KR101613422B1

KR101613422B1 - 아미노산을 포함하는 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법

Info

Publication number: KR101613422B1
Application number: KR1020130164169A
Authority: KR
Inventors: 강창모; 윤현진; 김소라
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2016-04-19
Also published as: KR20150075826A

Abstract

본 발명은 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사람의 섬유아세포에서 방사선 피폭에 의해 증가 되는 아미노산을 바이오마커로 사용하며, 이를 이용한 방사선 피폭 진단키트를 제공한다.
또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료의 아미노산 바이오마커와 정상 대조군에서 분리된 아미노산 바이오마커의 증가량 비교를 통한 진단방법을 제공함으로써, 피폭 의심 환자의 피폭 여부 및 피폭 정도를 빠르고 효율적으로 진단하여 방사선 피폭 환자에 대한 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

Description

아미노산을 포함하는 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법{Biomarker composition for diagnosing radiation exposure comprising amino acid and method for diagnosing using the biomarker}

본 발명은 방사선 피폭 진단용 아미노산 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 방사선 피폭 시 그 양이 변화하는 아미노산 바이오마커 조성물과 상기 바이오마커 조성물을 이용하여 방사선 피폭 여부를 분별할 수 있는 방사선 피폭 진단방법 및 상기 바이오마커 조성물을 이용한 키트에 관한 것이다.

방사선 이용 및 원자력 에너지를 기반으로 한 산업구조가 획기적으로 변화함에 따라 국내 방사선 및 원자력 산업의 경쟁력 유지와 지속적 성장을 위하여 계속적인 기술 개발은 필수적이다.

이러한 방사선 및 원자력 산업의 확충과 함께 방사선 관련 종사자들의 의료복지 증진과 의료대책 수립 또한 시급한 실정으로 비파괴업체의 안전사고 및 원전사고 시 반드시 방사선 피폭 여부 및 피폭 환자에 대한 신속하고 효율적인 진료대책, 의료기술 개발 확립이 피폭 환자에 대한 치료 증진 및 부작용을 감소시킬 수 있다.

암에 대한 방사선 치료 분야에서 사용하는 생체 내 바이오마커는 주로 종양 반응에 초점을 맞추고 있었으나 최근에는 방사선 조사에 의한 간접적인 위험성, 치료 단계에서의 효과 및 손상예측, 치료 부작용 관련 독성을 진단하는 등 방사선에 의한 정상 조직 관련 마커 발굴로 관심이 집중되고 있다.

또한 암 치료를 위한 방사선 치료에서 나타나는 부작용인 방사선에 의한 정상조직의 손상과 같은 심각한 부작용은 방사선 치료 기기 관련 산업의 위축 및 방사선 치료 선량의 한계를 가져오며, 완치율을 저하시키게 된다.

최근 방사선 치료 기술의 발달에 따라 방사선 치료를 받은 암환자의 생존율은 높아진 반면, 방사선 피폭에 따른 다양한 부작용으로 인한 암 환자의 삶의 질 저하는 큰 문제로 제기되고 있다. 따라서, 피폭 여부 및 정도를 판단할 수 있는 신속하고 효율적인 진료대책, 의료기술 개발의 확립이 환자의 치료 증진 및 부작용을 감소시킬 수 있는 비교 분석 기술의 개발이 필요한데 이는 방사선 피폭환자의 피폭선량에 따라 이들의 예후가 다르며 치료방법의 선택도 다르기 때문이며 정확하고 신속한 피폭선량 측정 방법의 개발은 환자의 생명을 좌우될 수 있기 때문이다.

또한, 선량측정법이 확립되면 방사선 피폭에 의한 인체장해 정도를 예측하여 피폭환자의 효율적인 관리 및 치료를 계획할 수 있으며, 방사선 피폭에 의한 2차 암발생과 기형 발현을 최대한 경감시킬 수 있다.

최근까지는 방사선 피폭사고로 인한 피폭환자의 피폭선량 측정은 통상의 염색체 이상(conventional chromosome aberration)을 이용하고 있으며, 염색체 이상법은 말초혈액의 임파구를 배양하여 임파구내에 형성된 염색체 이상인 이동원체(dicentrics)의 발생빈도를 광학현미경 관찰을 통하여 피폭된 선량을 측정하는 것으로 보고된 바 있으며, 생체내(in vivo) 결과와 시험관내(in vitro) 결과가 거의 동일하게 나타나 말초 혈액내 임파구를 시험관내에서 실험 분석하고 이 결과를 실제 상황에서 이용할 수 있는 장점이 있었다.

그러나 염색체 이상법에서는 임파구를 배양하여 임파구내에 형성된 염색체 이상인 이동원체(dicentrics)와 환(ring)의 발생빈도의 광학현미경 관찰을 통해 피폭선량을 측정하는데, 이러한 피폭선량 측정은 전문가들만이 할 수 있으며, 많은 시간과 고도의 기술이 필요할 뿐만 아니라, 고선량의 방사선에 피폭된 환자의 말초 혈액내 생존 임파구의 수가 급격하게 줄어들기 때문에 더욱 선량지표로 이용하기 불가능한 문제가 있다.

그러므로 상기 문제점을 보완할 수 있는 대체방법의 개발이 시급하지만 이에 대해 아직까지 구체적으로 확립된 바가 없다.

한국등록특허 제10-1270761호 공보

상기 문제점을 해결하고자 본 발명은 방사선 피폭 여부를 진단할 수 있는 아미노산 바이오마커 조성물과 그 바이오마커 조성물을 이용하여 피폭 여부와 방사선 선량에 따른 피폭 정도를 확인할 수 있는 진단키트 및 진단방법을 제공하며, 방사선 피폭 여부에 필요한 정보를 제공하기 위한 바이오마커 검출방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 아미노산을 포함하는 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

다른 구체예로 아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 아미노산을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트를 제공한다.

또 다른 구체예로 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 아미노산의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 아미노산의 증가량을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 방사선 피폭 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 혈액, 소변 또는 생검조직으로부터 얻어질 수 있다.

상기 방사선 피폭 진단방법에 사용되는 아미노산은 아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

본 발명은 방사선 피폭 여부를 진단할 수 있는 바이오마커 조성물과 이를 이용한 키트 및 방사선 피폭 진단방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 본 발명은 방사선 피폭에 따라 증가한 아미노산을 바이오마커로 이용하여 생물학적 시료의 아미노산 증가량과 비교함으로써 방사선 피폭의 우려가 있는 사람에게서 방사선 피폭 여부와 피폭 정도를 기존의 방사선 피폭 진단방법보다 효율적이고 빠르게 진단할 수 있게 함으로써, 방사선 피폭 환자에게 신속하고 적절한 치료를 제공할 수 있다.

도 1은 사람 섬유아세포에 1Gy의 방사선을 조사한 후 시간대 별로 측정한 사람 섬유아세포의 아미노산 바이오마커의 증가량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 사람 섬유아세포에 5Gy의 방사선을 조사한 후 시간대 별로 측정한 사람 섬유아세포의 아미노산 바이오마커의 증가량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 아미노산을 포함하는 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

보다 상세하게는 상기 생물학적 시료의 아미노산 수준은 예를 들어 질량분석법, 광흡수분석법, 기체크로마토그래피 및 발광분광분석법을 이용한 정량분석을 이용하여 확인할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 섬유아세포에 1Gy 또는 5Gy의 방사선 선량을 조사하고 48시간 후 섬유아세포에서 분리한 아미노산 변화량을 정상섬유아세포에서 분리한 아미노산량과 비교한 결과, 표 1 및 도 1과 같이 1Gy 방사선에 피폭된 섬유아세포의 아미노산은 정상섬유아세포와 비교하여 유의적으로 30 내지 89%의 증가가 확인되었으며 표 2 및 도 2와 같이 5Gy 방사선에 피폭된 섬유아세포의 아미노산은 정상섬유아세포와 비교하여 28 내지 121%의 증가를 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 섬유아세포의 아미노산 바이오마커 조성물의 증가량 측정을 통하여 방사선 피폭 여부 및 피폭 정도를 기존의 진단방법보다 효율적이며 빠르게 진단할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 세포주 배양

사람 정상섬유아세포(HDF: Primary Human dermal fibloblast cell)를 Young Science (Korea)에서 구입한 후 DMEM 기본 배지에 56℃에서 30분간 불활성화시킨 10% 태아소혈청(FBS)와 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, Gibco, USA)을 첨가하여 배양하였다.

또한 모든 배양은 5% CO₂ 와 섭씨 37℃의 온도가 유지되는 100% 습윤 배양기에서 실시되었으며, 계대 배양은 1:4의 비율로 실시하였다.

< 실시예 2> 방사선 조사

사람 정상섬유아세포를 100 mm 배양 접시에 분주하고, 안정화시키기 위하여 37℃, CO₂ 배양기에서 하룻밤 동안 배양한 후 방사선을 조사하였다.

방사선 선원은 Cs-137 γ선으로 고선량 방사선 조사기(Gamma Cell 3000, 2.73 Gy/min)를 이용하여 1Gy 및 5Gy를 각각 조사하였으며 방사선 조사 후 5% CO₂ 와 섭씨 37℃의 온도가 유지되는 100% 습윤 배양기에서 24, 48 및 72 시간 동안 배양 후 각각의 세포를 수확하였다.

그리고, 72시간 동안 배양한 세포에 대해서는 방사선 조사 후 24시간 후에 1:2 또는 1:3으로 계대 배양을 한번 시행하였다.

< 실시예 3> 세포 수확

각각의 목적 시간까지 배양 후 100 mm 배양 접시의 배양액을 제거하고 인산완충용액(PBS) 7㎖로 2회 반복 세척하고 세척 후 트립신 이디티에이(Trypsin-EDTA)를 1㎖ 처리하여 세포를 분리하고 10㎖ 인산완충용액(PBS)을 첨가하여 15㎖ 튜브(Greiner bio-one, Germany)에 옮겨 담아 2,000rpm으로 10분간 2회 원심분리하였다.

원심분리된 세포 침전물이 들어있는 튜브에 인산완충용액 1㎖을 첨가하여 세포를 현탁시킨 후 1.5㎖ 튜브(Eppendorf, Germany)로 옮기고 10㎕ 세포액을 사용하여 TC20 자동 세포계수기(BIO-RAD, USA)로 세포 수를 측정하였다.

< 실시예 4> 아미노산 추출 및 분석 전처리

상기 세포액을 1.5㎖ 튜브(Eppendorf, Germany)에 넣고 4℃, 500×g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 세포에 증류수 500㎕을 넣고 유리알갱이(glass bead, 직경 150~212 μm, Sigma-Aldrich) 200 mg이 들어있는 2㎖ 튜브로 옮겨 티슈라이져(TissueLyserⅡ, QIAGEN, Germany)를 사용하여 1초당 30회 진동 조건으로 4분간 세포를 파쇄하였다.

파쇄된 세포가 들어있는 2㎖ 튜브를 4℃, 8,000×g에서 5분간 원심분리 후 새로운 1.5㎖ 튜브(Eppendorf, Germany)에 상층액 400㎕를 옮겨 담고 그 중 10㎕를 사용하여 단백질 양을 측정하였다. 단백질 측정은 브레드포드 (BIO-RAD, USA) 500㎕에 시료 10㎕를 섞은 후 100㎕를 96 well 플레이트에 옮겨 담아 ELISA 리더기를 사용하여 595nm에서 OD값을 측정하고 BSA(Sigma. USA)를 이용하여 정량하였다.

상기 세포 패쇄 상층액이 들어 있는 1.5㎖ 튜브에 정량보정을 위하여, 일정량의 표준액(I.S.: internal standard)인 메틸 4-하이드록시벤조네이트(MW : 152.15)를 넣어 혼합하고 13,000×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 보관하였다. 또한 상기 1.5㎖ 튜브 하단에 남이 있는 침전물에 80% 메탄올 1㎖를 첨가하여 혼합하고 13,000×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 상기 보관된 상층액 튜브에 넣어 혼합하였다.

상기 과정을 반복하여 분석액을 모았으며 그렇게 모인 분석용 용액을 4,000×g로 20분간 원심분리한 후 상층액을 동결 건조하였다.

상기 동결 건조된 시료에 250㎕의 50% 메탄올을 첨가하고 필터한 후 시료 500㎕를 분석용 용기에 옮겨 담았다.

< 실시예 5> 아미노산 매스 ( MASS ) 분석

아미노산 분석장비는 UPLC-ESI-QTOF-MASS (Acqurity UPLC system-Waters Corp, Milford. MA / TripleTOF 5600 System-AB SCIEX, Framingham, MA)를 이용하였으며, 컬럼은 ACQUITY UPLC HSS T3 컬럼(2.1 mm X 30 mm, 1.8μm , 100Å)을 사용하였다.

이동상(Mobile phase)의 Elute A는 0.1 포름산이 첨가된 물을 사용하였으며, Elute B는 0.1 포름산이 첨가된 아세토나이트릴을 이용하여 0.35 mL/min 컬럼 유속(Column flow rate)으로 측정하였다.

또한 주입량(Injection volume)은 5㎕이었으며, 유지시간(Retention time)을 21분으로 하였다. 컬럼 온도는 40℃였으며, 이온화 모드(Ionization mode)로는 양성(Positive) 및 음성(Negative)을 함께 진행하였다.

분무기 가스(Nebulizer Gas)단위는 50 arbitrary unit이었으며, 가스커튼(Curtain Gas)의 단위는 30 arbitrary unit이었다.

소스 온도(Source temperature)는 500℃였으며, 이온스프레이 부유 전압(Ionspray Floationg Voltage)은 4.5kV(음성 -4.5kV)이었으며, DP(declustering potential)는 90 arbitrary unit, 매스 범위(Mass range)는 50-1200 m/z였다.

매스의 정확도는 automated calibrant delivery system (AB SCIEX, Framingham, MA)를 이용하여 보정하였으며, 캘리브레이션(calibration)은 분석 실험 시작 전과 물질의 이온화 극성이 변할 때 마다 측정하였다.

MS/MS 스펙트라는 Analyst TF software(Framingham, MA)의 IDA function (IDA LC-MS/MS Analysis)을 통하여 얻었으며, 매스 범위는 50-1200 m/z였다.

< 실시예 6> 아미노산 데이터 분석 및 바이오마커 확인

분석된 스펙트라(spectra)를 이용하여 m/z(mass-to-charge ratio)와 RT(retention time) 그리고 동정(identification)에 대한 정보를 얻기 위하여 MZmine 2.10 프로그램을 사용하였다.

Data set 필터링은 Crop 필터 방식(RT 0.5-19 min)이며, Scan by scan 필터링은 Savitzky-Golay 필터 방식(5 datapoint)이며, 기준선보정(Baseline correction)은 크로마토그램 타입(TIC)이며, Mass 분석은 Centroid (Noise level 1.0E2)이며, FTMS sholder 피크 필터는 Mass resolution(10,000)이며, Chromatogram Builder는 m/z tolerance(5.0ppm), Min time spam(0.05min) 이며, Smoothing은 Filter with(5)이며, 크로마토그램 디콘볼루션(Chromatogram deconvolution)은 local minimum search Algorithm(Chromatographic threshold(85.0%)) 이며, Isotope peaks grouper는 m/z tolerance(7.0ppm), RT tolerance(0.5min) 이며, 정렬(Alignment)는 Join aligner(m/z tolerance 7.0ppm, RT tolerance 0.5min) 이며, 필터링은 Peak list rows 필터(minimum peak in a row 3) 이며, Gap-filing은 Peak finder 이며, 표준화(Normalization)는 Linear normalizer이었다.

데이터 보정(normalization)은 MZmine에서 얻은 데이터를 시료 전처리 단계에 넣어준 표준액(I.S.)으로 다시 한 번 더 보정시켜 준 후, 각각의 시료의 단백질 농도로 보정하였다.

Multivariate data analysis는 보정된 데이터를 SIMCA-P+ software v12.0 으로 PCA 분석하였다.

후보 아미노산 바이오마커의 선택은 MZmine에서 얻은 데이터에서 상대표준오차(RSD) 20% 이내의 구성요소들을 분류한 뒤, 이들 중에 온라인 데이터베이스 조사를 통하여 MS/MS 피크가 일치한 표 1 내지 표 2의 구성요소들을 최종 바이오마커로 선택하였다.

방사선 비피폭군 대비 방사선 1Gy 피폭군의 증가 정도(표본수=10)

바이오마커	비피폭 대조군	1Gy-48h	1Gy-72h
아르기닌	100	112	112
글루탐산	100	152^＊＊＊	189^＊＊＊
페닐알라닌	100	130^＊＊＊	131^＊＊＊
트립토판	100	141^＊＊＊	156^＊＊＊
크레아틴	100	134^＊＊＊	140^＊＊＊
p<0.05, p<0.01, **p<0.001

방사선 비피폭군 대비 방사선 5Gy 피폭군의 증가 정도(표본수=10)

바이오마커	비피폭 대조군	1Gy-48h	1Gy-72h
아르기닌	100	138^＊＊＊	133^＊＊＊
글루탐산	100	221^＊＊＊	160^＊＊＊
페닐알라닌	100	140^＊＊＊	141^＊＊＊
트립토판	100	153^＊＊＊	169^＊＊＊
크레아틴	100	161^＊＊＊	128^＊＊＊
p<0.05, p<0.01, **p<0.001

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴을 모두 검출하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물.
아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴을 모두 검출하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트.
검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 아르기닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 트립토판 및 크레아틴의 증가량을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 방사선 피폭 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 소변 또는 생검조직으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방사선 피폭 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
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