KR101627413B1

KR101627413B1 - 만니톨 대사 저해를 통한 항균방법 및 만니톨 대사 저해제를 함유하는 항균용 조성물

Info

Publication number: KR101627413B1
Application number: KR1020140076570A
Authority: KR
Inventors: 김경규; 트룽 탄 누엔; 최종근
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2014-06-23
Filing date: 2014-06-23
Publication date: 2016-06-03
Also published as: KR20150146255A; US20150366191A1

Abstract

본 발명은 만니톨 대사 저해를 통해 만니톨 대사경로를 갖는 세균을 살균하는 항균방법, 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법, 및 만니톨 대사 저해제를 함유하는 항균용 조성물 및 화장료에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase; M1PDH)와 같은 만니톨 대사 효소를 타겟으로 하는 항균방법, 저해제 스크리닝방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 항생제 내성의 문제를 해결하고 항균효과가 뛰어난 항균방법, 항균용 조성물 및 화장료를 제공할 수 있다.

Description

만니톨 대사 저해를 통한 항균방법 및 만니톨 대사 저해제를 함유하는 항균용 조성물 {Antimicrobial method by blocking manitol metabolism and Antimicrobial composition containing mannitol metabolic inhibitor}

본 발명은 만니톨 대사 저해를 통해 만니톨 대사경로를 갖는 세균을 살균하는 항균방법, 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법, 및 만니톨 대사 저해제를 함유하는 항균용 조성물 및 화장료에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase; M1PDH)와 같은 만니톨 대사 효소를 타겟으로 하는 항균방법, 저해제 스크리닝방법 및 조성물에 관한 것이다.

항균제는 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위하여 많이 사용되고 있으며, 주로 곰팡이를 비롯한 천연물로부터 분리되거나 화학적으로 합성하는 방법으로 제조되어왔다. 가장 대표적인 항균제는 1928년에 알렌산더 플레밍이 발견한 페니실린이다. 페니실린은 인류가 최초로 개발한 항균제로써, 페니실린의 베타-락탐의 일부분이 세균의 세포막인 펩티도글리칸 분자를 연결하는 트랜스펩티다아제(transpeptidase)와 임의로 결합하여 세균의 세포벽을 자라지 못하게 함으로써 세포벽이 약화되어 삼투압을 견디지 못하고 세균이 용균(lysis)되게 하여 박테리아의 생장을 억제시켜 항균 효과를 낸다. 페니실린의 개발 이후 이를 기초로 우수한 항균제의 개발이 진행되어 왔으며, 대표적인 것이 페니실린의 화학 구조를 일부 변경하여 제조한 메티실린(methicillin)이다. 항균제는 세포벽의 합성을 차단, 세포막 구조를 파괴, DNA 또는 RNA 합성 억제, 단백질 합성 억제 등의 기전에 의하여, 세균 감염을 막거나 치료하는데 있어서 많은 역할을 하였으나, 항균제의 무분별한 사용 등으로 인하여 기존 항균제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 항균제 내성 세균이 출현하는 문제가 발생하였다. 항균제 내성 세균이란 특정 항균제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말하며, 내성균은 다른 균에도 내성을 전이시켜서 내성균이 계속 늘어나게 하기 때문에 내성이 생기면 항균력이 더 강한 항균제를 사용하든지 다른 계열의 항균제로 바꾸어야 하는 문제가 발생한다.

항균제에 내성을 가지는 여러 가지 세균 중 대표적인 것이 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus; MRSA), 반코마이신 내성 엔테로코키(vancomycin resistant enterococci; VRE), 반코마이신 매개 황색포도상구균(vancomycin intermediate Staphylococcus aureus; VISA), 그리고 최소 6종 이상의 항균제에 내성을 가지는 대장균(E.coli) P157:H7 등이 있다.

메티실린 내성 황색포도상구균의 경우 1961년 영국에서 처음으로 발견된 후 세계 각처에서 보고되기 시작하였는데, 메티실린 내성 황색포도상구균은 메티실린 뿐 아니라 대부분의 항균제에 내성을 보여 극히 제한된 항균제로만 치료가 가능하다는 문제가 있다. 또한, 메티실린 내성 황색포도상구균은 병원내 감염을 유발하는 병원균 중 가장 빈번히 나타나는 원인균이고, 면역력이 약한 환자나 노약자에게 감염되는 경우 사망에까지 이를 정도로 치명적일 수 있다는 점에서 심각하다. 예로, 2006년 한 해 동안 미국에서 9만 4000여명이 메티실린 내성 황색포도상구균에 감염되었고, 이 중 1만 9천여명 이상이 사망한 것으로 보고되었다. 우리나라에서도 메티실린 내성 황색포도상구균은 병원의 감염 병원체로 대형 종합병원에서 80% 가까이 상재하고 있는 것으로 보고되었다.

이에, 항균제에 대하여 내성이 발생하지 않는 신규한 작용 메커니즘을 지닌 새로운 항균 방법 및 항균 약물을 개발하는 것이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2006-0069790), 아직 미비한 실정이다.

본 발명자들은 만니톨 대사에 관여하는 중요한 효소중의 하나인 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH)가 결여된 포도상구균이 만니톨이 고농도로 존재하는 환경에서 생존율이 현저하게 감소한다는 사실을 확인함으로써 만니톨 대사 저해를 통해 세균을 제어할 수 있다는 사실을 발견하였다. 이에, 만니톨 대사를 저해하는 화합물을 탐색(screening)하는 방법과, 발굴된 저해제를 통해 세균을 효과적으로 살균하는 방법을 고안하게 되었다. 특히, M1PDH 단백질의 3차원 구조를 통하여 기질 특이성을 규명하고 3차원 구조를 이용한 가상 검색 및 화합물 라이브러리를 이용한 저해제 검색을 통해 M1PDH를 억제하는 화합물을 발굴하고 그 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 종래의 항생제들과 달리, 만니톨 대사 저해를 통하여 세균을 용균시켜 사멸하게 하는 항균방법 및 항균용 조성물로서, 항생제 내성의 문제를 해결하고 항균효과가 뛰어난 항균용 약학적/화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로, 세포외에서 배양된 세균에 대해서는 55 mM 내지 500 mM의 만니톨을, 대식세포와 함께 배양된 세균에 대해서는 2.74 mM 내지 164 mM의 만니톨을, 만니톨 대사 효소 저해제와 함께 세균에 처리함으로써, 만니톨 대사 저해를 통한 항균방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 만니톨 대사를 저해함으로써 만니톨 대사경로를 갖는 세균을 살균하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 방법은 만니톨 대사 저해제와 55 mM 내지 500 mM의 만니톨을 세균에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 처리는 체외(in vitro)에서 행해지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 만니톨 대사경로를 갖는 세균은 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E coli K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 체외(in vitro)에서 만니톨 대사에 관여하는 효소의 활성을 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 효소는 과발현시켜 정제된 것이고, 상기 효소활성은 효소의 반응액에 저해제 후보물질을 처리하여 그 활성을 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 효소의 반응액은 기질로서 fructose-6-phosphate와 NADH, 또는 Mtl-1-phosphate와 NAD를 포함하고, 상기 효소활성은 340 nm에서 NADH의 optical density를 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 만니톨 대사에 관여하는 효소는 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH), Mannitol-2-dehydrogenase, Mannitol-1-phosphatase, Mannitol repressor, Mannitol ABC transporter permease, 및 Mannitol-specific PTS enzyme으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 만니톨의 존재하에 세균을 배양하면서 세균의 생존율을 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 배양은 55 mM 내지 500 mM의 만니톨이 포함된 배지에서 세균을 배양하고, 상기 생존율 측정은 배양액에 저해제 후보물질을 처리한 후 세균의 CFU(colony forming unit) 또는 OD600에서 세균 농도를 측정하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 만니톨의 존재하에 세균을 배양하면서 페놀레드의 색변화를 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 배양은 27 mM 내지 500 mM의 만니톨과 페놀레드가 포함된 배지에서 세균을 배양하고, 상기 색변화 측정은 페놀레드의 붉은색이 유지되는지를 확인하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 만니톨의 존재하에 세균을 식균세포에 감염시킨 후 세균의 생존율을 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 배양은 2.74 mM 내지 164 mM의 만니톨이 포함된 배지에서 세균을 배양하고, 상기 생존율 측정은 배양액에 저해제 후보물질을 처리한 후 세균의 CFU(colony forming unit)를 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 세균은 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E coli K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 만니톨 대사 저해제 및 만니톨을 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물 및 화장료를 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 만니톨 대사 저해제는 만니톨 대사 효소를 타겟으로 하는 저해제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 만니톨 대사 저해제는 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH) 저해제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 M1PDH 저해제는 6-amino-3-methyl-4-(4-nitrophenyl)-1-phenyl-1,4-dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile, 2-(1-adamantyl)-4-methoxy-6-{[({[2-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonyl}amino)carbonyl]amino}-1,3,5-triazine, 3-amino-2-benzyl-7-nitro-4-(2-quinolyl)-1,2-dihydroisoquinolin-1-one, N-[4-(4-chlorophenoxy)-3-nitrobenzoyl]-N'-[2-(trifluoromethyl)phenyl]urea 및 (2R,4aS,6aS,6aS,14aS,14bR)-10,11-dihydroxy-2,4a,6a,6a,9,14a-hexamethyl-3,4,5,6,8,13,14,14b-octahydro-1H-picene-2-carboxylic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물 및 화장료는 만니톨 대사 효소를 갖는 세균 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 세균은 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E colii K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물 및 화장료는 만니톨을 2.74 mM 내지 164 mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 만니톨 대사 저해제 및 만니톨을 유효성분으로 함유하는 조성물을 항균에 이용하는 용도를 제공한다.

본 발명은, 만니톨 대사를 저해하는 화합물을 탐색(screening)하는 신규 방법과, 발굴된 저해제를 통해 세균을 효과적으로 살균하는 신규 항균방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 종래의 항생제들과 달리, 만니톨 대사 저해를 통하여 세균을 용균시켜 사멸하게 하는 항균방법 및 항균용 조성물로서, 항생제 내성의 문제를 해결하고 항균효과가 뛰어난 바, 항균 용도로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 X-선(1.8Å)을 이용하여 M1PDH의 결정구조를 확인한 결과이다.
도 2는 X-선(1.8Å)을 이용하여 포도상 구균의 M1PDH (이하 saM1PDH) 와 pfM2DH (pseudomonas fluorescence mannitol-2-dehdrogenase))의 N-terminal 및 C-terminal domain의 구조를 비교한 결과이다.
도 3은 X-선(1.8Å)을 이용하여 M1PDH가 SO4^2-와 결합하여 형성된 복합체(saM1PDH) 와, pfM2DH가 MtL(만니톨)와 결합하여 형성된 복합체(afM2DH) 구조를 비교한 결과이다.
도 4는 잔기 R283, R287, R294에 대하여 변이를 일으킨 경우, M1PDH의 효소활성을 확인한 결과이다.
도 5의 a는 NaCl 농도에 따른 mannitol-1-Phosphate에 대한 M1PDH의 활성을 확인한 결과이고, 도 5의 b는 NaCl 농도에 따른 fructose-6-phosphate에 대한 M1PDH의 활성을 확인한 결과이다.
도 6의 a는 glycerol 농도에 따른 mannitol-1-Phosphate에 대한 M1PDH의 활성을 확인한 결과이고, 도 6의 b는 glycerol 농도에 따른 fructose-6-phosphate에 대한 M1PDH의 활성을 확인한 결과이다.
도 7은 고염 및 활성산소(ROS) 스트레스하에서 M1PDH 넉아웃(△M1PDH) SA 및 야생형(WT) SA 생존률을 비교한 결과이다.
도 8의 a는 M1PDH knock-out 돌연변이(△M1PDH) 및 야생형(WT) SA를 macrophage RAW264.7 숙주세포로 처리한 후 숙주세포의 사멸을 caspase 3/7 Gb의 활성도로 확인한 결과이고, 도 8의 b는 같은 조건에서 박테리아의 세포내 생존율(CFU)를 확인한 결과이고, 도8의 c는 박테리아의 세포내 생존율을 콜로니 수로 확인한 결과이다.
도 9의 a는 M1PDH knock-out 돌연변이(△M1PDH) SA 및 야생형(WT) SA의 만니톨 uptake에 대한 assay 결과이고, 도 9의 b는 27 mM 만니톨을 24시간 처리했을 때 세균의 용균정도를 관찰한 결과이다.
도 10의 a는 M1PDH knock-out 돌연변이(△M1PDH) SA 및 야생형(WT) SA를 2.74 mM 만니톨의 존재하에서 대식세포에 감염시킨 후 세균의 생존율을 평가한 결과이고, 도 10의 b는 55 mM 만니톨 존재하에 박테리아 배양액에서 세균의 생존율을 평가한 결과이다.
도 11의 a는 가상 약효 검색법 (virtual screening)을 통하여 선정된 화합물들에 대하여 만니톨 대사 억제효과를 확인한 결과이고, 도 11의 b는 chemical toxicity assay를 통하여 세균성장 저해효과를 확인한 결과이다.
도 12의 a는 화합물 10, 26, 27 및 31(각각 화학식 1, 2, 3 및 4에 대응)의 fructose-6-phosphate 또는 Mtl-1-phosphate의 존재하에서 in vitro M1PDH 효소 어세이를 수행한 결과이고, 도 12의 b는 2.74 mM의 만니톨 존재하에서 대식세포에 세균을 감염시킨 후 각 화합물을 1-200μM로 처리하여 배양한 경우, 세균 생존율을 확인한 결과이다.
도 13의 a는 natural compound library로부터 screening한 결과이고, 도 13의 b는 in vitro assay를 통하여 확보한 화합물(화학식 5)의 M1PDH의 저해 활성을 확인한 결과이다.
도 14의 a는 화학식 5의 화합물을 처리한 경우, 600nm에서 흡광도를 측정하여 세균의 생존률을 확인한 결과이고, 도 14의 b는 450nm에서 흡광도를 측정하여 mammalian cell의 생존률을 확인하여 화학식 5의 화합물이 숙주세포에 직접적인 영향을 주지 않음을 증명한 결과이다.
도 15는 화학식 5의 화합물과 만니톨 병용한 경우, 대식세포 감염모델에서 감염 18시간 후, 대식세포내 SA의 생존률을 평가한 결과이다.

본 발명은 만니톨 대사 저해를 통하여 세균을 용균시켜 사멸하게 하는 신규 항균방법, 항균약물 탐색방법, 및 만니톨 대사 저해제와 만니톨을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물 및 화장료에 관한 것이다.

만니톨은 4개의 유전자로 구성된 만니톨 오페론(mtlA, mtlR, mtlF, mtlD)에 의해 대사된다. 이때, mtlA와 mtlF는 세균외 또는 세균내 만니톨을 인식하고 인산화하는 만니톨 수송 막단백질을 인코딩하고, mtlD는 fructose-6-phosphate와 mannitol-1-phosphate의 가역적인 변환을 일으키는 단백질을 인코딩하고, mtlR는 기능이 밝혀지지 않은 전사인자를 인코딩한다.

하기, 만니톨 대사 경로의 모식도에서 확인할 수 있는 바와 같이, M1PDH는 Mannitol-1-phosphate와 Fructose-6-phophate의 가역적 반응을 촉매한다.

만니톨 대사에 관여하는 효소에는 Mannitol 2-dehydrogenase, Mannitol-1-phosphatase, Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, Mannitol repressor, Mannitol ABC transporter permease, Mannitol-specific PTS enzyme 등이 있으며, 본 발명은 특히, 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH)를 타겟으로 하는 저해제를 이용한 항균 효과를 확인하였다.

우선, M1DPH 단백질을 결정화하여 구조를 분석하였으며, 특히 효소 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인한 후, 돌연변이로 검증하였다.

또한, M1DPH에 대하여 외부 삼투적 스트레스(osmotic stress) 또는 활성산소(ROS)에 따른 Mannitol-1-phosphate 또는 Fructose-6-phosphate 기질에 대한 특이성을 확인하였으며, 이에 근거하여, 고농도 염(14% NaCl) 함유 배지 또는 ROS 환경(무세포 hydroxyl radical 발생 시스템 : H₂O₂ + FeSO₄ + NaI)에서 M1PDH Knock-out 돌연변이를 일으킨 SA의 생존률 감소를 확인하였다.

또한, 만니톨 대사가 블락킹된 경우에도 만니톨은 외부로 분비되지 않고 내부에 축적된다는 것을 확인하였으며, 이에 따라, 균 외부에서 만니톨의 제공과 M1PDH를 저해함으로서, 만니톨 축적에 의한 삼투적 스트레스환경을 조성하고 이에 의하여 세균은 용균되어 사멸하게 되는 바, 항균 효과를 확인 하였다.

또한, docking study에 의한 가상 약효 검색법(Virtual screening) 및 Natural compound library로부터 M1PDH 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하였으며, M1PDH enzymatic assay를 수행하여 그들의 억제 활성을 검증하였다.

그 결과, 본 발명의 M1PDH 저해제는, 6-amino-3-methyl-4-(4-nitrophenyl)-1-phenyl-1,4-dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile, 2-(1-adamantyl)-4-methoxy-6-{[({[2-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonyl}amino)carbonyl]amino}-1,3,5-triazine, 3-amino-2-benzyl-7-nitro-4-(2-quinolyl)-1,2-dihydroisoquinolin-1-one, N-[4-(4-chlorophenoxy)-3-nitrobenzoyl]-N'-[2-(trifluoromethyl)phenyl]urea 및 (2R,4aS,6aS,6aS,14aS,14bR)-10,11-dihydroxy-2,4a,6a,6a,9,14a-hexamethyl-3,4,5,6,8,13,14,14b-octahydro-1H-picene-2-carboxylic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 항균 조성물은 만니톨 대사를 하는 세균에 대하여 항균활성을 가지며, 바람직하게는 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E colii K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 '항균'이란, 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이, 효도 등과 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항균용 조성물은 약학적 조성물로 제조될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 만니톨 및 만니톨 대사 저해제를 유효성분으로 함유하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.01∼1000 ㎎/일, 바람직하게는 1∼500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물에서 만니톨의 양은 바람직하게는 2.74 mM 내지 164mM을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 농도의 최소 용량은 본 명세서의 실시예에서 M1PDH 넉아웃 돌연변이의 경우 2.74 mM 이상의 만니톨이 존재하는 조건에서 용균현상이 발생하는 것에 근거하여 결정하였고, 최고 용량은 현재 임상적으로 사용되고 있는 만니톨의 용량을 기준으로 결정하였다.

만니톨은 체내에서 장시간의 대사를 요하며 혈액 뇌관문을 통과하지 않은 다당류로 혈중에 길게 존재하므로 급성신부전, 뇌부종의 치료에 이용되고 있다. 현재 치료 목적으로 사용되고 있는 만니톨은 보통 1회 체중 Kg당 1~3g을 15%, 20%, 25%액으로 점적 정주하고, 1일 최대량은 200g 까지로 한정 되어 있다. 이와 같이, 현재 다양한 치료제로 이용되고 있는 만니톨과 함께 만니톨 대사 저해제를 병용할 수 있기 때문에 다양한 질환의 복합처방제로도 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항균용 조성물은 화장료 조성물로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유효 성분으로서 만니톨 및 만니톨 저해제를 유효성분으로 함유하며, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및/또는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 만니톨 및 만니톨 저해제를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 화장료 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물은 그대로 첨가되거나 다른 화장료 성분과 함께 사용될 수 있고 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서 만니톨의 양 바람직하게는 2.74 mM 내지 164 mM을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 농도의 최소 용량은 본 명세서의 실시예에서 M1PDH 넉아웃 돌연변이의 경우 2.74 mM 이상의 만니톨이 존재하는 조건에서 용균현상이 발생하는 것에 근거하여 결정하였고, 최고 용량은 현재 임상적으로 사용되고 있는 만니톨의 용량을 기준으로 결정하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 만니톨 대사 효소 저해제와 2.74 mM내지 164 mM의 만니톨을 세균에 처리하는 단계를 포함하는, 만니톨 대사 저해를 통한 항균 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 타겟이 되는 만니톨 대사 효소는 Mannitol 2-dehydrogenase, Mannitol-1-phosphatase, Mannitol ABC transporter permease, mannitol-specific PTS enzyme, 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 체외(in vitro)에서 행해지는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 결정화된 M1PDH의 구조 확인

M1PDH(Mtl-1-phosphate-5-dehydrogenase)의 효소적 메카니즘을 이해하기 위하여 M1PDH를 결정화하였으며, 이 결정으로부터 1.8 Å의 X-선 회절데이타를 얻고 분자치환법을 이용하여 위상문제를 해결하여 상기 효소의 삼차원 구조를 최종적으로 규명하였다. 또한, M1PDH와 pfM2DH (pseudomonas fluorescence mannitol 2-dehydrogenase)의 N-terminal 및 C-terminal domain 및 활성화 자리(active site)의 구조를 비교하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, M1PDH는 단량체로 구성되며, C-termianl domain과 N-terminal domain으로 구분된다. N-terminal domain(residue 1-190)은 핵산 결합 단백질에 전형적으로 나타나는 Rossmainn fold를 형성하며(도 1A), fold의 양 옆면은 5개의 α-helix(α1, α2, α3, α4, α5)구조로 이루어져 있으며, fold의 중앙은 6개의 평행한 β-sheet(β5, β2, β1, β6, β7, β8)(도 1B)로 이루어져 있음을 확인하였다. 또한, C-termianl domain(residue 190-368)은 11개의 α-helix로 이루어져 있음을 확인하였다(도 1C). 이때, C-terminal에는 제 1 sheet(β9, β11, β12)가 연결되어 있고, N-terminal에는 제 2 sheet(β10 β3 β4)가 연결되어 있었다.

실시예 2. M1PDH 활성에 특이적인 잔기(Residue)의 확인

2-1: M1PDH와 pf M2DH의 구조 비교

M1PDH의 효소적 메카니즘 및 활성화 자리(active site)를 탐지하기 위하여, M1PDH와 pfM2DH(pseudomonas fluorescence mannitol 2-dehydrogenase)의 N-terminal 및 C-terminal domain과 활성화 자리 구조를 비교하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, M1PDH와 pfM2DH는 모두 두 개의 β-sheets와 Rossmann folding을 포함하는 유사한 core region을 가지고 있었으나, pfM2DH의 구조와 비교하여 M1PDH의 구조는 외부 helix 구조가 덜 발달하여, domain 간 active site pocket이 더 큰 구조를 이루고 있었다.

2-2: sa M1PDH와 af M2DH의 구조 비교

또한, M1PDH가 SO4^2-와 결합하여 형성된 복합체(saM1PDH) 구조와, pfM2DH가 MtL(만니톨)와 결합하여 형성된 복합체(afM2DH) 구조를 비교함으로써, mannitol-1-phosphate 또는 fructose-6-phosphate 기질에 대한 M1PDH의 특이성을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, saM1PDH 구조에서, SO4^2-는 M1PDH의 R283, R287, R294 잔기에 결합되어 있었는데, 이들 잔기는 afM2DH와 비교하여 M1PDH에 특이적으로 잘 보존된 활성화 부위(conserved active site)에 해당하는 것임을 확인하였다.

실제, mannitol-1-phosphate 또는 fructose-6-phosphate 기질을 M1PDH에 매뉴얼 도킹(mannual docking)시켜본 결과, SO4^2-는 mannitol-1-phosphate 또는 fructose-6-phosphate 기질의 PO4^2-와 잘 오버랩되어 있었다. 따라서, 잔기 R283, R287, R294는 M1PDH의 효소 특이성에 중요한 잔기임을 알 수 있다.

2-3: M1PDH 돌연변이 활성

상기 실시예 2-2의 결과를 더욱 검증하기 위하여, PO4^2- 결합자리에 해당하는 잔기 R283, R287, R294에 대하여 변이를 일으킨 경우, mannitol-1-phosphate에서 fructose-6-phosphate를 생성하는 반응에서 NADH의 생성(도 4의 a) 및 fructose-6-phosphate에서 mannitol-1-phosphate를 생성하는 반응에서 NADH의 소멸(도 4의 b)을 340 nm에서 측정함으로써 M1PDH의 효소활성을 측정하였다.

즉, 야생형 잔기 R283, R287, R294를 R283S, R287S, R294F로 변이시켜 mannitol-1-phosphate 및 fructose-6-phosphate 기질에 대한 효소활성을 분석한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, R283, R287의 잔기에 대하여 변이를 일으킨 M1PDH의 효소활성은 유의적으로 감소하였으며, R294의 잔기에 대하여 변이를 일으킨 M1PDH는 효소활성을 거의 갖지 못하였다. 이로써, M1PDH 효소 활성에 있어서 잔기 R283, R287, R294의 중요성이 명확해졌다.

실시예 3. 외부 스트레스에 따른 M1PDH의 기질 특이성

Staphylococcus aureus(SA)의 게놈 분석 결과, M1PDH는 mannitol-1-phosphate를 fructose-6-phosphate로 전환시키거나, fructose-6-phosphate를 mannitol-1-phosphate로 전환시키는 가역적 반응에 관여하는 유일한 효소임이 알려져 있다. 또한, 만니톨은 세포내에서 합성되거나, 세포외로부터 유입될 수 있는 극성 물질로서, hydroxyl radical을 제거(scavenging)할 수 있는 화합물이다.

이에, 본 실시예에서는, M1PDH가 삼투압과 같은 스트레스에 반응하는 효소로서, 만니톨이 존재하는 환경에서 만니톨 대사에 핵심적인 역할을 할 것이라는 가정하에 다음과 같은 실험을 수행하였다.

즉, M1PDH의 mannitol-1-phosphate 또는 fructose-6-phosphate에 대한 선택적 기질 특이성이 삼투적 스트레스(Osmotic stress) 또는 활성산소(ROS)의 수준에 따라 결정될 수 있다는 점에 근거하여, mannitol-1-phosphate에서 fructose-6-phosphate를 생성하는 반응에서 NADH의 생성(도 5A) 및 fructose-6-phosphate에서 mannitol-1-phosphate를 생성하는 반응에서 NADH의 소멸(도 5B)을 340 nm에서 NADH의 농도를 측정함으로써 삼투적 스트레스를 야기하는 NaCl 또는 Glycerol를 농도별로 처리에 따른 M1PDH의 기질 특이성을 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, mannitol-1-phosphate 를 fructose-6-phosphatefh 바꾸는 M1PDH의 활성(도 5의 a)은 증가한 반면, NaCl 농도가 증가할수록 fructose-6-phosphate를 mannitol-1-phosphate를 바꾸는 M1PDH의 활성(도 5의 b)은 감소하였다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, glycerol 농도가 증가할수록 mannitol-1-phosphate를 fructose-6-phosphate로 바꾸는 M1PDH의 활성(도 6의 a)은 증가한 반면, fructose-6-phosphate를 mannitol-1-phosphate로 바꾸는 M1PDH의 활성(도 6의 b)은 감소하였다.

따라서, M1PDH의 기질 특이성은 삼투적 스트레스에 의하여 조절됨을 알 수 있다. 즉, 고장성(hypertonic) 환경에서는, M1PDH가 mannitol-1-phosphate를 fructose-6-phosphate로 전환시킬 수 있도록 형태가 변화되며, 그 결과 세포내 전체 용질의 농도를 감소시켜 세포의 수분 유입에 의한 용균을 막을 수 있도록 한다. 반대로, 저장성(hypotonic) 환경에서는 M1PDH가 fructose-6-phosphate를 mannitol-1-phosphate로 전환시킬 수 있도록 형태가 변화되며, 그 결과 세포내 전체 용질의 농도를 증가시켜 세포의 수분 손실에 의한 세포 수축을 막을 수 있도록 한다.

실시예 4. M1PDH knock-out 돌연변이에서의 SA 생존률 평가

4-1: 고염 및 활성산소(ROS) 스트레스에서의 생존률

만니톨은 SA에 의해 대사될 뿐만 아니라 세포내에서 합성(글루코스 대사산물)되기도 하지만, 박테리아 내에서의 만니톨의 기능은 명확히 밝혀진 바 없다. 병원성 SA 와 비병원성 staphylococcus는 만니톨을 합성하고 대사하는 능력에 의하여 구분되어지기 때문에, 만니톨을 세포외부로부터 uptake하거나 또는 내부에서 합성하는 것이 세균 감염시 유해성 및 스트레스를 일으키는데 있어서 유사한 작용을 할 것이라는 가정하에, 본 실시예에서는 다음과 같은 실험을 수행하였다.

즉, 만니톨 대사경로에서 핵심적인 효소인 M1PDH를 삽입 돌연변이(insertion mutation)에 의해 넉아웃(knock out)시킴으로써 만니톨의 대사를 저해시켰을 경우, 고농도 염(14% NaCl) 함유 배지 또는 ROS 환경(무세포 hydroxyl radical 발생 시스템 : H₂O₂ + FeSO₄ + NaI)에서의 SA 생존률을 조사하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, M1PDH 유전자가 넉아웃된 돌연변이는 야생형(WT)에 비하여 고염 및 ROS 스트레스 환경에서 모두 만니톨 합성 및 대사가 저해되었음을 확인하였다.

4-2: in vitro 감염시 생존율

세균은 감염시 숙주세포 방어 시스템에 의해 다양한 삼투 및 ROS 스트레스 상황에 처하기 때문에, 감염시 M1PDH knock-out 돌연변이 균주 역시 만니톨 대사 저해로 인하여 생존율이 줄어들 것이라는 가정하에, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

즉, 마우스의 macrophage RAW264.7를 숙주세포로 하여 M1PDH knock-out 돌연변이 SA와 야생형 SA를 감염시킨 후, apoptosis detection kit를 이용하여 숙주세포(RAW264.7) 사망률에 의한 병원성을 평가하고, 세균 생존율을 평가하였다. 숙주세포가 세포사멸 (apoptosis)를 일으킬 때 발현이 증가하는 caspase의 활성을 측정하여 숙주세포의 사멸을 확인하였으며, CFU (colony forming unit)를 통해 세균의 생존 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 야생형(WT)에 비하여 M1PDH knock-out 돌연변이는 caspase 3/7 Gb activity의 활성이 감소하였는데 (도 8의 a), 이는 숙주세포의 사멸이 감소하였음을 의미하며, 세균의 병원성의 감소를 확인하였다. 또한 야생형(WT)에 비하여 M1PDH knock-out 돌연변이는세균의 세포내 생존률이 감소되었음을 확인하였다 (도 8의 b 및 c).

실시예 5. M1PDH knock-out 돌연변이에서의 만니톨 축적에 의한 세균사멸효과

5-1: M1PDH 변이체의 만니톨 축적 확인

만니톨은 균내에서 합성되거나 외부로부터 uptake된다는 것이 알려져 있으나, 만니톨 대사가 블락킹되었을 때 만니톨이 외부로 분비되는지에 대하여는 알려진 바 없기 때문에, 이를 확인하기 위하여, 만니톨을 함유하고 있는 고형배지에 M1PDH 넉아웃 변이를 일으킨 SA와 야생형 SA를 배양하여 만니톨 uptake에 대한 assay를 실시하였다. 즉, 배지에 만니톨을 처리한 후 야생형과 돌연변이 세균내에 만니톨 양을 측정하여서 만니톨 축적정도를 확인하였고 (도 9의 a), 또한 27 mM 만니톨 존재하에서 야생형과 돌연변이의 콜로니 수를 측정함으로써 만니톨이 세균의 생존에 미치는 정도를 측정하였다 (도 9의 b)

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 야생형(WT_SA)과 달리 M1PDH가 넉아웃된 돌연변이 SA는 세균내 만니톨의 양이 계속적으로 증가하였으며, 늦은 정지기(late stationary phase)에 만니톨의 축적에 의한 삼투압적 스트레스에 의하여 세균이 터지는 것을 확인하였다. 이로써 만니톨 대사가 블락킹되어도 만니톨이 외부로 분비되지 않고 내부에 계속 축적된다는 것을 알 수 있었다.

5-2: 만니톨 함유 배지상에서 M1PDH 변이체의 병원성 감소 확인

상기 실시예 5-1의 결과로부터 SA를 사멸시킬 수 있는 tool을 개발하고자, 대식세포 감염모델(macrophage infection model) 및 박테리아 배지에서 각각 만니톨 존재하에 SA의 생존율을 평가하였다. 즉, M1PDH 넉아웃 변이를 일으킨 SA와 야생형 SA를, 2.74 mM 만니톨 존재하에서 대식세포에 감염시킨 경우와, 55mM 만니톨 함유 박테리아 배지에서 키운 경우, 각각 SA의 생존율을 평가하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 넉아웃 SA의 경우, 야생형에 비하여 생존률이 유의적으로 감소하였으며, 이러한 결과는, 균내의 만니톨 대사가 블락킹됨과 동시에 균외부에 만니톨이 제공될 경우에는, 만니톨이 uptake되기는 하지만 대사되지 않고 축적되어 삼투적 스트레스를 야기함으로써, 숙주세포 방어시스템에 의해 결국 균이 터져 죽는다는 것을 알 수 있다.

실시예 6: M1PDH 억제 화합물 스크리닝

6-1: 가상 약효 검색법(virtual screening)

M1PDH 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위하여 docking study에 의한 가상 약효 검색법(virtual screening)을 수행하였다. 가상 약효 검색법이란, 구조 기반 가상 검색 기술(Structure-Based Ligand Design) 중 하나로서 단백질에 결합하여 활성을 조절할 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 말하며, 컴퓨터를 이용하여 대규모 화합물군(chemical library)의 데이터베이스를 표적 수용체에 도킹시켜 스크리닝하는 방법이다.

본 실시예에서는, 1차적으로 이러한 가상 약효 검색법 (virtual screening)을 통하여 상용화된 화합물 라이브러리인 Maybridge chemical library 데이터베이스의 약 6만여종의 화합물을 대상으로 가상검색을 수행함으로써, M1PDH의 활성부위(만니톨 결합부위 및 인산기 결합부위)에 결합력이 우수할 것으로 예측되는 화합물 93종을 선별하였다.

2차적으로는, 이들 화합물에 대하여 만니톨 대사 억제효과를 보이는 선도(hit) 리간드 8종을 발굴하였다(도 11의 a). 세균을 27 mM 만니톨과 페놀레드(phenol red)가 함유된 배지에서 배양하면, 만니톨이 대사되어 fluctose가 생성되면서 배지의 pH가 떨어지게 되어 페놀레드의 색이 노란색으로 변하게 되는 반면, 만니톨 대사가 저해되면 페놀레드의 색변화가 없어 배지의 빨간색이 유지되므로, 이러한 원리를 이용하여 만니톨 대사 저해 효과를 보이는 저해제를 발굴하였다 (도 11의 a).

또한 chemical toxicity assay를 통하여 세균의 성장은 저해하지 않으면서 만니톨 대사만을 저해하는 4종의 화합물 10, 26, 27, 31을 최종 선정하였다 (도 11의 b).

6-2: M1PDH enzymatic assay

상기 실시예 6-1을 통하여 최종 선별된 4종의 화합물에 대하여 M1PDH enzymatic assay를 수행함으로써, 실제 M1PDH 억제 효과를 발휘하는지 최종 확인하였다.

in vitro M1PDH 효소활성을 측정하기 위하여, fructose-6-phosphate와 NADH, 또는 Mtl-1-phosphate와 NAD를 기질로 하여, 340 nm에서의 optical density 변화를 통해 효소활성에 따른 NADH의 농도 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 12의 a에 나타난 바와 같이 실시예 6-1의 4종 화합물(10, 26, 27, 31) 모두 M1PDH 활성을 저해함이 확인되었다.

또한, 숙주세포 내에서의 억제효과를 확인하기 위하여 대식세포 감염모델을 이용하였다. 즉, 대식세포에 만니톨(2.74 mM)을 처리하고, 4종의 화합물 각각 서로 다른 농도로 처리하여 배양한 결과, 도 12의 b에 나타낸 바와 같이, 4종 화합물 모두 세균 생존률을 감소시킴이 확인되었다.

본 실시예를 통하여 M1PDH에 대해서 억제활성 가지는 4종의 화합물(10, 26, 27, 31)은 각각 하기와 같다.

1) 6-amino-3-methyl-4-(4-nitrophenyl)-1-phenyl-1,4-dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile

[화학식 1]

2) 2-(1-adamantyl)-4-methoxy-6-{[({[2-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonyl}amino)carbonyl]amino}-1,3,5-triazine

[화학식 2]

3) 3-amino-2-benzyl-7-nitro-4-(2-quinolyl)-1,2-dihydroisoquinolin-1-one

[화학식 3]

4) N-[4-(4-chlorophenoxy)-3-nitrobenzoyl]-N'-[2-(trifluoromethyl)phenyl]urea

[화학식 4]

6-3: 천연물 라이브러리를 이용한 저해제 탐색

natural compound library (microsource사 800종)를 만니톨을 함유한 배양액내의 세포에 처리하여 만니톨 대사 저해 여부를 확인하여 1차적으로 저해제를 선택한 후, (도 13의 a), 상기 화합물 중 실시예 6-2와 마찬가지로 M1PDH의 활성을 저해하는 화합물 5를 최종 확인하였다 (도 13의 b).

또한, 화합물 5 농도의 변화에 의한 세균 및 mammalian cell의 생존률의 감소(도 14의 a 내지 b)를 확인하였으며, 숙주세포 내에서의 억제효과를 확인하기 위하여 대식세포 감염모델을 이용하여, 화합물 5와 만니톨 병용에 의한 대식세포내 SA 생존률의 감소(도 15)를 확인하였다.

본 실시예를 통하여 M1PDH에 대해서 억제활성 가지는 화합물 5는 하기와 같다.

5) (2R,4aS,6aS,6aS,14aS,14bR)-10,11-dihydroxy-2,4a,6a,6a,9,14a-hexamethyl-3,4,5,6,8,13,14,14b-octahydro-1H-picene-2-carboxylic acid

[화학식 5]

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

체외(in vitro)에서, 만니톨 대사 저해제와 만니톨을 세균에 처리하는 단계를 포함하는, 만니톨 대사경로를 갖는 세균을 살균하는 항균방법으로서,
상기 만니톨 대사 저해제는, 6-amino-3-methyl-4-(4-nitrophenyl)-1-phenyl-1,4-dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile, 2-(1-adamantyl)-4-methoxy-6-[([2-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonylamino)carbonyl]amino-1,3,5-triazine, 3-amino-2-benzyl-7-nitro-4-(2-quinolyl)-1,2-dihydroisoquinolin-1-one, N-[4-(4-chlorophenoxy)-3-nitrobenzoyl]-N'-[2-(trifluoromethyl)phenyl]urea 및 (2R,4aS,6aS,6aS,14aS,14bR)-10,11-dihydroxy-2,4a,6a,6a,9,14a-hexamethyl-3,4,5,6,8,13,14,14b-octahydro-1H-picene-2-carboxylic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항균방법.
제 1 항에 있어서, 상기 만니톨은 55 mM 내지 500 mM 농도로 세균에 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 만니톨 대사경로를 갖는 세균은 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E coli K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
체외(in vitro)에서 만니톨 대사에 관여하는 효소의 활성을 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법으로서,
상기 효소는 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH)인 것을 특징으로 하는, 방법
제 5 항에 있어서, 상기 효소는 과발현시켜 정제된 것이고, 상기 효소활성은 효소의 반응액에 저해제 후보물질을 처리하여 그 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 효소의 반응액은 기질로서 fructose-6-phosphate와 NADH, 또는 Mtl-1-phosphate와 NAD를 포함하고, 상기 효소활성은 340 nm에서 NADH의 optical density를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
만니톨의 존재하에 세균을 배양하면서 세균의 생존율을 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 배양은 55 mM 내지 500 mM의 만니톨이 포함된 배지에서 세균을 배양하고, 상기 생존율 측정은 배양액에 저해제 후보물질을 처리한 후 세균의 CFU(colony forming unit) 또는 OD600에서 세균 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
만니톨의 존재하에 세균을 배양하면서 페놀레드의 색변화를 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 배양은 27 mM 내지 500 mM의 만니톨과 페놀레드가 포함된 배지에서 세균을 배양하고, 상기 색변화 측정은 페놀레드의 붉은색이 유지되는지를 확인하는 방법.
만니톨의 존재하에 세균을 식균세포에 감염시킨 후 세균의 생존율을 측정함으로써 만니톨 대사 저해제를 스크리닝하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 배양은 2.74 mM 내지 164 mM의 만니톨이 포함된 배지에서 세균을 배양하고, 상기 생존율 측정은 배양액에 저해제 후보물질을 처리한 후 세균의 CFU(colony forming unit)를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균은 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E coli K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
만니톨 대사 저해제 및 만니톨을 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물로서, 상기 만니톨 대사 저해제는 6-amino-3-methyl-4-(4-nitrophenyl)-1-phenyl-1,4-dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile, 2-(1-adamantyl)-4-methoxy-6-[([2-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonylamino)carbonyl]amino-1,3,5-triazine, 3-amino-2-benzyl-7-nitro-4-(2-quinolyl)-1,2-dihydroisoquinolin-1-one, N-[4-(4-chlorophenoxy)-3-nitrobenzoyl]-N'-[2-(trifluoromethyl)phenyl]urea 및 (2R,4aS,6aS,6aS,14aS,14bR)-10,11-dihydroxy-2,4a,6a,6a,9,14a-hexamethyl-3,4,5,6,8,13,14,14b-octahydro-1H-picene-2-carboxylic acid로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 세균은 만니톨 대사 경로를 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 만니톨 대사 저해제는 만니톨 대사 효소를 타겟으로 하는 저해제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 만니톨 대사 저해제는 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH) 저해제인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 만니톨 대사 효소를 갖는 세균 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 세균은 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E colii K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 만니톨을 2.74 mM 내지 164 mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
만니톨 대사 저해제 및 만니톨을 유효성분으로 함유하는, 항균 화장료로서, 상기 만니톨 대사 저해제는 6-amino-3-methyl-4-(4-nitrophenyl)-1-phenyl-1,4-dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile, 2-(1-adamantyl)-4-methoxy-6-[([2-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonylamino)carbonyl]amino-1,3,5-triazine, 3-amino-2-benzyl-7-nitro-4-(2-quinolyl)-1,2-dihydroisoquinolin-1-one, N-[4-(4-chlorophenoxy)-3-nitrobenzoyl]-N'-[2-(trifluoromethyl)phenyl]urea 및 (2R,4aS,6aS,6aS,14aS,14bR)-10,11-dihydroxy-2,4a,6a,6a,9,14a-hexamethyl-3,4,5,6,8,13,14,14b-octahydro-1H-picene-2-carboxylic acid로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 세균은 만니톨 대사 경로를 가지는 것을 특징으로 하는, 특징으로 하는, 화장료.
제 23 항에 있어서, 상기 만니톨 대사 저해제는 만니톨 대사 효소를 타겟으로 하는 저해제인 것을 특징으로 하는 화장료.
제 24 항에 있어서, 상기 만니톨 대사 저해제는 1-인산-만니톨탈수소효소(Mannitol-1-phosphate-5-dehydrogenase, M1PDH) 저해제인 것을 특징으로 하는 화장료.
삭제
제 23 항에 있어서, 상기 화장료는 만니톨 대사 효소를 갖는 세균 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료.
제 27 항에 있어서, 상기 세균은 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 하이몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 뮤턴트(Streptococcus mutants), 스트렙토콕쿠스 프네우모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실루스 안트라키스(Bacillus anthracis), 프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프세우도모나스 스툿쩨리(Pseudomonas stutzeri), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pesti), 아이로모나스 살모니키다(Aeromonas salmonicida), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 예르시니아 프세우도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 파스테우렐라 물토키다(Pasteurella multocida), 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 미코플라스마 뉴모니(Mycoplasma pneumonia), 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 대장균 KTE112(E coli KTE112), 대장균 CFT073(E coli CFT073), 대장균 K-12(E coli K-12), 클렙시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumonia), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia Haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료.
제 23 항에 있어서, 상기 화장료는 만니톨을 2.74 mM 내지 164 mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료.