KR101609299B1

KR101609299B1 - 재조합 숙주 비의존성 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스

Info

Publication number: KR101609299B1
Application number: KR1020130040051A
Authority: KR
Inventors: 김성현; 에반슨 오이스틴
Original assignee: 제주광어주식회사
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2016-04-05
Also published as: KR20140122947A

Abstract

본 발명은 (a) 바이러스성 출혈패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV) 뉴클레오타이드 서열 중 상기 뉴클레오타이드 서열의 3'-비번역지역 말단에 존재하는 팬핸들 RNA 이차구조의 내부고리 열림 지점 4번 및 5번 A-G를 G-A로 변환한 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 AG4-5GA VHSV 풀 지놈(Genome) 플라스미드(KCTC12380BP)를 제공한다. 본 발명의 플라스미드를 이용하여 재조합 약독화 생백신을 제조할 경우 기존의 방식으로 재조합 약독화 생백신을 제조한 것에 비해 안정성이 현저히 증가하는 장점이 있다.

Description

재조합 숙주 비의존성 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스{Recombinant Host-independent Live Attenuated Viral Hemorrhagic Septicemia Virus}

본 발명은 재조합 숙주 비의존성 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

바이러스성 출혈패혈증은 세계적으로 다양한 어류에 치명적인 병원성을 가지며, 경제적으로 중요한 질병으로 지정된 병원체이다. 현재 공지된 바이러스 분리주는 랍도비리데(Rhabdovidae)과, 노버랍도비리데(Novirhabdoviridae)속에 속하며, 여러 유전자형(genotype)이 존재한다.

바이러스성 출혈패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)는 70여종의 담수 해수어류에 감염되며, 특히 세계적 대표 양식 어종인 무지개송어, 넙치 및 터봇에서 그 경제적 피해가 크다(Ammayappen et al.,2009;Bain et al.,2010;Kim S.M.,2003;Kim et al.,2009).

VHSV는 단일 네가티브 극성 비분절 RNA 외피(enveloped) 바이러스이며, 3'-비번역지역 말단 뉴클레오타이드와 5'비번역 지역 말단 뉴클레오타이드가 상보적이며, RNA 팬핸들 이차 구조를 형성한다(Ammayappan et al.,2009).

단일 네가티브 극성 RNA 바이러스인 인플렌자 바이러스의 경우 3'-비번역 지역 말단은 RNA 의존성 RNA 폴리메라제(RNA-dependent-RNA-polymerase, RdRp)에 의해 인식되며, 이는 바이러스의 전사(transcription)와 복제(replication)과정에 중요한 영향을 미치며, 3'- 및 5'- 비번역 지역 말단 뉴클레오타이드들이 상보적으로 형성하는 RNA 팬핸들 구조의 내부 고리는 바이러스 재생산에 결정적인 역할을 한다(Bae et al.,2001).

단일 네가티브 극성 RNA 바이러스인 인플렌자 바이러스의 RdRp는 엔트로피 값을 줄이기 위하여 말단지역에 형성되는 내부 고리와 결합을 선호한다(Bae et al.,2001)

단일 네가티브 극성 RNA 바이러스의 말단 프로모터 지역은 바이러스의 전사와 복제과정에 결정적인 역할 뿐만 아니라, 단백질 막 형성(encapsidation) 및 조립에도 관여한다(Whelan et al.,2010).

랍도비리데과 VSV(vesicular stomatitis virus)의 경우 말단 프로모터 지역은 바이러스의 생산력에 결정적 영향을 미친다(Whelan et al.,2010;Whelan et al.,2002;Whelan et al.,1999).

양식 어류에 감염성 및 병원성이 높은 바이러스성 출혈패혈증 바이러스(VHSV)를 깁스자유에너지 값에 의해 예상 되어진 비번역지역 말단에 존재하는 RNA 팬핸들 이차구조 분석을 바탕으로 바이러스의 능률적인 초기 전사과정에 결정적인 역할을 할 것으로 추정되는 내부 고리 열림 지점에 위치하는 뉴클레오타이드를 변이할 경우 기존의 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 백신에 비해 안전성 및 약독화 정도를 비약적으로 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다. 하지만, 이와 관련한 문헌은 개시되지 않은 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 기존의 바이러스성 출혈패혈증 백신과 비교하여 안전성이 뛰어난 약독화 백신을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 출혈패혈증 바이러스(VHSV)를 깁스자유에너지 값에 의해 예상 되어진 비번역지역 말단에 존재하는 RNA 팬핸들 이차구조 분석을 바탕으로 바이러스의 능률적인 초기 전사과정에 결정적인 역할을 할 것으로 추정되는 내부 고리 열림 지점에 위치하는 4번과 5번 두개의 뉴크레오타이드 (A-G)를 상호 위치를 교환한 후 재조합하고, 이후 역유전(reverse genetics) 시스템에 의해 재조합 바이러스를 재생산할 경우 안전성이 매우 현저한 약독화 백신을 개발할 수 있다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 약독화된 출혈패혈증 바이러스를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약독화된 바이러스를 제조하는데 이용하는 플라스미드를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약독화 바이러스를 포함하는 백신을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 약독화 바이러스 백신을 제공한다.

본 발명자들은 기존의 바이러스성 출혈패혈증 백신과 비교하여 안전성이 뛰어난 약독화 백신을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 출혈패혈증 바이러스(VHSV)를 깁스자유에너지 값에 의해 예상 되어진 비번역지역 말단에 존재하는 RNA 팬핸들 이차구조 분석을 바탕으로 바이러스의 능률적인 초기 전사과정에 결정적인 역할을 할 것으로 추정되는 내부 고리 열림 지점에 위치하는 4번과 5번 두개의 뉴크레오타이드 (A-G)를 상호 위치를 교환한 후 재조합하고, 이후 역유전(reverse genetics) 시스템에 의해 재조합 바이러스를 재생산할 경우 안전성이 매우 현저한 약독화 백신을 개발할 수 있다는 사실을 확인하였다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 바이러스성 출혈패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV) 뉴클레오타이드 서열 중 상기 뉴클레오타이드 서열의 3'-비번역지역 말단에 존재하는 팬핸들 RNA 이차구조의 내부고리 열림 지점 4번 및 5번 A-G를 G-A로 변환한 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 AG4-5GA VHSV 풀 지놈(Genome) 플라스미드(KCTC12380BP)를 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어‘바이러스성 출혈패혈증 바이러스 (VHSV)’는 랍도비리데과 노버랍도비리데속에 속하는 VHSV 여러 유전자형의 모든 구성원을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어‘약독화 VHSV’는 본 발명의 약독화 VHSV가 유래되는 야생형 VHSV 병독성이, 주요 임상 매개변수에 대해 예컨대, VHSV의 경우 동일용량, 바람직하게는 4×10³TCID₅₀으로 감염된 동물의 누적 폐사율에 대해 서로 통계적으로 유의적인 차이가 있다는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어‘뉴클레오타이드’는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 (primer)로서 타깃 병원체 핵산과의 혼성화를 통하여 타깃 병원체 핵산을 증폭하는데 사용된다. 본 명세서에서 용어 “프라이머”는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 뉴클레오타이드 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 발명의 바이러스성 출혈패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV) 서열 중 상기 뉴클레오타이드 서열의 3'-비번역지역 말단에 존재하는 팬핸들 RNA 이차구조의 내부고리 열림 지점 4번 및 5번 A-G를 G-A로 변환한 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 상기 변환 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.

본 명세서에서, 용어 “작동적으로 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 상기 변환 뉴클레오타이드 서열에 연결된 프로모터는 다양한 프로모터가 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 프로모터는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다. 예를 들어, 인간 연장인자 1α(hEF1α) polyA, 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 발현 컨스트럭트는 벡터와 같은 유전자 운반체에 포함되는 것이 바람직하다. 본 발명에 이용될 수 있는 발현벡터 백본은 당업계에 공지된 다양한 벡터로부터 선택할 수 있다. 예를 들어, pIRES2-EGFP 발현벡터, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, YIp5, YCpl9, 엡스테인-바 바이러스 벡터, pMSG, pAV009/A⁺, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE, pSecTag2B 또는 yT&A 벡터의 구조를 기본적인 백본으로 가질 수 있다.

본 발명은 발명의 목적을 달성하기 위하여 '네가티브 RNA 바이러스의 말단 프로모터 지역은 바이러스의 전사와 복제과정에 결정적인 역할에 관여한다(Wertz et al.,1994;Whelan et al.,2010;Whelan et al.,2002; Whelan et al.,1999)'는 연구 근거를 바탕으로 깁스자유에너지 값에 의해 예상된 VSHV의 RNA 팬핸들 이차구조의 내부고리 열림 지점의 4번, 5번 (A-G)를 'G-A'로 교환함으로써 약독화 되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 플라스미드를 역유전(reverse genetics) 시스템에 의해 재조합 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는 숙주 비의존적 약독화 바이러스성 출혈성패혈증 바이러스(VHSV AG4-5GA) 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서의 용어‘역유전 시스템’은 바이러스 유전자를 분석 후 유전자 변형에 의한 표현형의 차이를 나타내게 하는 시스템으로, 기존의 전통적인 유전학 연구방식인 표현형을 바탕으로 유전형을 찾는 방식의 역방향으로 연구를 진행하는 시스템을 특징으로 한다. 본 시스템에 의하여, 재조합 바이러스 DNA 플라스미드를 제작 후 약독화된 재조합 바이러스를 재생산한다. 본 발명에 쓰인 단일 네가티브 극성 RNA 바이러스인 경우 바이러스 DNA 플라스미드는 최초 포지티브 극성의 mRNA 역할을 못하므로써 이를 보완하기 위하여, 트랜스팩션(transfection)시 N(Nucleocapsid)단백질 플라스미드, P(Phospho-)단백질 플라스미드, L(Polymerase)단백질 플라스미드를 첨가한다. 위의 세가지의 보조 플라스미드들은 리보뉴크레오프로테인 컴플렉스(ribonucleoprotein complex, RNP)를 형성하여 최초 트랜스크립션(transcription)를 활성화 시키므로써 이를 바탕으로 바이러스 RNA를 풀 지놈 DNA 플라스미드로 완성한 후, 바이러스를 재생산하는 시스템를 의미할 수 있다.

본 발명의 약독화 바이러스를 제조하기 위한 방법을 보다 상세히 설명하면, 다음과 같다:

(a) 바이러스 풀 지놈 플라미드 제작 단계

VHS 증세가 의심되는 넙치에서 VHSV를 수집 후, RT-PCR법과 RACE RT-PCR법을 이용하여 3'-, 5'-비번역지역 말단의 뉴크레오타이드를 포함한 총 염기 유전체를 분석한 후, RT-PCR법을 이용하여 전체 바이러스 유전자 플라스미드(full genomic plasmid)를 제작한다.

(b)　플라스미드 변이 유발 단계

안전한 약독화 VHSV를 개발하기 위하여 바이러스 3'-,5'-비번역지역 말단 부분의 RNA 팬핸들 이차구조를 분석한다. 깁스자유에너지 양의 값을 갖고 있는 내부 고리 열림 지점을 확인 후, 인위적으로 점변이(point mutation)를 일으킨다. 　　

(c) 역유전 방식에 의한 바이러스 생산 단계

변이가 완성된 플라스미드는 역유전 시스템에 의하여 재조합 바이러스로 재생산 된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 바이러스를 포함하는 약독화 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물은 (a) 상술한 약독화 바이러스의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어‘약제학적 유효량’은 상술한 질환에 대한 예방 또는 치료, 바람직하게는 예방 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미할 수 있다.

본 발명의 백신에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 백신의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신은 1 x 10³ - 1 x 10¹⁵ pfu/㎖의 재조합 바이러스를 포함한다.

본 발명의 백신은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 (a) 바이러스성 출혈패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV) 뉴클레오타이드 서열 중 상기 뉴클레오타이드 서열의 3'-비번역지역 말단에 존재하는 팬핸들 RNA 이차구조의 내부고리 열림 지점 4번 및 5번 A-G를 G-A로 변환한 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 AG4-5GA VHSV 풀 지놈(Genome) 플라스미드(KCTC12380BP)를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 플라스미드를 이용하여 백신을 제조할 경우 기존의 방식으로 백신을 제조한 것에 비해 안정성이 현저히 증가하는 장점이 있다.

도 1은 숙주 비의존성 약독화 재조합 VHSV AG4-5GA의 완성된 플라스미드(AG4-5GA VHSV Full genome plasmid, 15,182 bp: KCTC12380BP) 도면 및 숙주 의존성 약독화 재조합 VHSV delta-NV의 완성된 플라스미드(14,806 bp) 도면을 나타낸다.
도 2는 약독화 VHSV를 제작하기 위한 RNA 팬핸들 이차구조의 깁스자유에너지 분석 및 바이러스 프로모터지역에 존재하는 내부고리 열림 지점의 뉴클레오타이드 서열 4번과 5번에 존재하는 A 및 G가 바이러스 RdRp 초기 결합 인식 지점임을 예상 도면을 나타낸다.
도 3은 면역형광법을 통하여, 역유전 시스템에 의해 재생산된 변이 VHSV의 회복력의 차이를 나타낸다. VHSV AG4-5GA는 현저히 낮은 수준으로 표현되고 있다.
도 4는 역유전 방식에 의해 생산되는 변이 VHSV의 플라스미드의 초기 전사과정에서의 효율의 차이를 나타낸다. VHSV AG4-5GA는 현저히 낮은 수준인 야생형 바이러스의 51%로 표현된다.
도 5는 역유전 시스템에 의해 생산되는 변이 VHSV의 바이러스 글리코단백질 생산능력의 차이를 나타낸다. VHSV AG4-5GA(2번 라인)는 현저히 낮은 수준으로 표현된다.
도 6은 VHSV AG4-5GA가 숙주 비의존적으로 잉어 주화세포(EPC)에서 1.42log와 무지개 송어 주화세포(RTG-2)에서 2.08log 약독화 되었음을 나타낸다. 반면 기존의 약독화 방식으로 제작된 VHSV delta-NV는 EPC에서는 1.17log 약독화 되나, RTG-2에서는 약독화 되지 않음을 보여주고 있다.
도 7은 세포변성효과 실시간 모니터링을 통하여 VHSV AG4-5GA가 야생형 바이러스에 비해 현저히 약독화 되었음을 나타낸다. 이는 야생형 바이러스에 비해 70시간이 늦게 세포변성효과가 나타났으며, 바이러스 감염 72시간 후 정량 RT-PCR 결과 야생형 바이러스의 5%의 양에 해당하는 바이러스 증식력을 보인다.
도 8은 제브라피쉬 감염실험 결과, VHSV AG4-5GA는 상대적으로 현저히 낮은 병원성이 보이고 있음을 나타낸다. 야생형 바이러스와 비교한 상대생존율을 계산한 결과, 4×10²TCID₅₀ 감염 시 상대생존율 74%이며, 4×10³TCID₅₀ 감염 시 상대생존율은 56%를 나타낸다. VHSV delta-NV와 같은 농도인 4×10TCID₅₀ 감염 시에는 VHSV delta-NV는 26%의 누적 폐사율을 보였으나, VHSV AG4-5GA는 0%의 누적 폐사률을 나타내며, 병원성을 나타내지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 발명의 구체적인 실시예를 설명함에 앞서, 본 명세서에 사용된 단수 형태의 용어들은 다른 분명한 언급이 없는 한 복수 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 예컨대 "VHSV"란 언급은 이러한 다수의 VHSV를 포함한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학용어는 본 발명이 속하는 업계의 숙련된 자가 일반적으로 이해하고 있는 의미를 가진 것이다. 본 발명의 실시에 또는 실험예에는 여기에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의 방법 및 재료를 사용할 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료에 대해 이제부터 설명 할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물들은 방법을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 본 발명에 참고 인용한 것이다.

야생형 바이러스 수득

본 발명에 이용된 야생형 VHSV는 대한민국 제주도 서귀포시 성산에서 수집되었으며, VHSV 유전자형 IVa에 속하며, 11,168 뉴크레오타이드로 구성되어있다.

제조예 : 재조합 바이러스 제작 및 생산

바이러스 뉴클레오타이드 서열 분석

바이러스 뉴클레오타이드 서열은 하기 표 1에 주어진 프라이머을 이용, 일반 RT-PCR법에 의해 바이러스 번역지역의 뉴클레오타이드 서열 과 RACE RT-PCR법을 이용하여 비번역지역 말단 뉴클레오타이드 서열을 분석 후, 바이러스 총 뉴클레오타이드가 포함한 cDNA를 수집하였다.

Genomic sequencing		GeneBank
VHSV-f1-Forward	gtatcataaaatatgatgagttatg	AB179621.1
VHSV-f1-Reverse	ccctccaaggagtccactgc
VHSV-f2-Forward	ctgatgaggcaggtgtcgga
VHSV-f2-Reverse	actgagcccttgcagagtac
VHSV-f3-Forward	gaacgggaagaagaccgaca
VHSV-f3-Reverse	gggtcagtcctttgggtcta
VHSV-f4-Forward	atgtggggggaaaaggccac
VHSV-f4-Reverse	gacagtttcttcgctccccc
VHSV-f5-Forward	ggacacatgatcacagggtg
VHSV-f5-Reverse	caagcacatggaggtagggaa
VHSV-f6-Forward	tgtccttcgcgagatgatcg
VHSV-f6-Reverse	ctggcagatggctgtgagga
VHSV-f7-Forward	agttcgagttcaaggaaggg
VHSV-f7-Reverse	gcgatgctctctcggagaac
VHSV-f8-Forward	gctgacgaaatctacgacac
VHSV-f8-Reverse	gattccttgcaaccggacct
VHSV-f9-Forward	caatctcagaatgcgtgaac
VHSV-f9-Reverse	gagttccatgtaggcttttg
VHSV-f10-Forward	atcatgggaggaagagaagg
VHSV-f10-Reverse	gagattgctttggcgagtgt
VHSV-f11-Forward	agacatctcataccaagcac
VHSV-f11-Reverse	ggatgatgtgacgtgcagct
VHSV-f12-Forward	gaccccgacaatttgctcag
VHSV-f12-Reverse	gtatagaaaataatacataccacacc

바이러스 플라스미드 제작

바이러스 구조 재조합에 앞서 하기 표 2에 주어진 프라이머를 이용, 바이러스 cDNA를 RT-PCR법에 의해 증폭시킨 후 재조합 바이러스 플라스미드 구조(하기 도 1 참조) 및 역유전 시스템에 이용한 플라스미드들을 완성하였다. 그 구조적 특징은 RT-PCR법에 의해 확인되었다.

Construction of pVHSV
VHS-S1-Forward-NheI	aatgctagcgtatcataaaagatgatgagttatgttac
VHS-S1-Reverse-EcoRI	tatcggatgtagaattcctccctaatcttg
VHS-S2-Forward-EcoRI	caagattagggagaattctacatccgata
VHS-S2-Reverse-NotI	ttagcggccgcgtatagaaaatgatacataccacaacc
VHS-HdvRz-Reverse-NotI	ttagcggccgc ctcccttagccatccgagtggacgtgcgtcctccttcggatgcccaggtcggaccgcgaggaggtggagatgccatgccgacccgtatagaaaatgatacataccac
delta-NV-Forward-AleI	cacccctgtgtgaactcctcccccttctc
Construction of helper plasmids
N-Forward-NheI	gctagc gccaccatggaagggggaatcc
N-Reverse-NotI	atgcggccgcttaatcagagtcccctgg
P-Forward-NheI	gctagc gccaccatgactgatattgaga
P-Reverse-NotI	atgcggccgcctactccaacttgtccaac
L-Forward-NheI	gctagc gccaccatggagatgttcgagc
L-Reverse-NotI	atgcggccgctcattgctctccaaatgg
NV-Forward-NheI	gctagc gccaccatgacgacccagtcgg
NV-Reverse-NotI	atgcggccgctcatgggggagattcggag
Identify delta-NV
Deleted NV-Forward	cgagttacgggattccgatgcagcagtt
Deleted NV-Reverse	ctggcagatggctgtgagga

바이러스 RNA 이차구조 확인

바이러스 RNA 이차구조를 확인하기 위하여 VHSV 말단 뉴클레오타이드 서열의 정보를 수집(하기 표 3 참조) 후, 비정상적을 안정한 헤어핀 구조를 형성하는 3'-GGCUUC-5'(Bae et al.,2001;Cheong et al.,1990;Cheong et al.,1996)와 합성 후 결정된 28개의 뉴클레오타이드를 RNA Folding Form(v2.3 energies)프로그램을 이용하여 RNA 팬핸들 이차구조를 예상한 후, 인위적 변이를 일으킬 지점을 결정하였다(하기 도 2 참조).

cDNA sequence		Gene Bank
Fi 13 (genotype Ia)	5'-gtatcataaaagat attattttctatac-3'	Y18263.1
23-27 (genotype Ia)	5'-gtatcataaaagat attattttctatac-3'	FN665788.1
MI03GL (genotype IVb)	5'-gtatcataaaatat attattttctatac-3'	GQ385941.1
JF00Ehi1 (genotype IVa)	5'-gtatcataaaagat atcattttctatac-3'	AB490792.1
KRRV9822 (genotype IVa)	5'-gtatcataaaatat attattttctatac-3'	AB179621.1
JF-09 (genotype IVa)	5'-gtatcataaaagat atcattttctatac-3'
Conserved sequence	5'-gtatcataaaa_at at_attttctatac-3'

인위적 변이 유발

28개의 뉴클레오타이드 중 변이 지점으로 결정되어진 4번, 5번, 7번, 8번 및 25번(A,G,A,U,U)은 인위 점변이 키트를 이용하여 하기 표 4에 주어진 프라이머 세트와 바이러스 플라스미드를 이용하여 인위적 변이를 일으켰다.

Point mutation at internal loop
U8C-Forward	gtcagatccgctagcgtatcat G aaagatgatgagttatgttac
U8C-Reverse	gtaacataactcatcatcttt C atgatacgctagcggatctgac
AG4-5GA-Forward	gtcagatccgctagcgta CT ataaaagatgatgagttatgttac
AG4-5GA-Reverse	gtaacataactcatcatcttttat AG tacgctagcggatctgac
AU7-8CA-Forward	gtcagatccgctagcgtatca GT aaagatgatgagttatgttac
AU7-8CA-Reverse	gtaacataactcatcatcttt AC tgatacgctagcggatctgac
U25C-Forward	gtggtatgtatcattttct G tacgggtcggcatggcatct
U25C-Reverse	agatgccatgccgacccgta C agaaaatgatacataccac
3UTR-Sequence	cattgacgcaaatgggcggta
5UTR-Sequence	cgtgcgtcctccttcggatgc

재조합 바이러스 생산

변이가 완성된 플라스미드는 한국 생명자원센터(KCTC)에 바이러스 풀 지놈 플라스미드를 기탁하였고, 기탁번호를 부여받았다(AG4-5GA VHSV Full genome plasmid: KCTC12380BP). 이후 상기 플라스미드는 역유전 시스템을 이용하여 재조합 바이러스 생산에 이용되었다.

실험예

실험예 1 : 변이가 완성된 바이러스 플라스미드의 바이러스 회복력 확인

VHSV 플라스미드(250 ng), N단백질 플라스미드(60 ng), P단백질 플라스미드(50 ng), L단백질 플라스미드(50 ng)와 NV단백질 플라스미드(30 ng)를 25 ul Opti-MEM medium(invitrogen)에서 혼합 후 1.5 ul FuGENE HD transfection reagent(Roche)를 첨가하였다. 이 혼합물을 10분간 상온 보관 후 EPC 세포에 접종하였다. 상기 혼합물이 접종된 세포를 15℃에서 4일간 보관하고, 세포의 상층액을 수집 후, 다시 EPC 세포에 접종 2일 후, 그 바이러스의 회복력을 면역 형광법에 의해 확인하였다. 면역 형광법은 MAb IP5B11 항체와 Alexa 488 anti-mouse IgM를 이용하였다. 형광의 발현 정도는 Olympus IX81 형광현미경을 통하여 VHSV AG4-5GA가 다른 VHSV에 비해 현저히 낮음을 확인하였다(하기 도 3 참조).

하기 표 5에 주어진 프라이머를 이용, 더 자세한 변이 바이러스 플라스미드의 바이러스 회복 경향을 알아보기 위하여 단일 가닥 정량 RT-PCR법 (Shannon et al.,2012)에 의해 VHSV AG4-5GA가 초기전사과정의 효율이 야생형에 대비 51%로 현저히 저하되었음을 확인하였다(하기 도 4 참조).

Strand-specific quantitative RT PCR
VHSV-G-Forward	ggacacatgatcacagggtg
VHSV-G-Reverse	gacagtttcttcgctccccc
Carp-40s-Forward	ccgtgggtgacatcgttaca
Carp-40s-Reverse	tcaggacattgaacctcactgtct

보다 자세한 변이 바이러스 플라스미드의 바이러스 회복 경향을 알아보기 위하여 특수단백질검출검사를 실시한 경과, 트랜스펙션 5일 후, AG4-5GA의 바이러스의 글리코 단백질의 양이 다른 VHSV에 비해 현저히 낮음을 확인하였다(하기 도 5 차조).

VHSV AG4-5GA 플라스미드는 야생형 VHSV 플라스미드 및 다른 변이 플라스미드에 비해 현저히 낮은 수준의 바이러스 회복력을 나타냈다. 결과는 상대적 델타델타Ct법(Livak et al.,2001)으로 표현 값이 주어지며, ANOVA법에 의해 그 유의적 차이(p-value<0.05)를 통계적으로 계산하였다.

실험예 2 : 변이가 완성된 바이러스의 약독화 정도 확인

실험예 2-1 : 세포감염 실험

VHSV(moi of 0.1)를 EPC 세포와 RTG-2에 감염 후 3일 간격으로 세포 상층액을 수집 후, EPC 세포를 이용하여 바이러스를 정량화 하였다. 확인 결과, 감염 6일차 VHSV AG4-5GA는 야생형 VHSV에 비해 EPC세포에서 1.42log 그리고 RTG-2세포에서 2.08log 약독화 되었다. 실험 비교군인 VHSV delta-NV는 EPC 세포에서 1.17log 약독화 되어졌으나, RTG-2 세포에서는 약독화 되지 않았다(하기 도 6 참조).

실시간 세포변성효과를 확인하기 위하여 바이러스 (moi of 0.01)를 EPC 세포에 접종 후 XCELLigence (Roche)를 이용하였다. 그 결과, U8C>야생형>>AU7-8CA>>>AG4-5GA 순으로 세포변성효과를 보였으며, 야생형 VHSV와 VHSV AG4-5GA사이는 70시간의 차이를 보였다. 상기 표 5에 주어진 프라이머를 이용, 정량 RT-PCR법에 의한 정량 결과 감염 72시간 후, VHSV AG4-5GA는 야생형 VHSV에 비해 그 상대적인 값이 5%로 확인되었다(하기 도 7 참조).

상기 결과에 따라 실험예 2-1에서 VHSV AG4-5GA는 야생형 VHSV 및 다른 변이 VHSV에 비해 숙주 비의존적으로 현저히 낮은 수준의 바이러스 증식력과 현저히 늦은 세포변성효과를 나타냈다.

실험예 2-2 : 동물감염실험

야생형 제브라피쉬(Danio rerio)를 16.5℃의 수온에 2일간 적응 후 바이러스를 감염시켰다. 벤조카인으로 마취 후, 3개의 수조를 이용하여 병용 그룹 시행하였다. 복강 주사법과 근육주사법으로 세 가지 접종 농도로 접종하였다. 야생형 VHSV 감염시, 농도 그룹 당 18 마리를 접종하였다. VHSV A4-5GA와 VHSV delta-NV는 농도 그룹 당 27 마리를 접종하였다. 비감염 대조군은 2 ul L15세포미디엄을 복강에 접종하였으며, 3번에 걸친 감염실험 동안 18마리, 27마리, 27마리로 설정하였다. 시험 그룹은 "바이러스/감염농도/접종방법"으로 표기하였으며, 그 누적폐사율 결과는 하기 표 6 및 하기 도 9에 나타내었다.

감염일	18마리	18마리	18마리	27마리	27마리	27마리	27마리	Control
	6마리 x 3수조	6마리 x 3수조	6마리 x 3수조	9마리 x 3수조	9마리 x 3수조	9마리 x 3수조	9마리 x 3수조
	wt /400/im	wt /4000/ip	wt /4000/im	AG4-5GA /40/ip	AG4-5GA /400/ip	AG4-5GA 4000/ip	ΔNV /40/ip
0	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%
1	0.00%	5.56%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%
2	0.00%	5.56%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%
3	0.00%	5.56%	0.00%	0.00%	0.00%	3.70%	0.00%	0.00%
4	0.00%	11.11%	0.00%	0.00%	0.00%	7.41%	0.00%	0.00%
5	0.00%	16.67%	0.00%	0.00%	0.00%	7.41%	0.00%	0.00%
6	11.11%	33.33%	22.22%	0.00%	0.00%	7.41%	0.00%	0.00%
7	11.11%	44.44%	55.56%	0.00%	0.00%	7.41%	0.00%	0.00%
8	33.33%	55.56%	83.33%	0.00%	0.00%	7.41%	0.00%	0.00%
9	50.00%	66.67%	94.44%	0.00%	3.70%	11.11%	0.00%	0.00%
10	50.00%	77.78%	100.00%	0.00%	3.70%	14.81%	3.70%	0.00%
11	66.67%	77.78%	100.00%	0.00%	7.41%	22.22%	18.52%	0.00%
12	66.67%	83.33%	100.00%	0.00%	7.41%	25.93%	22.22%	0.00%
13	72.22%	83.33%	100.00%	0.00%	14.81%	33.33%	25.93%	0.00%
14	72.22%	83.33%	100.00%	0.00%	18.52%	37.04%	25.93%	0.00%
15	72.22%	83.33%	100.00%	0.00%	18.52%	37.04%	25.93%	0.00%

상기 결과에 따라 실험예 2-2에서 VHSV AG4-5GA는 야생형 VHSV에 비해 현저히 낮은 수준의 병원성을 나타냈다. 이는 상대생존율 계산법에 의해 야생형과 비교한 결과, 4×10²TCID₅₀ 농도 접종 시 74%, 그리고 4×10³TCID₅₀ 농도 접종 시에는 56%의 상대생존율을 나타냈다.

결론

바이러스 프로모터지역에 존재하는 팬핸들 구조의 내부고리 열림 지점의 뉴클레오타이드 서열 4번, 5번(A, G)을 'G, A'로 교환함으로써 VHSV의 약독화가 초래되었다는 것이 명백하다. 이러한 약독화는 바이러스의 초기 전사과정에서 바이러스 자체의 RdRp와 서로 상호작용에 문제가 있었음이 예상된다. 또한 본 발명은 기존의 약독화 바이러스의 기술인 단백질 치환 방식에서 진일보하여 최소한의 바이러스 뉴클레오타이드의 변화를 통한 최대한의 바이러스 특성의 변화를 일으켰다는데 의미를 둘 수 있다. 이는 바이러스와 숙주간의 면역작용에 의한 약독화가 아닌 바이러스 자체의 전사과정 결함에 의한 약독화로써, 숙주 비의존적 약독화 바이러스의 특성을 보여주었다.

참고문헌

1. Ammayappan A, Vakharia VN (2009) Molecular characterization of the Great Lakes viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) isolate from USA. Virology Journal 6. 10.1186/1743-422X-6-171.

2. Bain MB, Cornwell ER, Hope KM, Eckerlin GE, Casey RN, Groocock GH, Getchell RG, Bowser PR, Winton JR, Batts WN, Cangelosi A, Casey JW (2010) Distribution of an Invasive Aquatic Pathogen (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus) in the Great Lakes and Its Relationship to Shipping. Plos One 5. 10.1371/journal.pone.0010156.

3. Kim S.M. (2003) Infection of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) in cultured olive flounder, Paralichthys olivaceus [dissertation].

4. Kim WS, Kim SR, Kim D, Kim JO, Park MA, Kitamura SI, Kim HY, Kim DH, Han HJ, Jung SJ, Oh MJ (2009) An outbreak of VHSV (viral hemorrhagic septicemia virus) infection in farmed olive flounder Paralichthys olivaceus in Korea. Aquaculture 296: 165-168. DOI 10.1016/j.aquaculture.2009.07.019.

5. Bae SH, Cheong HK, Lee JH, Cheong C, Kainosho M, Choi BS (2001) Structural features of an influenza virus promoter and their implications for viral RNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 10602-10607.

6. Whelan SPJ, Barr NJ, Wertz GW (2010) Transcription and replication of Nonsegmented Negative-Strand RNA viruses. In: Y.Kawaoka, editors. Biology of Negative Strand RNA viruses: The Power of Reverse Genetics. Springer. pp. 63-119.

7. Whelan SPJ, Wertz GW (1999) Regulation of RNA synthesis by the genomic termini of vesicular stomatitis virus: Identification of distinct sequences essential for transcription but not replication. Journal of Virology 73: 297-306.

8. Whelan SPJ, Wertz GW (2002) Transcription and replication initiate at separate sites on the vesicular stomatitis virus genome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 9178-9183.

9. S.P.J.Whelan, J.N.Barr, G.W.Wertz (2010) Transcription and replication of Nonsegmented Negative-Strand RNA viruses. In: Y.Kawaoka, editors. Biology of Negative Strand RNA viruses: The Power of Reverse Genetics. Springer. pp. 63-119.

10. Kim MS, Kim DS, Kim KH (2011) Generation and characterization of NV gene-knockout recombinant viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) genotype IVa. Diseases of Aquatic Organisms 97: 25-35.

11. Ammayappan A, Kurath G, Thompson TM, Vakharia VN (2011) A Reverse Genetics System for the Great Lakes Strain of Viral Hemorrhagic Septicemia Virus: the NV Gene is Required for Pathogenicity. Marine Biotechnology 13: 672-683.

12. Thoulouze MI, Bouguyon E, Carpentier C, Bremont M (2004) Essential role of the NV protein of Novirhabdovirus for pathogenicity in rainbow trout. Journal of Virology 78: 4098-4107.

13. Wertz GW, Whelan S, Legrone A, Ball LA (1994) Extent of Terminal Complementarity Modulates the Balance Between Transcription and Replication of Vesicular Stomatitis-Virus Rna. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91: 8587-8591.

14. Cheong CJ, Varani G, Tinoco I (1990) Solution Structure of An Unusually Stable Rna Hairpin, 5'Ggac(Uucg)Gucc. Nature 346: 680-682.

15. Cheong HK, Cheong C, Choi BS (1996) Secondary structure of the panhandle RNA of influenza virus A studied by NMR spectroscopy. Nucleic Acids Research 24: 4197-4201.

16. Shannon R.Matzinger, Timothy D.Carroll, Joseph C.Dutra, Zhong-min Ma, Christopher J.Miller (2012) Myxovirus resistance gene A (MxA) expression suppresses influenza A virus replication in Alpha interferon-treated primate cells. Journal of Virology 87: 1150.

17. Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(T)(-Delta Delta C) method. Methods 25: 402-408.

Claims

바이러스성 출혈패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV) 리보뉴크레오타이드 서열 중 상기 리보뉴크레오타이드 서열의 3' 말단 4번째 아데닌(Adenine) 및 5번째 구아닌(Guanine)을 4번째 구아닌(Guanine) 및 5번째 아데닌(Adenine)으로 변환한 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스.
삭제
삭제
상기 제 1 항의 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스를 포함하는 약독화 백신 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제