KR101623521B1 - siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양세포 내에서 특정 유전자를 사일런싱하기 위한 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 말단이 티올기로 변형된 폴리-siRNA 사슬; 및 상기 폴리-siRNA 사슬과 이황화 가교결합 및 전하 상호작용에 의해서 결합되는 티올화 젤라틴을 포함하는, siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체는 세포독성 없이, 혈류 내에서 분해되지 않고 우수한 효율성으로 종양세포 내로 흡수될 수 있으며, 전달된 siRNA는 표적 유전자의 사일런싱을 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법 {Gelatin based nanoparticle composite for tumor-targeted delivery of siRNA and method for preparing the same}
본 발명은 종양세포 내에서 특정 유전자를 사일런싱하기 위한 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
유전자 사일런싱 (gene silencing)을 위한 보존된 메커니즘인 RNA 간섭 (RNA interference, RNAi)은 종양을 포함하는 다양한 질병을 치료하기 위해서 강력한 치료적 수단이다. 그러나, 이러한 RNA 간섭을 위해서 소규모 간섭 RNA (small interference RNA, siRNA)를 임상적으로 적용하기에는, siRNA가 안정성이 낮고 세포로 효과적으로 흡수되지 못한다는 점 때문에 그 제약이 있어왔다. 따라서, siRNA 치료법에 있어서 가장 큰 문제점은 siRNA의 전달 효율을 높이는 것이라 할 수 있겠다.
종래 siRNA의 전달 효율을 높이기 위해서 다양한 캐리어들이 개발된 바 있다. 일반적으로, 이러한 siRNA 캐리어로는 강한 양이온성 폴리머 기반의 나노입자들이 널리 고려되어 왔다. 비록 양이온성 폴리머들이 정전기적 상호작용을 통해서 siRNA 분자들에 대해서 강한 친화도를 갖기 때문에 나노입자들을 형성하지만, 결과물인 나노입자들은 대개 높은 독성 및 면역원성을 갖는다. 더욱이, 양이온성 폴리머 기반의 벡터 시스템들은 통상적으로 인 비보에서 낮은 표적 특이성을 나타내는 바, 그 임상적 적용에 한계점이 있다.
최근에, siRNA 전달에 내재된 문제점들을 극복하기 위해서 siRNA 분자들에 대해서 다양한 구조적 변형을 가한 시도들이 있었다. 실제로, siRNA 골격을 적당히 변형하면 유전자 사일런싱 효율을 잃지 않으면서도 그 물리화학적 특성이 개선되어 유전자 캐리어들에 잘 통합되는 것으로 알려져 있다. 점성 siRNA 및 화학적으로 변형된 중합 siRNA (poly-siRNA)와 같은 변형된 siRNA는 상보적 A5-8/T5-8 3' 오버행 또는 화학적 자가-가교결합과 같은 방법을 통해서 siRNA 폴리머를 형성한다. 천연 siRNA와 비교할 때, 변형된 siRNA 폴리머는 다양한 폴리머 캐리어들과 농축된 나노입자들을 형성함으로써, 높은 분자량 및 증가된 전하 밀도에 기반하여, 향상된 전달 효율을 나타낸다. 따라서, 구조적으로 변형된 siRNA는 siRNA 전달을 위한 다양한 선택을 가능하게 하는데, 이러한 siRNA들이 캐리어들에 대해서 더 높은 결합 친화도를 나타내기 때문이다.
단백질들은 일반적으로 다양한 약물들에 대해서 낮은 독성 및 높은 결합 친화도를 나타낸다. 단백질 기반 캐리어들의 수성 입체 장벽 (aqueous steric barrier)으로 인해서, 세망내피계 (reticuloendothelial system, RES)의 클리어런스 현상 수준이 낮고, 이로 인해서 개선된 약물동력학적 특성들이 나타난다. 이러한 관점에서, 천연 단백질들은 안전하고 효과적인 유전자 전달을 달성하기 위한 유망한 유전자 캐리어 물질이다. 특히, 젤라틴 (gelatin)은 siRNA 캐리어로서 경쟁력 있는 후보물질이라고 할 수 있다. 젤라틴은 수많은 관능기들을 갖게끔 용이하게 변형될 수 있고, 콜라겐의 변성된 형태 (denatured form)로서 낮은 세포독성 및 항원성을 나타낸다. 더욱이, 젤라틴은 인 비보 적용을 위해서 큰 잠재력을 보유하는데, 젤라틴 주사는 통상적으로 피하주사로 이루어지지만, 특정 치료 목적을 위해서는 정맥 내로 주사될 수도 있다. 실례로서, 젤라틴 유도체로 구성된 젤라펀딘 (Gelafundin) 및 젤라푸살 (Gelafusal)이 임상적 세팅에서 정맥 내로 투여된 바 있다. 그러나, 천연 젤라틴이 siRNA 캐리어로 사용된 예는 보고된 바가 없는데, 이는 젤라틴과 천연 siRNA가 이루는 느슨한 복합체 구조가 RNAi 기능을 수행하기 이전에 혈류 내에서 쉽게 분해되기 때문이다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 세포독성 없이, 우수한 표적 특이성 및 혈류내 내분해성을 가지고 표적 종양세포에 siRNA를 전달할 수 있는 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위해서,
말단이 티올기로 변형된 폴리-siRNA 사슬; 및
상기 폴리-siRNA 사슬과 이황화 가교결합 및 전하 상호작용에 의해서 결합되는 티올화 젤라틴을 포함하는, siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 티올화 젤라틴은 젤라틴 1몰에 대해서 10 내지 50몰의 시스타민을 반응시킴으로써 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 젤라틴 기반 나노입자 복합체는 상기 폴리-siRNA 사슬 1 중량부에 대해서 상기 티올화 젤라틴 5 내지 20 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 폴리-siRNA는 21 bp 내지 1,000 bp의 염기쌍을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 두 번째 과제를 해결하기 위해서,
상보적 서열을 갖는 siRNA 서열 쌍의 각 가닥의 5' 말단에 티올기를 도입하는 단계;
상기 siRNA 서열 쌍 복수개를 혼합하고 산화시킴으로써 자가-중합된 폴리-siRNA 사슬을 제조하는 단계;
젤라틴에 티올기를 도입함으로써 티올화 젤라틴을 제조하는 단계; 및
상기 폴리-siRNA 사슬과 상기 티올화 젤라틴 나노입자를 반응시키는 단계
를 포함하는, siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 티올화 젤라틴은 젤라틴 1몰에 대해서 10 내지 50몰의 시스타민을 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 젤라틴 기반 나노입자 복합체는 상기 폴리-siRNA 사슬 1 중량부에 대해서 상기 티올화 젤라틴 5 내지 20 중량부를 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체는 세포독성 없이, 혈류 내에서 분해되지 않고 우수한 효율성으로 종양세포 내로 흡수될 수 있으며, 전달된 siRNA는 표적 유전자의 사일런싱을 효과적으로 수행할 수 있다.
도 1a 내지 1d는 본 발명에 따른 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체의 제조방법을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2a 내지 2g는 본 발명에 따른 젤라틴 기반 나노입자 복합체 (psi-tGel NPs)의 물리화학적 특성 분석 결과에 대한 데이터들이다.
도 3a 내지 3b는 psi-tGel NPs의 인 비트로 세포독성 및 세포흡수 평가 결과에 대한 데이터들이다.
도 4a 내지 4c는 psi-tGel NPs의 인 비보 유전자 사일런싱 평가 결과에 대한 데이터들이다.
도 5a 내지 5d는 psi-tGel NPs의 생체분포를 평가하기 위한 NIFR 영상화 결과 데이터들이다.
도 6a 내지 6d는 종양 보유 마우스에 있어서 psi(RFP)-tGel NPs를 투여하였을 경우 관찰되는 인 비보 유전자 사일런싱 평가 결과에 대한 데이터들이다.
본 발명에서는 생체적합성이 우수한 젤라틴을 사용하여 생체 내로 siRNA를 전달하기 위한 새로운 siRNA 전달 시스템을 제공하고자 한다. 따라서, 본 발명에 따른 siRNA 전달 시스템은 젤라틴 및 siRNA를 포함하는 나노복합체의 형태를 가지며, 젤라틴과 siRNA의 결합 친화도를 증가시키기 위해서 각각의 분자들에 티올기를 도입하였다. 결과물로 생성된 티올화 젤라틴 (tGel)은 자가-가교결합을 통해서 젤라틴 나노입자를 형성하게 되며, 5' 말단에 티올기가 도입된 siRNA 역시 자가-중합을 통해서 폴리-siRNA를 형성하게 된다. 이어서, 상기 티올화 젤라틴과 폴리-siRNA를 반응시키게 되면, 폴리-siRNA가 밀집된 티올화 젤라틴 나노입자와 함께 복합체를 형성하게 된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 젤라틴 기반 나노입자 복합체는, 말단이 티올기로 변형된 폴리-siRNA 사슬; 및 상기 폴리-siRNA 사슬과 이황화 가교결합 및 전하 상호작용에 의해서 결합되는 티올화 젤라틴을 포함한다.
한편, 젤라틴의 티올화를 위해서는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 시스타민 등과 같은 적당한 티올화제를 사용할 수 있으며, 젤라틴의 티올화도는 젤라틴과 반응하는 시스타민의 몰 수에 변화를 줌으로써 조절가능하다. 바람직하게는, 상기 젤라틴의 몰수에 비해서 10배 내지 50배 과량 몰수의 시스타민을 반응시킬 수 있는데, 시스타민의 몰수가 낮아서 젤라틴의 티올화도가 낮은 경우에는 폴리-siRNA 사슬과 젤라틴이 완전히 복합체를 형성할 수 없다는 문제점이 있고, 이와는 반대로 젤라틴의 티올화도가 과도한 경우에는 폴리-siRNA와의 반응 이전에 스스로 큰 마이크로 사이즈의 침전으로 조립되는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
또한, 하기 실시예로부터도 알 수 있는 바와 같이, 티올화 젤라틴과 폴리-siRNA 사슬의 반응 중량비 역시 젤라틴 기반 나노입자 복합체 형성에 영향을 미치는 바, 상기 젤라틴 기반 나노입자 복합체는 상기 폴리-siRNA 사슬 1 중량부에 대해서 상기 티올화 젤라틴 5 내지 20 중량부를 포함하는 것이 바람직하다. 전술한 바와 마찬가지로, 상기 티올화 젤라틴의 상대적 중량비가 낮은 경우에는 폴리-siRNA 사슬을 젤라틴을 사용하여 완전한 복합체를 형성할 수 없다는 문제점이 있고, 이와는 반대로 상대적 중량비가 너무 높은 경우에는 폴리-siRNA의 봉입 효율이 낮아지는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 젤라틴 기반 나노입자 복합체에 있어서, 티올화 젤라틴과 복합체를 형성하는 폴리-siRNA는 세포내 환원성 환경 하에서는 모노-siRNA로 분해될 수 있다. 따라서, 다양한 길이의 폴리-siRNA가 젤라틴 기반 나노입자 복합체 내에 포함될 수 있으며, 대략 21 bp 내지 1,000 bp의 염기쌍을 갖는 것들이 포함될 수 있다.
한편, 본 발명은 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체의 제조방법을 제공하며, 하기 도 1a 내지 도 1d에는 본 발명에 따른 방법에 대한 개략적인 과정을 도시하였다. 도면을 참조하면, 본 발명에 따른 방법은, 상보적 서열을 갖는 siRNA 서열 쌍의 각 가닥의 5' 말단에 티올기를 도입하는 단계; 상기 siRNA 서열 쌍 복수개를 혼합하고 산화시킴으로써 자가-중합된 폴리-siRNA 사슬을 제조하는 단계; 젤라틴에 티올기를 도입함으로써 티올화 젤라틴을 제조하는 단계; 및 상기 폴리-siRNA 사슬과 상기 티올화 젤라틴 나노입자를 반응시키는 단계를 포함한다. 최종적으로 제조된 젤라틴 기반 나노입자 복합체는 표적 종양 세포에 투입됨으로써 RNAi 메카니즘에 의해서 특정 유전자의 사일런싱 효과를 달성하게 된다.
하기 실시예로부터도 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리-siRNA-티올화 젤라틴 나노입자 (psi-tGel NPs)에 대해서 물리화학적 특성, 효소 분해에 대한 내성, 환원성, 유전자 전달 특성, 인 비보 생체 분포, 인 비보 유전자 사일런싱 효과 등에 대해서 평가한 결과, 본 발명에 따른 psi-tGel NPs는 siRNA를 종양특이적으로 세포에 전달할 수 있는 것으로 판단되었다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
원료 및 시약
B 타입 젤라틴 (225 bloom, MW=40-50 KDa), 시스타민디하이드로클로라이드 (cystaminedihydrochloride), 1,4-디티오쓰레이톨 (1,4-dithiothreitol, DTT), N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-에탄술폰산 (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid, HEPES), 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)은 Sigma사 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 형광염료인 FlammaFluor-FPR675 (FPR675) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 이소머는 각각 DKC사 (Seoul, Korea) 및 Sigma사로부터 구입하였다. 무 RNase 증류수 및 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000)은 Invitrogen사 (Carlsbad, CA)로부터 구입하였다. PCR 시약들은 Qiagen사 (Valencia, CA)로부터 구입하였다.
유전자 억제를 가시화하기 위한 적색 형광 단백질-표적 siRNA (Red fluorescence protein, RFP-targeted siRNA)의 5' 말단에 티올기를 도입하여 어닐링함으로써 자가 중합체를 형성하였다: 센스 서열, 5'-UGUAGAUGGACUUGAACUCdTdT-3', 및 안티센스 서열, 5'-GAGUUCAAG UCCAUCUACAdTdT-3'. 음대조군용으로서, siRNA의 스크램블 서열을 제조하였다: 센스 서열, 5'-UGAAGUUGCACUUGAAGUCdTdT-3', 및 안티센스 서열, 5'-GACUUCAAGUGCAACUUCAdTdT-3'.
중합된 siRNA ( 폴리 - siRNA )의 합성
2가지 다른 siRNA (1 mg, 0.076 μmol) 서열들을, 센스 및 안티센스 서열들의 5' 말단들에서 티올기로 변형시킴으로써 자가-중합된 siRNA 폴리머를 합성하였다. 초순수 중의 티올기가 도입된 siRNA 분자들을 DTT와 혼합함으로써 자유 티올기들을 노출시켰다. 용액을 실온에서 1시간 동안 서서히 볼텍스한 다음, Nap-10 탈염 컬럼 (GE Healthcare,Piscataway, NJ)을 사용하여 정제하고, 동결건조시켰다. 동결건조된 술프히드릴기가 노출된 siRNA 분자들을 온건한 산화 조건 하의 HEPES 완충용액 (10 mM, pH 8.0) 중에서 자가중합시켰다. 결과물인 폴리-siRNA를 8% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기영동시켜서 폴리-siRNA의 분자 분포를 확인하였다. 젤을 에티듐 브로마이드로 3분 동안 염색하고 Gel Imaging System (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel)을 사용하여 가시화하였다. 폴리-siRNA 각각의 밴드 분획을 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 준정량함으로써 폴리-siRNA의 크기 분포를 확인하였다. 폴리-siRNA의 환원성은 DTT 처리 (10 mM, 5 시간) 이후에 폴리-siRNA 10 ㎍을 젤 전기영동시킴으로써 분석하였다.
신규 siRNA 캐리어로서 티올 -변형된 젤라틴 ( tGel )의 합성
자가-가교결합된 젤라틴 나노입자를 제조하기 위해서 티올기를 도입함으로써 젤라틴을 관능화하였으며, 이에 의해서 폴리-siRNA와 복합체를 형성하였다. tGel은 젤라틴의 카르복실산기를 공유결합에 의해서 변형시킴으로써 합성하였다. 간단히 요약하면, 100 mg의 젤라틴을 10ml의 인산 완충용액 중에 용해시키고, 10배, 20배 및 50배 과량 몰의 시스타민과 함께 배양하였다 (각각 tGel10, tGel20, 및 tGel50). 시스타민 (5 mg/ml 인산 완충용액, 변화량)을 젤라틴 (100 mg/10 ml)에 서서히 가하고, 1.5 과량 몰의 EDC (5 mg/ml 인산 완충용액)를 용액 중에서 시스타민에 혼합하였다. 혼합 용액을 실온에서 2시간 동안 서서히 교반하고, 최종 용출은 탈염 컬럼 (PD-10 desalting column; GE Healthcare)을 사용하여 DEPC로 수행하였다. 이황화 결합을 환원시키기 위해서, 각 반응 혼합물들을 5 mg의 DTT와 함께 30분 동안 배양하였고, 이어서 PD-10 컬럼을 사용하여 젤 여과를 통해서 다시 정제하였다. 정제된 티올화 젤라틴을 사용 이전에 동결건조하였다.
폴리 - siRNA - 티올화 젤라틴 나노입자의 제조 및 특성화
폴리-siRNA-를 보유한 tGel 나노입자 (psi-tGel NPs)를 제조하기 위해서, 폴리-siRNA (1 ㎍/1 ㎕ HEPES 완충용액)를 중량비 5 내지 20의 범위로 각각의 tGel10, tGel20, 및 tGel50와 혼합하였다. 당량의 폴리-siRNA를 비티올화 젤라틴과 반응시킴으로써 폴리-siRNA와 천연 젤라틴과의 결합 친화도를 측정하였다. 모든 샘플들은 서서히 볼텍싱하면서 24 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 복합체의 형성은 먼저 젤 저지 분석 (gel retardation assay)를 통하여 확인하였으며, 다양한 psi-tGel NPs의 크기 분포를 동적 광산란 (dynamic light scattering)을 사용하여 633 nm 및 25℃에서 관찰하였다 (DLS, Spectra Physics Laser Model 127-35). 나노입자들의 모폴로지는 TEM (CM 200 전자현미경, Philips)으로 관찰하였으며, 나노입자들은 2 중량%의 수성 우라닐 아세테이트를 사용하여 음으로 염색되었다.
psi-tGel NPs가 기능성 모노머 siRNA 분자들을 방출할 수 있는지 확인하기 위해서, 결과물인 psi-tGel 복합체를 환원제로 처리하였다. 각각의 psi-tGel10, psi-tGel20, 및 psi-tGel50를 37℃에서 5 시간 동안 10 mM의 DTT 중에서 배양하였다. psi-tGel NPs의 안정성은 혈청 조건 중에서 최적화된 psi-tGel NPs를 사용하여 조사하였다. 당량의 단독 폴리-siRNA, 폴리-siRNA-젤라틴 혼합물, 및 psi-tGel NPs를 50% 쥐 혈청을 함유하는 PBS 중에서, 37℃로 0 내지 48 시간 동안 배양하였다. 배양 이후에, DTT를 처리하여 이황화결합들을 절단함으로써 21 염기쌍들을 갖는 나머지 RNA 분자들과 비교하였다.
psi - tGel NPs 의 세포 흡수
경북대학교 (Daegu, South Korea)로부터 입수한 쥐과 흑색종 세포들 (B16F10) 및 RFP-발현 B16/F10 세포들을 본 실시예에서 사용하였다. psi-tTF NPs의 세포독성은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석법을 사용하여 평가하였다. B16F10 세포들 (96-웰 플레이트 중의 5.0×103 세포들)을 7.3125 내지 250.0 ㎍/mL의 다양한 농도의 psi-tGel NPs에 48시간 동안 노출시켰다. psi-tGel 제제는 31.25 nM 내지 1 μM의 폴리-siRNA를 포함하였으며, 형질감염 (transfection)에 대한 tGel 캐리어의 세포독성을 상업적 시약들의 세포독성과 비교하기 위해서, 당량의 폴리-siRNA를 포함하는 폴리-siRNA-리포펙타민 제제 (psi-LF)를 또한 처리하였다. 20 μL의 MTT 용액을 처리한 후에, 570 nm에서의 광학적 흡광도 차이를 측정함으로써 세포 생존도를 측정하였다.
psi-tGel NPs의 세포 흡수는 형광 염료 표지된 나노입자들로 처리한 후에 쥐 흑색종 세포들 (B16F10) 중에서 가시화하였다. 형광 염료 표지된 나노입자들은 FITC-표지된 tGel 및 FPR675-표지된 폴리-siRNA를 사용하여 제조하였다. FITC (0.2 mg, 0.6 μmol)는 물/DMSO (1:1 v/v, 5 ml) 조건 하에서 3시간 동안 반응시킴으로써 젤라틴 (20 mg, 0.08 μmol)에 화학적으로 결합하였다. 미반응된 분자들은 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 제거하였으며, 티올화 변형시켰다. 또한, 1 mg의 폴리-siRNA를 제조자 사용법에 따라서 적외선 형광 염료 (NIRF)인 FPR675 (0.2 mg, 0.6 μmol)로 표지하였다. B16F10 세포들 (1.0×105 세포들/35 mm 커버 글래스 바닥 배양 플레이트)을 이중-형광 표지된 psi-tGel NPs (5 ㎍/ml)에 2시간 동안 노출시켰다. 세포들을 인산 완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS)로 2회 세척하고, 포름알데히드-글루타르알데히드 조합 고정제를 사용하여 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포들을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 사용하여 핵염색시킨 다음, 공초점 레이저 주사 현미경 (LSM 510 META NLO, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 관찰하였다.
psi - tGel NPs 의 인 비트로 유전자 사일런싱
RFP/B16F10 세포들 중에서 유전자 사일런싱 효과를 가시화하였다. RFP/B16F10 세포들은 2.0×105/웰의 농도로 6-웰 플레이트 중에서 배양하였으며, 형질감염시키기 이전에 무혈청 형질감염 배지 중에서 1시간 동안 안정화시켰다. 세포들을 단독 RFP 폴리-siRNA, 스크램블된 폴리-siRNA-tGel50 (psi(sc)-tGel), psi(RFP)-tGel20, 및 psi(RFP)-tGel50로 각각 4시간 동안 처리하였다. 폴리-siRNA의 최종 농도는 100 nM로 조정하였다. 배양 24시간 경과 후, 세포들에서의 RFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다 (IX81-ZDC, Olympus, Japan). 또한, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하여 유전자 발현을 정량적으로 분석하였다. 전장 RNA를 RNeasyMini kit (Qiagen)를 사용하여 세포들로부터 추출한 다음 MultiScribe Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 cDNA 내로 역전사시켰다. 프라이머를 사용하여, PCR 중의 RFP 서열들 (순방향: 5'-GGCTGCTTCATCTACAAGGT-3T 및 역방향: 5A-GCGTCCACGTAGTAGTAGCC-3s)이 245 염기쌍의 표적 앰플리콘을 생산하였다. RFP mRNA의 상대적 발현 수준을 β-액틴 mRNA에 대해서 정규화하였으며, β-액틴에 대한 프라이머는 하기와 같다: 순방향, 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3', 및 역방향, 5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'). 증폭은 25 사이클 동안 수행하였으며, PCR 산물들은 2% 아가로오스 젤 상에서 분리하였다.
psi - tGel NP 가 주사된 종양 보유 마우스에 대한 인 비보 및 엑스 비보 NIRF 영상화
모든 동물 실험들은 관계 법령 및 한국과학기술연구원의 원내 지침에 부합하도록 수행하였다. 멜라닌 안료 및 B16F10 세포들의 RFP에 의한 형광 간섭을 방지하기 위해서, 편평세포암종 (SCC-7) 종양을 보유한 마우스를 제조하여 최적화된 psi-tGel NPs의 인 비보 생체분포를 모니터링하였다. SCC-7 세포들 (1.0×106 세포들/헤드) 수컷 무흉선 누드 마우스 (n=6, Oriental Bio Inc., Seoul, Korea)에 피하주사로 주입하였다. 접종 14일 경과 후에, FPR675-표지된 폴리-siRNA 또는 FPR675-표지된 psi-tGel50을 폴리-siRNA/헤드의 50 ㎍ 상당 투여량으로 마우스에 정맥 주사하였다. eXploreOptix 시스템 (Advanced Research Technologies, Montreal, Canada)을 사용하여 24 시간 동안 실시간 인 비보로 FPR675의 형광을 모니터링하였다. 각 종양 영역에서의 형광 강도는 Analysis Workstation 소프트웨어 (ART Advanced Research Technologies, Montreal, Canada)의 관심 영역 (region of interest, ROI) 함수를 사용하여 계산하였다. 마우스는 주사 후 24 시간이 경과한 시점에서 안락사시켰으며, 절개된 종양 및 내부 장기들의 FPR675 형광을 12-비트 CCD 카메라 (Image Station 4000 MM; Kodak, New Haven, CT)를 사용하여 관찰하였다.
RFP /B16F10 종양 보유 마우스에서 psi - tGel NPs 의 인 비보 유전자 사일런 싱
psi-tGel NPs의 인 비보 유전자 사일런싱을 RFP/B16F10 종양 보유 마우스에서 가시화하였다. RFP/B16F10 종양 보유 마우스 (n=9) 또한 RFP/B16F10 세포들 (1.0×106 세포들/헤드)을 무흉선 누드 마우스에 피하주사로 접종시킴으로써 제조하였다. 마우스들은 종양 부피가 65 mm3에 이르게 되면 3개의 종양-RFP 매칭된 그룹으로 분류하였다. 각 그룹에서의 마우스들에는 psi(sc)-tGel50, psi(RFP)-tGel50 (40㎍ 폴리-siRNA/헤드), 및 식염수를 각각 투여하였다. psi-tGel NPs 및 식염수는 0일째, 2일째 및 4일째에 정맥주사로 투여하였다. RFP 발현에 대한 종양 형광의 변화를 5일 동안 모니터링하였으며, 모든 마우스들은 안락사시켜서 종양 조직들을 분리한 다음 절개된 종양들의 형광 강도를 비교하였다. 또한, 전장 RNA를 RNeasyPlusMini kit (Qiagen)를 사용하여 종양 조직들로부터 추출하였고, 역전사 효소 PCR (RT-PCR)을 수행하여 RFP 유전자 발현을 준정량적으로 분석하였다. 체중 변화 및 행동 비정상을 모니터링함으로써 체계적 독성의 표지 및 징후를 관찰하였다. 실험 이후에, 주된 내장 기관들에 대한 조직학 검사 역시 수행하였다.
통계
대조군 쌍들 및 psi-tGelNPs-처리된 군들에 대해서 Student's t-test를 사용하여, 세포 생존성의 차이, 종양에서의 형광 강도, 및 상대적 종양 RFP 발현을 분석하였다. 0.05 미만의 Ap -수치를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 모든 통계적 분석들은 소프트웨어 SPSS (version 11.0, SPSS, Chicago, IL)를 사용하여 수행하였다.
결과 및 검토
psi - tGelNPs 의 합성 및 특성화
도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 siRNA 전달을 위한 젤라틴계 나노입자들을 제조하였다. 먼저, siRNA의 5'-말단 티올-변형된 센스 및 안티-센스 siRNA 가닥들을 사용하여 폴리-siRNA를 합성하였다 (도 1d 참조). 티올-변형된 siRNA 분자들은 이황화결합을 통해서 자가-중합되었다. 둘째로, 시스타민을 사용하여 천연 젤라틴을 또한 변형시켰다 (도 1b 참조). 폴리-siRNA 및 tGel은 이황화 가교결합 반응 및 부분적 전하 상호작용에 의해서 psi-tGel 접합체를 형성할 것으로 예상되었다. 평균적으로, 젤라틴은 8%의 아르기닌, 4%의 라이신, 및 1%의 히스티딘을 포함하며, 이들은 양으로 대전된 아미노산 잔기들이고, 증가된 음이온성 전하 밀도를 갖는 폴리-siRNA는 이러한 아미노산 잔기들과 상호작용한다. tGel 및 폴리-siRNA 상의 티올기들이 더욱 가교결합에 기여하여 psi-tGel NPs를 형성한다 (도 1c). 이러한 psi-tGel NPs가 증가된 투과 및 보유 (enhanced permeation and retention, EPR) 효과를 가지고 종양 부위들에 위치할 수 있게 되며, 종양 세포 세포질에서 기능성 모노머 siRNA 분자들을 방출한다 (도 1d).
합성된 폴리-siRNA는 8% 폴리아크릴아미드 젤 중에서 사다리형 패턴을 보이는데, 이는 siRNA 폴리머들의 분자량 분포를 나타낸다 (도 2a 참조). 폴리-siRNA의 분자량 분포는 21 bp 내지 1,000 bp였다. 폴리-siRNA에 대한 각각의 밴드 분획을 정량적으로 분석하였으며, 그 결과 폴리-siRNA 분자들의 52.8%가 200 bp 이상이었다. 평균적으로, 폴리-siRNA는 통상적인 모노머 siRNA에 비해서 1개의 분자 당 약 8배 더 많은 음이온성 전하를 나타내었다. 비록 siRNA 분자들이 성공적으로 자가-중합되어 더 높은 분자량 및 전하 밀도를 나타내었지만, 폴리-siRNA 및 천연 젤라틴의 결합 친화도는 충분치 않은 관계로 미결합된 siRNA 분자들이 젤 저지 분석 (gel retardation assay)에서 관찰되었다 (도 2b). 그러므로, 본 발명에서는 젤라틴을 티올기로 화학적으로 변형시켜서 폴리-siRNA와의 결합 친화도를 향상시켰다. tGels는 10-, 20-, 및 50-배 몰 과량의 시스타민을 접합시킴으로써 용이하게 합성하였으며, 그 결과 각각 tGel10, tGel20, 및 tGel50을 제조하였다. 결과물인 tGel 폴리머들을 폴리-siRNA와 함께 배양하였으며, 자가 조립시켰다. 폴리-siRNA는 중량비 1:5, 1:10 및 1:20에서는 tGel10NPs 내에 완전히 복합체를 형성하지 않았으며,tGel에 미결합된 siRNA 분자들이 젤 저지 분석에서 관찰되었다 (도 2c). psi-tGel20 또한 1:5 및 1:10 중량비에서 미결합된 siRNA를 나타내었으며, 이는 불완전한 복합체의 형성을 의미하는 것이다. 이와는 대조적으로, 1:20 중량비에서는 모든 폴리-siRNA가 tGel20에 접합되었다 (conjugated). psi-tGel50 또한 1:5 내지 1:20 중량비에서 전체 siRNA 분자들과 복합체를 형성하였다.
폴리-siRNA/천연 젤라틴 복합체 (psi-Gel) 및 psi-tGel들의 입자 크기로부터 또한 tGel50이 psi-tGel NPs을 구축하기에 가장 적합하다는 사실을 알 수 있었다. 1:20 중량비에서, psi-tGel50 나노입자들은 입자 직경 145 nm에서 뚜렷한 피크를 나타내었다. 그러나, psi-Gel, psi-tGel10, 및 psi-tGel20은 10 nm 및 150 nm의 두 가지 입자 크기 분포를 나타내었다 (도 2d). TEM 영상들에서, 천연 젤라틴은 12.3 nm의 비정질 과립으로 관찰되었다 (도 2e). 이와는 대조적으로, psi-tGel 나노입자들은 약 200 nm의 평균 입경을 갖는 콤팩트 구형 구조를 나타내었다 (도 2d). 특히, 결과물인 psi-tGel50 나노입자들은 뚜렷하고 균일한 나노입자 구조를 나타내었다. 따라서, 상기 실시예로부터, 폴리-siRNA 및 tGel50 접합체들은 자발적으로 가교결합되어 밀집된 형태의 psi-tGel50 나노입자들을 형성하고, 결과적으로 psi-tGel NPs를 형성하는 것을 알 수 있다. 또한, 그 특성을 알아보기 위해서, 이하 실시예에서는 psi-tGel20 및 psi-tGel50의 최적화된 중량비로서 1:20을 선택하였다.
기능성 siRNA를 성공적으로 전달하기 위해서, psi-tGel NPs는 산화 조건 하에서 가역적으로 분해되어야 한다. 본 발명자들에 의한 이전 연구에서, 이황화 가교결합에 의해서 합성된 폴리-siRNA가 환원제의 존재 하에서 모노-siRNA로 분해될 수 있다는 사실이 밝혀진 바 있다. 더욱이, 세포질 내의 글루타치온은 일반적으로 이황화 결합의 불안정화를 야기하고 티올 접합된 나노입자들의 분해를 야기한다. 동물 세포들은 세포질 내에 높은 수준의 글루타치온을 포함하므로 (5-10 mM), 세포내 조건을 모방하여 psi-tGel NPs를 환원시키기 위해서 10 mM의 DTT를 처리하였다. 10 mM의 DTT 처리 이후에, 다량의 21 bp siRNA 분자들이 폴리아크릴아미드 젤 중에서 관찰되었다 (도 2f). 이는 폴리-siRNA 및 psi-tGel NPs 중의 이황화결합들이 세포질과 같은 환원성 환경 중에서 가역적으로 환원되어 기능성 siRNA 분자들을 방출할 수 있다는 것을 의미한다. 더 나아가, psi-tGelNPs는 제제화된 siRNA 분자들이 뉴클레아제에 의해서 분해되지 않도록 보호한다. 대부분의 단독 폴리-siRNA는 배양 30분 이내에 분해된 반면에, 21 bp를 갖는 다량의 siRNA 분자들은 psi-tGel NPs 내에서 24 시간까지 잔류하였다 (도 2g). 이러한 데이터들은 psi-tGel NP 형성에 의해서, 폴리-siRNA가 나노입자들과 성공적으로 복합체를 형성하기 때문에 뉴클레아제에 대한 siRNA 분자들의 안정성이 향상되었다는 것을 의미한다. 그러므로, psi-tGel NPs는 표적 부위에서 세포 흡수되어 유전자 사일런싱을 위한 기능성 siRNA를 전달하기 이전에 혈류 내에서 안정하다.
psi - tGel NPs 의 세포 독성 및 세포 흡수
siRNA 캐리어들의 독성으로 인해서 종종 siRNA의 임상적 적용에 제한이 따른다. 상업적 리포좀계 시약인 리포펙타민 (Lipofectamine)은 유전자 형질감염용으로서 가장 널리 사용되어 왔다. 비록 리포펙타민이 만족스러운 형질감염 효율을 나타내지만, 리포좀 자체는 일차 세포들 (primary cells)을 포함하는 특정 세포들에 대해서 독성을 나타낸다. 젤라틴이 상대적으로 비독성인 것으로 기대되며, tGel NPs의 세포 독성을 리포펙타민 내에 제제화된 폴리-siRNA (psi-LF)의 세포 독성과, 균등한 투여량의 siRNA 형질감염 조건 하에서 비교하였다. psi-tGel NPs의 세포 독성을 결정하기 위해서, B16F10에서 MTT 분석을 수행하였다. psi-LF는 >12.7 ㎍/mL psi-LF (> 200 nM siRNA가 포함된 제제) 농도에서 MTT 분석 결과 상당한 독성을 나타내었다. psi-LF의 경우, 200, 500, 및 1,000 nM siRNA 형질감염 투여량에서, 세포 생존률이 76.4%, 54.0%, 및 24.2%였다. 이와는 대조적으로, 동일한 투여량에서 psi-tGel NPs의 세포 생존률은 100% (도 3a)에 근접하였다. psi-tGel은 1 μM siRNA를 포함하는 250 ㎍/mL 농도에서 그다지 큰 독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 psi-tGel NPs가, 중성 전하 및 천연 폴리머 기반의 특성들로 인해서, 높은 형질감염 투여량에서도 낮은 세포 독성을 나타낸다는 것을 의미한다. 이러한 결과들은 기존에 이미 보고된 바 있는 인 비트로 형질감염을 위한 티올화 젤라틴계 플라스미드 DNA 전달 벡터 시스템과 유사한 것이다. 상기 결과는 또한 tGels가 생적합성을 지니고 유전자를 전달하기 위한 캐리어 시스템으로서 큰 잠재력을 갖는다는 것을 의미한다.
세포 독성 테스트 결과에 기초하여, 세포 흡수 테스트를 위한 psi-tGel NPs의 폴리-siRNA 농도는 62.5 nM siRNA (31.25 ㎍/ mL의 psi-tGel NPs)로 고정하였다. 이러한 농도에서, FPR675-표지된 폴리-siRNA 단독 (적색)은 NIRF를 거의 나타내지 않았으며, 이는 세포 내로 거의 흡수되지 않는다는 것을 의미한다. 그러나, 이중 표지된 psi-tGel20 및 psi-tGel50 NPs는 뚜렷한 형광을 나타내었으며, psi-tGel NPs의 세포내 전달이 이루어졌다 (도 3b). 폴리-siRNA 및 tGel의 적색 및 녹색 반점들은 세포질 전체에 퍼져 있었으며, 주로 함께 위치하였다. psi-tGel50 NPs는 psi-tGel20 NPs보다 강한 형광 신호를 나타내었는 바, 효과적으로 세포 흡수가 이루어졌다는 것을 의미한다. 밀집된 NP 구조들은 psi-tGel50 NPs가 더욱 우수하게 세포로 흡수되는데 있어서 중요한 역할을 담당한다.
psi - tGel NPs 의 인 비트로 유전자 사일런싱
인 비트로 유전자 사일런싱을 RFP/B16F10 세포들에서 가시화하였다. 폴리-siRNA (RFP) 단독 및 psi(sc)-tGel50-처리된 세포들은 RFP 발현으로 강한 적색 형광을 나타내었다. 이와는 대조적으로, psi(RFP)-tGel20 및 psi(RFP)-tGel50-처리된 세포들은 명백히 감소된 RFP 발현을 나타내었다 (도 4a). 특히, psi(RFP)-tGel50은 psi(RFP)-tGel20보다 더욱 효과적인 RFP 사일런싱을 유도하였다. 이는 psi(RFP)-tGel50가 더욱 효과적으로 세포 내로 흡수되는 것과 관련이 있다. RFP mRNA의 정량 분석을 위해서, 세포로부터 전장 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. 세포내 RFP mRNA의 수준은 관찰된 RFP 형광과 밀접한 관련성이 있었다 (도 4b). 폴리-siRNA(RFP) 단독 및 psi(sc)-tGel50-처리된 세포들은 대조군 RFP/B16F10 세포들에 비해서 RFP mRNA 수준에 있어서 유의성 있는 차이점을 보여주지 않았다. 그러나, RFP mRNA 수준은 psi(RFP)-tGel-처리된 세포들에서 현저하게 감소하였고, psi(RFP)-tGel50은 psi(RFP)-tGel20 보다 더욱 우수한 표적 유전자 사일런싱 효과를 보여주었다 (도 4c) 이러한 결과들은 psi-tGel NPs의 기능성 siRNA가 세포 내로 전달되었다는 것을 확인해 주는 것이다. psi-tGel NPs 내의 전달된 폴리-siRNA 분자들은 세포질에서 이황화결합이 절단됨으로써 모노-siRNA로 성공적으로 환원되며, siRNA는 RFP/B16F10 세포들에서 표적 유전자 억제를 유도하였다. psi-tGel NPs는 인 비트로에서 효과적인 siRNA 전달을 일으키며, 젤라틴을 siRNA 캐리어로서 사용할 수 있는 가능성이 확인되었다.
psi - tGel NPs 의 인 비보 분포
psi-tGel NPs는 나노 크기의 구조를 갖는 것으로 나타났으며, EPR 효과에 의해서 종양에 축적되는 것으로 추측된다. 인 비트로 세포 흡수 및 유전자 사일런싱에 대한 결과에 기초해서, psi-tGel50 NPs를 사용하여 인 비보 특성을 조사하였다. FPR675-표지된 폴리-siRNA는 폴리-siRNA 단독 및 psi-tGel NPs의 인 비보 약물동태학을 모니터링하기 위해서 제조하였으며, 주사 이후에 비침습적 전신 NIRF 영상화를 수행하였다. 종양 내 NIRF는 FPR675-표지된 폴리-siRNA가 단독으로 주사된 마우스에서는 그다지 증가하지 않았으나, psi-tGel NP-주사된 마우스에서는 높은 종양 NIRF 강도가 관찰되었으며, 이는 psi-tGel NPs가 종양에 축적된다는 것을 의미한다 (도 5a). 종양 부위에서의 형광은 주사 후 6시간까지는 점진적으로 증가하였으며, 종양 NIRF 강도는 폴리-siRNA가 단독으로 주사된 군에 비해서 psi-tGel NP가 주사된 군에서 2.8배 더 높았다 (도 5b).
psi-tGel 주사된 군에서, 절제된 종양은 간, 폐, 비장, 신장 및 심장에서보다 더 강한 형광을 나타내었다 (도 5c). 이러한 결과는 psi-tGel NPs가 종양 표적화되어 siRNA를 전달하기 때문이다 (도 5d). 다른 나노입자들이 비슷한 ㅋ크기 분포를 나타내는 것을 고려할 때, psi-tGel NPs의 이러한 종양 축적 특성은 EPR 효과로 인한 것이다. 비록 혈관 결함이 다양한 종양들에서 일관적이지는 않았지만, 종양 혈관은 증가된 모세혈관 투과성을 갖기 때문에, 일반적으로 50-200 nm 크기 범위의 나노입자들이 투과되는 것을 가능하게 한다. 따라서, psi-tGel NPs가 종양에 축적되는 것은 그 입자 직경이 145 nm이기 때문일 수도 있다. 더욱이, psi-tGel NP가 주사된 마우스의 신장에서 상대적으로 낮은 NIRF 강도가 기록되었는 바, 이러한 사실은 psi-tGel NPs가 폴리-siRNA 단독보다 혈액 내에서 더욱 오래 순환한다는 것을 암시한다. 더 긴 혈액내 순환 역시 표적 부위에서 psi-tGel NPs가 축적되는데 기여한다.
psi - tGel NPs 의 인 비보 유전자 사일런싱
psi(RFP)-tGel NPs의 인 비보 유전자 사일런싱에 대한 증거를 제공하기 위해서, 살아있는 RFP/B16F10 종양 보유 마우스에서 종양 형광 영상들을 5일 동안 비침습적으로 모니터링하였다. 종양에서의 형광 강도는 RFP-매칭된 마우스들의 그룹에서 상대적으로 평가하였다. psi(sc)-tGel NP-주사된 마우스들은 대조군 마우스들에 비해서 종양에서 강한 RFP 형광을 보유하였다. 이와는 대조적으로, psi(RFP)-tGel NP-주사된 군은 주사 2일 경과 시점에서 현저한 RFP 형광의 감소가 관찰되었다 (도 6a). 절개된 종양들에서, psi(RFP)-tGel NPs의 RFP 사일런싱은 더욱 명확하게 관찰되었다 (도 5b). 이러한 결과들은 psi-tGel NPs의 종양 표적화 siRNA 전달 및 그에 따른 표적 유전자 사일런싱에 대한 결정적인 증거이다. RT-PCR은 psi(RFP)-tGel NP-주사된 군의 종양 RFP가 mRNA 수준에서 현저하게 감소되었다는 것을 확인해 주었다. psi(sc)-tGel NP-처리된 군의 종양들은 PCR 산물 중에 비슷한 수준의 RFP mRNA를 보여주었지만, psi(RFP)-tGel NP-처리된 마우스들은 종양에서 단지 20.4%의 RFP mRNA를 보여주었다 (도 6c). psi-tGel NPs는 종양에 기능성 siRNA 분자들을 전달할 수 있으며, 서열특이적인 RNA 간섭 메카니즘을 통해서 표적 유전자를 억제할 수 있다. 종양 축적 및 효과적인 세포 흡수 특성에 기초해서, psi-tGel NPs는 성공적인 종양 표적화된 siRNA 전달 효과를 나타낸다.
또한, psi-tGel NPs는 안전할 것으로 예상되는데, 이는 천연 폴리머들은 일반적으로 우수한 생체적합성을 갖기 때문이다. 본 발명에서는 마지막으로 psi-tGel NPs의 생체적합성을 확인하였다. psi-tGel NPs의 체계적 독성을 평가하기 위해서, 생체 기관들의 행동 변화 및 조직병리학을 psi-tGel NP-주사된 마우스들에서 면밀히 모니터링하였다. psi-tGel NPs가 주입된 이후에 어떠한 현저한 행동 이상도 관찰되지 않았다. psi-tGel NPs의 주사는 급작사 또는 쇼크-관련된 반응들을 야기하지 않았다. 조직병리학 검사 결과, 생체 기관들에서 어떠한 뚜렷한 출혈, 경색, 또는 괴사도 관찰되지 않았다 (도 6d). psi-tGel NP-주사된 마우스들에서 심각한 전신적 독성에 대한 어떠한 뚜렷한 징후 및 조직병리학적 병변도 관찰되지 않았으며, 이로부터 psi-tGel NPs가 전신적 독성 없이 종양 표적화된 siRNA 전달을 가능케한다는 사실을 알 수 있었다.
상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는 젤라틴 나노캐리어를 사용하여 새로운 종양 표적화 siRNA 전달을 구현할 수 있다. 천연 젤라틴은 그 결합 친화도가 낮기 때문에 siRNA 분자들과 거의 상호작용하지 않기 때문에, 젤라틴의 일차 아민과 siRNA의 5'-말단이 티올화되었다. 최적화된 조건 하에서, tGel은 자발적으로 나노입자를 형성하여 폴리-siRNA 분자들과 복합체를 형성하며, 결과물인 psi-tGel NPs는 siRNA 분자들을 효소적 분해로부터 보호하였다. 기능성 모노머 siRNA는 환원성 환경 하에서 나노입자들로부터 분리되며, psi-tGel NPs는 세포질로 효과적으로 전달되어 표적 RFP 유전자의 발현을 억제하였다. psi-tGel NPs는 EPR 효과에 기반하여 우수한 종양 축적성을 나타내었으며, 정맥 주사에 의해서 종양 내에서 효과적인 표적 유전자의 사일런싱을 야기하였다. 더 나아가, psi-tGel NP-주사된 마우스들에서는 체계적 독성에 대한 어떠한 현저한 징후도 관찰되지 않았다. 체계적 siRNA 전달을 위한 psi-tGel NPs의 장점은 그들이 종양 표적화 전달특성을 갖는다는 사실 뿐만 아니라, 독성이 낮다는 점에서도 기인한다. 그러므로, 본 발명은 siRNA 전달을 위한 안전하고 효과적인 시스템으로서 psi-tGel NPs의 우수한 잠재력을 보여주며, 이러한 psi-tGel NPs는 인 비보 항암 치료에도 적용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 말단이 티올기로 변형된 폴리-siRNA 사슬; 및
    상기 폴리-siRNA 사슬과 이황화 가교결합에 의해서 결합되는 티올화 젤라틴을 포함하며,
    상기 티올화 젤라틴은 젤라틴 1몰에 대해서 10 내지 50몰의 시스타민을 반응시킴으로써 제조되고, 상기 폴리-siRNA 사슬 1 중량부에 대해서 상기 티올화 젤라틴 5 내지 20 중량부를 포함하고,
    상기 폴리-siRNA는 21 bp 내지 1,000 bp의 염기쌍을 가지되, 상기 폴리-siRNA 분자의 52.8%가 200 bp이상인 것을 특징으로 하는 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 상보적 서열을 갖는 siRNA 서열 쌍의 각 가닥의 5' 말단에 티올기를 도입하는 단계;
    상기 siRNA 서열 쌍 복수개를 혼합하고 산화시킴으로써 자가-중합되어 21 bp 내지 1,000 bp의 염기쌍을 가지되, 폴리-siRNA 분자의 52.8%가 200 bp이상인 폴리-siRNA 사슬을 제조하는 단계;
    젤라틴에 티올기를 도입함으로써 티올화 젤라틴을 제조하는 단계; 및
    상기 폴리-siRNA 사슬과 상기 티올화 젤라틴 나노입자를 반응시키는 단계를 포함하며,
    상기 티올화 젤라틴은 젤라틴 1몰에 대해서 10 내지 50몰의 시스타민을 반응시킴으로써 제조되고, 상기 폴리-siRNA 사슬 1 중량부에 대해서 상기 티올화 젤라틴 5 내지 20 중량부를 반응시키는 것을 특징으로 하는 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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