KR101595439B1 - 산모 혈장의 mRNA 발현 차이를 이용한 태아의 염색체 이상 질환의 선별방법 - Google Patents

산모 혈장의 mRNA 발현 차이를 이용한 태아의 염색체 이상 질환의 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산모 혈장의 mRNA 발현 차이를 이용하여 태아의 염색체 이상 질환을 출산 전에 선별하는 방법 및 선별을 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 태아의 염색체 이상 질환 선별방법은 산모의 체중, 나이, 임신 주수에 영향을 적게 받으면서 높은 민감도와 정확도로 태아의 염색체 이상 질환을 선별할 수 있다. 또한, 산모의 혈장 내 mRNA 발현량의 차이를 이용한 것이기 때문에, 위험성이 낮으며 저비용으로 간단하게 태아의 염색체 이상 질환을 선별할 수 있는 장점이 있다.

Description

산모 혈장의 mRNA 발현 차이를 이용한 태아의 염색체 이상 질환의 선별방법 {A method for screening chromosome abnormality syndrome with differential expression of maternal plasma mRNA}
본 발명은 산모 혈장의 mRNA 발현 차이를 이용하여 태아의 염색체 이상 질환을 출산 전에 선별하는 방법 및 태아의 염색체 이상 질환의 선별용 조성물에 관한 것이다.
태아의 염색체 이상 질환으로는 성염색체 이상 증후군 및 상염색체 이상 증후군으로 나눌 수 있으며, 상기 상염색체 이상 증후군으로는 21번 염색체(human chromosome 21, HSA21)가 삼염색체성인 다운 증후군, 18번 염색체가 삼염색체성으로 태생기의 발달장애를 일으키는 에드워드(Edward) 증후군(18-트리소미증후군),13번 염색체가 삼염색체성으로 고도의 기형을 수반하는 파타우(Patau) 증후군(13-트리소미증후군) 등이 있다.
이 중에서 다운 증후군은 21번 염색체의 일부 또는 전체가 삼염색체로 존재하여 지적 장애를 비롯한 다양한 건강상의 문제를 일으키는 질환이다. 현재 다운 증후군을 산전에 진단하기 위한 산전 모체 혈청 검사는 임신 제1 삼분기, 제2 삼분기 또는 두시기에 통합하여 선별 검사로 사용되고 있다. 제1 삼분기에 사용되는 마커로는 인간 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin, hCG), 및 PAPP-A(pregnancy associate plasma protein)를 초음파 소견(nuchal translucency, NT)과 함께 사용한다. 제2 삼분기에 사용되는 삼중 마커는 산모 혈청 알파-페토단백질(maternal serum alpha-fetoprotein, MS AFP), 비결합 에스트리올(unconjugated estriol) 그리고 hCG이고, 사중 마커는 삼중 마커에 inhibin-A를 추가한다.
그러나 상기와 같은 검사방법에 따른 정량 결과가 검사 기관마다 혹은 동일 기관이라도 검사자마다 차이가 있으므로, 절대치보다는 해당 주수에 해당하는 정상인 수치보다 높거나 낮은 수치로 표시한다 (multiple of the median, MoM). 이는 각 마커별 정확도 이외에 임신주수, 산모의 체중, 인종, 인공 수정 여부, 흡연, 임신성 당뇨 등 외적 요인에 따른 판별의 영향을 많이 받는다. 따라서 MoM 결과를 바탕으로 확률로 표시하는 것이 현재 사용하는 방법이다.
한편, 융모막 검사 혹은 양수 검사는 고비용이며 위험 요인이 있다. 따라서, 선별 검사의 검사수를 최소화 하기 위해서는 임신 초기에 외적 요인의 영향을 최소로 받고 정확도가 높은 새로운 선별 검사법이 요구되고 있다. 이를 위하여 후생 유전학 혹은 다음 세대 염기서열 결정법 (Next generation sequencing)이 검토되고 있으나 아직은 일반적으로 사용하기에는 부족하다.
상기와 같은 문제점 및 새로운 산전 검사법의 필요성을 고려하여, 본 발명자들은 산모 혈장에서 염색체 이상 질환을 가지는 태아의 임신시 발현 차이를 보이는 mRNA들을 선별하고, 이를 정량 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 Cq 값을 결정한 후, Cq 값들의 차이 값을 염색체 이상 질환 선별의 기준으로 이용할 때 높은 민감도 및 특이성으로 태아의 염색체 이상 질환을 정확히 선별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 태아의 염색체 이상 질환의 선별을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 태아의 염색체 이상 질환 선별용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 산모로부터 분리된 시료에서, 정상 태아를 임신한 산모의 혈액과 염색체 이상 질환을 가지는 태아를 임신한 산모의 혈액 간에 발현차이를 보이는 제1 표지물질과 제2 표지물질을 정량 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 후 제1 표지물질 mRNA 발현에 대한 Cq 값과 제2 표지물질 mRNA 발현에 대한 Cq 값을 측정하는 단계; 및 상기 제1 표지물질의 Cq 값과 제2 표지물질의 Cq 값의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이상 질환의 선별을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 산모로부터 분리된 시료에서 IGF(Insulin-like growth factor) mRNA의 발현량과 hCG(human chorionic gonadotropin) mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이상 질환의 선별을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 산모로부터 분리된 시료에서 IGF-2의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 IGF-2의 발현량이 정상 태아를 임신한 산모로부터 분리된 시료에서 측정된 IGF-2의 발현량보다 높은 경우, 상기 산모의 태아를 염색체 이상 질환으로 선별하는 단계를 포함하는, 태아의 염색체 이상 질환의 선별을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 IGF-2 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제; 및 hCG 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 태아의 염색체 이상 질환 선별용 조성물, 및 이를 포함하는 태아의 염색체 이상 질환 선별용 키트를 제공한다.
산전에 태아의 염색체 이상 질환을 선별하는 기존의 방법은 특정 표지물질의 발현량의 정도만을 측정하여 선별하는 것으로서, 정량 결과가 검사 기관 또는 검사자에 따라서 차이가 있고, 산모의 체중, 건강상태 등에 따른 외적 요인, 임신 주수에 영향을 많이 받아 정확한 선별이 어려웠다.
이에, 본 발명에서는 정상 태아를 임신한 산모와 염색체 이상 질환을 가지는 태아를 임신한 산모의 혈청에서 발현차이를 보이는 2 이상의 표지물질의 mRNA 발현량의 차이를 측정하고, 이를 염색체 이상 질환의 선별 기준으로 이용함으로 인해서, 정확하고 민감도가 높은 새로운 선별방법을 제공한다.
구체적으로, 산모 혈청에서 염색체 이상 질환의 태아 임신시 발현 차이를 보이는 mRNA를 선별하고, 이를 정량 PCR을 이용하여 Cq 값을 결정하였다. Cq 값은 특정 발현량에 도달하기 위한 PCR의 사이클 수이기 때문에, 정량 PCR에서 발현이 증가하면 Cq 값이 작아지고, 발현이 감소하면 Cq 값이 증가하는 점을 이용하였다. 또한, 상기 측정된 Cq 값의 차이를 계산하여 산전에 태아의 염색체 이상 질환 선별에 사용하였다. 예를 들어, 다운 증후군에서 발현이 감소하는 표지물질의 Cq 값에서 발현이 증가하는 표지물질의 Cq 값을 빼면, 다운 증후군을 임신한 산모의 델타(delta) Cq 값은 크게된다. 따라서, 이 경우 델타 Cq 값이 클수록 태아를 염색체 이상 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다.
유전자 자체의 발현은 태령의 변화, 분화 및 성장에 따라 변화를 보이며, 정배수체(euploid) 개인차에 의한 유전자의 발현 차이는 삼염색체(trisomy)에 의한 발현차이보다 클 수 있다. 그러나, 본 발명에서 제시한 같은 개체 내에서 발현의 증감에 의해 계산되는 delta Cq 값은 증가와 감소의 두 가지 요인이 동시에 측정되어지는 지표이므로, 각 표지물질의 발현량을 측정하는 경우보다 상대적으로 오차의 범위를 줄일 수 있다. 이를 바탕으로 완성된 본 발명은 산모의 개인차가 상대적으로 적고, 높은 경제적 효율을 보이면서, 높은 정확도와 민감도로 산전에 태아의 염색체 이상 질환을 선별할 수 있다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 (a) 산모로부터 분리된 시료에서, 정상 태아를 임신한 산모의 혈액과 염색체 이상 질환을 가지는 태아를 임신한 산모의 혈액 간에 발현차이를 보이는 제1 표지물질과 제2 표지물질을 정량 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 후 제1 표지물질 mRNA 발현에 대한 Cq 값과 제2 표지물질 mRNA 발현에 대한 Cq 값을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 제1 표지물질의 Cq 값과 제2 표지물질의 Cq 값의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이상 질환의 선별방법 또는 선별을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계는 정상 태아를 임신한 산모의 혈액과 염색체 이상 질환을 가지는 태아를 임신한 산모의 혈액 간에 발현차이를 보이는 제1 표지물질과 제2 표지물질을 증폭시켜 각 표지물질에 대한 Cq 값을 측정하는 단계이다.
상기 표지물질은 정상 태아를 임신한 산모와 염색체 이상 질환을 가지는 태아를 임신한 산모의 혈액 간에 발현차이를 보이는 물질이면 종류에 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 IGF-2 (Insulin-like growth factor-2), hCG(human chorionic gonadotropin), 또는 베타-액틴(ACTB)을 사용하였다. 따라서, 제1 표지물질은 IGF-2, 제2 표지물질은 hCG가 될 수 있으며, 또한, 제1 표지물질은 hCG, 제2 표지물질은 베타-액틴이 될 수 있다.
상기 표지물질은 정상 태아를 임신한 산모의 혈액과 염색체 이상 질환을 가지는 태아를 임신한 산모의 혈액 간에 mRNA 발현차이가 나는 물질일 수 있다.
본 발명의 태아의 염색체 이상 질환의 선별방법은 산모의 임신 주수와 상관없이 적용 가능하다. 바람직하게는 태아가 8주 내지 28주일 때 적용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 태아가 11주 내지 19주일 때 적용할 수 있다.
상기 산모로부터 분리된 시료는 산모로부터 분리된 생물학적 시료로서 바람직하게는 혈액을 의미한다. 보다 바람직하게는 전혈, 혈청, 혈장이고, 보다 더 바람직하게는 혈장(plasma)이다.
상기 표지물질에 대한 Cq 값은 특정 발현량에 도달하기 위한 정량 중합효소 연쇄반응(PCR)의 반복수(사이클 수)를 의미한다. 따라서, 산모의 시료에서 mRNA의 발현량이 적은 물질은 Cq 값이 크고, RNA의 발현량이 많은 물질은 Cq 값이 작다.
상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 측정된 각 표지물질에 대한 Cq 값의 차이(델타 Cq 값)를 측정하는 단계이다.
상기 측정된 2가지 표지물질에 대한 델타 Cq 값이 태아의 염색체 이상 질환 유무에 사용될 수 있다. 예를 들어, 다운 증후군에서 발현이 감소하는 표지물질의 Cq 값에서 발현이 증가하는 표지물질의 Cq 값을 빼면, 다운 증후군을 임신한 산모의 델타(delta) Cq 값은 크게된다. 따라서, 이 경우 델타 Cq 값이 클수록 태아가 염색체 이상 질환을 갖는 것으로 진단할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 산모로부터 분리된 시료에서 IGF(Insulin-like growth factor) mRNA의 발현량과 hCG(human chorionic gonadotropin) mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이상 질환의 선별방법 또는 선별을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
상기 산모로부터 분리된 시료는 산모로부터 분리된 생물학적 시료를 의미하는 것으로서, 산모의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 산모의 전혈, 혈청, 혈장이고, 보다 바람직하게는 혈장(plasma)이다.
상기 IGF(Insulin-like growth factor)는 인슐린 유사 성장인자로서 인슐린과 구조가 비슷한 분자량 7,500의 폴리펩티드로 이루어진 성장인자이다. 혈청 내에서 인슐린과 유사한 작용을 하지만 인슐린 항체로 억제되지 않는 물질이며, 연골세포의 증식이나 단백질 생합성에서 생장호르몬의 작용을 매개하는 것 외에 인슐린과 유사한 생리작용을 한다. 혈장 내에 고농도로 존재하지만, 대부분 결합 단백질과 결합하여 불활성화되는 특징이 있다.
상기 IGF는 바람직하게는 IGF-2이다.
상기 hCG(human chorionic gonadotropin)는 수정이 일어난 직후 배아로부터 만들어지는 펩타이드 호르몬으로, 수정란이 자궁 내벽에 착상하면 태반의 영양 아세포(syncytiotrophoblast)로부터 만들어지기 시작한다. 이 호르몬은 난소에 있는 황체가 퇴화되는 것을 막음으로써 사람의 임신기간에 중요한 프로게스테론(progesterone) 분비를 유지하도록 한다.
상기 mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 방법으로는 역전사효소 중합효소 연쇄반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소 연쇄반응, 실시간 역전사효소 중합효소 연쇄반응, 정량 중합효소 연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 정량 중합효소 연쇄반응으로서, 산모로부터 분리된 시료로부터 RNA을 추출하고, 이로부터 cDNA를 제조한 후, 정량 중합효소 연쇄반응을 수행하여 mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 것이다. 이때 태아 핵산 검출 방법은 기 출원한 출원번호 10-2011-0117726 : 산모 혈액 내 세포 유리 태아 핵산 검출 방법에 기재된 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로, (a) 산모로부터 채취한 혈액을 수득하는 단계; (b) 상기 혈액 내에 존재하는 검출하고자 하는 세포 유리 태아 mRNA(cell free fetal mRNA)의 5' 말단으로부터 100번째 염기서열 중 일부분과 상보적으로 결합할 수 있는 역전사 프라이머를 사용하여, 상기 mRNA의 5' 말단으로부터 연속하는 20개 내지 100개의 염기서열로 이루어진 RNA에 상보적인 서열로 이루어진 cDNA를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 cDNA를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응을 수행하여 수득한 증폭 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 산모 혈액 내 태아의 핵산을 검출하는 방법을 사용할 수 있다.
보다 바람직하게는 산모로부터 분리된 시료에서 IGF 유전자 및 hCG 유전자를 정량 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후, IGF mRNA의 발현 및 hCG mRNA의 발현에 대한 각각의 Cq 값을 측정하는 단계; 및 상기 IGF의 Cq 값과 hCG의 Cq 값의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 것이다.
상기 중합효소 연쇄반응은 IGF 및 hCG에 특이적인 프라이머를 사용하여 IGF 및 hCG를 증폭시킬 수 있다. 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 hCG 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 4 및 5의 염기서열로 구성된 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 중합효소 연쇄반응은 90 내지 100℃에서 15초, 50 내지 55℃ 10초 그리고 70 내지 75℃에서 30초 조건에서 40 내지 60 사이클 반복하여 수행할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 95℃에서 15초, 52℃에서 10초, 그리고 72℃에서 30초 조건에서 50 사이클 반복하였다.
상기 선별방법 또는 선별을 위한 정보 제공방법은 상기 IGF의 Cq 값에서 hCG의 Cq 값을 뺀 값이 2.3 이하이면 태아를 염색체 이상 질환으로 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 선별방법 또는 선별을 위한 정보 제공방법은 hCG(human chorionic gonadotropin) mRNA의 발현량과 보정물질 mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계를 추가로 포함하여 수행할 수 있다.
상기 hCG mRNA의 발현량과 보정물질 mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계는, 산모로부터 분리된 시료에서 hCG 유전자 및 보정물질 유전자를 정량 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후, IGF mRNA의 발현 및 보정물질 mRNA의 발현에 대한 각각의 Cq 값을 측정하는 단계; 및 상기 hCG의 Cq 값과 보정물질의 Cq 값의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 것 일 수 있다.
상기 보정물질은 베타-액틴 또는 베타-마이크로그로블린-2(beta-microglobulin 2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 중합효소 연쇄반응은 hCG 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 4 및 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 베타-액틴 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 7 및 8의 염기서열로 구성된 프라이머를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 선별방법 또는 선별을 위한 정보 제공방법은 hCG의 Cq 값에서 베타-액틴의 Cq 값을 뺀 값이 0 이상이면 태아를 염색체 이상 질환으로 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 산모의 분리된 시료에서 IGF-2와 hCG의 mRNA 발현량의 차이 및 hCG와 보정물질의 mRNA의 발현량의 차이를 동시에 측정하여 태아의 염색체 이상 질환을 선별할 경우, 보다 더 정확한 선별이 가능하다. 예를 들어서, 산모로부터 분리된 시료에서 IGF-2의 Cq 값에서 hCG의 Cq 값을 뺀 값이 2.3 이하이고, hCG의 Cq 값에서 베타-액틴의 Cq 값을 뺀 값이 0 이상인 경우, 상기 산모의 태아는 염색체 이상 질환을 보유하고 있다고 선별할 수 있다.
본 발명에서 태아의 염색체 이상 질환은 염색체 이상에 의해 발생하는 모든 질환을 의미하는 것으로서, 종류에 제한되지 않는다. 상기 태아의 염색체 이상 질환은 바람직하게는 다운 증후군(Down syndrome), 에드워드 증후군(Edward syndrome), 또는 파타우(patau) 증후군일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다운 증후군이다.
본 발명의 산전 염색체 이상 질환의 선별방법 또는 선별을 위한 정보 제공방법은 제1 표지물질과 제2 표지물질의 발현량의 차이를 측정하여 선별하는 것으로서, 각 표지물질의 발현량만으로 선별하는 경우보다 민감도, 특이도, 양예측치, 음예측치 모두 우수한 결과가 나타났다. 따라서, 본 발명은 산전에 간단한 방법으로 정확하게 태아의 염색체 이상 질환을 선별할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 산모로부터 분리된 시료에서 IGF-2의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 IGF-2의 발현량이 정상 태아를 임신한 산모로부터 분리된 시료에서 측정된 IGF-2의 발현량보다 높은 경우, 상기 산모의 태아를 염색체 이상 질환으로 선별하는 단계를 포함하는, 태아의 염색체 이상 질환의 선별을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
상기 IGF-2의 발현량의 IGF-2의 mRNA 발현량을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 염색체 이상 질환을 가진 태아를 임신한 산모로부터 분리한 시료에서 정상의 태아를 임신한 산모로부터 분리한 시료에서보다 IGF-2의 mRNA 발현량이 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 산모로부터 분리한 시료에서 IGF-2의 mRNA의 발현량을 측정하여 정상 태아를 임신한 산모로부터 분리된 시료에서 측정된 IGF-2의 mRNA의 발현량보다 높은 경우, 상기 산모의 태아를 염색체 이상 질환으로 진단할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 IGF-2 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제; 및 hCG 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 태아의 염색체 이상 질환 선별용 조성물을 제공한다.
상기 mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, IGF-2 유전자 또는/및 hCG 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 IGF-2 유전자 또는/및 hCG 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 태아의 염색체 이상 질환 여부를 간편하게 선별할 수 있다.
따라서, 상기 IGF-2 유전자 및 hCG 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 IGF-2 및 hCG 각각에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 보다 바람직하게는 서열번호 1, 2, 4, 및 5의 염기서열로 구성된 프라이머일 수 있다.
한편, DNA 칩은 상기 IGF-2 유전자 또는/및 hCG 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 태아의 염색체 이상 질환 여부를 판독할 수 있다.
상기 태아의 염색체 이상 질환은 염색체 이상에 의해 발생하는 모든 질환을 의미하는 것으로서, 종류에 제한되지 않는다. 상기 태아의 염색체 이상 질환은 바람직하게는 다운 증후군(Down syndrome), 에드워드 증후군(Edward syndrome), 또는 파타우(patau) 증후군일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다운 증후군이다.
상기 선별용 조성물은 IGF-2 유전자 및 hCG 유전자의 발현량의 차이 즉, 각 유전자의 Cq 값의 차이를 측정하는데 사용할 수 있다. 따라서, 상기 선별용 조성물은 IGF-2 유전자의 Cq 값 및 hCG 유전자 Cq 값의 차이를 측정함으로 인하여, 태아의 염색체 이상 질환 여부를 선별할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 선별용 조성물을 포함하는 태아의 염색체 이상 질환의 선별용 키트에 관한 것이다.
상기 선별용 키트는 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 선별용 키트일 수 있다. IGF-2 및 hCG에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 바람직하게는 서열번호 1, 2, 4, 및 5의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 태아의 염색체 이상 질환 선별방법은 산모의 체중, 나이, 임신 주수에 영향을 적게 받으면서 높은 민감도와 정확도로 태아의 염색체 이상 질환을 선별할 수 있다. 또한, 산모의 혈장 내 mRNA 발현양의 차이를 이용한 것이기 때문에, 위험성이 낮으며 저비용으로 간단하게 태아의 염색체 이상 질환을 선별할 수 있는 장점이 있다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: RNA 추출
8개의 삼염색체 시료와 27개의 정상 시료 (표 1 참조) 200 ul 플라스마(plasma)에서 QIAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Cat No. 52960)를 사용하여 mRNA를 추출하였다. 제조사의 방법을 따랐으며 간단히 기술하면 다음과 같다. 800 ul의 AVL 완충용액에 캐리어 A용액 8 ug을 섞고 200 ul 플라스마를 넣어 15초간 섞어 10분간 실온에서 반응시켰다. 이 튜브에 800 ul의 에탄올을 넣고 15초간 혼합 후 미니 컬럼(mini column)에 넣고 6000 g에서 30초간 원심 분리하였다. 컬럼에 AW1용액을 500 ul 넣어 6000 g에서 30초간 원심분리하고, AW2용액을 500 ul 넣어 20000 g에서 3분간 원심분리하였다. 이 튜브에 35 ul의 용출 완충용액을 넣고 20000 g에서 1 분간 원심 분리하여 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA는 nano drop mass spectrometer를 이용하여 단백질 및 유기용매의 오염 정도를 측정하였다.
특징 정상 산모 대조군(N=27) 삼염색체성 산모(N=8)
산모연령의 평균(Mean of maternal age)
(years, mean±SD)		 32.1±3.4 33.4±2.6
임신주수의 중앙값(Median of gestational age) (weeks) 12 12.5
유전자형(Genotype) 46XX, 46XY 47XX+18
47XY+18
47XX+21
47XX+21
상기 방법으로 추출된 RNA는 양과 질에서 실험군(삼염색체성 산모로부터 분리된 RNA)과 대조군(정상 산모 대조군에서 분리된 RNA) 사이에 차이가 없었다. 대조군과 실험군의 추출된 RNA 양과 흡광도 비율로 표시한 순도는 하기 표 2와 같았다.
대조군a) 삼염색체군b)
(ng/ul)
260/280
260/230		 111.2±29 96.9±30.6
3.2±0.1 3.2±0.1
1.6±0.6 1.3±0.8
a) 27개의 시료의 정량한 평균 농도의 흡광도 비율을 표시하였다.
b) 8개의 시료의 정량한 평균 농도의 흡광도 비율을 표시하였다.
실시예 2: cDNA 제조
추출한 RNA 300 ng로 SuperScript III RT-PCR kit (Invitrogen, Cat No. 18080-051)를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 300 nM의 역방향 프라이머(reverse primer)와 1 mM의 dNTP, 100 unit superscripIII RTase, 1 mM dNTP, 5 mM MgCl2을 넣고 50 ℃로 40분 반응 후, 95 ℃로 5분 반응하여 종료하였다. 이때 양성 대조군은 genomic DNA를 사용하였고 음성 대조군은 템플레이트 없는 대조군(no template control)을 사용하였다. 상기 cDNA 제조를 위해 사용한 역방향 프라이머의 서열은 하기와 같았다.
IGF-2 R : GCGCCGAATTAGTTGATTT
hCG R : TGGACTCGAAGCGCACATC
ACTB R : TCCACTCACCATTCTGGTTGTAA
실시예 3: 정량 PCR 의 수행
상기 실시예 2에서 제조된 100 ng의 cDNA에 하기 표 3의 250 nM 정방향 프라이머(forward primer), 125 nM 역방향 프라이머(reverse primer), 및 250 nM 태크만 프로브(Taqman probe)를 20 ul에 넣어 ABI 7300기기를 이용하여 정량 PCR을 다음과 같이 진행하였다. 95 ℃에서 15초, 52 ℃에서 10초, 그리고 72 ℃에서 30초 조건에서 50 사이클 반복하였다. 이때 Template의 농도가 높을 수록 형광물질이 먼저 탐지되어 작은 사이클의 수 (Cq) 값을 보이게 된다.
표적 염기서열 (5’->3’)
IGF-2 F : CTCTCAGGCCGTACTTCCGGAC (서열번호 1)
R : GCGCCGAATTAGTTGATTT (서열번호 2)
Probe : ACCATCGGGCAAGGGGATCTCAGC (서열번호 3)
hCG F : CTACTGCCCCACCATGACCC (서열번호 4)
R : TGGACTCGAAGCGCACATC (서열번호 5)
Probe : CCTGCCTCAGGTGGTGTGCAACTAC (서열번호 6)
ACTB F : CAACCGTGAGAAGATGACTCAGA (서열번호 7)
R : TCCACTCACCATTCTGGTTGTAA (서열번호 8)
Probe : TCTCTGTACGCTTCTGGCCGCACC (서열번호 9)
그 결과, 단백질 마커에서 임신 제1 삼분기에서 증가하는 것으로 알려진 hCG의 변화는 미비한 반면, IGF-2의 발현은 삼염색체군에서 유의하게 증가하였다. ACTB의 변화도 감지되었으나 대조군 오차 범위가 IGF-2 보다 크게 관찰되었다. 하기 표 4는 대조군 및 삼염색체군에서 ACTB, hCG, IGF-2에 대한 정량 PCR의 평균 Cq 값을 나타낸 것이다 (표 4).
대조군 a) 삼염색체군b)
ACTB
hCG
IGF-2		 33.1±3.2 30.2±1.7
30.7±1.6 29.7±3.9
33.5±1.1 30.8±1.3
a) 27개의 시료를 사용하였고 정량 PCR의 Cq값에 SD를 표시하였다.
b) 8 개의 시료를 사용하였고 정량 PCR의 Cq값에 SD를 표시하였다.
IGF2와 hCG 그리고 hCG와 ACTB의 발현 차이를 delta Cq로 표시하였을 때 표 5와 표 6에서 보는 바와 같이 정상 대조군에 비해 다운 증후군을 임신한 산모의 혈액에서 차이를 보였다. 구체적으로, 하기 표 5는 삼염색체 실험군의 IGF2와 hCG, 그리고 hCG와 ACTB의 발현 차이를 나타낸 것이다.
유전형 임신주수(GA) IGF2(Cq) hCG(Cq) ACTB(Cq) IGF-hCGa) hCG-ACTBb)
47XX,+21 12.0 29.44 31.67 30.11 -2.24 1.57
47XX,+21 12.4 30.46 31.70 31.47 0.93 -1.72
47XY,+21 12.4 31.95 31.02 32.74 -1.24 0.23
47XX,+21 12.6 32.13 30.45 28.82 1.68 1.63
47XX,+21 18.6 32.08 31.77 30.16 0.31 1.61
47XY,+18 11.3 32.98 31.48 26.59 1.51 4.89
47XY,+18 12.6 31.39 29.34 26.55 2.05 2.79
47XX,+18 13.0 32.04 30.00 33.23 2.04 -3.23
mean± SD 31.6± 1.1 30.9± 0.9 30± 2.5 0.6± 1.6 1± 2.5
a) △Cq = Cq of IGF- Cq of hCG 2.2 이하는 다운 증후군으로 판정
b) △Cq = Cq of hCG- Cq of ACTB 0 이상은 다운 증후군으로 판정
하기 표 6은 정상 대조군의 IGF2와 hCG, 그리고 hCG와 ACTB의 발현 차이를 나타낸 것이다.
임신주수(GA) IGF2(Cq) hCG(Cq) ACTB(Cq) IGF-Hcga) hCG-ACTBb)
11.2 33.30 31.77 31.43 1.53 0.34
11.3 35.47 32.76 34.63 2.70 -1.87
11.3 32.61 27.14 32.31 5.47 -5.17
11.4 35.40 32.40 38.26 3.00 -5.86
11.4 32.45 31.56 34.32 0.89 -2.76
11.4 30.88 30.25 29.35 0.64 0.89
11.4 34.37 31.34 28.58 3.04 2.76
11.4 33.65 30.50 29.18 3.15 1.32
11.5 34.76 33.17 33.46 1.59 -0.29
11.5 34.40 31.36 34.87 3.04 -3.51
11.5 34.47 30.46 35.18 4.00 -4.71
11.5 33.49 31.44 31.85 2.06 -0.42
12 33.57 31.18 31.52 2.39 -0.35
12 33.07 30.87 38.40 2.20 -7.53
12 34.69 30.79 36.49 3.90 -5.69
12 33.97 27.80 33.68 6.17 -5.88
12.1 32.66 29.85 25.56 2.81 4.28
12.2 34.03 31.06 32.85 2.97 -1.79
12.3 34.16 32.33 33.16 1.83 -0.83
12.3 34.67 31.43 38.20 3.24 -6.78
12.4 33.10 30.79 33.25 2.30 -2.46
12.5 33.89 30.78 36.50 3.11 -5.71
12.5 31.81 30.63 30.56 1.18 0.07
12.6 32.72 31.34 36.12 1.38 -4.78
12.6 33.26 30.29 32.86 2.97 -2.57
12.8 31.15 25.69 29.69 5.46 -4.00
13 34.18 31.29 37.05 2.89 -5.76
mean±SD 33.6± 1.2 30.8± 1.6 33.3± 3.2 2.8± 1.4 -2.6± 3.1
a) △Cq = Cq of IGF- Cq of hCG 2.2 이상은 정상군으로 판정
b) △Cq = Cq of hCG- Cq of ACTB 0 이하는 정상군으로 판정
다운 증후군 산전 선별 검사를 위하여 선택한 표지물질 IGF2, hCG 그리고 ACTB는 표 4에서 보는 바와 같이 그 자체로도 발현의 차이를 보이고 있다. 그러나 표5, 6에서 보이는 바와 같이 IFG-hCG 혹은 hCG-ACTB의 delta Cq 값이 산모 혈장에서 다운증후군을 산전에 선별하는데 더 우수함을 알 수 있다.
또한, 표지물질의 발현차이(delta Cq) 값을 이용하여 염색체 이상을 분석하면, 염색체 이상 선별의 민감도, 특이도 양예측치, 음예측치에서 각 표지물질의 발현량으로 분석한 것보다 모두 우수한 결과가 나타났다. 하기 표 7은 각각의 표지물질(IGF, hCG, ACTB) 발현량을 이용한 분석결과를 나타낸 것이며, 하기 표 8은 표지물질의 발현차이 값을 이용한 분석결과를 나타낸 것이다.
　 IGF hCG ACTB
민감도 50 37.5 75
특이도 88.9 51.8 66.7
양예측치 57.1 18.7 40
음예측치 85 73 90
　 IGF-hCG hCG-ACTB
민감도 100 75
특이도 70 78
양예측치 50 50
음예측치 100 91
또한, hCG와 ACTB의 delta Cq 값 (△Cq)으로 예측한 다운증후군 유무와 검사결과(표 12) 및 IGF와 hCG의 delta Cq 값 (△Cq)으로 예측한 다운증후군 유무와 검사결과(표 13)는 IGF의 발현량으로 예측한 다운증후군 유무와 검사결과(표 9), hCG의 발현량으로 예측한 다운증후군 유무와 검사결과(표 10), 및 ACTB의 발현량으로 예측한 다운증후군 유무와 검사결과(표 11)보다 훨씬 정확한 다운증후군 선별이 가능함을 뒷받침하였다.
　IGF (32) 다운증후군 정상대조군
검사결과양성 4 3
검사결과음성 4 24
　hCG(31) 다운증후군 정상대조군
검사결과양성 3 13
검사결과음성 5 14
　ACTB(32) 다운증후군 정상대조군
검사결과양성 6 9
검사결과음성 2 18
　 hCG-ACTB 다운 증후군 정상대조군
검사결과 양성 6 6
검사결과 음성 2 21
　 IGF-hCG 다운 증후군 정상대조군
검사결과 양성 8 8
검사결과 음성 0 19
질병을 진단하는데 있어서, 상기와 같이 개개의 표지 물질이 우수하지 못하더라도 혹은 단백질의 발현 양상과는 다른 결과를 보이더라도, 이들의 발현 차이를 이용하여 질병을 진단할 경우, 우수한 민감도와 정확성을 가짐을 알 수 있으며, 이러한 표지물질의 발현차이를 기준으로 질병을 진단하는 방법은 기존에 알려져 있지 않은 새로운 접근법이다. 상기와 같은 실험결과로부터 본 발명의 표지물질 발현 차이를 이용한 방법은 태아의 성별에 좌우되지 않고, 다운증후군 뿐만 아니라 에드워드 증후군으로 알려진 다른 염색체 이상에도 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
<110> YeBT.Inc. <120> A method for screening chromosome abnormality syndrome with differential expression of maternal plasma mRNA <130> PA121078KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IGF-2 <400> 1 ctctcaggcc gtacttccgg ac 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IGF-2 <400> 2 gcgccgaatt agttgattt 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for IGF-2 <400> 3 accatcgggc aaggggatct cagc 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for hCG <400> 4 ctactgcccc accatgaccc 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for hCG <400> 5 tggactcgaa gcgcacatc 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for hCG <400> 6 cctgcctcag gtggtgtgca actac 25 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ACTB <400> 7 caaccgtgag aagatgactc aga 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ACTB <400> 8 tccactcacc attctggttg taa 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for ACTB <400> 9 tctctgtacg cttctggccg cacc 24

Claims (17)

  1. 산모로부터 분리된 시료에서 IGF(Insulin-like growth factor)-2 mRNA의 발현량과 hCG(human chorionic gonadotropin) mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 태아의 다운 증후군의 선별을 위한 정보 제공방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IGF-2 mRNA의 발현량과 hCG mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계는,
    산모로부터 분리된 시료에서 IGF-2 유전자 및 hCG 유전자를 정량 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후, IGF-2 mRNA의 발현 및 hCG mRNA의 발현에 대한 각각의 Cq(quantification cycle) 값을 측정하는 단계; 및
    상기 IGF-2의 Cq(quantification cycle) 값과 hCG의 Cq(quantification cycle) 값의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 것인 정보 제공방법.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 PCR은 IGF-2 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 hCG 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 4 및 5의 염기서열로 구성된 프라이머를 사용하여 수행되는 것인 정보 제공방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 IGF-2의 Cq(quantification cycle) 값에서 hCG의 Cq(quantification cycle) 값을 뺀 값이 2.3 이하이면 태아를 다운 증후군으로 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것인 정보 제공방법.
  6. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, hCG(human chorionic gonadotropin) mRNA의 발현량과 베타-액틴 mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 정보 제공방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 hCG mRNA의 발현량과 베타-액틴 mRNA의 발현량의 차이를 측정하는 단계는,
    산모로부터 분리된 시료에서 hCG 유전자 및 베타-액틴 유전자를 정량 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후, hCG mRNA의 발현 및 베타-액틴 mRNA의 발현에 대한 각각의 Cq(quantification cycle) 값을 측정하는 단계; 및
    상기 hCG의 Cq(quantification cycle) 값과 베타-액틴의 Cq(quantification cycle) 값의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 것인 정보 제공방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 PCR은 hCG 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 4 및 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 베타-액틴 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 7 및 8의 염기서열로 구성된 프라이머를 사용하여 수행되는 것인 정보 제공방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 hCG의 Cq(quantification cycle) 값에서 베타-액틴의 Cq(quantification cycle) 값을 뺀 값이 0 이상이면 태아를 다운 증후군으로 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것인 정보 제공방법.
  11. 삭제
  12. 산모로부터 분리된 시료에서, 정상 태아를 임신한 산모의 혈액과 다운 증후군을 가지는 태아를 임신한 산모의 혈액 간에 발현차이를 보이는 IGF-2 유전자와 hCG 유전자를 정량 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 후 IGF-2 유전자 mRNA 발현에 대한 Cq(quantification cycle) 값과 hCG 유전자 mRNA 발현에 대한 Cq(quantification cycle) 값을 측정하는 단계; 및
    상기 IGF-2 유전자의 Cq(quantification cycle) 값과 hCG 유전자의 Cq(quantification cycle) 값의 차이를 측정하는 단계를 포함하는 태아의 다운 증후군의 선별을 위한 정보 제공방법.
  13. 산모로부터 분리된 시료에서 IGF-2의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 IGF-2의 발현량이 정상 태아를 임신한 산모로부터 분리된 시료에서 측정된 IGF-2의 발현량보다 높은 경우, 상기 산모의 태아를 다운 증후군으로 선별하는 단계를 포함하는, 태아의 다운 증후군의 선별을 위한 정보 제공방법.
  14. IGF-2 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제; 및 hCG 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 태아의 다운 증후군 선별용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 IGF-2 및 hCG 각각에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1, 2, 4, 및 5의 염기서열로 구성된 프라이머인 것인 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 태아의 다운 증후군 선별용 키트.
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