 클로렐라 소로키니아나를 이용한 축산폐수 처리방법

Info

Publication number: KR101631591B1
Application number: KR1020120073061A
Authority: KR
Inventors: 김희식; 김병혁; 조대현; 오희목
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2016-06-17
Also published as: KR20140005063A

Abstract

본 발명은 높은 농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서 증식할 수 있는 신규한 미세조류 클로렐라 소로키니아나 HS, 상기 미세조류의 배양방법 및 상기 미세조류를 이용하여 염류를 포함하는 축산폐수를 처리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 클로렐라 소로키니아나 HS는 높은 농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서도 정상적으로 증식할 수 있기 때문에, 축산폐수에 관한 한 지금까지 사용되어온 그 어떤 정화방법보다도 경제적이고 환경친화적인 정화처리에 활용될 수 있을 것이다.

Description

미세조류 클로렐라 소로키니아나를 이용한 축산폐수 처리방법{Treatment method of swine wastewater by microalgae, Chlorella sorokiniana}

본 발명은 미세조류 클로렐라 소로키니아나를 이용한 축산폐수 처리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 높은 농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서 증식할 수 있는 신규한 미세조류 클로렐라 소로키니아나 HS, 상기 미세조류의 배양방법 및 상기 미세조류를 이용하여 염류를 포함하는 축산폐수를 처리하는 방법에 관한 것이다.

축산폐수와 같이 고농도의 염류를 함유한 폐수는 다양한 산업으로부터 발생되며, 염류를 함유한 폐수는 원료물질의 종류에 따라 발생되는 오염물질의 성상이 변한다. 상기 염류를 함유하고 있는 폐수는 처리가 용이하지 않고, 자연 환경으로 유입시 주변환경에 환경오염을 유발시키는 결과를 초래한다.

통상적으로, 폐수를 처리하기 위하여는 미생물을 이용한 생물학적 처리방법, 다양한 화학물질을 사용하는 화학적 처리방법 및 침강 등의 물리적 처리방법을 병용하여 사용하게 되는데, 상기 염류를 포함하는 폐수의 경우에는 생물학적 방법이 사용되지 못하고 있다. 그 이유는 폐수에 포함된 고농도의 염류로 인하여 삼투압이 증가함으로써 생물학적 방법에 사용되는 미생물이 손상될 뿐만 아니라 미생물 군집체가 해체되어 전체적으로 미생물이 감소되며, 이로 인하여 처리효율이 급격하게 감소하기 때문이다. 이에 따라, 화학적 처리방법이나 물리적 처리방법이 사용되고 있으나, 처리비용이 매우 증가한다는 단점을 극복하지 못하고 있다. 이에 따라, 염류에 대하여 저항성을 나타내어 고농도의 염류를 포함하는 폐수에서도 정상적으로 증식할 수 있는 미생물을 이용한 생물학적 처리방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 고농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서 정상적으로 증식할 수 있는 신규한 미세조류인 본 발명은 높은 농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서 증식할 수 있는 신규한 미세조류인 클로렐라 소로키니아나 HS를 분리동정하고, 상기 미세조류를 사용할 경우 고농도의 염류를 포함하는 축산폐수를 정화할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

등록특허공보 제10-1061035호(2011.09.01.)

Chemosphere Volume 83, Issue 4, April 2011, Pages 510-516

본 발명의 하나의 목적은 고농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서 정상적으로 증식할 수 있는 신규한 미세조류를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미세조류를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세조류를 이용하여 고농도의 염류를 포함하는 축산폐수를 처리하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 고농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서 정상적으로 증식할 수 있는 신규한 미세조류를 제공한다.

본 발명의 용어 "축산폐수"란, 넓은 범위로는 가축을 사육하면서 발생하는 각종 폐기물을 포함하는 폐수를 의미하고, 좁은 범위로는 가축분뇨와 축산폐수배출시설을 청소한 물이 혼합된 폐수를 의미하는데, "축산배수(畜産排水)"라고도 하며, 각종 유기물, 질소, 인 뿐만 아니라 고농도의 염류를 포함한다. 통상적으로 28,500oom 내지 65,000ppm에 이르는 BOD 농도를 나타내는데, 이처럼 오염부하량이 폐수발생량에 비하여 크기 때문에 적정하게 처리하지 않고 공공수역으로 방류하게 되면 하천의 수질악화 및 호수의 부영양화를 초래할 뿐만 아니라 악취 및 해충피해 등의 요인이 되어 심각한 환경오염의 원인이 된다. 본 발명의 목적상 상기 축산폐수는 생물학적 처리방법에 의하여 처리 또는 정화되어야할 대상으로서 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "미세조류"란, 넓은 범위로는 광합성 색소를 포함하여 광합성을 수행할 수 있는 단세포생물을 통칭하여 의미하고, 좁은 범위로는 수서환경에서 서식하고, 광합성을 수행하며, 포자를 이용하여 번식하고, 단세포로서 존재하거나 또는 단세포군집체를 형성할 수 있는 진핵생물을 의미하는데, 서식하는 환경에 따라 민물에서 서식하는 담수조류와 해수에서 서식하는 해조류로 구분하기도 한다. 본 발명의 목적상 상기 미세조류는 클로렐라 속에 속하는 조류를 의미하는 것으로 해석될 수 있고, 바람직하게는 고농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서 정상적으로 증식할 수 있는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 계열의 미세조류로서 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)"란, 단세포로서 존재하는 클로렐라 속(Chlorella sp.)에 속하는 담수조류의 일종을 의미하는데, 17-24시간의 세포분열 속도를 나타내어 빠른 성장율을 보이고, 생체내의 리피드 함량이 28.27%이며, 배지내의 염류농도가 35ppm(0.035 g/L) 이상인 경우에는 성장이 억제되고, 1%이상인 경우에는 더이상 증식하지 않는 생물학적 특성을 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 염류에 대하여 저항성을 나타내어 고농도의 염류를 포함하는 폐수에서도 정상적으로 증식할 수 있는 미생물을 분리동정하기 위하여, 축산폐수를 배양하여 이로부터 증식할 수 있는 신규한 미세조류를 검색하고, 이의 DNA를 분석한 결과, 종래에 알려진 미세조류의 일종인 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)의 18S rRNA와 99%의 상동성을 나타냄을 확인하였다(표 1). 상기 분리동정된 미세조류의 염류 저항성을 분석한 결과, 상기 미세조류는 약 3%(w/v)의 염류를 포함하는 배지에서도 정상적으로 증식하고, 염류의 농도가 증가할 수록 상기 미세조류의 부피가 증가하는 특성을 나타냄을 확인하였다(도 1). 또한, 축산폐수 처리수를 포함하지 않는 배지에서는 정상적으로 증식하지 않지만, 40%(v/v)의 함량으로 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서는 정상적으로 증식함을 확인할 수 있음을 확인하였으나(도 3 및 도 4), 종래의 공지된 다른 종류의 미세조류는 상기 배지에서 생존하지 못함을 확인하였다(도 5).

이에, 본 발명자들은 상기 축산폐수로부터 분리동정된 신규한 미세조류를 "클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)"라 명명하고, 2012년 3월 28일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, 이하, "KCTC"라 약칭함)에 수탁번호 KCTC 12171BP로 기탁하였다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 신규한 미세조류를 염류를 포함하거나 또는 포함하지 않는 배지에 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 상기 신규한 미세조류를 배양하는 방법을 제공한다.

이때, 염류를 포함하는 배지를 사용할 경우, 염류는 배지의 최종 부피에 대하여 4%(w/v) 이하, 바람직하게는 0.01 내지 4%(w/v), 보다 바람직하게는 1 내지 3%(w/v), 가장 바람직하게는 3%(w/v)의 함량으로 배지에 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 염류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 해수중에 용해되어 있는 다양한 무기물이 될 수 있고, 바람직하게는 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘(MgCl₂), 황산마그네슘(MgSO₄), 황산칼슘(CaSO₄), 황산칼륨(K₂SO₄), 탄산칼슘(CaCO₃), 브로민화마그네슘(MgBr₂) 등이 될 수 있다. 또한, 보다 효과적으로 배양하기 위하여 축산폐수를 배지에 추가로 포함할 수도 있는데, 이때 배지에 포함된 축산폐수는 배지의 최종 부피에 대하여 60%(v/v) 이하, 바람직하게는 0.01 내지 60%(v/v), 보다 바람직하게는 20 내지 60%(v/v), 가장 바람직하게는 40%(v/v)의 함량으로 배지에 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다. 본 발명에서 상기 미세조류를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다.

아울러, 광합성을 수행하는 상기 미세조류의 특성상 배양시 빛을 제공함이 바람직한데, 제공되는 빛의 양과 제공시간은 당업자가 필요에 따라 적절하게 조절할 수 있으나, 약 50μmole/㎡/s의 광도조건으로 빛을 제공할 수 있다. 또한, 온도조건은 특별히 이에 제한되지 않으나 24-26℃를 유지함이 바람직하고, 배양시간은 1 내지 36일 동안 배양함이 바람직하다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 신규한 미세조류를 축산폐수를 포함하는 배지에 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 축산폐수의 처리방법을 제공한다. 이때, 사용되는 배지, 배양조건 등은 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 미세조류를 축산폐수를 포함하는 배지에 접종하여 배양할 경우, 화학적 산소요구량(Chemical Oxygen Demand, COD), 총 인의 농도 및 총 질소의 농도를 현저하게 감소시키고(표 4 내지 표 6), 색도를 감소시킬 수 있음을 확인하였다(표 7).

높은 농도의 염류를 포함하는 축산 폐수는 정화가 매우 어렵기 때문에, 많은 시간과 비용이 소요되는 것으로 알려져 있다. 상기 축산 폐수는 소요 비용이 상대적으로 저렴한 것으로 알려진 생물학적 방법인 활성 슬러지 공법을 이용하여 처리할 경우에도, 포기조 내에 과포화상태로의 산소를 공급해야만 하기 때문에, 다른 폐수를 처리할 경우보다도 높은 운전 및 유지비용이 소요되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 제공하는 클로렐라 소로키니아나 HS는 높은 농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서도 정상적으로 증식할 수 있기 때문에, 축산폐수에 관한 한 지금까지 사용되어온 그 어떤 정화방법보다도 경제적이고 환경친화적인 정화처리에 활용될 수 있을 것이다.

아울러, 상기 축산폐수를 정화한 후에 대량으로 증식된 클로렐라 소로키니아나 HS는 균체내에 축적된 다양한 물질을 이용하여 다양한 산업에서 원료물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 균체내 지질을 추출하여 바이오디젤로 전환시키거나, 색소성분을 추출하여 화장품의 원료로서 사용하는 등의 방법으로 활용할 수 있다.

도 1은 염류 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS의 성장수준을 비교한 사진 및 그래프이다.
도 2는 축산폐수의 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS의 증식수준을 나타내는 그래프이다.
도 3은 축산폐수의 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS의 클로로필 A의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4는 축산폐수를 이용하여 미세조류를 배양한 결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 염류를 함유한 축산폐수를 이용한 미세조류의 분리 및 동정

실시예 1-1: 미세조류의 분리 및 DNA 의 수득

염류를 함유한 축산 폐수를 집적배양 하여 미세조류를 분리하고, FastDNA SPIN for kit(MP biomedicals)을 이용하여 상기 분리된 미세조류로부터 DNA를 추출하였다.

상기 추출된 DNA 1㎕, 12.5 pmol Chlo-165F 2.5㎕, 12.5 pmol Chlo-595R 2.5㎕, 10mM dNTP 혼합물 2㎕, 10× PCR 완충액 5㎕, 보빈 시럼 알부민(BSA) 0.5㎕, Taq DNA 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.5㎕ 및 dH₂O 36㎕를 혼합하고, 하기의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하고(초기 변성 과정 - 95℃, 5분; 30회 반복(변성 과정 - 94℃, 1분; 어닐링 과정 - 58℃, 1분; 및, 중합 과정 - 72℃, 1분 30초); 최종 연장 과정 - 72℃, 10분), 얻어진 PCR 산물을 아가로스 겔에서 확인하였다.

Chlo-165F: 5'-CGA CTT CTG GAA GGG ACG TA-3' (서열번호 1)

Chlo-595R: 5'-ATT GGA GCT GGA ATT ACC GC-3' (서열번호 2)

실시예 1-2: 클로닝

상기 실시예 1-1에서 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 분석하기 위해 TA-클로닝을 수행하였다.

구체적으로, pGEM-T easy(Promega) 벡터 1㎕, T4 ligase 1㎕, PCR 산물 3㎕ 및 2X buffer 5㎕를 혼합하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어, 상기 반응물 1㎕와 얼음에서 해동된 E. coli DH5α를 혼합하고 얼음에서 30분동안 반응시키고, 상기 반응물을 42℃에서 90초 동안 추가로 반응시켰으며, 얼음에서 2분간 방치하고, 200㎕의 LB 배지를 가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕배양하였으며, 상기 배양물을 LB-amp 고체배지(X-gal+IPTG)에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였으며, 고체배지에서 성장한 흰색 콜로니를 선별함으로써, TA-클로닝을 수행하였다.

실시예 1-3: 염기서열 결정 및 미세조류의 동정

상기 실시예 1-2에서 선별된 흰색 콜로니를 3㎖의 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕배양하여 배양물을 수득하였다. 상기 배양물을 Qiagen spin miniprep kit(Qiagen)에 적용하여 플라스미드를 추출하고, 상기 추출된 플라스미드를 제한효소 EcoRI으로 절단하여, 920 bp의 절편을 나타내는 플라스미드를 선별하였다. 상기 선별된 플라스미드에 포함된 PCR 산물의 염기서열을 분석하고(서열번호 3), 분석된 염기서열을 NCBI blast에 적용하여 상기 분리된 미세조류를 동정하였다(표 1).

미세조류 동정결과

Accession	Species	Similarity
X74001 AB058372	Chlorella sorokiniana 18S rRNA gene Chlorella sp. MBIC 10595 18S rRNA gene	99 % 99 %

상기 표 1에서 보듯이, 상기 서열번호 3의 염기서열은 Chlorella sorokiniana의 18S rRNA 및 Chlorella sp. MBIC 10595의 18S rRNA gene과 99%의 상동성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 분리된 미세조류는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)로 동정되었다. 상기 동정된 균주를 "클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)"라 명명하고, 2012년 3월 28일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, 이하, "KCTC"라 약칭함)에 수탁번호 KCTC 12171BP로 기탁하였다.

실시예 2: 클로렐라 소로키니아나 HS 의 염류에 대한 저항성

상기 실시예 1에서 동정된 클로렐라 소로키니아나 HS의 염류에 대한 저항성을 확인하기 위하여, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 4.0%(w/v)의 NaCl을 포함하는 BG11 배지(표 2)에 상기 클로렐라 소로키니아나 HS를 접종하고 광독립영양(photoautotrophic)조건으로 진탕배양하였다. 상기 BG11 배지는 표 2에 개시된 Stock No.1 내지 Stock No.9를 혼합하여 제조하였는데, 구체적으로, 배지 1ℓ당, Stock No.1 100㎖, Stock No.2 10㎖, Stock No.3 10㎖, Stock No.4 10㎖, Stock No.5 10㎖, Stock No.7 10㎖, Stock No.8 10㎖, Stock No.9 10㎖ 및 여분의 증류수를 포함하도록 혼합하고, 멸균한 후, 최종적으로 Stock No.6 1㎖을 가하여 제작하였다. 또한, 광원으로 형광등(cool white fluorescent lamps)을 사용하고, 50μmole/㎡/s의 광도조건 및 24-26℃의 온도조건하에 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양결과를 육안으로 비교확인하고, 배양물에 포함된 세포수 및 배양물에 포함된 세포의 건조중량을 측정하며, 배양된 세포의 크기를 현미경으로 관찰하였다(도 1). 이때, 건조중량은, 중량을 측정한 GF 여과지로 단위 부피의 배양물을 여과하고, 여과지에 잔류하는 세포를 건조시킨 후, 이의 중량을 측정하고, 측정된 중량값에서 여과지의 중량값을 삭감하여 단위 부피의 배양물에 포함된 건조중량을 결정하고, 결정된 단위 부피 배양물의 건조중량을 배양물 1ℓ에 해당하는 값으로 환산하여 산출하였다.

BG11 배지의 조성

Stock no.	배지성분	용량
1	NaNO₃	15 g/L
2	K₂HPO₄	4.0 g/500ml
3	MgSO₄.7H₂O	3.75 g/500ml
4	CaCl₂.2H₂O	1.80 g/500ml
5	citric acid	0.30 g/500ml
6	EDTA Na₂	0.05 g/500ml
7	Ammonium ferric citrate green	0.30 g/500ml
8	Na₂CO₃	1.0 g/500ml
9	Trace metal solution
	H₃BO₃	2.86 g/L
	MnCl₂4H₂O	1.81 g/L
	ZnSO₄7H₂O	0.22 g/L
	Na₂MoO₄2H₂O	0.39 g/L
	CuSO₄5H₂O	0.08 g/L
	Co(NO₃)₂6H₂O	0.05 g/L

도 1은 염류 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS의 성장수준을 비교한 사진 및 그래프로서, a는 각각 상이한 농도의 염류를 포함하는 배양액으로 배양한 결과를 나타내는 사진이고, b는 배양물에 포함된 세포수 및 배양물에 포함된 세포의 건조중량을 나타내는 그래프이며, c는 서로 다른 염류농도를 포함하는 각 배양액에서 배양된 세포의 크기를 나타내는 현미경 사진이다.

도 1에서 보듯이, 0 내지 2.5%(w/v)의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 클로렐라 소로키니아나 HS의 성장은 큰 차이를 보이지 않았고, 3.0%(w/v)의 염류를 포함하는 BG11 배지에서는 성장이 느리게 진행된 것을 확인하였으며, 4.0%(w/v)의 염류를 포함하는 BG11 배지에서는 더 이상 성장하지 않음을 확인하였다. 특히, 도 1의 b에서 보듯이, 배양액에 포함된 염류농도의 변화에 따라 배양액 1 ml안에 클로렐라 소로키니아나 HS의 세포수를 의미하는 cell count와 배양액 1 L에 포함된 클로렐라 소로키니아나 HS의 건조중량을 의미하는 DCW가 변화됨을 확인하였는데, 상기 도 1의 b의 결과는 배양액에 포함된 염류의 농도가 증가할 수록 클로렐라 소로키니아나 HS의 생장이 천천히 둔화되어 세포수가 감소하는 반면, 염류의 농도가 3%에 도달하기 까지는 DCW가 증가하므로, 배양액에 포함된 염류의 농도가 일정수준(3%)까지 증가하면, 세포의 수는 감소하지만 세포의 크기가 증가하여 건조중량이 증가되는 것으로 분석되었다.

이러한 분석결과는 염류를 포함하지 않는 배지 및 3%의 염류를 포함하는 배지에서 배양한 클로렐라 소로키니아나 HS의 현미경사진으로부터 확인할 수 있었는데(도 1의 c), 일정수준까지는 염류의 농도가 증가할 수록 클로렐라 소로키니아나 HS의 부피가 증가하는 양상을 나타냄을 알 수 있었다.

한편, 염류 농도에 따른 배양액에서 성장한 미세조류의 수를 hemocytometer로 정량한 한 결과, 염류의 농도가 증가됨에 따라서 미세조류의 수는 감소되는 경향을 확인하였다. 그러나, 건조중량을 측정한 결과 0 내지 3%(w/v)의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양할 경우에는 건조중량이 증가하는 반면, 3%(w/v)를 초과하는 농도의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양할 경우에는 건조중량이 감소되는 경향을 확인하였다. 이 결과로, 미세조류의 수는 줄어들지만, 건조중량은 3%(w/v)의 NaCl을 포함하는 배지에서 배양할 때까지 증가하다 감소하는 경향을 나타냄을 알 수 있었다. 건조중량이 3%(w/v)를 초과하는 NaCl을 포함하는 배지에서 배양할 경우부터 감소하는 것은 셀 수가 감소하기 때문에 건조중량이 낮게 나타났으나, 균주의 부피는 증가하는 양상을 나타냄을 알 수 있었다(도 1의 c).

상기 결과로부터, 본 발명의 클로렐라 소로키니아나 HS는 염류의 농도가 증가하면 균체의 수는 감소하지만, 균체 자체의 부피가 증가하여 건조중량을 증가시키는 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 클로렐라 소로키니아나 HS 배양조건 결정

실시예 3-1: 축산폐수의 성상분석

전남 강진에 위치한 돼지 사육 농가에서 나오는 축산폐수 원수(약 COD 30,000 ppm)를 물리 화학적 처리방법(고형물질 응집 및 부유물질 제거)으로 1차 처리하여 수득한 축산폐수 처리수(약 COD 800 ppm)를 대상으로 성상분석(COD, TP, TN, 색도 및 염도)을 수행하였다. 이때, 화학적 산소요구량(Chemical Oxygen Demand, COD), 총 인(Total phosphate concentration, TP), 총 질소(Total nitrate concentration, TN)는 표준 방법(standard method)에 따라 측정하고, 색도는 색도계로 측정하였으며, 염도는 축산폐수 1ℓ에 포함된 가용성 염류의 중량비로 환산하여 산출하였다(표 3).

축산폐수의 성상

	측정값	단위
COD TN TP 색도 염도	807 330 1.48 329 1.8	ppm ppm ppm color unit %(w/v)

상기 표 3에서 보듯이, 화학적 산소요구량은 807 ppm으로 확인되었고, 총인과 총질소는 각각 330 ppm, 1.48 ppm으로 확인되었다. 또한, 축산폐수의 염도는 1.8%(w/v)로 확인되었다. 본 발명에서 사용한 축산폐수는 총질소의 농도에 비하여 총인의 농도가 매우 낮은 것을 확인하였다. 또한, 축산폐수는 노란색의 색을 띄고 있으며, 색도계로 측정해 본 결과 329 unit를 확인할 수 있었다.

실시예 3-2: 축산폐수를 이용한 클로렐라 소로키니아나 HS 의 배양 및 직접계수방법을 이용한 증식율 측정

서로 다른 농도의 축산폐수를 포함하는 배지에서 본 발명의 클로렐라 소로키니아나 HS를 배양하고, 축산폐수 농도에 따른 증식수준을 직접계수방법인 헤모사이토미터를 이용하는 방법으로 산출하였다.

구체적으로, 클로렐라 소로키니아나 HS의 최적 배양조건을 확인하기 위하여, 1차 처리된 축산폐수 처리수를 각각 0, 20, 40, 60 또는 100%(v/v)의 함량으로 포함하는 BG11 배지에 클로렐라 소로키니아나 HS를 3.83 X 10⁴cell/ml의 농도로 접종한 후 10일동안 배양하면서, 2일 간격으로 현미경하에서 헤모사이토미터를 이용하여 배양물 단위부피당 클로렐라 소로키니아나 HS의 균체수를 계수하고, 이를 비교하였다(도 2).

도 2는 배지에 포함된 축산폐수 처리수의 함량에 따른 배양물 단위부피당 클로렐라 소로키니아나 HS의 세포수 변화를 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 축산폐수 처리수를 포함하지 않는 배지(0%, v/v)를 사용할 경우에는 접종 4일 후에 균체수가 1.05 X 10⁵cell/ml로 증가한 후 다시 감소하는 경향을 나타내었고, 10%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지를 사용할 경우에는 접종 4일 후에 균체수가 2.12 X 10⁵ cell/ml로 증가한 후 다시 감소하는 경향을 나타내었으며, 뒤에 감소하였다. 또한, 20%, 30% 및 40%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 접종시점부터 계속 증가하여 36일이 지난 후 5.15 X 10⁵, 5.53 X 10⁵및 5.35 X 10⁵cell/ml로 증가하였다. 그러나, 50 및 100%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 접종 후 12일까지 증식하지 않았으며, 16일부터 증가하여 36일이 지난 후 3.47 X 10⁵ 및 2.55 X 10⁵cell/ml로 증식하는 것을 확인하였다.

실시예 3-3: 축산폐수를 이용한 클로렐라 소로키니아나 HS 의 배양 및 간접계수방법을 이용한 증식율 측정

서로 다른 농도의 축산폐수를 포함하는 배지에서 본 발명의 클로렐라 소로키니아나 HS를 배양하고, 축산폐수 농도에 따른 증식수준을 간접계수방법인 클로로필 A 색소의 농도를 측정하는 방법으로 산출하였다.

구체적으로, 상기 실시예 3-2와 동일한 조건에서 클로렐라 소로키니아나 HS를 배양하고, 2일 간격으로 각각의 배양물로부터 단위부피의 시료를 수집하였다. 상기 수집된 각 시료를 유리섬유거름종이(GF/C, 45 D)로 여과하고, 시료에 포함된 균체가 잔류하는 거름종이에 90% 아세톤 수용액을 가한 다음, 조직마쇄기에 적용하여 상기 균체를 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 4℃의 암실에서 하룻밤동안 방치하고, 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액을 분광광도계에 적용하여 OD₆₆₃, OD₆₄₅, OD₇₅₀ 및 OD₆₃₀에서의 흡광도를 각각 측정한 다음, 표준방법을 이용하여 측정된 각 흡광도로부터 클로로필 A 색소의 농도를 산출하였다(도 3).

도 3은 배지에 포함된 축산폐수 처리수의 함량에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS의 클로로필 A 색소의 농도을 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 축산폐수 처리수를 포함하지 않는 배지(0%, v/v)를 사용할 경우에는 접종시점부터 클로로필 A의 수준이 증가하지만 4일후부터는 감소하는 경향을 나타내었고, 20%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 접종시점부터 클로로필 A의 수준이 급격히 증가하지만 6일후부터는 감소하는 경향을 나타내었으며, 40%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 접종시점부터 클로로필 A의 수준이 급격히 증가하지만 8일후부터는 다소 감소하는 경향을 나타내었고, 60%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 접종시점부터 클로로필 A의 수준이 서서히 감소하는 경향을 나타내었으며, 100%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 접종시점부터 클로로필 A의 수준이 급격히 감소하여 2일후부터는 클로로필 A가 전혀 검출되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 40%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 배양할 경우에 클로렐라 소로키니아나 HS가 가장 활발하게 증식함을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 축산폐수를 이용한 다양한 미세조류의 배양

클로렐라 소로키니아나 HS이외의 다른 다양한 미세조류들이 염류를 함유한 축산폐수에서 성장할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명의 클로렐라 소로키니아나 HS(실험군 1), 클로렐라 엘립소이데(Chlorella ellipsoidea) NIES 2150(실험군 2), 클로렐라 프로토데코이드(Chlorella protothecoide) UTEX 1806(실험군 3), 클로렐라 피레니도사(Chlorella pyrenidosa) UTEX 252(실험군 4), 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis) UTEX 1807(실험군 5), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) NIES 2170(실험군 6), 클로렐라 조핀기엔시스(Chlorella zofingiensis) CCAP 21114(실험군 7), 시네데스무스 속 균주(Scenedesmus sp.)(실험군 8), 시네데스무스 속 균주(Scenedesmus sp.)(실험군 9), 시네데스무스 속 균주(Scenedesmus sp.)(실험군 10), 페디아스트럼 앤글로섬(Pediastrum angulosum) UTEX LB 1370(실험군 11), 페디아스트럼 듀플렉스(Pediastrum duplex) UTEX 1364(실험군 12), 안키스트로데스무스 브라우니(Ankistrodesmus braunii) NIES 2194(실험군 13), 코리시스티스 속(Choricystis sp.) CCALA 305(실험군 14), 코엘라스트럼 프로보시듐(Coelastrum proboscideum) NIES 131(실험군 16) 및 마이크로탐니온 케찡기아눔(Microthamnion kyetzingianum) CCALA 368(실험군 16)를 각각 1차 처리된 축산폐수 처리수를 40%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 BG11 배지에 접종하고, 2주동안 배양한 후, 이들의 증식여부를 확인하였다(도 4). 도 4는 축산폐수 처리수를 이용하여 미세조류를 배양한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 보듯이, 본 발명의 클로렐라 소로키니아나 HS 이외의 다른 모든 미세조류는 축산폐수 처리수를 포함하는 배지에서 성장하지 않음을 확인하였다.

실시예 4: 클로렐라 소로키니아나 HS 를 이용한 축산폐수의 처리

클로렐라 소로키니아나 HS를 이용한 축산폐수의 처리효율을 확인하고자, 다양한 함량의 축산폐수를 포함하는 배지에서 클로렐라 소로키니아나 HS를 배양하고 배양물에 포함된 화학적 산소요구량, 총 인의 농도, 총 질소 농도 및 색도의 변화를 분석하였다.

실시예 4-1: 클로렐라 소로키니아나 HS 를 이용하여 처리된 축산폐수의 화학적 산소요구량( COD ) 변화

1차 처리된 축산폐수 처리수를 각각 0, 10, 20, 30, 40, 50 또는 100%(v/v)의 함량으로 포함하는 BG11 배지에 클로렐라 소로키니아나 HS를 3.83 X 10⁴cell/ml의 농도로 접종한 후 36일동안 배양하여, 각각의 배양물을 수득한 다음, 상기 각 배양물의 화학적 산소요구량(COD)을 측정하고 비교하였다(표 4). 이때, 대조군으로는 배양물 대신 증류수를 사용하여 반응시킨 반응물을 사용하였다.

또한, 상기 COD는 하기의 표준방법에 따라 측정하였다: 각 배양물 5㎖, 황산제2수은 0.4g 및 물을 혼합하여 20㎖의 반응물을 수득하고, 상기 반응물에 중크롬산칼륨용액 10.0㎖를 가하였다. 이때, 각 배양물의 COD가 50㎎/ℓ 이하인 경우에는 0.025N K₂Cr₂O₇용액을 사용하고, 50㎎/ℓ 이상인 경우에는 0.25N K₂Cr₂O₇용액을 사용하였다. 그런 다음, 상기 반응물에 황산-황산은용액 30㎖를 가하고 진탕혼합하고, 2시간 동안 환류냉각장치에서 가열하고, 냉각시켰다. 냉각된 반응물에 증류수를 가하여 반응물의 총 부피를 140㎖로 맞추고, 이에 페로인 지시약을 가한 다음, 교반하면서 반응물의 색이 청록색에서 적갈색으로 변화할 때 까지 0.25 N FAS 용액으로 적정하여, 사용된 0.25 N FAS 용액의 양을 환산하고, 대조군의 값을 기준으로 하여 각 배양물의 COD를 산출하였다.

축산폐수 처리수의 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS 배양물의 COD

축산폐수 처리수의 함량(v/v)	0day	36day	제거량	제거율
0% 10% 20% 30% 40% 50% 100%	39.6 85.2 122.8 163.6 396 456 807	61.6 73.6 102.4 104 118 258 694	- 11.6 20.4 59.6 278 198 113	- 14% 17% 36% 70% 43% 14%

상기 표 4에서 보듯이, 축산폐수 처리수를 포함하지 않는 배지에서 배양할 경우에는 COD값이 감소되지 않았고, 축산폐수 처리수의 농도에 따라 서로 다른 COD의 제거율을 나타내었으나, 40%(v/v)의 함량으로 축산폐수 처리수를 포함하는 배지를 사용할 경우에 클로렐라 소로키니아나 HS를 이용한 COD의 제거율이 가장 높은 수준을 나타내었다.

실시예 4-2: 클로렐라 소로키니아나 HS 를 이용하여 처리된 축산폐수의 총 인의 농도 변화

상기 실시예 4-1과 동일한 방법을 수행하여, 클로렐라 소로키니아나 HS 배양물을 수득하고, 표준방법을 이용하여 각 배양물에 포함된 총 인의 농도를 측정하고 비교하였다(표 5).

축산폐수 처리수의 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS 배양물의 총 인의 농도(단위: ppm)

축산폐수 처리수 함량(v/v)	0day	36day	제거량	제거율
0% 10% 20% 30% 40% 50% 100%	0.08 0.22 0.33 0.48 0.66 0.74 1.48	0.04 0.07 0.12 0.16 0.18 0.26 1.27	0.04 0.15 0.21 0.32 0.48 0.48 0.21	50% 68% 64% 67% 73% 65% 14%

상기 표 5에서 보듯이, 축산폐수 처리수를 포함하지 않는 배지에서 배양할 경우에는 매우 낮은 수준으로 인이 제거되었고, 축산폐수 처리수의 농도에 따라 서로 다른 인의 제거율을 나타내었으나, 40%(v/v)의 함량으로 축산폐수 처리수를 포함하는 배지를 사용할 경우에 클로렐라 소로키니아나 HS를 이용한 인의 제거율이 가장 높은 수준을 나타내었다.

실시예 4-3: 클로렐라 소로키니아나 HS 를 이용하여 처리된 축산폐수의 총 질소의 농도 변화

상기 실시예 4-1과 동일한 방법을 수행하여, 클로렐라 소로키니아나 HS 배양물을 수득하고, 표준방법을 이용하여 각 배양물에 포함된 총 질소의 농도를 측정하고 비교하였다(표 6).

축산폐수 처리수의 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS 배양물의 총 질소의 농도(단위: ppm)

축산폐수 처리수 함량(v/v)	0day	36day	제거량	제거율
0% 10% 20% 30% 40% 50% 100%	1.48 47.62 73.6 113.98 148.62 180.37 330.48	1.28 43.58 71.87 105.32 132.73 170.48 328.91	0.2 4.04 1.73 8.66 15.89 9.89 1.57	14% 8% 2% 8% 11% 5% 0%

상기 표 6에서 보듯이, 축산폐수 처리수를 포함하지 않는 배지에서 배양할 경우에는 가장 높은 수준으로 질소가 제거되었고, 축산폐수 처리수의 농도에 따라 서로 다른 질소의 제거율을 나타내었으나, 40%(v/v)의 축산폐수 처리수를 포함하는 배지를 사용할 경우에 클로렐라 소로키니아나 HS를 이용한 질소의 제거율이 축산폐수 처리수를 포함하는 배지 중에서는 가장 높은 수준을 나타내었다.

실시예 4-4: 클로렐라 소로키니아나 HS 를 이용하여 처리된 축산폐수의 색도 변화

상기 실시예 4-1과 동일한 방법을 수행하여, 클로렐라 소로키니아나 HS 배양물을 수득하고, 디지털 색도계를 이용하여 각 배양물의 색도를 측정하고 비교하였다(표 7).

축산폐수 처리수의 농도에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS 배양물의 색도(단위: color unit)

축산폐수 처리수 함량(v/v)	0day	36day	제거량	제거율
0% 10% 20% 30% 40% 50% 100%	12 50 90 140 155 159 329	11 16 38 73 75 105 265	1 34 52 67 80 54 64	8% 68% 58% 48% 52% 34% 19%

상기 표 7에서 보듯이, 축산폐수 처리수를 포함하지 않는 배지에서 배양할 경우에는 매우 낮은 수준으로 색도가 변화하였고, 축산폐수 처리수의 농도에 따라 서로 다른 색도의 변화율을 나타내었고, 10%(v/v)의 함량으로 축산폐수 처리수를 포함하는 배지를 사용할 경우에 클로렐라 소로키니아나 HS를 이용한 색도의 변화율이 축산폐수 처리수를 포함하는 배지 중에서는 가장 높은 수준을 나타내었으나, 실질적인 색도변화량은 40%(v/v)의 함량으로 축산폐수 처리수를 포함하는 배지를 사용할 경우에 가장 높은 수준을 나타내었다.

생물자원센터

KCTC12171BP

20120328

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Treatment method of swine wastewater by microalgae, Chlorella sorokiniana <130> PA120428/KR <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Chlo-165F <400> 1 cgacttctgg aagggacgta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Chlo-595R <400> 2 attggagctg gaattaccgc 20 <210> 3 <211> 920 <212> DNA <213> Chlorella sorokiniana HS 18S rRNA <400> 3 ctaggtggga gggtttaatg aacttctcgg cggccgagag cggagaccgc acccggtcgc 60 caatccgaac acttcaccag cacacccaat cggtaggagc gacgggcggt gtgtacaaag 120 ggcagggacg taatcaacgc aagctgatga cttgcgctta ctaggcattc ctcgttgaag 180 attaataatt gcaataatct atccccatca cgatgcagtt tcaaagatta cccgggcctc 240 tcggcnaagg ctaggctcgt tgaatgcatc agtgtagcgc gcgtgcggcc cagaacatct 300 aagggcatca cagacctgtt attgcctcat gcttccattg gctagtcgcc aatagtccct 360 ctaagaagtc cgccggctgg agaaccaacc gtgactattt agcaggctga ggtctcgttc 420 gttaccggaa tcaacctgac aaggcaaccc accaactaag aacggccatg caccaccacc 480 catagaatca agaaagagct ctcaatctgt caatcctcac tatgtctgga cctggtaagt 540 tttcccgtgt tgagtcaaat taagccgcag gctccacgcc tggtggtgcc cttccgtcaa 600 ttcctttaag tttcagcctt gcgaccatac tccccccgga acccaaaaac tttgatttct 660 cataaggtgc cggcggagtc atcgaagaaa catccgccga tccctagtcg gcatcgttta 720 tggttgagac taggacggta tctaatcgtc ttcgagcccc caactttcgt tcttgattaa 780 tgaaaacatc cttggcaaat gctttcgcag tagttcgtct ttcataaatc caagaatttc 840 acctctgaca atgaaatacg aatgccctcg actgtccctc ttaatcatta ctccggtcct 900 acagaccaac aagataggcc 920

Claims

축산폐수 처리용 클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP).
제1항의 축산폐수 처리용 클로렐라 소로키니아나 HS를 염류를 포함하거나 또는 포함하지 않는 배지에 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 클로렐라 소로키니아나 HS의 배양방법.
제2항에 있어서,
배지에 포함된 염류의 함량은 배지의 최종 부피에 대하여 4%(w/v) 이하인 것인 방법.
제2항에 있어서,
상기 염류는 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘(MgCl₂), 황산마그네슘(MgSO₄), 황산칼슘(CaSO₄), 황산칼륨(K₂SO₄), 탄산칼슘(CaCO₃), 브로민화마그네슘(MgBr₂) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서,
상기 배지에 축산폐수를 추가로 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 배지내 축산폐수의 함량은 배지의 최종 부피에 대하여 60%(v/v)이하인 것인 방법.
제1항의 축산폐수 처리용 클로렐라 소로키니아나 HS를 축산폐수를 포함하는 배지에 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 축산폐수의 처리방법.
제7항에 있어서,
상기 배지내 축산폐수의 함량은 배지의 최종 부피에 대하여 60%(v/v)이하인 것인 방법.