KR101594948B1 - 미세조류 배양공정에서 과초산의 분해기작을 이용한 새로운 멸균방법 - Google Patents

미세조류 배양공정에서 과초산의 분해기작을 이용한 새로운 멸균방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 과초산을 이용한 광생물반응기의 멸균 및 분해반응은 광생물반응기의 내부 및 배관을 과초산으로 채우고 반응시켜 살균하는 단계와, 광생물반응기를 살균한 후에 광생물반응기에 FeCl3와 HEPES을 첨가하는 단계와, 광생물반응기내에서 이들을 반응시켜 과초산과 그 반응물을 최종적으로 완전분해시킨 후, 초산, 물, 산소로 분해시키는 단계와, 광생물반응기에 농축된 배지(BG11)를 첨가하여 순수배양하는 단계로 구성된다.
본 발명은 공정단축, 세척수 절감 및 자원을 재활용할 수 있으며, 환경친화적인 미세조류 배양시스템 및 멸균공정을 제공하므로 산업상 이용가능성이 크다.

Description

미세조류 배양공정에서 과초산의 분해기작을 이용한 새로운 멸균방법{Novel Method for Decomposition of Peracetic Acid in a Microalgal Cultivation System}
본 발명은 미세조류의 배양에 있어서 과초산의 분해기작을 이용한 새로운 멸균방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 광합성 미생물인 미세조류의 옥내배양시스템에서 외부로부터의 배지의 오염을 차단하고 순수배양을 하기 위하여 강력한 산화제인 과초산을 사용하여 배양기 내부를 화학적인 방법으로 멸균처리한다. 그 후 배양기에 잔류하는 멸균제인 과초산은 미세조류의 배지에 사용되는 FeCl3 (철이온)과HEPES(pH buffer)등의 화합물들에 의하여 완전한 과초산의 분해를 촉진하게 되어 추가적으로 배양탱크를 세척하지 하지 않아도 무균적으로 배양할 수 있으므로 경제적이고 효율적인 멸균공정을 제공할 수 있다.
미세조류는 고부가가치인 천연물질이나 대체에너지원 중에 한 가지인 바이오디젤 생산을 위한 새로운 대안(Platform)으로 각광을 받고 있다. 보다 높은 생산성을 이루기 위하여 미세조류의 배양은 광생물반응기 안에서 지속적이고 안정적인 순수단일 배양을 위한 효율적이고 경제적인 멸균공정이 필요하다. 흔히 사용하고 있는 고온습식 멸균방법은 가장 확실하게 광생물반응기 내부의 오염균을 멸균시킬 수있으나, 열내구성이 떨어지는 재질로 구성된 광생물반응기의 경우 그 적용이 불가능하고 120℃가 넘는 고온을 최소 20분 이상 유지해야 하기에 에너지소모가 지나치게 많다는 단점이 있다.이에 대한 대안으로 강한 산화제인 과초산을 이용한 화학적멸균방법은 반응기를 구성하는 재질의 열내구성에 관계없이 광생물반응기 안에서 미세조류를 외부오염 없이 단일배양을 이루기 위하여 사용할 수 있으나 멸균 후(접종전) 배양기 안에 남아 있는 멸균제의 잔류 물질을 세척해야 하는 추가 공정이 필요하고, 또한 이 세척 과정에 필요한 멸균된 세척수(증류수)를 준비하는 과정에서 추가적인 비용이 발생한다.
이에 본 발명에서는 반응기내부를 2 mM과초산으로 멸균한 후 멸균제인 과초산을 미세조류 배양에 필요한 화합물 중 일부를 선택적으로 과초산 용액과 반응시켜 과초산의 분해반응을 촉매하는 공정을 도입하였다. 실험을 통해 흔히 미세조류의 배지에 사용되는 FeCl3 (철이온)과 HEPES (pH buffer)의 두 가지 화합물이 시너지 효과로 과초산의 분해를 촉진하는 데 필요하다는 것을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다.
기존 광합성반응기를 이용한 대량 미세조류 배양시스템(광생물반응기)은 멸균제(살균제)를 이용하여 반응기 내부를 화학적인 방법으로 멸균한 후, 배양기 내부에 잔류하는 멸균제를 수차례 멸균된 물로 세척한 후 배지와 미세조류를 접종하여 배양시킨다. 그러나 이러한 방법은 화학적 멸균제를 후처리하는 방법이나 멸균된 세척액을 준비하는 과정에서 경제적, 환경적인 문제를 일으키는 요인이 되고 있으나, 마땅한 방안이 없었다.
본 발명의 과초산을 이용한 광생물반응기의 멸균 및 분해반응은 광생물반응기의 내부 및 배관을 과초산으로 채우고 반응시켜 살균하는 단계와, 광생물반응기를 살균한 후에 FeCl3와 HEPES을 첨가하는 단계와, 광생물반응기내에서 이들을 반응시켜 과산화수소로 분해시킨 후 초산, 물, 산소로 분해시키는 단계와, 광생물반응기에 농축된 배지(BG11)를 첨가하여 순수 배양하는 단계로 구성된다.
광생물 배양기내에서 순수배양을 하기 위하여 강력한 산화제인 과초산을 사용하여 배양기내부를 멸균한 후, 멸균 후 잔류하는 과초산은 미세조류의 배지에 사용되는 FeCl3 (철이온)과HEPES (pH buffer) 등의 화합물 들을 이용하여, 분해를 촉진하게 되므로 추가적으로 배양탱크를 세척하지 않아도 무균배양할 수 있다. 이들 과초산의 분해촉진제는 최종적으로 초산과 산소와 물로 촉매분해하는 환경친화적인 새로운 멸균시스템을 제공한다. 종래에는 미세조류 배양에 있어 과초산으로 멸균한 후 멸균수를 버리고 멸균된 세척수로 배양기를 세척하는 공정을 생략할 수 있으므로 경제적이며 공정을 단순화할 수 있고, 과초산의 분해산물인 초산이 미세조류의 접종후 영양분으로 사용될 수 있어서 미생물의 성장을 돕고 최종적으로 바이오매스의 생산량을 높일 수 있게 한다.
과초산에 의한 광생물반응기의 멸균 후에 잔류하는 과초산을 세척하지 않으므로 세척수와 세척공정을 절감할 수 있고, 미세조류 배지에 포함되는 배지성분의 일부인 철이온과 pH완충액 등으로 잔류하는 과초산을 산소, 물 및 초산으로 분해시켜 그 일부 성분을 미세조류의 영양배지로 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 공정단축, 세척수 절감 및 자원을 재활용 할 수 있으며, 환경친화적인 미세조류 배양시스템 및 멸균공정을 제공한다.
도 1은 광생물반응기 내에서 과초산과 배지에 의해 살균과 중화가 일어나는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 BG11용 영양배지에 의해 과초산의 분해과정을 나타낸 것이다. 염화철과 HEPES에 의해 과초산의 반응이 6시간 이내에 완료되었다.
도 3은 본 발명의 과초산 분해과정을 거친 미세조류인C. vulgaris and Synechocystissp.PCC 6803 의 배양시 생육곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 박테리아에 오염된 배양물의 과초산에 대한 영향을 나타낸 것으로 아가플레이트 상의 LB 및 TYG배지에 생육박테리아 수의 CFU를 측정하였다.
본 발명의 과초산을 이용한 광생물반응기의 멸균 및 분해반응은 광생물반응기의 내부 및 배관에 과초산을 채우고 반응시켜 살균하는 단계와, 광생물반응기를 살균한 후에 멸균수에 잔류하는 과초산을 제거하는 단계와, 광생물반응기에 FeCl3와 HEPES을 첨가하는 단계와, 광생물반응기내에서 이들을 반응시켜 과산화수소로 분해시킨 후 최종적으로 초산, 물, 산소로 분해시키는 단계와, 광생물반응기에 농축된 배지(BG11)를 첨가하여 순수배양하는 단계로 구성된다.
과초산은 물과 반응하여 다음과 같이 반응하여 초산과 과산화수소를 형성한다.
ⅰ) CH3CO3H + H2O H를의2O2 + CH3CO2H
과초산과 물이 반응하여 생성된 과산화수소는 Ferric iron(III)에 의하여Fenton reaction에 의해 최종적으로 초산과 물과 산소로 분해된다.
Figure 112014015866869-pat00001

실험적으로, 24 ㎛ FeCl3가 2mM 과초산의 분해를 촉매하기 위해서 사용되었으나 시간상 효율적인 분해반응을 위해서는 FeCl3 뿐만 아니라 pH값에 영향을 미치는 HEPES가 필요하였고, 6시간 만에 완전히 과초산이 분해(중화)되었다. 과초산의 배양기내에서 분해 및 배양까지의 과정(프로토콜)은 광생물반응기의 내부 및 배관에 2 mM의 과초산을 채우고 2시간 이상 반응시켜서 살균하는 단계와, 광생물반응기를 살균한 후에 24 ㎛ FeCl3과 10mM HEPES을 첨가하는 단계와, 광생물반응기내에서 이들을 6시간 이상 반응시켜 초산, 물, 산소로 분해시키는 단계와, 광생물반응기에 농축된 배지(BG11)를 첨가하여 순수배양하는 단계로 구성된다.
<실시예>
광생물반응기의 내부 및 배관을 2 mM의 과초산으로 채우고 2시간 이상 반응시켜 살균하였다. 광생물반응기를 과초산으로 살균한 후에 광생물반응기에 24 ㎛ FeCl3와 10mM HEPES을 첨가하였다. 광생물반응기 내에서 이들을 6시간 이상 반응시켜 과초산과 그 반응물을 최종적으로 초산, 물, 산소로 분해시켰다. 광생물반응기에 농축된 배지(BG11)를 첨가하여 순수배양하였다.
<시험예>
본 발명의 광생물반응기를 과초산으로 멸균하고 잔류하는 과초산을 세척하지 않고 배지 중에서 분해시켜 배지로 이용하였을 때 잡균의 오염 여부를 확인하기 위하여 시험한 결과를 다음의 표 1(도4)에 나타냈다.
Figure 112014015866869-pat00002
상기와 같이 과초산 멸균후 과초산이 완전히 분해되어도 잡균오염이 없는 것으로 나타났다.
본 발명은 공정단축, 세척수 절감 및 자원을 재활용할 수 있으며, 환경친화적인 미세조류 배양시스템 및 멸균공정을 제공하므로 산업상 이용가능성이 크다.

Claims (5)

  1. 광생물반응기의 내부 및 배관을 과초산으로 채우고 반응시켜 살균하는 단계와, 상기의 광생물반응기에 과초산 분해촉진제를 첨가하는 단계와, 상기 광생물반응기 내에서 이들을 반응시켜 과초산 반응물을 최종적으로 초산, 물, 산소로 분해시키는 단계와, 상기 광생물반응기에 농축된 배지를 첨가하여 미세조류를 순수배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 과초산의 분해기작을 이용한 미세조류의 새로운 멸균방법
  2. 제 1항에 있어서, 과초산 분해촉진제로 철이온 및 염기성 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는 과초산의 분해기작을 이용한 미세조류의 새로운 멸균방법
  3. 제 2항에 있어서, 상기 철이온은 FeCl3이고, 상기 염기성 완충액은 HEPES가 미세조류용 배지 중에 포함되는 것을 특징으로 하는 과초산의 분해기작을 이용한 미세조류의 새로운 멸균방법
  4. 제 1항에 있어서, 농축된 배지는 BG11 또는 미세조류용 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 과초산의 분해기작을 이용한 미세조류의 새로운 멸균방법
  5. 제 1항에 있어서, 미세조류는 광합성 미생물을 포함하는 것을 특징으로하는 과초산의 분해기작을 이용한 미세조류의 새로운 멸균방법
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