KR101612885B1

KR101612885B1 - 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 프로모터 상의 메틸화 검출방법 및 dna 메틸화에 의한 후성유전학적 변이의 검지 및 추적방법

Info

Publication number: KR101612885B1
Application number: KR1020140036071A
Authority: KR
Inventors: 심상준; 원훙안; 마흥의
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2016-04-26
Also published as: KR20150112273A

Abstract

본 발명은 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 프로모터 상의 메틸화 검출 방법 및 DNA 메틸화에 의한 후성유전학적 변이의 검지 및 추적방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용하여 프로모터 상의 CpG 부위의 메틸화 유무 검출 및 메틸화 정량 방법뿐만 아니라 CpG 부위 메틸화에 따른 전사인자 입체장애 및 후성유전학적 매개 전사억제를 평가하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 프로모터의 메틸화 분석방법은 바이설페이트 처리와 같은 전처리 과정없이 바로 CpG 부위의 메틸화 여부 및 갯수를 측정할 수 있고, p53 프로모터의 메틸화 여부 및 과발현된 MBD2를 동시에 측정할 수 있어, 초기 암 진단에 적용 및 응용할 수 있다. 또한, 프로모터의 메틸화에 따른 전사활성변화를 측정할 수 있으므로, 후성유전학적 매개 변이에 따른 전사활성을 추적 및 평가할 수 있다.

Description

나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 프로모터 상의 메틸화 검출방법 및 DNA 메틸화에 의한 후성유전학적 변이의 검지 및 추적방법{Methods for Detection Methylation on Promoter and Methods for Detection and Tracking Epigenetics Alterations by DNA methylation Using Nanoplasmonic Biosensor}

본 발명은 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 프로모터 상의 메틸화 검출 방법 및 DNA 메틸화에 의한 후성유전학적 변이의 검지 및 추적방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용하여 프로모터 상의 CpG 부위의 메틸화 유무 검출 및 메틸화 정량 방법뿐만 아니라 CpG 부위 메틸화에 따른 전사인자 입체장애 및 후성유전학적 매개 전사억제를 평가하는 방법에 관한 것이다.

수많은 질병들이 유전자 이상에 의하여 발생하고, 유전자 이상의 가장 빈번한 형태가 유전자 코드 서열의 변화이다. 이러한 유전자 변화를 돌연변이라고 한다. 어떠한 유전자에 돌연변이가 있으면, 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 구조 및 기능이 변화하고, 이상 및 절단이 발생하며, 이러한 변이된 단백질은 질병을 일으킨다. 그러나, 특정 유전자에 변이가 없어도, 상기 유전자의 발현에 이상이 생겨 병을 유발할 수 있다.

전형적인 예가 유전자 전사조절부위, 예를 들면, CpG 섬의 사이토신 염기 부위에 메틸 그룹이 부착되는 메틸화이다. 이를 후생유전학적(epigenetic) 변화라고 하며, 돌연변이와 비슷한 방식으로 자손 세포에 전이되고, 예를 들면, 대응하는 단백질의 발현이 소실되는 것과 같은 동일한 효과를 나타낸다. 암 세포의 경우, 종양 억제 유전자의 발현이 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의하여 억제되고, 이러한 억제된 발현은 암을 유발하는 중요한 메카니즘의 하나로 인식되고 있다 (Robertson, K. and Jones, P., Carcinogen, 21, 461, 2000). 실제로 전립선암, 결장암, 자궁암, 유방암 등 다양한 암 세포에서 CpG 섬에서의 비정상적인 메틸화/탈메틸화가 보고되었으며, 이들이 암 형성 초기에 중요한 역할을 하고 있다는 점이 밝혀지고 있어서 DNA 메틸화 경향이 유력한 암 조기진단의 마커로서 주목받고 있다.

따라서, 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 이는 암의 진단 및 조기진단, 발암 위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다. 이를 메틸화 특이 PCR(이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있으며 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al ., Cancer Res ., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al ., Cancer Res ., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al ., Gastroenterol .,119:1219, 2000).

특히, 종양 억제 유전자로 알려진 p53의 프로모터는 TATA box 및 CpG 섬(CpG island)를 제외하고, 전사시작 위치 및 네 곳의 전사인자(transcription factor; TF) 결합부분(AP1, NF-kB, YY1, c-Myc)을 포함하는 213bp의 기본적 프로모터 활성 부위에 낮은 밀도로 CpG 서열이 포함되어 있다 (A. Ventura, et al ., Nature., 445:661, 2007; C. C. Harris and M. Hollstein, N Engl J Med.,329:1318, 1993). 상기 낮은 밀도로 존재하는 CpG 부위가 불규칙적으로 메틸화되면(methylated CpG; mCpG) MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2)가 결합하여 전사억제를 유발하게 된다 (W. Dai et al ., Clin Cancer Res, 15:5788, 2013; A. Chatagnon, et al ., Epigenetic, 11:1295, 2011). 전사조절 레벨에서 최소변이 조절지역의 메틸화는 p53 유전자의 전사를 불활성화시키는데 중요한 기능을 수행하며, MBD2는 중요한 전사억제인자 및 잠재적 종양 바이오마커로, 생체내 및 생체 외에서 CpG 주변에 인접한 A/T서열에 관계없이 p53 프로모터(dsp53) 상의 단일 mCpG 또는 모든 mCpG 부분에 효율적으로 결합하고, MBD2가 결합함에 따라, 입체장애가 발생하여 전사가 억제되는 것으로 알려져 있다 (Y.M Omar et al ., Mol Cancer Res, 9:1152, 2011; E. Ballestar et al ., The EMBO J.. 23: 6335, 2003). 또한, 실제 샘플 내에서 메틸화된 p53 프로모터(mdsp53) 및 과발현된 MBD2가 모두 존재하면, 종양 형성 시작과 관련된 생물학적 현상이 관찰되므로, p53 프로모터 및 MBD2 둘 다 바이오마커로 진단테스트에 적용이 가능하다.

하지만, 최근의 메틸화 검출 방법의 진보에도 불구하고 샘플 내에서 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2를 동시에 검출할 수 있으며, MBD2에 의한 전사인자의 입체 장애 관찰 및 후성유전학적 매개 전사억제의 추적 또는 평가할 수 있는 다중 검출 플랫폼의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 최근 바이오센서의 기술은 표지물질을 사용하지 않는 비표지 측정기술 개발에 초점이 맞추어져 있으며, 대표적으로는 금속 표면에서 발생하는 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 방법(R. Q. DUAN et al ., Neoplasma , 59(3):348, 2012; Wei Zhou et al ., International Journal of Nanomedicine , 6:381, 2011), 3차원 미세 구조물인 캔틸버러의 휨 현상에 의한 빛의 굴절률 변화를 측정하는 방법(Balle, MK. et al ., Ultramicroscopy, 82;1, 2000), 생체분자의 질량 변화에 따른 수정 크리스탈의 공명주파수 변화를 측정하는 방법(Marx, KA., Biomacromolecules, 4;1099, 2003), 반도체 공정에 기반을 둔 전기장 효과를 측정하는 방법(Yuqing, M. et al ., Biotechnol . Adv ., 21;527, 2003) 및 전기화학적 측정 방법(Hanahan, G. et al ., J. Environ . Monit ., 6; 657, 2004; Sang Hee Han et al., Analytica Chimica Acta , 665:79, 2010) 등이 있다.

그 중 국소 표면 플라즈몬 공명(Localized surface plasmon resonance: LSPR) 방법은 복잡한 사전 정제 및 표지화 공정 없이 정량적으로 반응을 감지할 수 있기 때문에, 표면에 고정된 생체분자 사이의 상호작용에 관한 많은 연구에서 다양하게 사용되어 왔다. LSPR 방법은 금속 나노입자와 같이 국소적인 표면이 존재하는 재료에 다양한 파장을 갖는 빛을 조사하면 벌크 금속과는 달리 금속 나노입자 표면에 분극이 발생하게 되고 전기장의 강도를 중대하는 특이한 성질을 보인다. 이러한 LSPR 광학특성은 나노입자 근처에서 발생하는 유전율(굴절율) 변화에 민감하게 응답한다. 이러한 유전율(굴절율) 변화를 이용하여 생체분자 간의 흡착을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 지난 수십 년 동안 항원/항체, 리간드/수용체, 단백질/단백질 반응 및 DNA 혼성체화를 포함하여 특정 생체 피분석물에 대한 생체재료 농도, 두께 및 결합 반응속도 데이터를 측정하기 위하여 LSPR의 광학특성을 기초로 다양한 생체분자 상호작용 분석이 수행되어 왔다.

이에, 본 발명에서는 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2를 동시에 검출하고, 후성유전학적 매개 전사억제를 추적할 수 있는 새로운 다중검출 플랫폼을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 금 나노스타(gold nanostar; AuNS) 및 PNA 프로브를 이용하여 제조한 나노플라즈모닉 바이오센서(nanoplasmonic biosensor)를 이용하면, 별도의 라벨 없이 실시간으로 빠르고 정확하게 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2를 동시 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 후성유전학적 매개 전사억제로 인한 전사활성을 측정 할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용하여 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위 검출 및 mCpG 정량 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, 프로모터 상의 전사인자 결합 도메인 내의 메틸화 여부 검출 및 프로모터 메틸화에 따른 후성유전학적 매개 전사억제에 따른 전사활성 측정방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 메틸화된 CpG에 특이적인 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 메틸화된 CpG에 특이적인 단백질의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도(Δλmax)분석을 통해 표적핵산 CpG 부위 메틸화 여부를 분석하는 단계를 포함하는 표적핵산의 CpG 부위 메틸화 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계;(b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 메틸화된 CpG 부위의 MBD2 단백질 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도 분석을 통해 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위 개수를 측정하는 단계를 포함하는 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위 개수 측정방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 포함하는 시료를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 메틸화된 CpG 부위의 MBD2 단백질 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도(Δλmax) 분석을 통해 표적핵산의 CpG 부위 메틸화 여부를 분석하는 단계를 포함하는 표적핵산의 메틸화에 따른 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 전사인자 결합 도메인의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도시킨 후, 전사인자를 첨가하는 단계; 및 (c) 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 프로모터 내의 전사인자 결합 도메인의 CpG 부위 메틸화 여부를 검출하는 단계를 포함하는 프로모터 내의 전사인자 결합 도메인의 CpG 부위 메틸화 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도시킨 다음, RNA 폴리머레이즈 및 전사인자를 처리하는 단계; 및 (c) RNA 폴리머레이즈 및 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 프로모터의 활성을 분석하고, 메틸화되지 않은 프로모터와 비교하여 유전자 전사활성을 분석하는 단계를 포함하는 프로모터의 CpG 부위 메틸화에 따른 전사활성 억제를 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 RNA 폴리머레이즈, MBD2 및 전사인자를 접촉시켜 프로모터의 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; (c) MBD2, RNA 폴리머레이즈 및 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 전사억제인제 및 전사인자 단백질의 경쟁적 상호작용을 모니터링 하는 단계를 포함하는 프로모터 CpG 부위 메틸화에 따른 전사인자 단백질의 경쟁적 상호작용을 모니터링하는 방법을 제공한다.

본 발명의 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 프로모터의 메틸화 분석방법은 바이설페이트 처리와 같은 전처리 과정없이 바로 CpG 부위의 메틸화 여부 및 갯수를 측정할 수 있고, p53 프로모터의 메틸화 여부 및 과발현된 MBD2를 동시에 측정할 수 있어, 초기 암 진단에 적용 및 응용할 수 있다. 또한, 프로모터의 메틸화에 따른 전사활성변화를 측정할 수 있으므로, 후성유전학적 매개 변이에 따른 전사활성을 추적 및 평가할 수 있다.

도 1은 본 발명의 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 다중 타켓 검출에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 금 나노스타의 UV/VIS 패터(A) 및 크기 및 모양(B)을 나타낸 데이타이다.
도 3은 pH에 따른 PNA 프로브와 p53 프로모터의 pH에 따른 혼성화 정도를 나타낸 데이타이다.
도 4는 본 발명의 나노플라즈모닉 바이오센서의 PNA 프로브 특이성 및 MBD2 단백질의 mCpG 결합 능력을 나타낸 데이타이다.
도 5는 PNA 프로브를 금 나노스타 표면에 수직 또는 수평으로 결합했을 때의 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 금 나노스타 표면에 고정시켰을 때, 적외선 분광법(FT-IR; A) 및 전기영동(B)으로 혼성화 정도를 관찰한 데이타이다.
도 7은 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2 결합에 따른 파장 이동 정도(A), p53 프로모터 내에 mCpG 수 측정(B), MBD2 처리 농도에 따른 최대 파장 이동(C 및 B)를 나타낸 데이타이다.
도 8은 금 나노스타 주변 플라즈몬 공명 영역의 민감지역에 대한 모식도(A) 및 PNA 프로브 고정의 안정성 증가를 위한 수평결합에 대한 모식도(B)이다.
도 9는 PNA 프로브 수직(A) 또는 수평(B)으로 금 나노스타 표면에 고정시키고, p53 프로모터 내 mCpG 위치를 확인한 데이타이다.
도 10은 HeLa 세포 및 HEK293 세포 핵 추출물에서 총 DNA 메틸화 정도(A) 및 MBD2(B)를 확인한 데이타이다.
도 11은 HeLa 세포(A) 및 HEK293 세포(B)의 p53 프로모터와 양성대조군(mdsp53; C)를 PNA 프로브가 고정된 금 나노스타와 결합시켰을 때의 파장 이동 및 mCpG에 MBD2가 결합했을 때의 파장 이동 정도를 관찰한 데이타이다.
도 12는 HeLa 세포 및 HEK293 세포의 p53 프로모터의 메틸화 유무 및 각 세포의 MBD2를 동시 검출한 결과(A) 및 HeLa 세포 및 HEK293 세포의 p53 프로모터 내의 mCpG 수와 mCpG 수에 따른 최대파장 이동값의 상관관계(B)를 측정한 데이타이다.
도 13은 mCpG에 MBD2의 결합에 따른 전사인자 입체장애를 나타낸 데이타이다.
도 14는 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용하여 전사활성 또는 전사억제를 측정하는 방법에 관한 모식도로, 플라즈몬 비활성 지역(2)에 RNA 중합효소가 p53 프로모터를 따라 금 나노스타 주변인 플라즈몬 민감 지역(1)으로 이동함에 따라 발생하는 스펙트럼 변화를 측정한다.
도 15는 메틸화된 프로모터에 따른 후성유전학적 매개 전사억제를 관찰한 것으로, MBD2를 포함하는 HeLa 세포 핵 추출물을 처리하였을 때(A), MBD2를 처리하지 않았을 때(B)의 최대 파장 이동도를 관찰한 데이타 및 메틸화된 전사인자 바인딩 도메인 p53 프로모터 (mAP-1 dsp53, mNF-kB dsp53, mYY1 dsp53)의 상대적 전사활성(C 및 D)를 측정한 데이타이다.
도 16은 전사개시 이후 MBD2 첨가에 따른 전사 억제 활성을 최대 파장 이동도 분석을 통해 관찰한 데이타이다.
도 17은 각 전사인자 바인딩 도메인의 메틸화에 따른 후성유적학적 매개 전사억제를 관찰한 것으로, MBD2를 처리하였을 때(A), MBD2를 처리하지 않았을 때(B)의 최대 파장 이동도를 관찰한 데이타이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용하여 메틸화된 프로모터 및 표적핵산을 검출하는 것으로, 실제 게놈 상의 많은 CpG 부위가 메틸화되기 때문에, 서열을 특이적으로 인식하여 표적핵산 또는 특정 프로모터의 메틸화를 검출하기 위해 PNA 프로브를 금 나노입자에 고정시키는 캡춰프로브(capture probe)로 사용하였다. PNA(Peptide Nucleic Acid)는 N-(2-아미노에틸)글리신 아미드를 기본 골격으로 하는 핵산 유사체로써, PNA 골격은 전기적으로 중성이기 때문에 상보적 염기서열을 갖는 표적 핵산에 대해서 DNA 프로브보다 높은 특이도와 선택성을 가지며, 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 분해되지 않는 장점이 있어 프로브를 이용한 분자 진단 방법에 널리 이용되고 있다 (Egholm et al ., Nature , 365:556, 1993; Nielsen et al ., Bioconjugate Chem ., 5:3, 1994; Demidov, et al., Biochem . Pharmacol ., 48:1310, 1994).

본 발명에서는, PNA의 아미노 그룹 말단의 (C₃-NH₂)링커를 포함하는 하이드로카본 사슬(hydrocarbon chain)에 3개의 감마(γ)결합 위치가 포함되도록 PNA 프로브를 합성하였으며, PNA 백본의 감마(γ) 변형으로 인해 프로모터 특이적 상보성이 증가하고, PNA-DNA 복합체 형성이 용이하도록 하였다.

본 발명에서는 국소 표면 플라즈몬 공명(Localized surface plasmon resonance: LSPR) 시스템과의 통합 플랫폼으로 PNA가 골합된 금 나노스타(gold nanostar; AuNS)를 제조하여 사용하였으며, LSPR은 금 나노스타의 광학적 특성 변화에 매우 민감하여 프로모터의 메틸화에 따른 후성유전학적 변화를 민감하고, 특이적으로, 간단하게, 실시간으로 검출할 수 있다. 국소 표면 플라즈몬 공명기반 나노플라즈모닉 바이오센서는 레일리 이론에 기초하여, 금 나노스타 주변에서 발생하는 굴절율 및 스펙트럼 파장 이동 정도를 분석하여 메틸화 여부 및 후성유전학적 매개 전사억제 정도를 측정할 수 있다 (도 1).

본 발명은 일 관점에서, (a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 메틸화된 CpG에 특이적인 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 메틸화된 CpG에 특이적인 단백질의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도(Δλmax) 분석을 통해 표적핵산 CpG 부위 메틸화 여부를 분석하는 단계를 포함하는 표적핵산의 CpG 부위 메틸화 검출방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계;(b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 메틸화된 CpG 부위의 MBD2 단백질 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도 분석을 통해 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위 개수를 측정하는 단계를 포함하는 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위 개수 측정방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 포함하는 시료를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 메틸화된 CpG 부위의 MBD2 단백질 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도(Δλmax) 분석을 통해 표적핵산의 CpG 부위 메틸화 여부를 분석하는 단계를 포함하는 표적핵산의 메틸화에 따른 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 전사인자 결합 도메인의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도시킨 후, 전사인자를 첨가하는 단계; 및 (c) 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 프로모터 내의 전사인자 결합 도메인의 CpG 부위 메틸화 여부를 검출하는 단계를 포함하는 프로모터 내의 전사인자 결합 도메인의 CpG 부위 메틸화 검출방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도시킨 다음, RNA 폴리머레이즈 및 전사인자를 처리하는 단계; 및 (c) RNA 폴리머레이즈 및 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 프로모터의 활성을 분석하고, 메틸화되지 않은 프로모터와 비교하여 유전자 전사활성을 분석하는 단계를 포함하는 프로모터의 CpG 부위 메틸화에 따른 전사활성 억제를 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 형성된 복합체에 RNA 폴리머레이즈, MBD2 및 전사인자를 접촉시켜 프로모터의 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; (c) MBD2, RNA 폴리머레이즈 및 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 전사억제인제 및 전사인자 단백질의 경쟁적 상호작용을 모니터링 하는 단계를 포함하는 프로모터 CpG 부위 메틸화에 따른 전사인자 단백질의 경쟁적 상호작용을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 표적핵산 및 프로모터는 p53 프로모터인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않고, 다양한 프로모터 및 표적핵산의 사용이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있거나, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하며, 상기 아민(NH₂)기는 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수직으로 고정되며, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수평으로 고정되는 것을 특징을 한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서는 (ⅰ) 유리 또는 플라스틱에서 선택되는 투명한 지지체에 별 모양의 금 나노스타를 고정시키는 단계; 및 (ⅱ) 금 나노스타가 고정된 표면에 (CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH를 고정시킨 후, EDC/NHS를 이용하여 표적핵산에 특이적인 PNA 프로브를 (CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH에 고정시키는 단계를 이용하여 제조된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 표면 플라즈몬 공명 현상을 기반으로 한 나노플라즈모닉 바이오센서를 제작하기 위해, 약 45nm 크기의 별 모양 금 나노스타를 당업계에 공지된 방법(surfactant-stabilized seed; T.K. Sau et al ., Adv . Mater , 22:1805, 2010)으로 합성하였으며(도 2), 유리 기판 위에 고정시키고, 상기 금 나노입자가 고정된 유리 기판을 이미징 챔버 (RC-30, Warner Instrument Inc.)에 장착시키고, 이 이미징 챔버는 암시야 공명 현미경의 샘플 홀더에 삽입하여 나노플라즈모닉 센서를 제조하였다. 이 후, 금 나노스타 표면에 HS (CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH (OEG₆ _-COOH)를 부착 시킨 다음, 표적핵산 또는 프로브에 특이적인 서열을 가진 PNA 프로브를 EDC/NHS 생접합(bioconjugation) 반응을 통해 OEG₆ _-COOH와 결합시켰으며, 표적핵산 또는 프로브, MBD2 단백질을 순차적으로 결합시켜 금 나노스타 주변의 굴절율 변화를 통한 최대 파장 이동값을 측정하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 PNA 프로브와 표적핵산의 복합체 형성은 50 내지 55℃, pH 5.4 내지 8.3의 조건으로 반응시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 p53 프로모터와 PNA혼성화 조건을 확인한 결과, 52℃, pH 5.4에서 최적의 혼성화를 보이는 것을 확인하였으며(도 3), PNA 프로브의 p53 프로모터에 대한 특이성 및 mCpG 결합에 대한 특이성을 분석한 결과, PNA 프로브에 비특이적인 서열인 DNA 1, DNA 2 및 DNA 3의 경우 최대 파장이동 정도가 미미한 수준인 반면, p53 프로모터를 처리하였을 때, 최대 파장 이동값이 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, MBD2를 나노플라즈모닉 센서에 주입한 경우만 최대파장 이동값이 변하는 것을 확인하여, p53 프로모터의 mCpG를 특이적으로 인식하여 결합하는 것을 확인하였다 (도 4).

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 광산란 스펙트럼의 측정은 암시야 공명 현미경(dark-field microscopy) 및 레일리-산란 스펙트럼(Rayleigh scattering spectrum)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하며, background 스펙트럼과 암시야 공명 현미경 자체의 기계적으로 발생하는 노이즈 시그널을 측정하여 이를 제거한 스펙트럼 분석을 실시하였으며, 단일 금 나노입자의 주위 굴절률 변화로부터 얻어진 LSPR 산란 최대 파장 이동 값(λ_max)은 하기 수학식 1로 계산하였다.

[수학식 1]

Δλ_max = λ_max (after binding) - λ_max (before binding)

본 발명에 있어서, 상기 MBD2 단백질의 처리농도는 120 내지 130fM인 것을 특징으로 하며, 최적 MBD2의 처리 농도를 확인하기 위해, 5 x 10^-6fM 내지 125 x 10⁶ fM 농도로 처리하여 최대파장 이동값을 확인한 결과, 농도 의존적으로 최대파장 이동값이 증가하는 것을 확인하였으며, 125 fM에서 16.3nm의 LSPR λ_max이동이 관찰되어 현저한 민감도를 보이는 것을 확인하였다 (도 7C 및 도 7D).

본 발명은 도 5에 나타낸 바와 같이, 검출 목적에 따라, 금 나노스타 표면에 PNA 프로브를 수직 또는 수평으로 고정화시켜 사용할 수 있다. PNA 프로브를 수직 또는 수평으로 결합하였을 때 금나노스타에 PNA-dsp53 프로모터 복합체가 형성된 것을 적외선 분광법(Fourier transform infrared spectroscopy; FT-IR)(도 6A) 및 전기영동(도 6B)을 이용하여 분석하였다.

본 발명에서 PNA 프로브를 수직으로 금 나노스타 표면에 고정시킨 후, 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2를 주입하였을 때의 파장변화를 측정한 결과, 고정화 단계마다 최대 파장이 오른쪽으로 이동함을 확인하였으며, PNA와 mdsp53의 혼성화였을 경우 및 mCpG에 MBD2가 결합하였을 때 플라즈모닉 파장이 금 나노스타에 비해 각각 33.8nm 및 49.5nm으로 레드파장 쪽으로 이동한 것을 확인하였다 (도 7A).

프로모터(표적핵산) 내에 존재하는 mCpG 수에 따른 LSPR 최대파장 이동정도 및 LSPR 최대파장 이동의 포화정도를 결정하기 위해 DNA 서열상에 mCpG가 1개 내지 4개가 존재하도록 타겟 DNA를 합성하여, 프로모터(표적핵산) 내에 존재하는 mCpG 수에 따른 LSPR 최대파장 이동도를 측정한 결과, 메틸화된 CpG의 수에 따라 최대 파장 이동값의 변화를 확인한 결과, 메틸화된 CpG에 의존적으로 최대 파장 이동값이 증가하는 것을 확인하였으며, 메틸화된 CpG 부위가 3개 및 4개가 존재할 때 최대파장 이동값은 각각 24nm 및 24.8nm을 보여 LSPR 스펙트럼 이동의 포화정도를 확인할 수 있었다 (도 7B).

PNA 프로브를 금 나노스타에 수직으로 결합하였을 때는 길이변화에 따른 파장 이동을 분석하여 mCpG 개수 측정, 메틸화 유무, 메틸화 위치, 입체장애 및 전사활성을 측정할 수 있으며, 타겟 DNA(표적핵산)의 길이에 따라 PNA 프로브를 금 나노스타에 수평으로 결합하여 분석을 수행할 수도 있다. 본 발명에서 사용한 30nm 크기의 금 나노스타는 표면으로부터 약 20nm에 해당하는 부분이 플라즈몬 민감 지역이며, 상기에서 각각의 mCpG를 포함하고 있는 각각의 서열은 30bp길이를 가지므로, 약 10.3nm(10bp당 약 3.4nm)에 해당하며 표면 플라즈몬 공명 영역의 민감지역에 포함된다 (도 8A). 하지만, 타켓 DNA의 길이가 길어지게 되면 민감지역 바깥에 있는 부분의 메틸화된 mCpG의 유무의 판단이 어려워진다. 만약, PNA 프로브를 금 나노스타에 수평으로 결합하였을 때는 금 나노스타로부터 메틸화된 mCpG의 위치가 동일하므로 mCpG 개수 파악 및 MBD2에 의한 입체 장애를 측정할 수 있다.

또한, 상기 p53 프로모터에 특이적인 PNA 프로브 서열을 합성하여, 금 나노스타에 수직으로 고정시킨 다음, p53 프로모터를 챔버 안에 주입하여 PNA 프로브와의 혼성화를 유도하였지만, 결합할 때의 동적인 에너지 변화로 인해 PNA 프로브가 금 나노스타로부터 분리되는 경우가 발생하였다. PNA 프로브를 안정적으로 금 나노스타에 고정시키기 위해, PNA 서열 내에 감마(γ)결합 위치 2 군데에 -NH₂기(상기 서열에서 *로 표시된 부분)를 도입하여 PNA 프로브를 제작하였으며, p53 프로모터는 여전히 금 나노스타 표면에 수직으로 결합시키기 위해, PNA 프로브는 p53 프로모터의 5' 말단에 결합하도록 제작하였다 (도 8B).

PNA 프로브를 수직 또는 수평으로 각각 금 나노스타에 고정시켰을 때, 프로로모터(표적핵산) 내에 존재하는 mCpG 위치에 따른 LSPR 최대파장 이동도를 측정한 결과, PNA 프로브를 수직으로 금 나노스타 표면에 고정시킨 경우에는 최대 파장 이동값이 p53 프로모터 상의 -105, -77, -35 및 +1위치에 따라 각각 16.5 nm, 15.2 nm, 13.8 nm, 13.2 nm을 나타내는 것을 확인하였다 (도 9A). 반면, PNA 프로브를 수평으로 금 나노스타 표면에 고정시킨 경우에는 수평고정된 PNA 프로브와 p53 프로모터의 혼성화는 mCpG 위치에 상관없이 금 나노스타로부터의 길이가 같기 때문에 p53 프로모터의 mCpG 위치에 영향을 받지 않아 최대 파장 이동정도가 서로 비슷하게 나타나는 것을 확인하였다 (도 9B).

본 발명에서는 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용하여 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2을 다중 검출이 가능한지 확인하기 위해 실험을 수행하였으며, 이 경우에는 MBD2가 타겟 물질 및 mCpG 검출자(detector)의 역할을 모두 수행하게 된다.

시료로 HEK 293 세포(Hk; CRL-1573^TM) 및 HeLa 세포(He; CCL-2™)에서 p53 프로모터 단편 및 MBD2가 포함되어 있는 핵 추출물을 분리하여 실험을 수행하였으며, 그 결과, HeLa 세포의 p53 프로모터(He-dsp53)은 양성 대조군(mdsp53)과 유사한 수준으로 파장의 이동이 관찰되었으나, HEK293 세포의 p53 프로모터의 경우 파장 이동이 미미한 것을 확인하였다 (도 11). 이는 실시예 4-1의 도 10A의 총 메틸화 정도와 유사한 결과로, HeLa 세포의 p53 프로모터 내에 메틸화된 CpG가 높은 수준으로 존재하는 것을 의미하며, HEK293 세포의 경우 p53 프로모터 내 메틸화된 CpG가 거의 존재하지 않는 것을 의미한다.

p53의 프로모터의 메틸화 정도와 MBD2의 동시 검출에 있어서, 도 12A 나타난 바와 같이, HeLa 세포의 p53 프로모터에 각각의 MBD2를 반응시킨 경우 재조합 MBD2(Rec MBD2), He-MBD2, Hk-MBD2에서 각각 20.3nm, 16.4nm, 2.5nm의 최대파장 이동값을 보여 HeLa 세포에서 MBD2가 과발현되는 것을 확인하였으며, 이는 실시예 4-1의 도 10B의 MBD2 정량 값과 유사한 것을 확인하였다. HEK293 세포의 p53 프로모터에 각각의 MBD2를 반응시킨 경우에는, HEK293 세포의 p53 프로모터 내에 메틸화 된 부분이 거의 없어 MBD2 처리에 따른 파장의 변화가 크지 않은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서 p53 프로모터 상의 전자인자 바인딩 도메인의 메틸화에 따른 전사인자의 입체장애 모니터링하기 위해, 각각의 기본 프로모터 활성 지역(-213 ~ +1) 및 짧은 RNA 인코딩 DNA 절편(+1 ~ +30)을 포함하는 메틸화된 전사인자 바인딩 도메인 서열을 각각 합성하여 실험에 사용하였으며, 나노플라즈모닉 바이오센서 상에서 MBD2 단백질을 처리한 다음, AP-1, NF-κB, YY-1, Myc 각각의 전사인자 및 RNA polymerase Ⅱ(p33서브 유닛)을 첨가하여 반응시켰다. MBD2를 결합시켰을 때, 16.3nm의 최대파장이 이동하는 것을 측정하였으나, 전사인자를 반응시켰을 때 붉은 파장으로 더 이상의 이동은 없는 것을 관찰하였다(도 13). 이는 MBD2가 전사인자 바인딩 도메인의 mCpG에 완전히 결합하여, 입체장애로 인해 중요한 전사인자의 결합이 이루어지지 못했기 때문으로 판단된다.

전사 속도를 측정하기 위해서, 금 나노스타 표면으로 더 가까이 이동하는 RNAP Ⅱ에 의존적으로 변하는 LSPR 스펙트럼을 측정하기 위해, PNA 프로브를 금나노스타에 수직으로 고정시켜 사용하였다. PNA 프로브를 금 나노스타에 수직으로 결합시키게 되면, mCpG는 플라즈모닉 민감성 지역의 바깥쪽에 위치되어 있어(도 14), RNAP Ⅱ가 프로모터의 바깥쪽에서부터 결합하여 p53 프로모터를 따라 이동하면 LSPR 스펙트라의 뚜렷한 변화가 실시간으로 발생한다. 만약, p53 프로모터상의 mCpG에 핵 추출물 속의 MBD2가 결합하면 LSPR 변화가 메틸화 되지 않은 p53 프로모터에 비해 LSPR 변화가 크지 않으므로, 후성유전학적 매개 전사 활성 변화를 측정할 수 있게 된다.

본 발명에서 p53 프로모터의 메틸화에 따른 전사속도를 측정하기 위해, MBD2 존재하에 메틸화된 프로모터상에서 RNA 중합효소(RNAP Ⅱ)의 결합 속도를 측정하였다. 스펙트럼 변화를 측정하여 전사 속도를 측정한 결과, 표 5 및 도 14에 나타난 바와 같이, 메틸화된 p53 프로모터의 경우, MBD2결합에 개시전 복합체(pre-initiation complex)가 형성이 저해되어 메틸화되지 않은 p53 프로모터에 비해 LSPR 최대 파장 이동 변화가 크지않은 것을 확인하였다 (도 15 A 및 B). MBD2의 존재 여부에 따른 파장 변화는 MBD2 결합에 따른 차이로 판단된다.

상기의 LSPR 최대 파장 이동값의 감소는 MBD2에 의해 mdsp53, he-dsp53에서 개시전 복합체의 형성이 hk-dsp53 및 umdsp53 프로모터에 비해 느려져 전사속도가 급격히 감소한 것을 확인하였다.

HeLa 세포 및 HEK 세포로부터 p53 프로모터 및 메틸화된 전사인자 바인딩 도메인 p53 프로모터 (mAP-1 dsp53, mNF-kB dsp53, mYY1 dsp53)의 상대적 전사활성을 나노플라즈모닉 바이오센서로 측정하여 분석한 결과, 전사활성은 mAP-1, mNF-kB 및 mYY1에서 각각 43%, 35% 및 27%로 감소하였으며, he-dsp53, hk-dsp53 및 mdsp53는 메틸화 되지 않은 p53에 비해 각각 45%, 86% 및 29%의 활성을 보이는 것을 확인하였다 (도 15C 및 D).

또한, 전사가 시작된 경우에 MBD2에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해, 나노플라즈모닉 센서의 챔버 내에 각각의 전사인자(AP-1, NF-κB, YY-1, c-Myc) 및 RNA 중합효소를 주입하여 전사반응을 먼저 유도한 뒤에, MBD2를 챔버 안으로 주입하여, MBD2에 따른 전사억제를 관찰하였다. 그 결과, 전사인자 바인딩 도메인에 mCpG가 존재하는 경우 최대파장 이동값이 감소하는 것을 확인하였으며(도 16), 이는 전사인자 바인딩 도메인의 mCpG에 MBD2가 결합함에 따라 RNA 합성과정의 초기에도 전사가 중지될 수 있음을 말해준다.

각각의 전사인자 바인딩 도메인 내에 메틸화된 CpG가 존재함에 따른 후성유전학적 매개 전사억제 정도를 측정하기 위해, 메틸화되지 않은 p53 프로모터(서열번호 6), 메틸회된 p53 프로모터(양성대조군, 서열번호 5)와 메틸화된 mCpG를 포함하는 AP-1, NF-κB 전사인자 바인딩 도메인 서열(각각 서열번호 23 및 25, 표 6)을 이용하여 실험을 수행한 결과, 전사인자 바인딩 도메인 내의 mCpG에 결합한 MBD2의 존재하에 메틸회된 p53 프로모터(mdsp53)와 메틸화된 mCpG를 포함하는 AP-1, NF-κB 전사인자 바인딩 도메인이 메틸화되지 않은 p53 프로모터(umdsp53)에 비해 전사속도가 감소하는 것을 확인하였다 (도 17).

결론적으로, 본 발명에서는 나노플라즈모닉 바이오센서를 이용하여, 메틸화 여부 판단 및 정량, 프로모터 상의 mCpG 및 과발현된 MBD2 단백질의 동시 검출, 후성유전학적 매개 전사억제 활성 측정할 수 있는 것을 확인하였으며, 이를 이용하여 암 발달 초기 단계의 생물학적 특징인, p53과 같은 암 억제 유전자의 전사 억제 원인이, 프로모터 상의 전사인자 바인딩 도메인 내의 메틸화에 따른 전사억제이 기인하는 것을 확인할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

나노플라즈모닉 바이오센서 제작

1-1 : 금 나노스타의 제조

본 발명의 표면 플라즈몬 공명 현상을 기반으로 한 나노플라즈모닉 바이오센서를 제작하기 위해, 약 45nm 크기의 별 모양 금 나노스타를 당업계에 공지된 방법(surfactant-stabilized seed; T.K. Sau et al., Adv . Mater , 22:1805, 2010)으로 합성하였으며, 합성에 사용된 재료은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich , 미국)에서 구입하여 사용하였다.

금 나노스타 시드용액은 10mM HAuCl₄ 0.5㎖과 0.1M CTAB 15㎖을 혼합하여 준비하였으며, 금 나노스타 시드를 성장시키기 위해, 차가운 상태의 수소화 붕소 나트륨(sodium borohydride; NaBH₄, 환원제) 1.2㎖을 상기 밝은 갈색의 시드 용액에 첨가하여 용해시켰다 (시드용액). 금 나노스타 성장을 위한 용액은, 0.1 M CTAB 9.5㎖, 10 mM AgNO₃ 0.06㎖ 및 10 mM HAuCl₄ 0.4㎖을 고루 혼합하여 준비하였으며 (성장용액), HAuCl₄를 첨가하면 용액의 속이 노란 갈색으로 바뀐다. 금 나노스타의 성장을 시작하기 위해, 상기의 성장용액에 시드용액 20㎕를 첨가하고 100mM 아스코르빈산(ascorbic acid) 0.064㎖을 첨가하였다 (이때 용액은 투명한 색으로 변한다). 그 후, 0.1 M NaOH 0.05㎖을 첨가하고, 용액의 색이 보라/파란색에서 짙은 녹색으로 변할 때까지 약 2시간 30분 동안 자석교반기(magnetic stirring)로 250rpm으로 교반하여 금 나노스타를 성장시켰다.

금 나노스타의 성장이 완료되면, 반응이 완료된 용액에서 응집된 생성물을 제거하기 위해 0.2㎕ 필터를 이용하여 여과하였으며, 나노플라즈모닉 바이오센서를 제조하기 위한, 균일한 크기의 금 나노스타를 수득하기 위해 20 ~ 80% 자당밀도 구매 원심분리법을 이용하여 26000rpm에서 1시간 동안 원심분리하였으며, 크기 및 모양은 고분해능 투과전자현미경(high resolution transmission electron microscopy; HR-TEM, jEOL JEM-3011) 및 UV/VIS 분광 광도계(UV/VIS 3600, Shimadzu)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 약 45nm 크기를 가지는 금 나노스타가 제조된 것을 확인하였으며, 약 700nm에서 최대 파장값을 보이는 것을 확인하였다 (도 2).

1-2 : 금 나노스타 고정 및 챔버 세팅( chamber setting )

실시예 1-1에서 제조된 금 나노스타를 3-MPTES로 활성화된 커버스립 슬라이드(coverslip slide; 22 x 40 x 0.1 mm) 위에 고정시켰다.

먼저, 커버슬립 슬라이드는 피란하 용액(piranha solution; H₂SO₄: H₂O₂: 3:1) 안에서 초음파 처리한 다음, 18.2 mΩ/m 초순수 증류수로 완전히 세척하였다. 금 나노스타를 포함한 용액은 흡광도 690nm에서 OD 0.02 값을 가지도록 희석한 뒤, drop-coating을 통해 유리 기판(커버슬라이드 글래스)의 중앙에 정전기적으로 고정시키기 위해 30초 동안 반응시켰다. 여기서, 금 나노입자의 농도와 반응시간은 입자간 간격 및 고정된 금 나노스타의 밀도를 조절하여 입자간 커플링 효과를 감소시키는 역할을 한다.

그 후, 준비한 유기 기판 샘플을 미세유체 이미징 챔버 (RC-30, Warner Instrument Inc.)에 장착시키고, 상기 이미징 챔버는 암시야 공명 현미경(Eclipe TE2000-U, Nikon, 일본)의 샘플 홀더에 삽입하였다. 이미징 챔버는 금 나노입자의 표면 기능화에 필요한 흡착물 및 반응물 등의 여러 가지 화학 물질을 주입하기 위한 수단으로, 주사기 펌프와 연결되어 있으며, 챔버 안으로 흐르는 유체의 속도는 50㎕/min으로 조절하였다. 챔버 안에서 최적 결합온도는 온도조절기(TC-324B, Warner Instruments)를 사용하여 조절하였다.

시스템 세팅 후에, 고정된 금 나노스타 표면은 앱솔루트 에탄올(absolute ethanol)을 흘려주어 5분 동안 세척한 다음, 부착되지 않은 금나노스타 및 다른 불순물을 제거하기 위해 초순도 증류수를 10분 동안 흘려주었다. 그 다음, 에탄올에 포함된 0.2 mM HS (CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH(OEG₆ _-COOH) 1㎖을 챔버 안으로 주입시키고 금 나노스타 표면에 부착시키기 위해 10시간 동안 반응시켰다.

그 후, 표적 프로모터 또는 표적핵산에 특이적인 PNA 프로브를 고정시키기 위해, NHS 커플링 키트(Thermo Scientific, FL, 미국)를 이용하여 EDC/NHS 생접합(bioconjugation) 반응을 통해 PNA 프로브를 OEG₆COOH와 결합시켰다.

나노플라즈모닉 바이오센서의 PNA 및 p53 프로모터의 혼성화 조건 및 특이성 확인

2-1 : 혼성화 조건 확인

실시예 1에서 제조한 나노플라즈모닉 바이오센서에서 PNA 프로브와 p53 프로모터의 혼성화 정도 및 메틸화 검출 여부를 파악하기 위해, 인간 지노믹 DNA에서 p53 프로모터의 약 213bp의 BAP(basic activity promoter region) 부분 및 전체 활성 프로모터(full-activity promoter; 381bp)를 다음의 두 개의 프라이머 세트(바이오니아 합성)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

프라이머 세트

	염기서열	서열번호
P53Bac-F	5'-GGGAGAAAACGTTAGGGTGTGG-3'	서열번호 1
P53Bac-R	5'-CCAATCCAGGGAAGCGTGTCAC-3'	서열번호 2
P53P-F	5'-TGCACCCTCCTCCCCAACTC-3'	서열번호 3
P53P-R	5'-CTCCCTGGACGGTGGCTCTAG-3'	서열번호 4

p53 프로모터의 BAP 부분은 94℃에서 4분 동안 반응 후 94℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 1분 반응 과정을 30 사이클(cycle) 반복하여 증폭시켰으며, 전체 활성 프로모터 부분은 94℃에서 4분 동안 반응 후 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분 반응 과정을 30 사이클 반복하여 증폭시킨 다음, 당업계에 알려진 방법으로 각각의 생성물을 분리하여 이후의 실험에 사용하였다.

금 나노스타에 고정된 PNA 프로브와 p53 프로모터(dsp53)와의 혼성화 조건을 확인하기 위해, PNA와 dsp53 농도가 3 : 1이 되도록 하여 perfectHyb^TM plus 혼성화 버퍼(1x; Sigma Aldrich)를 이용하여 52℃에서 반응시켰으며, 반응시 pH는 5.4, 6.2, 7.0, 7.7, 8.3으로 조건을 각각 달리하여 반응시켰다. 혼성화 효율을 관찰하기 위해 2.5% 아가로스 젤 전기영동 후, UV 트랜스일루미내이터(Spectronics, NY, USA) 를 이용하여 분석한 결과, pH는 5.4에서 최적의 혼성화를 보이는 것을 확인하였다 (도 3).

2-2 : 특이성 확인

나노플라즈모닉 바이오센서의 특이성을 확인하기 위해, PNA 프로브의 p53 프로모터에 대한 특이성 및 mCpG 결합에 대한 특이성을 분석하였다.

PNA 프로브의 특이성을 확인하기 위해 p53 프로모터에 특이적인 PNA 서열을 합성하여 실시예 1에서 제조한 나노플라즈모닉 센서의 금 나노스타에 고정시킨 다음, 비특이적인 DNA 및 p53 프로모터를 각각 처리하고, 스펙트럼 파장 변화 분석을 통해 최대 파장 이동값을 분석하였다. 상기 p53 프로모터는 프로모터 상에 CpG 부분이 메틸화 되도록 p53 프로모터에 메틸트랜스퍼레이즈(CpG Methyltranferase; M.SssI, New England Biolabs, 미국)를 처리하였다 (이 후의 실험에서 양성 대조군으로 사용).

고정화가 이루어지는 단계마다 암시야 공명 현미경을 이용한 광 산란(Light scattering) 스펙트럼 측정하였으며, 데이터의 프로세싱을 위해, 실험의 결과로 얻어진 스펙트럼에 OriginPro 7.5 프로그램의 Lorentzian 알고리즘을 적용함으로써 정확하고 효과적으로 Wavelength 최대 파장 값을 분석하였다. 마지막으로 단일 금 나노입자의 주위 굴절률 변화로부터 얻어진 LSPR 산란 최대 파장 이동 값(λ_max)은 하기 수학식 1로 계산하였다.

[수학식 1]

Δλ_max=λ_max(after binding)-λ_max(before binding)

mdsp53 프로모터 서열 및 PNA 서열

이름	염기서열	서열번호
Mdsp53 promoter	5'-CAGGT mCGGmCG AGAATCCTGACTCTGCACCCTCCTCCCCAACTCCATTTCCTTTGCTTCCTC mCG GCAGG mCG GATTACTTGCCCTTACTTGTCATGG mCG ACTGTCCAGCTTTGTGCCAGGAGCCT mCG CAGGGGTTGATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGG mCG CTAAAAgttttgagcttctcaaaagtctagagccacc-3'	서열번호 5
umsp53 promoter	5'-CAGGTCGGCGAGAATCCTGACTCTGCACCCTCCTCCCCAACTCCATTTCCTTTGCTTCCTCCGGCAGGCGGATTACTTGCCCTTACTTGTCATGGCGACTGTCCAGCTTTGTGCCAGGAGCCTCGCAGGGGTTGATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGGCGCTAAAAgttttgagcttctcaaaagtctagagccacc-3'	서열번호 6
PNA for Mdsp53 promoter	5'-NH2 linker-AATCCGCCTGCCGGA -3'	서열번호 7
DNA-1 (oligo from human GAPDH gene) (NCBI JN613429)	5'-TGCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3'	서열번호 8
DNA-2 (oligo from elongator complex gene 3)(NCBI)	5'-GACAAATACACACACAGCCTTGCCGTGAATTG-3'	서열번호 9
DNA-3 (Oligo from SP6 promoter)	5'-GGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-3'	서열번호 10

또한, PNA 프로브와 mCpG 부분이 포함된 p53 프로모터를 혼성화 시킨 후, 인간 IgG, MeCP2, P53 단백질 및 MBD2 단백질(New England Biolabs, 미국)을 각각 처리하여 mCpG에 특이적으로 결합하는지 확인하였다.

그 결과, PNA 프로브에 비특이적인 서열인 DNA 1, DNA 2 및 DNA 3의 경우 최대 파장이동 정도가 미미한 수준인 반면, p53 프로모터를 처리하였을 때, 최대 파장 이동값이 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, MBD2를 나노플라즈모닉 센서에 주입한 경우만 최대파장 이동값이 변하는 것을 확인하여, p53 프로모터의 mCpG를 특이적으로 인식하여 결합하는 것을 확인하였다 (도 4).

MeCP2의 경우 MBD2와 마찬가지로 mCpG를 인식하는 것으로 알려져 있으나, MeCP2는 mCpG 주변의 A/T 서열의 존재여부에 의해 많은 영항을 받기 때문에, p53 프로모터상의 mCpG를 검출하는데는 적합하지 않은 것을 확인하였다.

PNA 프로브 및 메틸화된 p53 프로모터 결합에 따른 파장 변화 및 MBD2 단백질 처리 농도 확인

3-1 : 수직 또는 수평 방향에 따른 PNA 프로브 고정화 정도 확인

본 발명에서는 검출 목적에 따라, 금 나노스타 표면에 PNA 프로브를 수직 또는 수평으로 고정화시켜 사용하였다 (도 5). PNA 프로브의 고정화의 경우, 금 나노스타 표면에 고정된 OEG₆ _-COOH의 -COOH와 PNA 프로브 5' 말단에 존재하는 -NH₂가 반응하여 결합하는 것으로, PNA 프로브를 금 나노스타의 표면에 수평으로 고정시키기 위해서, PNA 프로브 서열 내에 -NH₂가 두 군데 정도 위치하도록 변형시켜 합성하였다 (C₃-NH₂ linker 사용).

금 나노스타 표면에 수직 또는 수평으로 고정된 PNA의 고정 효율을 분석하기 위해, 실시예 2의 서열번호 6에 해당하는 PNA 프로브를 이용하였다. 수직으로 결합하는 PNA 프로브의 경우, 5' 말단에만 -NH₂기를 도입하였으며, 수평으로 결합하는 PNA 프로브의 경우, 5' 말단뿐만 아니라 PNA 서열 내에 감마(γ)결합 위치 2 군데에 -NH₂기(서열에서 *로 표시된 부분)를 도입하여 PNA 프로브를 제작하였다.

적외선 분광법(Fourier transform infrared spectroscopy; FT-IR)를 이용하여 OEG₆COOH로 기능화된 금 나노스타 표면에 EDC/NHS 커플링제를 처리하였을 때, PNA가 고정된 것을 확인하였으며(도 6A), 금나노스타에 PNA-dsp53 프로모터 복합체가 형성된 것을 전기영동(도 6B)을 통해 확인하였다.

3-2 : 금 나노스타 표면에 수직 결합된 PNA 프로브를 이용하였을 때, 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2 결합에 따른 파장 이동 정도 확인

실시예 1에서 제조한 나노플라즈모닉 바이오센서에 PNA 프로브를 수직으로 금 나노스타 표면에 고정시킨 후, 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2를 주입하였을 때의 파장변화를 측정하였다.

메틸화된 p53 프로모터(mdsp53) 및 PNA 프로브는 표 2의 서열을 사용하였으며, PNA 프로브는 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 금 나노스타 표면의 OEG₆COOH와 결합시켰다. mdsp53 프로모터는 챔버 안으로 주입하여 52℃, pH5.4에서 2시간 동안 반응시켰으며, 비특이적인 결합을 방지하기 위해 온도를 64℃로 올리고, 염화나트륨 농도는 100mM로 처리하였다. 이 후, 부착되지 않은 mdsp53 프로모터를 제거하기 위해 이온수로 3번 세척한 다음, MBD2(New England Biolabs, 미국)를 챔버안으로 주입한 후, p53 프로모터의 mCpG 부분과 결합시키기 위해 37℃, pH7.4 조건으로 반응시켰다.

고정화가 이루어지는 각 단계마다 암시야 공명 현미경을 이용한 광 산란(Light scattering) 스펙트럼 측정하였으며, 단일 금 나노입자의 주위 굴절률 변화로부터 얻어진 LSPR 산란 최대 파장 이동 값(λ_max)을 계산하였다.

그 결과, 고정화 단계마다 최대 파장이 오른쪽으로 이동함을 확인하였으며, PNA와 mdsp53의 혼성화였을 경우 및 mCpG에 MBD2가 결합하였을 때 플라즈모닉 파장이 금 나노스타에 비해 각각 33.8nm 및 49.5nm으로 레드파장 쪽으로 이동한 것을 확인하였다 (도 7A).

또한, 최적 MBD2의 처리 농도를 확인하기 위해, 5 x 10^-6fM 내지 125 x 10⁶ fM 농도로 처리하여 최대파장 이동값을 확인한 결과, 농도 의존적으로 최대파장 이동값이 증가하는 것을 확인하였으며, 125 fM에서 16.3nm의 LSPR λ_max이동이 관찰되어 현저한 민감도를 보이는 것을 확인하였다 (도 7C 및 도 7D).

3-3 : 메틸화 수에 따른 파장 변화 측정 및 메틸화 수 의존적 LSPR 포화정도 확인

프로모터(표적핵산) 내에 존재하는 mCpG 수에 따른 LSPR 최대파장 이동정도 및 LSPR 최대파장 이동의 포화정도를 결정하기 위해 DNA 서열상에 mCpG가 1개 내지 4개가 존재하도록 표 3의 서열과 같이 타겟 DNA 및 이에 따른 PNA 서열을 합성하였다 (바이오니아, 한국).

mCpG 수에 따른 서열 및 PNA 프로브

mCpG 수	염기서열	서열번호
1 mCpG	5'-CTTTCGTTCCTC mCG GCAGGCGGATCGCTAA-3’	서열번호 11
2 mCpG	5'-CTTTCGTTCCTC mCG GCAGG mCG GATCCGTAA-3’	서열번호 12
3 mCpG	5'-CTTT mCG TTCCTC mCG GCAGG mCG GATCCGTAA-3’	서열번호 13
4 mCpG	5'-CTTT mCG TTCCTC mCG GCAGG mCG GATC mCG TAA-3	서열번호 14
PNA probe	5'-NH₂-linker-GAGGAACGAAAG-3'	서열번호 15

본 발명에서 사용한 30nm 크기의 금 나노스타는 표면으로부터 약 20nm에 해당하는 부분이 플라즈몬 민감 지역이며, 상기에서 각각의 mCpG를 포함하고 있는 각각의 서열은 30bp길이를 가지므로, 약 10.3nm(10bp당 약 3.4nm)에 해당하며 표면 플라즈몬 공명 영역의 민감지역에 포함된다 (도 8A).

메틸화된 CpG의 수에 따라 최대 파장 이동값의 변화를 확인한 결과, 메틸화된 CpG에 의존적으로 최대 파장 이동값이 증가하는 것을 확인하였으며, 메틸화된 CpG 부위가 3개 및 4개가 존재할 때 최대파장 이동값은 각각 24nm 및 24.8nm을 보여 LSPR 스펙트럼 이동의 포화정도를 확인할 수 있었다 (도 7B).

3-4 : 금 나노스타 표면 수직 또는 수평 결합된 PNA 프로브에 따른 프로모터 내의 mCpG 위치 확인

프로모터(표적핵산) 내에 존재하는 mCpG 위치에 따른 LSPR 최대파장 이동도를 측정하기 위해, p53 프로모터의 213-BAP 지역에 존재하는 4개의 mCpG 위치인 전사시작위치(+1)로부터 업스트림 전사조절부분의 -105, -77, -35 및 +1위치에 각각 mCpG가 포함되도록 서열을 제조하였다 (표 4).

mCpG 위치에 따른 서열

		서열번호
1 mCpG site at -105 position	5'-TCCGGCAGGCGGATTACT mCGC CCTTACTTGTCATGGCGACTGTCCAGCTTTGTGCCAGGAGCCTCGCAGGGGTTGATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGGCGCTAAAA-3'(+1)	서열번호 16
1 mCpG site at -77 position	5'-TCCGGCAGGCGGATTACTCGCCCTTACTTGTCATGGCGACTGTCCA mCG TTTGTGCCAGGAGCCTCGCAGGGGTTGATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGGCGCTAAAA-3'(+1)	서열번호 17
1 site at -35 position	5'-TCCGGCAGGCGGATTACTCGCCCTTACTTGTCATGGCGACTGTCCACGTTTGTGCCAGGAGCCTCGCAGGGGTTGATGGGATTGGGGT mCG TCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGGCGCTAAAA-3'(+1)	서열번호 18
1 site at +1 position	5'-TCCGGCAGGCGGATTACTCGCCCTTACTTGTCATGGCGACTGTCCACGTTTGTGCCAGGAGCCTCGCAGGGGTTGATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGG mCG CTAAAA-3'(+1)	서열번호 19
PNA probe (수직)	5'-AATC()CGCCTGC()CGGA-3'	서열번호 20
PNA probe (수평)	5'-GGTCGA()AACACGGT()CCTC-3'	서열번호 21

(상기 *은 PNA 프로브 서열 내에 -NH₂기가 도입된 부분)

수평으로 결합하는 PNA 프로브의 경우, p53 프로모터의 가운데 부분에 결합하도록 합성하였으며, PNA 서열 내에 2 군데에 -NH₂기(상기 서열에서 *로 표시된 부분)를 도입하여 PNA 프로브를 제작하였다.

그 다음, 실시예 1에서 제조한 나노플라즈모닉 바이오센서에 PNA 프로브를 주입하여 금 나노스타 표면에 수직 또는 수평으로 고정되도록 한 후, 상기에서 제작한 -105, -77, -35 및 +1위치에 각각 mCpG가 포함되도록 제조한 p53 프로모터를 주입하여 금 나노스타-PNA 프로브-p53 프로모터 복합체가 형성되도록 하였다. 그 후 MBD2를 처리하여 p53 프로모터 상의 mCpG에 결합하도록 유도한 뒤, 암시야 공명 현미경을 이용한 광 산란(Light scattering) 스펙트럼 측정하여, LSPR 산란 최대 파장 이동값(λ_max)을 계산하였다.

그 결과, PNA 프로브를 수직으로 금 나노스타 표면에 고정시킨 경우에는 최대 파장 이동값이 p53 프로모터 상의 -105, -77, -35 및 +1위치에 따라 각각 16.5 nm, 15.2 nm, 13.8 nm, 13.2 nm을 나타내는 것을 확인하였다 (도 9A). 즉 10bp의 길이를 3.4nm로 계산하여 mCpG-MBD2 결합된 부분의 위치를 계산하면 금 나노스타로 부터 각각 6.1nm, 14.5nm, 28.8nm, 35.7nm 떨어져있는 것을 확인할 수 있으며, 금 나노스타로부터의 mCpG의 위치에 따라 최대 파장 이동값에 차이가 발생하는 것을 확인할 수 있었다.

반면, PNA 프로브를 수평으로 금 나노스타 표면에 고정시킨 경우에는 최대 파장 이동값은 약 16.5nm로, mCpG 위치변화에 따른 최대 파장 이동정도가 서로 비슷하게 나타나는 것을 확인하였다 (도 9B). 이는 수평고정된 PNA 프로브와 p53 프로모터의 혼성화는 mCpG 위치에 상관없이 금 나노스타로부터의 길이가 같기 때문에 p53 프로모터의 mCpG 위치에 영향을 받지 않기 때문으로 판단된다.

나노플라즈모닉 바이오센서를 이용한 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2 다중 검출

4-1 : 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2 다중 검출을 위한 재료 준비

실제 세포주에서의 p53프로모터의 메틸화 정도 및 MBD2의 과발현 여부를 판단하기 위해, HEK 293 세포(Hk; CRL-1573™) 및 HeLa 세포(He; CCL-2™)를 이용하여 실험을 수행하였다.

먼저, HeLa cell(He; CCL-2™) 및 HEK-293 cell(Hk; CRL-1573™)의 지노믹 DNA는 AccuPrep ^R Genomic DNA Extract Kit (바이오니아, 한국)를 사용하여 매뉴얼을 바탕으로 분리하였다. p53 프로모터의 BAP 지역을 포함하는 358bp를 수득하기 위해 XbaI (TCTAGA, 427/431; New England Biolabs, 미국) 및 BamHI (GGATCC, 73/77; New England Biolabs, 미국)를 처리하였으며, 양성대조군은 실시예 2-2에서 CpG 메틸트랜스퍼레이즈(M.SssI; NEB biolabs, MA, USA)를 사용하여 모든 CpG를 메틸화시킨 서열을 사용하였다.

각 세포의 MBD2 단백질은 시중에 판매되는 재조합 MBD2 단백질(NEB, 미국)과 HEK 293 세포(Hk; CRL-1573™) 및 HeLa 세포(He; CCL-2™)의 핵 추출물을 이용하였다.

추후, 본 발명의 나노플라즈모닉 바이오센서로 측정한 각 세포의 p53 프로모터의 메틸화 정도 및 MBD2의 발현정도를 측정하였을 때, 값에 대한 신뢰성을 판단하기 위해, HeLa 세포 및 HEK 293 세포의 총 메틸화 정도 및 핵 추출물 속에 포함된 MBD2 농도를 측정하였다.

실험에서 사용한 HeLa 세포 및 HEK 293 세포의 총 메틸화 정도를 측정하기 위해, Imprint^® Methylated DNA Quantification kit(Sigma Aldrich, 미국)를 이용하여 어세이를 수행하였으며, 그 결과 HeLa 세포가 HEK 293 세포에 비해 메틸화 정도가 높은 것을 확인하였다 (도 10A). 또한, HeLa 세포 및 HEK 293 세포의 핵 추출물 속에 포함된 MBD2 단백질은 MBD2 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA방법으로 측정하였으며, 그 결과 HeLa 세포에서 MBD2 단백질이 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다 (도 10B)

4-2 : 메틸화된 p53 프로모터 및 MBD2 다중 검출

HeLa 세포가 HEK 293 세포의 p53 프로모터를 인지할 수 있는 PNA 프로브를 제작하였으며, 금 나노스타 표면에 PNA 프로브를 안정적으로 결합시키기 위해 PNA 프로브 내부에 PNA 서열 내에 2 군데에 -NH₂기(서열에서 *로 표시된 부분)가 도입되로록 제작하였다.

[서열번호 22]

PNA 프로브 : 5'-CTGAGA(*)GCAAACGC(*)AAAA-3

(서열에서 *로 표시된 부분은 -NH₂기가 도입된 부분)

폐쇄형 챔버안에서 유리 기판 위에 고정된 금 나노스타 표면에 PNA 프로브를 안정적으로 결합시키기 위해 상기 PNA 프로브(서열번호 22)를 고정시킨 후, 실시예 4-1에서 분리한 p53 프로모터 단편을 각각 챔버 안으로 주입하고 52℃, pH5.4에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 100mM 염화나트륨을 처리하고 온도를 64℃로 증가시켜 비특이적인 반응을 제거하였다. 양성 대조군으로 표 2의 모든 CpG를 메틸화시킨 p53 프로모터를 사용하였다.

그 후, 실시예 4-1에서 분리한 HeLa 세포 및 HEK 293 세포의 핵 추출물 및 125fM의 MBD2 단백질(양성 대조군 및 mCpG detector; NEB, 미국)을 각각 챔버 안으로 주입한 다음, 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 암시야 공명 현미경을 이용한 광 산란(Light scattering) 스펙트럼 측정하여, LSPR 산란 최대 파장 이동값(Δλ_max)을 계산하였다.

HeLa 세포 및 HEK 293 세포의 p53 프로모터가 PNA 프로브와 결합했을 때와, p53 프로모터 내의 mCpG에 MBD2가 결합했을 때의 스페트럼 변화를 암시야 현미경으로 관찰하였을 때, HeLa 세포의 p53 프로모터(He-dsp53)은 양성 대조군(mdsp53)과 유사한 수준으로 파장의 이동이 관찰되었으나, HEK293 세포의 p53 프로모터의 경우 파장 이동이 미미한 것을 확인하였다 (도 11). 이는 실시예 4-1의 도 10A의 총 메틸화 정도와 유사한 결과로, HeLa 세포의 p53 프로모터 내에 메틸화된 CpG가 높은 수준으로 존재하는 것을 의미하며, HEK293 세포의 경우 p53 프로모터 내 메틸화된 CpG가 거의 존재하지 않는 것을 의미한다.

p53의 프로모터의 메틸화 정도와 MBD2의 동시 검출에 있어서, 도 12A 나타난 바와 같이, HeLa 세포의 p53 프로모터에 각각의 MBD2를 반응시킨 경우 재조합 MBD2(Rec MBD2), He-MBD2, Hk-MBD2에서 각각 21.5nm, 17.0nm, 2.9nm의 최대 파장 이동값을 보여 HeLa 세포에서 MBD2가 과발현되는 것을 확인하였으며, 이는 실시예 4-1의 도 10B의 MBD2 정량 값과 유사한 것을 확인하였다.

HEK293 세포의 p53 프로모터에 각각의 MBD2를 반응시킨 경우에는, 재조합 MBD2(Rec MBD2), He-MBD2, Hk-MBD2에서 각각 3.0nm, 2.0nm, 2.1nm의 최대 파장 이동값을 보이는 것을 확인하였으며, 이는 HEK293 세포의 p53 프로모터 내에 메틸화 된 부분이 거의 없어 MBD2 처리에 따른 파장의 변화가 크지 않기 때문이라고 볼 수 있다.

4-3 : HeLa 세포 및 HEK293 세포의 p53 프로모터 내 mCpG 수 측정

HeLa 세포 및 HEK293 세포의 p53 프로모터 내 mCpG 수 측정하기 위한 실험의 경우, 세포 성장기의 세포를 사용하게 되면, DNA 복제과정 동안 메틸화가 발생하지 않기 때문에 정확한 mCpG 수 측정이 불가능하므로, 본 실험에서는 세포 성장 정체기에 실시예 4-1의 방법으로 p53 프로모터를 분리하였으며, 세포마다 메틸화된 정도에 차이가 발생하므로, 각각 15개의 샘플에서 p53 프로모터를 분리하였다.

또한, HeLa 세포 및 HEK 293 세포의 p53 프로모터는 내에 존재하는 mCpG 수를 정확히 측정하기 위해, 폐쇄형 챔버 안에서 유리 기판 위에 고정된 금 나노스타에 PNA 서열 내에 2 군데에 -NH₂기가 도입된 PNA 프로브(서열번호 22)를 고정시켜 실험을 수행하였다.

그 후, HeLa 세포 및 HEK 293 세포의 핵 추출물 및 125fM의 MBD2 단백질(양성 대조군 및 mCpG detector; NEB, 미국)을 각각 챔버 안으로 주입한 다음, 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 암시야 공명 현미경을 이용한 광 산란(Light scattering) 스펙트럼 측정하여, LSPR 산란 최대 파장 이동값(Δλ_max)을 계산하였다.

그 결과, HeLa 세포의 p53 프로모터 내에 대략적인 mCpG를 측정할 수 있으며, HEK293 세포의 경우, 2개의 샘플을 제외하고는 p53 프로모터 내에는 메틸화가 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다 (도 12B).

p53 프로모터 상의 전자인자 바인딩 도메인( transcrption factor binding domain)의 메틸화에 따른 전사인자의 입체장애 모니터링

각각의 기본 프로모터 활성 지역(-213 ~ +1) 및 짧은 RNA 인코딩 DNA 절편(+1 ~ +30)을 포함하는 메틸화된 전사인자 바인딩 도메인 서열은(HeLa 세포에서 분리한 샘플) PNA 프로브(서열번호 20)가 수평으로 고정된 금 나노스타와 반응시켜 커버글라스 위에 고정시켰다. 125fM의 재조합 MBD2를 챔버 안으로 주입시킨 다음, 1시간 동안 반응시키고, 0.5X PBS 버퍼로 세척하여 결합하지 않은 MBD2를 제거하였다. AP-1(AP1S2; Mybiosource, 미국), NF-κB(p50; Sigma Aldrich , 미국), YY-1(P01; Abnova, 대만), c-Myc (SRP 2089-5UG; Sigma Aldrich , 미국) 각각의 전사인자 및 RNA polymerase Ⅱ(p33서브 유닛; Sigma Aldrich , 미국)을 반응 챔버 안으로 주입시킨 다음, 1시간 동안 반응시켰다.

MBD2가 결합되어 있는 메틸화된 전사인자 바인딩 도메인 상의 전사인자 결합 속도는 LSPR 스펙트럼의 최대파장 이동정도를 측정하였다.

그 결과, MBD2를 결합시켰을 때, 16.3nm의 최대파장이 이동하는 것을 측정하였으나, 전사인자를 반응시켰을 때 붉은 파장으로 더 이상의 이동은 없는 것을 관찰하였다(도 13). 이는 MBD2가 전사인자 바인딩 도메인의 mCpG에 완전히 결합하여, 입체장애로 인해 중요한 전사인자의 결합이 이루어지지 못했기 때문으로 판단된다.

p53 프로모터의 메틸화에 따른 전사속도 측정

본 발명에서 p53 프로모터의 메틸화에 따른 전사속도를 측정하기 위해, MBD2 존재하에 메틸화된 프로모터상에서 RNA 중합효소(RNAP Ⅱ)의 결합 속도를 측정하였다.

먼저, 엑손 1(+1 에서 +30)이 포함된 mdsp53 프로모터 및 임상적 샘플에서 분리한 메틸화되지 않은 dsp53 프로모터를 PNA가 고정된 금 나노스타와 혼성화 시켰다. 그 다음, MBD2를 챔버 안으로 주입한 후, 37℃에서 3분동안 전 반응시킨 다음, 각각의 전사인자(AP-1, NF-κB, YY-1, c-Myc) 및 리보뉴클레오타이드를 첨가하여 전사 반응을 유도하였다.

스펙트럼 변화를 측정하여 전사 속도를 측정한 결과, 표 5 및 도 14에 나타난 바와 같이, 메틸화된 p53 프로모터의 경우, MBD2결합에 개시전 복합체(pre-initiation complex)가 형성이 저해되어 메틸화되지 않은 p53 프로모터에 비해 LSPR 최대 파장 이동 변화가 크지않은 것을 확인하였다 (도 15 A 및 B). MBD2의 존재 여부에 따른 파장 변화는 MBD2 결합에 따른 차이로 판단된다.

전사활성 분석은 송민선 등의 논문에 기재된 내용을 참고로(Min Sun Song et al., Adv . Mater ., 25:1265, 2013) 분석하였다. 반응속도 상수는 k= ln₂/t₁ _/2(수학식 2)을 이용하여 측정하였으며,

상기의 반응속도를 이용해 프로모터의 활성을 분석하기 위해 프로모터의 활성을 나타내는 식 v=k_tK을 다음과 같은 가정들로 인해 하기와 같은 수학식 3으로 변경하여 분석하였다.

[수학식 3]

이때, k _t 는 전사과정의 전체 반응속도 상수, K는 결합상수, RV는 상대 프로모터 활성, k _b 는 프로모터에 대한 RNA 폴리머레이즈의 결합 속도 상수, Δλ_max 는 단백질의 결합으로 인한 파장 이동 값, 아래 첨자 i는 각 변이 프로모터의 종류를 나타낸다. 스펙트럼의 파장 이동 값은 단백질의 결합 정도와 비례하기 때문에 이는 결합 친화도 즉, 결합상수의 척도가 될 수 있다.

MBD2 존재 여부에 따른 전사속도 비교

	Presence of MBD2	Without MBD2
mdsp53	0.547 s^-1	0.066 s^-1
he-dsp53	0.227 s^-1	0.072 s^-1
mAP1	0.121 s^-1	0.068 s^-1
mNF-κB	0.101s^-1	0.072 s^-1
hk-dsp53	0.092 s^-1	0.035 s^-1
umdsp53	0.0224 s^-1	0.0254 s^-1

각 전사인자 바인딩 도메인의 메틸화에 따른 후성유적학적 매개 전사억제 측정

각각의 전사인자 바인딩 도메인 내에 메틸화된 CpG가 존재함에 따른 후성유전학적 매개 전사억제 정도를 측정하기 위해, 메틸화되지 않은 p53 프로모터(서열번호 6), 메틸회된 p53 프로모터(양성대조군, 서열번호 5)와 메틸화된 mCpG를 포함하는 AP-1, NF-κB 전사인자 바인딩 도메인 서열(각각 서열번호 23 및 25, 표 6)을 이용하여 실험을 수행하였다.

AP-1, NF-κB 전사인자 바인딩 도메인 서열 및 PNA 프로브

이름	염기서열	서열번호
NF-kB	5'-GCCAGGAGCCT mCG CAGGGGTTGATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCCTGGCGCTAAAAgttttgagcttctcaaa agtctagagccacc-3	서열번호 23
NF-kB PNA probe	5'-GTCCCCA()ACTACC()CTA -3	서열번호 24
AP-1	5'-TATCTACGGCACCAGGT mCG G mCG AGAATCCTGACTCTGCACCCTCCTCCCTGGCGCTAAAAgttttgagcttctcaaa agtctagagccacc-3'	서열번호 25
AP-1 PNA probe	5'-CTTAG()GACTGAGA()CG -3'	서열번호 26

(상기 *은 PNA 프로브 서열 내에 -NH₂기가 도입된 부분)

각각의 타겟 DNA에 특이적인 PNA 프로브를 수평으로 금 나노스타에 고정시킨 다음, 타겟 DNA를 챔버 안으로 주입하여 52℃, pH5.4에서 2시간 동안 반응시켰으며, 비특이적인 결합을 방지하기 위해 온도를 64℃로 올리고, 염화나트륨 농도는 100mM로 처리하였다. 그 다음, MBD2를 챔버 안으로 주입한 후, 37℃에서 3분동안 전 반응시킨 다음, 각각의 전사인자 및 리보뉴클레오타이드를 첨가하여 전사 반응을 유도하였다.

스펙트럼 변화를 측정한 결과, 전사인자 바인딩 도메인 내의 mCpG에 결합한 MBD2의 존재하에 메틸회된 p53 프로모터(mdsp53)와 메틸화된 mCpG를 포함하는 AP-1, NF-κB 전사인자 바인딩 도메인이 메틸화되지 않은 p53 프로모터(umdsp53)에 비해 전사속도가 감소하는 것을 확인하였다 (도 17).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Methods for Detection Methylation on Promoter and Methods for Detection and Tracking Epigenetics Alterations by DNA methylation Using Nanoplasmonic Biosensor <130> P14-B045 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P53Bac-F <400> 1 gggagaaaac gttagggtgt gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P53Bac-R <400> 2 ccaatccagg gaagcgtgtc ac 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P53P-F <400> 3 tgcaccctcc tccccaactc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P53P-R <400> 4 ctccctggac ggtggctcta g 21 <210> 5 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mdsp53 promoter <220> <221> misc_difference <222> (6) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (9) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (62) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (69) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (96) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (124) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (175) <223> 5-methylcytosine <400> 5 caggtcggcg agaatcctga ctctgcaccc tcctccccaa ctccatttcc tttgcttcct 60 ccggcaggcg gattacttgc ccttacttgt catggcgact gtccagcttt gtgccaggag 120 cctcgcaggg gttgatggga ttggggtttt cccctcccat gtgctcaaga ctggcgctaa 180 aagttttgag cttctcaaaa gtctagagcc acc 213 <210> 6 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> umsp53 promoter <400> 6 caggtcggcg agaatcctga ctctgcaccc tcctccccaa ctccatttcc tttgcttcct 60 ccggcaggcg gattacttgc ccttacttgt catggcgact gtccagcttt gtgccaggag 120 cctcgcaggg gttgatggga ttggggtttt cccctcccat gtgctcaaga ctggcgctaa 180 aagttttgag cttctcaaaa gtctagagcc acc 213 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA for Mdsp53 promoter <220> <221> misc_difference <222> (1) <223> NH2 linker <400> 7 aatccgcctg ccgga 15 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-1 (oligo from human GAPDH gene) (NCBI JN613429) <400> 8 tgcagcaatg cctcctgcac caccaactgc ttag 34 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-2 (oligo from elongator complex gene 3)(NCBI) <400> 9 gacaaataca cacacagcct tgccgtgaat tg 32 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-3 (Oligo from SP6 promoter) <400> 10 ggatgcatag cttgagtatt ctatagtgtc acctaaat 38 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 mCpG DNA <220> <221> misc_difference <222> (13) <223> 5-methylcytosine <400> 11 ctttcgttcc tccggcaggc ggatcgctaa 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 mCpG DNA <220> <221> misc_difference <222> (13) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (20) <223> 5-methylcytosine <400> 12 ctttcgttcc tccggcaggc ggatccgtaa 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 mCpG DNA <220> <221> misc_difference <222> (5) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (13) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (20) <223> 5-methylcytosine <400> 13 ctttcgttcc tccggcaggc ggatccgtaa 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4 mCpG DNA <220> <221> misc_difference <222> (13) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (5) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (13) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (20) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (26) <223> 5-methylcytosine <400> 14 ctttcgttcc tccggcaggc ggatccgtaa 30 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <220> <221> misc_difference <222> (1) <223> NH2-linker <400> 15 gaggaacgaa ag 12 <210> 16 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 mCpG site at -105 position <220> <221> misc_difference <222> (19) <223> 5-methylcytosine <400> 16 tccggcaggc ggattactcg cccttacttg tcatggcgac tgtccagctt tgtgccagga 60 gcctcgcagg ggttgatggg attggggttt tcccctccca tgtgctcaag actggcgcta 120 aaa 123 <210> 17 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 mCpG site at -77 position <220> <221> misc_difference <222> (47) <223> 5-methylcytosine <400> 17 tccggcaggc ggattactcg cccttacttg tcatggcgac tgtccacgtt tgtgccagga 60 gcctcgcagg ggttgatggg attggggttt tcccctccca tgtgctcaag actggcgcta 120 aaa 123 <210> 18 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 site at -35 position <220> <221> misc_difference <222> (89) <223> 5-methylcytosine <400> 18 tccggcaggc ggattactcg cccttacttg tcatggcgac tgtccacgtt tgtgccagga 60 gcctcgcagg ggttgatggg attggggtcg tcccctccca tgtgctcaag actggcgcta 120 aaa 123 <210> 19 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 site at +1 position <220> <221> misc_difference <222> (116) <223> 5-methylcytosine <400> 19 tccggcaggc ggattactcg cccttacttg tcatggcgac tgtccacgtt tgtgccagga 60 gcctcgcagg ggttgatggg attggggttt tcccctccca tgtgctcaag actggcgcta 120 aaa 123 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <220> <221> misc_difference <222> (4)..(5) <223> C3-NH2 linker <220> <221> misc_difference <222> (11)..(12) <223> C3-NH2 linker <400> 20 aatccgcctg ccgga 15 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <220> <221> misc_difference <222> (6)..(7) <223> C3-NH2 linker <220> <221> misc_difference <222> (14)..(15) <223> C3-NH2 linker <400> 21 ggtcgaaaca cggtcctc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <220> <221> misc_difference <222> (6)..(7) <223> C3-NH2 linker <220> <221> misc_difference <222> (14)..(15) <223> C3-NH2 linker <400> 22 ctgagagcaa acgcaaaa 18 <210> 23 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kB <220> <221> misc_difference <222> (13) <223> 5-methylcytosine <400> 23 gccaggagcc tcgcaggggt tgatgggatt ggggttttcc cctcccatgt gctcctggcg 60 ctaaaagttt tgagcttctc aaaagtctag agccacc 97 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kB PNA probe <220> <221> misc_difference <222> (13)..(14) <223> C3-NH2 linker <220> <221> misc_difference <222> (7)..(8) <223> C3-NH2 linker <400> 24 gtccccaact acccta 16 <210> 25 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-1 <220> <221> misc_difference <222> (18) <223> 5-methylcytosine <220> <221> misc_difference <222> (21) <223> 5-methylcytosine <400> 25 tatctacggc accaggtcgg cgagaatcct gactctgcac cctcctccct ggcgctaaaa 60 gttttgagct tctcaaaagt ctagagccac c 91 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-1 PNA probe <220> <221> misc_difference <222> (5)..(6) <223> C3-NH2 linker <220> <221> misc_difference <222> (13)..(14) <223> C3-NH2 linker <400> 26 cttaggactg agacg 15

Claims

다음 단계를 포함하는 표적핵산의 CpG 부위 메틸화 검출방법:
(a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계;
(b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및
(c) 메틸화된 CpG 부위의 MBD2 단백질 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도(Δλmax) 분석을 통해 표적핵산 CpG 부위 메틸화 여부를 분석하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 표적핵산은 p53 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있거나, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 아민(NH₂)기는 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수직으로 고정되며, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수평으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위 개수 측정방법:
(a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계;
(b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및
(c) 메틸화된 CpG 부위의 MBD2 단백질 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도 분석을 통해 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위 개수를 측정하는 단계.
제6항에 있어서, 상기 표적핵산은 p53 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있거나, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 아민(NH₂)기는 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수직으로 고정되며, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수평으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 표적핵산의 메틸화에 따른 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
(a) 표적핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 표적핵산 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 표적핵산을 포함하는 시료를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-표적핵산 복합체를 형성시키는 단계;
(b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계; 및
(c) 메틸화된 CpG 부위의 MBD2 단백질 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도(Δλmax) 분석을 통해 표적핵산의 CpG 부위 메틸화 여부를 분석하는 단계.
제11항에 있어서, 상기 표적핵산은 p53 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있거나, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 아민(NH₂)기는 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수직으로 고정되며, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수평으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 프로모터 내의 전사인자 결합 도메인의 CpG 부위 메틸화 검출방법:
(a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계;
(b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 전사인자 결합 도메인의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도시킨 후, 전사인자를 첨가하는 단계; 및
(c) 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 프로모터 내의 전사인자 결합 도메인의 CpG 부위 메틸화 여부를 검출하는 단계.
제16항에 있어서, 상기 프로모터는 p53 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있거나, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 아민(NH₂)기는 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수직으로 고정되며, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수평으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 프로모터의 CpG 부위 메틸화에 따른 전사활성 억제를 측정하는 방법:
(a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계;
(b) 상기 형성된 복합체에 MBD2(Methyl-CpG-binding domain protein 2) 단백질을 접촉시켜 표적핵산의 메틸화된 CpG 부위와 결합을 유도시킨 다음, RNA 폴리머레이즈 및 전사인자를 처리하는 단계; 및
(c) RNA 폴리머레이즈 및 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 프로모터의 활성을 분석하고, 메틸화되지 않은 프로모터와 비교하여 유전자 전사활성을 분석하는 단계.
제21항에 있어서, 상기 프로모터는 p53 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있거나, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 아민(NH₂)기는 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수직으로 고정되며, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수평으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에있어서, 상기 전사인자는 NF-κB, YY1, c-Myc 및 AP-1으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 프로모터 CpG 부위 메틸화에 따른 전사인자 단백질의 경쟁적 상호작용을 모니터링하는 방법:
(a) 프로모터의 5' 말단 또는 3' 말단 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수직 또는 수평으로 고정되어 있거나, 프로모터 가운데 부분과 혼성화하는 PNA 프로브가 수평으로 고정되어 있는 금 나노스타를 기반으로 한 플라즈모닉 센서에 프로모터를 처리하여 금 나노스타-PNA 프로브-프로모터 복합체를 형성시키는 단계;
(b) 상기 형성된 복합체에 RNA 폴리머레이즈, MBD2 및 전사인자를 접촉시켜 프로모터의 CpG 부위와 결합을 유도하는 단계;
(c) MBD2, RNA 폴리머레이즈 및 전사인자의 결합에 따른 광산란 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 최대 파장 이동도와 반응속도 상수의 분석을 통해 전사인자 단백질의 경쟁적 상호작용을 모니터링 하는 단계.
제27항에 있어서, 상기 프로모터는 p53 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있거나, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 아민(NH₂)기는 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 5'말단에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수직으로 고정되며, PNA 프로브 내부에 아민(NH₂)기가 결합되어 있는 경우 PNA 프로브는 금 나노스타에 수평으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 전사인자는 NF-κB, YY1, c-Myc 및 AP-1으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.