KR101593641B1 - Antibody recognizing nucleocapsid of Middle East respiratory syndrome coronavirus and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체 및 그를 생산할 수 있는 세포, 상기 항체를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 진단용 조성물, 키트, 및 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to an antibody that recognizes a nucleoside of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and a cell capable of producing the same, a composition for diagnosing a coronavirus of the Middle East Respiratory Syndrome including the antibody, a kit, The present invention relates to a method for diagnosing respiratory syndrome coronavirus infection.
중동호흡기증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV)는 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견된 뒤 중동 지역에서 집중적으로 발생한 바이러스다 Coroviridae 군에 속하며 SARS(중증급성호흡기증후군)와 유사한 바이러스로 알려져 있다.The Middle East Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV) is a virus that was first detected in Saudi Arabia in 2012 and is the most intensive virus in the Middle East. It is known as Coroviridae and is similar to SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome).
MERS-CoV는 잠복기가 1주일가량이며 SARS와 마찬가지로 고열, 기침, 호흡곤란 등 심한 호흡기 증상을 일으킨다. 다만 SARS와는 달리 급성 신부전증을 동반한다. SARS 보다 치사율이 6배가량 높다는 조사 결과가 나오기도 하는 등 더 치명적인 양상을 보이고 있다. 연령대에 따라 치사율은 50%가 넘는다.MERS-CoV has a latency period of about one week and, like SARS, causes severe respiratory symptoms such as high fever, cough, and difficulty in breathing. However, unlike SARS, acute renal failure is accompanied. There are also reports that the mortality rate is six times higher than that of SARS. The mortality rate is over 50% depending on the age group.
감염원은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만 낙타가 지목되고 있다. 감염자로부터 검출된 바이러스와 감염자가 사육하고 있던 낙타에서 검출된 바이러스가 일치한 경우도 있었다. 그러나 낙타고기를 먹거나 우유를 마시는 관습이 있어 예방은 쉽지 않은 것으로 알려져 있다.The source of the infection is not yet known, but a camel is being identified. There was a case where the virus detected from the infected person and the virus detected from the camel that the infected person was raised were matched. However, prevention is not easy due to the custom of eating camel meat or drinking milk.
따라서, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 감염의 진단이 요구되고 있다. Therefore, the diagnosis of the infection of the Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) is required.
본 발명의 일 양상은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체를 제공한다.One aspect of the invention provides an antibody that recognizes the Middle East Respiratory Syndrome coronavirus nucleocapsid.
본 발명의 다른 양상은 수탁번호 KCLRF-BP-00331 또는 KCLRF-BP-00332인 하이브리도마를 제공한다.Another aspect of the invention provides hybridomas having accession numbers KCLRF-BP-00331 or KCLRF-BP-00332.
본 발명의 다른 양상은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 진단용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for diagnosing coronavirus of the Middle East Respiratory Syndrome.
본 발명의 다른 양상은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 진단용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for diagnosing coronavirus of the respiratory syndrome of the Middle East.
본 발명의 다른 양상은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염 여부를 진단하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method of diagnosing whether or not a coronavirus infection is caused by a respiratory syndrome of the Middle East.
일 양상은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체를 제공한다. One aspect provides an antibody that recognizes the Middle East Respiratory Syndrome coronavirus nucleocapsid.
중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV, 이하 'MERS-CoV'라고 지칭)는 양성-센스 단일가닥 RNA를 갖는다. 상기 MERS-CoV는 베타코로나바이러스(Betacoronavirus) 속의 종이다. 상기 MERS-CoV는 또한 HCoV-EMC 또는 NcoV로 알려져있다. Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV, hereinafter referred to as 'MERS-CoV') has positive-sense single stranded RNA. The MERS-CoV is a species belonging to the genus Betacoronavirus. The MERS-CoV is also known as HCoV-EMC or NcoV.
상기 항체는 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 1에서 22 내지 40번째, 126 내지 146번째, 164 내지 202번째, 234 내지 259번째, 362 내지 388번째, 또는 그의 조합의 아미노산 서열을 갖는 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드는 친수성(hydrophilicity)일 수 있다. 서열번호 1에서 22 내지 40번째, 126 내지 146번째, 164 내지 202번째, 234 내지 259번째, 362 내지 388번째, 또는 그의 조합의 아미노산 서열을 갖는 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드는 각각 서열번호 1, 2, 3, 4, 및 5의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 친수성을 갖는 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드는 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명자들은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 친수성을 조사하여, 상기 단백질 중 친수성이 높은 부위의 폴리펩티드 항원을 제작하여, 이에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하였다. The antibody may specifically bind to the nucleocapsid of MERS-CoV. The nucleoside of MERS-CoV may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The nucleocapsid of MERS-CoV having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 at positions 22 to 40, 126 to 146, 164 to 202, 234 to 259, 362 to 388, or a combination thereof has hydrophilicity . The nucleoside of MERS-CoV having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from 22 to 40, 126 to 146, 164 to 202, 234 to 259, 362 to 388, 2, 3, 4, and 5, respectively. The nucleocapsid of the hydrophilic MERS-CoV may comprise an epitope. According to one embodiment of the present invention, the present inventors investigated the hydrophilicity of the nucleocapsid protein of MERS-CoV to prepare a polypeptide antigen having high hydrophilicity in the protein, and produced an antibody specifically binding thereto .
본 발명의 일 구체예에 따르면, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 또한, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 및 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 조합인 것인 항체를 제공한다. According to one embodiment of the present invention, there is provided a monoclonal antibody which specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in a nucleoside of MERS-CoV. According to one embodiment of the present invention, there is provided a monoclonal antibody which specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in a nucleocapside of MERS-CoV. In addition, a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the nucleoside of MERS-CoV, and an epitope expressed by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the nucleoside of MERS- Lt; RTI ID = 0.0 > monoclonal < / RTI > antibody.
용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 또는 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"은 당업자에게 통상적으로 알려진 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 항원-항체 복합체를 형성할 수 있으며, 또한 면역학적 반응을 하는 것을 의미할 수 있다.The terms "specifically binding" or " specifically recognizing "are the same as commonly known to those of ordinary skill in the art, wherein the antigen and antibody specifically interact to form an antigen- And may also mean immunological reactions.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가질 수 있다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가질 수 있다.A complete antibody has two full-length light chains and two full-length heavy chains. Each light chain has a constant region of a heavy chain and disulfide bond (SS-bond) antibody divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region (?), Gamma (?), Alpha (?), Delta (?) And epsilon 3 (gamma 3), gamma 4 (gamma 4), alpha 1 (alpha 1), and alpha 2 (alpha 2). The constant region of the light chain may have kappa (kappa) and lambda (lambda) types.
용어, "단일클론 항체(monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론 항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.The term "monoclonal antibody" means that the antibody molecule is made to consist of a single molecule. Monoclonal antibodies have specificity to react only to antigens having the same epitope, and also show affinity only for certain epitopes.
본 발명의 일구체예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 수탁번호 KCLRFBP00331인 것인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다. 또한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 수탁번호 KCLRFBP00332인 것인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody that specifically binds to the epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be one produced in a hybridoma cell having a deposit number KCLRFBP00331. In addition, the monoclonal antibody that specifically binds to the epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be one produced in a hybridoma cell having the accession number KCLRFBP00332.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 MERS-CoV 뉴클레오캡시드의 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 MERS-CoV 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.The hybridoma cells can be prepared using methods known in the art. Specifically, the hybridoma cells are prepared by immunizing an animal with a polypeptide of the immunogenic MERS-CoV nucleocapsid, fusing B cell, an antibody-producing cell derived from the immunized animal, with myeloma cells to prepare a hybridoma Next, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the MERS-CoV nucleocapsid can be selected from the hybridomas. The animal to be immunized can be an animal such as a goat, a sheep, a guinea pig, a rat or a rabbit as well as the mouse used in the examples.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다. 한편, 상기 단일클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있다.
As a method for immunizing the immunized animal, a method well known in the art can be used. For example, when a mouse is immunized, an immunogen of 1 to 100 占 퐂 is emulsified at a time with an antigen adjuvant such as an equivalent amount of physiological saline and / or Freund's adjuvant to subcutaneously Or by inoculating 2-6 times every 2-5 weeks in the abdominal cavity. After the immunized animal is immunized, the spleen or lymph node is harvested after 3-5 days of the final immunization, and the B cell contained in the tissue of the spleen or the lymph node in the presence of the fusion promoter is transplanted into the bone marrow Cells. As the fusion promoter, for example, a material such as polyethylene glycol (PEG) may be used. The myeloma cells include, for example, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2 / 0-Ag14, and rat-derived cells such as AG1 and AG2 can be used. In addition, the cell fusion method known in the art includes, for example, mixing B cells and myeloma cells at a ratio of 1: 1-10: 1, adding PEG having a molecular weight of 1,000-6,000 at a concentration of 10-80% Followed by incubation at 30-37 ° C for 1-10 minutes. The hybridoma producing the monoclonal antibody specifically binding to the nucleoside of MERS-CoV may be cultured in a selective medium such as a HAT medium in which only hybridomas are viable, The antibody activity in the culture supernatant can be measured and selected by a method such as ELISA. Finally, hybridomas that produce monoclonal antibodies that specifically bind to the nucleocapsids of MERS-CoV are, for example, those that produce monoclonal antibodies that specifically bind to the nucleocapsid of MERS-CoV The hybridoma can be selected by repeating the cloning by a method such as limiting dilution. The monoclonal antibody may be of the IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, or IgD type.
다른 양상은 상술한 단일클론 항체에 따른 항원 결합 단편을 제공한다.Another aspect provides antigen binding fragments according to the monoclonal antibodies described above.
용어 “항체(antibody)”는 MERS-CoV에 대한 특이 항체로서, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체, 항체 분자의 항원 결합 단편, 합성 항체, 재조합 항체, 또는 항체 하이브리드(antibody hybrid)를 포함할 수 있다. 완전한 항체에 대한 설명은 상기 언급한 바와 같다.The term " antibody " is a specific antibody to MERS-CoV that specifically binds to a nucleocapsid of MERS-CoV and is a complete antibody, an antigen-binding fragment of an antibody molecule, a synthetic antibody, a recombinant antibody, Hybrid (antibody hybrid) may be included. The description of the complete antibody is as mentioned above.
용어, "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있다(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다). 또한 상기 항원 결합 단편은 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. The term "antigen binding fragment" refers to a fragment of the immunoglobulin whole structure, and refers to a portion of a polypeptide comprising a moiety capable of binding an antigen. For example, F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv or scFv. Among the antigen-binding fragments, Fab has one antigen-binding site in a structure having a variable region of a light chain and a heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region (C H1 ) of a heavy chain. Fab 'differs from Fab in that it has a hinge region that contains at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain. The F (ab ') 2 antibody is produced when the cysteine residue of the hinge region of the Fab' forms a disulfide bond. Recombinant techniques for generating Fv fragments with minimal antibody fragments having only a heavy chain variable region and a light chain variable region are well known in the art. The double-chain Fv is a non-covalent bond, and the variable region of the heavy chain and the light chain variable region are connected to each other. The single-chain Fv generally shares the variable region of the heavy chain and the variable region of the short chain through the peptide linker Or directly connected at the C-terminus to form a dimer-like structure like the double-stranded Fv. The antigen-binding fragment can be obtained using a protein hydrolyzing enzyme (for example, when the whole antibody is restricted to papain, a Fab can be obtained, and when cut with pepsin, an F (ab ') 2 fragment can be obtained). The antigen-binding fragments can also be produced by recombinant techniques.
상기 항체는 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fv(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
The antibody may be a monoclonal antibody, a bispecific antibody, a non-human antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a short chain Fv (scFv), a short chain antibody, a Fab fragment, an F (sdFv) and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, and epitope-binding fragments of such antibodies.
또 다른 양상은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 (수탁번호: KCLRFBP00331)를 제공한다. 또 다른 양상은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 (수탁번호: KCLRFBP00332)를 제공한다. Another aspect provides a hybridoma cell (accession number: KCLRFBP00331) that produces a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in a nucleoside of MERS-CoV. Another aspect provides a hybridoma cell (accession number: KCLRFBP00332) that produces a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the nucleocapsid of MERS-CoV.
상기 하이브리도마 세포의 제조 방법은 상기한 바와 같다. 또한, 하기 실시예에 따라 제조된 상기 하이브리도마 세포는 2014년 10월 14일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 생명공학연구소 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다(수탁번호: KCLRFBP00331 및 KCLRFBP00332). 한편, 기탁된 하이브라도마 세포는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 상기 수탁 번호를 참조하여 일반인들에게 분양이 가능하다.
The method for producing the hybridoma cells is as described above. In addition, the hybridoma cells prepared according to the following examples were deposited with the Korean Collection for Type Cultures, an international depository organization under the Budapest Treaty, on October 14, 2014 (accession number: KCLRFBP00331 and KCLRFBP00332). On the other hand, the deposited Hybridoma cells are stored in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the Deposit of Microorganisms and can be distributed to the general public with reference to the above accession numbers.
다른 양상은 상기 단일클론 항체 또는 항원 결합 단편 및 항-MERS CoV 단일클론 항체를 포함하는 개체의 MERS CoV 진단용 조성물을 제공한다.Another aspect provides a composition for the diagnosis of MERS CoV comprising said monoclonal antibody or antigen-binding fragment and an anti-MERS CoV monoclonal antibody.
상기 조성물은 항체를 액체 중에서 포함하는 액체 조성물일 수 있다. 상기 액체는 상기 항체를 용해시킬 수 있고 유지시킬 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 물, 또는 PBS와 같은 버퍼 용액일 수 있다. 상기 조성물은 상기 항체를 안정하게 유지하는 물질을 더 포함할 수 있다.
The composition may be a liquid composition comprising the antibody in a liquid. The liquid may be one capable of dissolving and retaining the antibody. For example, water, or a buffer solution such as PBS. The composition may further comprise a substance that stably maintains the antibody.
다른 양상은 상술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 MERS-CoV 진단용 키트를 제공한다.Another aspect provides a MERS-CoV diagnostic kit comprising the above-described antibody or antigen-binding fragment thereof.
상기 키트는 검출가능한 모이어티를 더 포함할 수 있다. 검출가능한 모이어티(detectable moiety)는 모이어티의 존재, 상대적 양 및/또는 위치 (예를 들면, 어레이상의 위치)가 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 검출가능한 모이어티는 해당 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 검출가능한 모이어티는 특정 조건에 노출될 경우, 검출될 수 있는 것으로, 형광성 모이어티, 발광성 모이어티, 화학발광성 모이어티, 방사성 모이어티 (예, 방사성 원자), 및 효소 모이어티로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 형광 모이어티는 형광성 모이어티의 여기(excitation)를 야기하는 특정 파장 및 강도에서 방사선(radiation)에 노출될 필요가 있을 수 있고, 이에 의해 검출될 수 있는 특정 파장(wavelength)에서 검출가능한 형광을 발산하게 할 수 있다. The kit may further comprise a detectable moiety. Detectable moieties may include moieties in which the presence, relative amount and / or location (e.g., location on the array) of moieties can be determined, either directly or indirectly. Such detectable moieties are well known in the art. For example, a detectable moiety can be detected when exposed to a particular condition, such as a fluorescent moiety, a luminescent moiety, a chemiluminescent moiety, a radioactive moiety (e.g., a radioactive atom), and an enzyme moiety Lt; / RTI > For example, a fluorescent moiety may need to be exposed to radiation at a particular wavelength and intensity causing excitation of the fluorescent moiety, and detection at a particular wavelength that can be detected thereby It is possible to emit fluorescence as much as possible.
상기 모이어티는 금속 나노 입자를 포함할 수 있다. 상기 금속 나노 입자는 골드 입자일 수 있다. 상기 골드 나노 입자는 적색 골드 나노 입자 또는 청색 금 나노 입자일 수 있다. 상기 골드 나노 입자는 분산 상태, 예를 들면 콜로이드일 수 있다. The moiety may comprise metal nanoparticles. The metal nanoparticles may be gold particles. The gold nanoparticles may be red gold nanoparticles or blue gold nanoparticles. The gold nanoparticles may be in a dispersed state, for example, a colloid.
상기 키트는 분석물을 포함하는 액체 시료가 적용되는 부위인 검체 패드(1), The kit includes a sample pad (1), a sample pad
상기 검체 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고, 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 지지되어 있는 저장 패드(2)로서, 상기 골드 입자의 접합체는 제1 항체 또는 그의 단편과 골드 입자의 접합체이고, Wherein the gold particle conjugate is a conjugate of the first antibody or a fragment thereof and gold particles, and the gold particle conjugate is a conjugate of the first antibody or a fragment thereof and gold particles,
상기 저장 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 모세관 이동에 의하여 상기 액체 시료가 이동하는 크로마토그래피 막(membrane) 물질(3)로서, 상기 저장 패드의 하류에 제2 항체 또는 그의 단편이 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질; A chromatographic material (3) fluidly connected to the storage pad and to which the liquid sample is transferred by capillary movement, the second antibody or fragment thereof being non-diffusively immobilized downstream of the storage pad A chromatographic film material comprising a detection region that is in contact with the chromatographic film material;
상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드(4); 및 A
상기 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체(5)를 포함하는, 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 분석 장치일 수 있다. 상기 분석 장치는 면역 크로마토그래피 검출 장치일 수 있다. And a solid support (5) for supporting the sample pad, the storage pad, the chromatography membrane material and the moisture absorption pad. The analyzer may be an immunochromatographic detection device.
상기 제1 항체와 제2 항체는 예를 들면, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 중 하나의 항체일 수 있다. 상기 제1 항체와 상기 제2 항체는 다른 것일 수 있다. 일 구체예에서, 제1 항체는 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이고, 제2 항체는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다. 또한, 일 구체예에서, 제1 항체는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이고, 제2 항체는 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다.The first and second antibodies specifically bind to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the nucleocapsid of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) A monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: < RTI ID = 0.0 > 4, < / RTI > The first antibody and the second antibody may be different. In one embodiment, the first antibody is a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the second antibody specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Lt; RTI ID = 0.0 > monoclonal < / RTI > In one embodiment, the first antibody is a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the second antibody is a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: Lt; RTI ID = 0.0 > monoclonal < / RTI >
도 1은 본 발명의 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 진단하기 위한 분석 장치의 일 예를 나타내는 측면도이다. 1 is a side view showing an example of an analyzing apparatus for diagnosing to detect the coronavirus of the respiratory syndrome of the present invention.
상기 키트는 고체 지지체 (5) 상에 제2 항체가 고정화되어 있는 검출 영역 (T)과 대조 영역 (C)이 형성되어 있는 크로마토그래피 물질 막 (3)이 지지되어 있고 여기에 검체패드 (1), 제1 항체와 골드 접합체가 지지되어 있는 저장 패드(2) 및 흡습 패드가 중첩되어 연결되어 있다. 스트립에 시료를 검체패드 (1)에 첨가하면, 모세관 현상에 의하여 저장패드 (2)로 이동하여 시료 중의 항원은 저장패드 중의 제1 항체와 골드의 접합체와 결합하고 크로마토그래피 물질 막 (3)을 통하여 흡습 패드 (4)의 방향의 하류로 모세관 이동하게 된다. 상기 항원과 상기 접합체의 결합체가 검출 영역 (T)에 도달하게 되면 상기 결합체와 제2 항체가 특이적으로 결합하여 발색하게 되고, 상기 결합체가 없는 경우에는 발색을 하지 않게 된다. 또한, 상기 시료와 함께 제1 항체와 골드 입자의 접합체는 대조 영역 (C)을 통과하는 경우에는 상기 제1 항체와 골드 입자의 접합체는 상기 대조 영역 중의 제1 항체와 골드 입자 접합체에 특이적인 항체와 결합하여 발색함으로써, 모세관 이동이 제대로 되었는지를 확인할 수 있다.The kit includes a
상기 키트는 항원 또는 항체와 같은 면역화학 성분의 고상 담체로서 다공성 물질을 이용하는 면역분석 키트일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 사용되는 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드는 분석될 액체 시료를 수용하고 포함하기 충분한 다공성 (porosity)과 부피를 가진 물질이며, 예를 들면 마이크로다공성 막 물질일 수 있다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 예에는 나일론, 셀룰로즈 물질, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리에스테르 및 유리 섬유가 포함된다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 바람직한 예는, 니트로셀룰로스 막이다. 상기 분석 장치는 스트립의 형태를 가질 수 있다.The kit may be an immunoassay kit using a porous material as a solid phase carrier of an immunochemical component such as an antigen or an antibody. The sample pad, the storage pad, the chromatography membrane material, and the moisture absorption pad used in one embodiment of the present invention are substances having porosity and volume sufficient to contain and contain a liquid sample to be analyzed, for example, a microporous membrane Lt; / RTI > Examples of the microporous membrane material include nylon, cellulose material, polysulfone, polyvinylidene difluoride, polyester and glass fiber. A preferred example of the microporous membrane material is a nitrocellulose membrane. The analyzer may have the form of a strip.
용어 "유체 소통가능하게 연결되어 있는 (in flow communication with)"이라는 표현은 하나의 위치 (예, 검체패드)에 액체 시료가 적용되었을 경우 모세관 이동에 의하여 다른 위치 (예, 저장 패드)로 이용가능하게 연결되어 있는 것을 말한다. 또한, 용어 "이동가능하게 지지되어 있는 (movably supported)"이라는 표현은 액체 시료의 모세관 이동과 함께 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 저장 패드에 고정화되어 있는 것을 의미한다. 또한, 용어 "비확산적으로 고정화되어 있는 (nondiffusively immobilized)"이라는 표현은 제2 항체 또는 그의 단편이 상기 검출 영역 내에 상기 액체 시료의 모세관 이동에 의하여 함께 확산되지 않도록 고정화되어 있는 것을 의미한다. 항원 및/또는 항체를 비확산적으로 고정화하는 방법은 상기 크로마토그래피 막 물질과 항원 및/또는 항체를 크로마토그래피 막 물질의 상기 검출 영역에 비확산적으로 고정화할 수 있는 것이면 임의의 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 공유결합법이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 검출 영역은 임의의 모양, 예를 들면 사각형 및 원형의 형태를 취할 수 있으며 그 면적은 상기 크로마토그래피 막 물질의 면적보다는 작다.The term " in flow communication with "can be used in other locations (e.g., storage pads) by capillary movement when a liquid sample is applied to one location (e.g., a sample pad) And the like. In addition, the term "movably supported" means that the conjugate of gold particles is movably immobilized to the storage pad with the capillary movement of the liquid sample. In addition, the expression "nondiffusively immobilized" means that the second antibody or fragment thereof is immobilized so that it is not diffused together with the capillary movement of the liquid sample in the detection region. A method for non-diffusively immobilizing an antigen and / or an antibody may include any method as long as it is capable of non-diffusively immobilizing the chromatography membrane material and the antigen and / or antibody to the detection area of the chromatography membrane material. Including, but not limited to, covalent bonding. The detection zone can take any shape, for example a square and a circle, and its area is smaller than the area of the chromatographic film material.
본 발명의 일 구체예의 키트에 사용되는 항체와 골드 접합체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 골드 콜로이드 용액을 만들고, 상기 용액 중의 골드를 항체와 공유결합시킴으로써 제조될 수 있다. 항체와 골드 접합체는 예를 들면, 참조에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,514,302호 및 제4,313,734호에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다.Antibodies and gold conjugates used in the kits of one embodiment of the present invention can be prepared by methods well known in the art. For example, a gold colloid solution can be prepared and covalently bound to gold in the solution. Antibodies and gold conjugates can be prepared, for example, by the methods disclosed in U.S. Patent Nos. 5,514,302 and 4,313,734, which are incorporated herein by reference in their entirety.
또한, 상기 키트는 MERS-CoV를 면역분석 방법에 따라 검출하여 MERS-CoV을 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 면역친화성 정제, 면역 크로마토그래피 (immunochromatography), 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. In addition, the kit can be used to diagnose MERS-CoV by detecting MERS-CoV according to an immunoassay method. Such immunoassay can be performed according to various immunoassay or immunostaining protocols developed conventionally. The immunoassay or immuno-staining formats can be used for various methods such as radioimmunoassay, radioactive immunoprecipitation, immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, flow cytometry, Immunoaffinity purification, immunochromatography, and combinations thereof. ≪ RTI ID = 0.0 >
예를 들면, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 MERS-CoV 또는 이의 뉴클레오캡시드를 검출하는 데 이용될 수 있다.For example, when the method of the present invention is carried out according to a radioactive immunoassay, the antibody labeled with a radioactive isotope (for example, C14, I125, P32 and S35) detects MERS-CoV or a nucleocapsid thereof . ≪ / RTI >
또한, 예를 들면, 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에 대한 일차항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. Also, for example, when the method of the present invention is practiced by an ELISA method, a specific embodiment of the present invention includes the steps of (i) coating the surface of a solid substrate with an unknown cell sample lysate to be analyzed; (Ii) reacting the cell lysate with a primary antibody to a nucleocapsid of MERS-CoV; (Iii) reacting the result of step (ii) with an enzyme-conjugated secondary antibody; And (iv) measuring the activity of the enzyme.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 마이크로타이터 플레이트일 수 있다.Suitable as the solid substrate are hydrocarbon polymers (e.g., polystyrene and polypropylene), glass, metal or gel, and may be microtiter plates.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT)나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.The enzyme bound to the secondary antibody may include an enzyme catalyzing a chromogenic reaction, a fluorescent reaction, a luminescent reaction, or an infrared reaction. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase,? -Galactosidase, Oxydase, luciferase and cytochrome P450. When alkaline phosphatase is used as an enzyme that binds to the secondary antibody, it is preferable to use bromochloroindole phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT) naphthol-AS- B1-phosphate and ECF (enhanced chemifluorescence) are used. When horseradish peroxidase is used, chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis- (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazone), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (N-methyl acridinium nitrate), resorpine benzyl ether, luminol, amplex red reagent tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD), and naphthol / pyronin, glucose oxidase and nitroblue tetrazolium, phenzaine methosulfate) can be used. .
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 일 구체예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 항-MERS-CoV 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획 항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, MERS-CoV 또는 이의 뉴클레오캡티드에 특이적으로 반응하는 검출항체(예, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.When the method of the present invention is carried out in the Capture-ELISA system, one embodiment of the present invention comprises the steps of (i) coating an anti-MERS-CoV antibody as a capturing antibody on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting the capture antibody with the sample; (Iii) a detection antibody (e.g., an antibody or antigen-binding fragment of the invention) that is labeled with the resultant product of step (ii) and that specifically reacts with MERS-CoV or a nucleocapide thereof, ; And (iv) measuring a signal originating from the label.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예를 들어, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다. The detection antibody has a label that generates a detectable signal. The label may be a chemical substance (e.g., biotin), an enzyme (alkaline phosphatase,? -Galactosidase, horseradish peroxidase and cytochrome P450), a radioactive material (such as C14, I125 , P32 and S35), a fluorescent material (e.g., fluorescein), a luminescent material, a chemiluminescent material, and a fluorescence resonance energy transfer (FRET).
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 MERS-CoV의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
In the ELISA method and the capture-ELISA method, measurement of the activity of the final enzyme or measurement of the signal can be performed according to various methods known in the art. This signal detection enables qualitative or quantitative analysis of MERS-CoV. If biotin is used as a label, it can be easily detected by streptavidin. When luciferase is used, luciferin can easily detect a signal.
다른 양상은 MERS-CoV 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 MERS-CoV의 복합체를 검출하는 단계;를 포함하는 MERS-CoV를 검출하는 방법을 제공한다. Other aspects include contacting the sample with the antibody or antigen-binding fragment thereof described above to provide information necessary for MERS-CoV diagnosis; And detecting a complex of the antibody or an antigen-binding fragment thereof and MERS-CoV.
상기 MERS-CoV를 검출하는 방법은 상술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 접촉시키는 단계는 시료를 상술한 항-MERS-CoV 항체 또는 이의 항원 결합 단편('1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편'이라고 지칭)이 코팅된 플레이트에 접촉시킨 이후, 항-MERS-CoV 항체 또는 이의 항원 결합 단편('2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편'이라고 지칭)을 추가로 상기 플레이트에 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 상기 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출가능한 모이어티가 결합된 것일 수 있다. 예를 들면, 2차 항체 또는 이의 결합 단편은 금(gold)과 같은 검출가능한 모이어티를 포함하는 것일 수 있다. 상기 1차 및 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 및 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. The method of detecting MERS-CoV may include contacting the sample with the above-described antibody or antigen-binding fragment thereof. The contacting step may be performed by contacting the sample with a plate coated with the anti-MERS-CoV antibody or antigen-binding fragment thereof (referred to as the " primary antibody or antigen binding fragment thereof & Contacting the antigen-binding fragment thereof (referred to as a " secondary antibody or antigen-binding fragment thereof ") with the plate. The primary antibody or antigen-binding fragment thereof and the secondary antibody or antigen-binding fragment thereof may be the same or different. The primary antibody or antigen-binding fragment thereof and the secondary antibody or antigen-binding fragment thereof may be combined with a detectable moiety. For example, the secondary antibody or binding fragment thereof may comprise a detectable moiety such as gold. The primary and secondary antibodies or antigen-binding fragments thereof respectively comprise a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the nucleocapsid of MERS-CoV, A monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the capsid, or vice versa.
상기 MERS-CoV를 검출하는 방법은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 MERS-CoV의 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 검출은 상기 복합체에 결합된 검출가능한 모이어티를 측정함으로써 상기 MERS-CoV의 검출 또는 정량을 할 수 있다. The method for detecting MERS-CoV may include detecting a complex of the antibody or antigen-binding fragment thereof and MERS-CoV. The detection can detect or quantitate the MERS-CoV by measuring a detectable moiety bound to the complex.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있다. 상기 척추동물은 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간 및 비인간 영장류를 포함한 영장류, 낙타, 또는 마우스 및 래트를 포함한 설치류일 수 있다. 상기 시료는 냉동 보관된 것 또는 자연 상태에 방치된 것일 수 있다. 상기 시료는 물 시료, 흙 시료, 음식 시료, 공기 시료, 비강 면봉 시료, 비인두 세척액(nasopharyngeal wash), 기관지폐포세척액(branchioalveolar lavage), 또는 흉수(Pleural fluid)일 수 있다. The sample may be a biological material derived from an individual. The subject may be a vertebrate animal. The vertebrate may be a mammal. The mammal may be a primate, including humans and non-human primates, a camel, or a rodent, including mice and rats. The sample may be frozen or left in a natural state. The sample may be a water sample, a soil sample, a food sample, an air sample, a nasal swab sample, a nasopharyngeal wash, a branchioalveolar lavage, or a pleural fluid.
상기 생물학적 물질은 비강 도말(nasal swap), 비강 흡인액 (nasal aspirate), 비인두도말(nasopharyngeal swab), 비인두흡인액(nasopharyngeal aspirate), 혈액 또는 혈액 구성성분(blood constituent), 체액 (bodily fluid), 타액, 가래, 또는 이들의 조합일 수 있다.
The biological material may be a nasal swab, a nasal aspirate, a nasopharyngeal swab, a nasopharyngeal aspirate, a blood or blood constituent, a bodily fluid, saliva, sputum, or a combination thereof.
다른 양상은 상술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계; 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 MERS-CoV의 복합체를 검출하는 단계; 및 상기 검출 결과로부터 상기 시료의 MERS-CoV 감염 여부를 검출하는 단계를 포함하는 MERS-CoV 진단 방법을 제공한다. Another aspect relates to a method of detecting an antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising contacting the sample with the antibody or antigen-binding fragment thereof described above; Detecting a complex of the antibody or antigen-binding fragment thereof and MERS-CoV; And detecting MERS-CoV infection of the sample from the detection result.
상기 MERS-CoV 진단 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 MERS-CoV의 복합체가 검출되는 경우 상기 시료가 유래된 개체가 MERS-CoV에 감염된 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 복합체가 검출되지 않는 경우 상기 시료가 유래된 개체는 MERS-CoV에 감염되지 않은 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. In the MERS-CoV diagnostic method, when a complex of an antibody or an antigen-binding fragment thereof and MERS-CoV is detected, it can be determined that the sample from which the sample is derived is infected with MERS-CoV. In addition, if the complex is not detected, it may be determined that the sample from which the sample is derived is not infected with MERS-CoV.
일 구체예에 따른 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 진단용 조성물 및 키트, 및 이를 사용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 진단 방법에 따르면, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염 여부를 효율적으로 측정할 수 있다. According to one embodiment, an antibody specifically binding to a nucleocapsid of MERS-CoV, a composition and a kit for diagnosing coronavirus of the Middle East Respiratory Syndrome comprising the same, and a method of diagnosing the coronavirus of the Middle East Respiratory Syndrome using the same, Coronavirus infection can be measured efficiently.
도 1은 본 발명의 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 진단하기 위한 분석 장치의 일 예를 나타내는 측면도이다.
도 2는 서열번호 1의 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 친수성을 나타내는 그림이다.
도 3a는 MERS-CoV NP P1 내지 P5의 폴리펩티드의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3b는 항-MERS CoV P1 단일클론항체의 웨스턴블롯 결과를 나타낸 도면이다.
도 3c는 항-MERS CoV P3 단일클론항체의 웨스턴블롯 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에서 사용되는 키트의 작동을 개략적으로 나타낸 그림이다.1 is a side view showing an example of an analyzing apparatus for diagnosing to detect the coronavirus of the respiratory syndrome of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing hydrophilicity of a nucleocapsid protein of MERS-CoV of SEQ ID NO: 1. FIG.
3A shows the results of SDS-PAGE of the polypeptides of MERS-CoV NP P1 to P5.
FIG. 3B shows Western blot results of an anti-MERS CoV P1 monoclonal antibody.
3C is a Western blot result of an anti-MERS CoV P3 monoclonal antibody.
4 is a diagram schematically illustrating the operation of the kit used in one embodiment of the present invention.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: One: MERSMERS -- CoVCoV 의 of 뉴클레오캡시드에On nucleocapsid 대한 단일클론항체 제조 Production of anti-monoclonal antibodies
1. 면역용 항원 제조1. Preparation of antigen for immunization
MERS-CoV의 뉴클레오캡시드(NP) 유전자 중에서 친수성(hydrophilic)한 부위 중 펩티드 항원을 합성하여 면역원으로 사용하였다. MERS-CoV의 뉴클레오캡시드를 코딩하는 유전자의 친수성(hydrophilicity)을 조사해 친수성이 높은 부위 부분에 대한 펩티드 항원을 합성하였다. 도 2는 서열번호 1의 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 친수성을 나타내는 그림이다. Immune epitope database의 Parker Hydrophilicity prediction 프로그램을 이용하였다. 합성된 펩티드 항원은 서열번호 1의 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 22 내지 40번째 아미노산, 126 내지 146번째 아미노산, 164 내지 202번째 아미노산, 234 내지 259 번째 아미노산, 및 362 내지 388번째 아미노산으로, 각각 MERS-CoV NP P1, MERS-CoV NP P2, MERS-CoV NP P3, MERS-CoV NP P4, 및 MERS-CoV NP P5라고 지칭한다.
Among the nucleocapsid (NP) genes of MERS-CoV, peptide antigens among hydrophilic sites were synthesized and used as immunogen. The hydrophilicity of the gene encoding the nucleocapsid of MERS-CoV was examined to synthesize peptide antigens for high hydrophilic moieties. FIG. 2 is a graph showing hydrophilicity of a nucleocapsid protein of MERS-CoV of SEQ ID NO: 1. FIG. We used the Parker Hydrophilicity prediction program of Immune epitope database. The synthesized peptide antigen is composed of the 22 to 40 amino acid, 126 to 146 amino acid, 164 to 202 amino acid, 234 to 259 amino acid and 362 to 388 amino acid in the nucleoside of MERS-CoV of SEQ ID NO: 1 MERS-CoV NP P1, MERS-CoV NP P2, MERS-CoV NP P3, MERS-CoV NP P4, and MERS-CoV NP P5.
2. 단일 클론 항체 제조2. Production of monoclonal antibodies
(1) 면역원의 제조(1) Production of immunogen
MERS-CoV NP P1, P2, P3, P4, 및 P5의 항체를 제조하기 위한 면역용 펩티드를 합성 후, 다음과 같이 면역원을 제작하였다. 1차 면역시에 사용하는 면역원은 완전 프로인트 보조제 (Complete Freud? Adjuvant: Sigma사)를 항원: 상기 보조제의 비를 1:1로 유액화(emulsion)하여 제조하였고, 2차~4차 면역에 사용하는 면역원은 불완전 프로인트 보조제 (Incomplete Freud? Adjuvant: Sigma사)를 항원 : 상기 보조제의 비를 1:1로 유액화하여 제조하였다.
MERS-CoV NPs P1, P2, P3, P4, and P5 were synthesized, and the immunogen was prepared as follows. The immunogen used for the primary immunization was prepared by emulsifying the complete Freund ' s adjuvant (Sigma) with the antigen: the ratio of the adjuvant to 1: 1, and the second to fourth immunity The immunogen used was prepared by inoculating incomplete Freund ' s adjuvant (Sigma) with antigen: the adjuvant ratio 1: 1.
(2) 접종(2) Inoculation
상기의 방법으로 제조된 면역원을 6주령, 및 암컷인 BALB/c 마우스에 다음과 같이 면역하였다. 200 ㎕/마리의 양으로 1주 간격으로 4회 복강 주사하고 일주일 후에 상기 항원을 인산염 완충 용액(Phosphate buffered saline: PBS)에 20% 농도 (v/v)로 희석하여 1일 간격으로 3회 꼬리 정맥에 20 ㎕/회 주사하였다. 3차 면역 후에는 꼬리 정맥에서 얻어낸 혈청으로 중간 역가 검사를 실시하였다. 이의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합 과정을 수행하였다.
The immunogen prepared by the above method was immunized with BALB / c mice at 6 weeks of age and female as follows. The cells were intraperitoneally injected four times at an interval of 1 week at an amount of 200 μl / mouse. After one week, the antigen was diluted with a phosphate buffered saline (PBS) to a concentration of 20% (v / v) 20 [mu] l / injection into the vein. After the third immunization, midtrigger test was performed with the serum obtained from the tail vein. As a result, a mouse having a sufficient amount of antibody was selected and cell fusion process was performed.
(3) (3) 하이브리도마Hybridoma 세포주 제작 Cell line production
MERS-CoV NP P1, P2, P3, P4, 및 P5의 펩티드의 면역 후에, 항체가 생성된 마우스의 비장 세포를 떼어 70 ㎛ 구멍크기의 세포 strainer(BD Falcon사)를 통해 걸러내었다. 걸러진 비장세포를 원심분리 하여 침전물을 획득하고 적혈구 용해 버퍼 (Red blood cell lysis buffer, Sigma사)를 5 ml 섞어준 뒤 1분간 방치하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사)을 넣어 3회 세척하고 세포 카운팅을 실시하였다. 비장세포와 융합시킬 세포는 마우스 유래 골수종 세포인 SP2/0-Ag 14(ATCC CRL-1581) 세포주이며, 혼합비율은 10:1 (비장세포: SP2/0)이 되도록 섞어주었다. 혼합된 세포는 DMEM으로 2회 세척 후 PEG1500(Roche사)를 사용하여 융합하였다. 세포 융합은 PEG1500을 1분간 1.7 ml 점적, 30초간 정치, DMEM 1분간 1 ml 점적, 30초간 정치, DEME 1분간 2 ml 점적, DMEM 30초간 6 ml 점적, 및 30초간 정치 후 마지막으로 DMEM을 30초간 10 ml 점적하였다. 융합이 완료된 세포액은 원심분리하여 침전물로 획득하고 HAT(Gibco사)와 항생제(Gibco사), 소태아혈청(Fetal bovine serum, Hyclone사)이 10% 첨가된 DMEM(이하 'HAT배지')과 잘 섞어준 뒤 200 ㎕/웰의 용량으로 96 웰 플레이트에 분주한 뒤 3일간 배양기에서 성장시켰다.
After immunization of the peptides of MERS-CoV NP P1, P2, P3, P4, and P5, the splenocytes of the antibody-generated mouse were detached and filtered through a cell strainer of 70 mu m pore size (BD Falcon). The filtered spleen cells were centrifuged to obtain precipitates, and 5 ml of a red blood cell lysis buffer (Sigma) was added thereto. Then, the red blood cells were removed by allowing to stand for 1 minute. Splenocytes from which erythrocytes were removed were washed three times with DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco) and cell counting was performed. The cells to be fused with the splenocytes were mixed with mouse-derived myeloma cells, SP2 / 0-Ag 14 (ATCC CRL-1581), at a mixing ratio of 10: 1 (splenocytes: SP2 / 0). Mixed cells were washed twice with DMEM and fused using PEG 1500 (Roche). For cell fusion, 1.7 ml of PEG1500 was added for 1 minute, 30 seconds of stopping, 1 ml of DMEM for 1 minute, 30 seconds of stopping, 2 ml of 1 minute of DEME, 6 ml of 30 seconds of DMEM, 30 seconds of DMEM, 10 ml per second. After the fusion, the cell solution was centrifuged to obtain a precipitate. DMEM supplemented with 10% HAT (Gibco), antibiotics (Gibco), fetal bovine serum (Hyclone) And mixed in a 96-well plate at a volume of 200 [mu] l / well and grown in an incubator for 3 days.
(4) 세포 배양(4) Cell culture
융합이 완료된 세포주는 37℃, 5%의 CO2, 가습 조건이 유지되는 세포배양기에서 성장시켰으며, 2일 간격으로 일주일 간 HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium) 배지를 교체하여 융합된 세포주를 선별하였다
Fused cell lines were grown in a cell incubator maintained at 37 ° C, 5% CO 2 , and humidified conditions. Hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium (HAT) medium was changed every 2 days for one week to select fused cell lines And
(5) 양성 클론 세포주 검색 (단일클론 항체를 생산하는 (5) positive clone cell line detection (monoclonal antibody producing 하이브리도마Hybridoma 세포의 선별) Cell sorting)
HAT 배지로 선별이 완료된 세포주는 효소연결면역흡광도분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 양성 클론을 다음과 같이 선별하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트의 각각의 웰에서 자라고 있는 융합된 세포주 배양액을 MERS-CoV 뉴클레오캡시드(NP) 유전자 항원이 2.5 ug/ml의 농도로 코팅된 96 웰 흡착 플레이트(Costar사)에 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 5회 세척하고 항 마우스 IgG HRP 콘주게이트와 항 마우스 IgM HRP 콘주게이트를 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하고 37℃ 에서 30분간 반응시켰다. 30분 반응후 5회 세척하고 기질액을 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하여 15분간 발색반응시키고 반응정지액을 100 ㎕/웰의 용량을 첨가하였다. 반응을 정지시킨 후 판독기에서 450 nm 파장으로 흡광도를 측정하여 높은 수치를 나타내는 양성클론 MERS-CoV NP P1, 및 MERS-CoV NP P3을 선별하였다. 선별된 양성클론은 24 웰 조직 배양플레이트로 옮긴 뒤 3일간 배양하고, 위와 동일한 방법으로 2차 검색하여 즉, 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 최종 단일 양성 클론 후보군 MERS-CoV NP P1, 및 MERS-CoV NP P3을 선별하였다.Cell lines that had been screened with HAT medium were selected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as follows. Specifically, a fused cell culture medium growing in each well of a 96-well plate was added to a 96-well adsorption plate (Costar) coated with a MERS-CoV nucleocapside (NP) gene antigen at a concentration of 2.5 ug / ml / Well and reacted at 37 DEG C for 1 hour. After 1 hour of reaction, the cells were washed 5 times. The anti-mouse IgG HRP conjugate and anti-mouse IgM HRP conjugate were dispensed at a volume of 100 μl / well and reacted at 37 ° C for 30 minutes. After 30 minutes of reaction, the plate was washed five times, and the substrate solution was dispensed at a volume of 100 μl / well, followed by color reaction for 15 minutes, and the reaction stop solution was added at a volume of 100 μl / well. After the reaction was stopped, absorbance was measured at a wavelength of 450 nm in the reader, and positive clones MERS-CoV NP P1 and MERS-CoV NP P3 showing high values were selected. The selected positive clones were transferred to a 24-well tissue culture plate, cultured for 3 days, and subjected to a secondary search in the same manner as described above. Namely, the hybridoma cell line obtained through repeated selection was subjected to limiting dilution to obtain a final single positive clone candidate MERS-CoV NP P1, and MERS-CoV NP P3 were selected.
최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 항-MERS CoV P1 단일클론항체, 및 항-MERS CoV P3 단일클론항체로 명명하고, 이를 한국 세포주 은행에 기탁하여 수탁번호를 부여받았다.
The final selected monoclonal antibody-producing hybridomas were named anti-MERS CoV P1 monoclonal antibody and anti-MERS CoV P3 monoclonal antibody, which were deposited with the Korean Cell Line Bank and received the accession number.
(6) 항체 정제(6) Antibody purification
최종 선별된 양성클론은 T75 (SPL사) 배양접시로 옮긴 뒤 3일간 배양하여 1 X 106 cell/ml 세포 밀도로 0.5 ml씩 마우스의 복강에 주사한 뒤, 일주일 뒤 채취하였다. 상기 방법을 통하여 얻어낸 마우스 복수액은 원심분리(3000 rpm, 10분, 4℃)를 통해 부유물을 침전시키고 상층액을 결합버퍼(Binding buffer, Thermo scientific사)와 1:1 비율로 섞어준 뒤 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 1시간 후 원심분리(3000 rpm, 10분, 4℃)를 통해 다시 한번 부유물을 침전시키고, 1.2 um 구멍크기를 가지는 필터를 사용하여 침전되지 않은 부유물을 재차 걸러내었다. 부유물이 완전히 제거된 복수액은 Protein G 레진 (Pierce사)이 들어있는 컬럼에 넣어, 항체와 Protein G 간의 결합을 유도하였다. 복수액이 컬럼을 모두 통과한 후 인산염완충용액으로 3회 세척한 뒤 용출버퍼(Elution buffer, Thermo scientific사)을 사용하여 용출시켰다. 용출된 항체는 다시 PD-10 컬럼(GE heathcare사)에 적용하고 인산염완충용액으로 용출시켜 최종 정제하였다.
The final positive clones were transferred to a T75 (SPL) culture dish, cultured for 3 days, injected into the abdominal cavity of each mouse at a density of 1 × 10 6 cells / ml at a density of 1 × 10 6 cells / ml, and harvested one week later. The supernatant was precipitated with centrifugation (3000 rpm, 10 minutes, 4 ° C) and the supernatant was mixed with the binding buffer (Binding buffer, Thermo scientific) at a ratio of 1: 1, For 1 hour. After one hour, the suspension was again sedimented by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes, 4 ° C) and the non-precipitated suspension was again filtered out using a filter with a 1.2 um pore size. The supernatant, from which the supernatant was completely removed, was placed in a column containing Protein G resin (Pierce) to induce binding between the antibody and Protein G. After the multiple liquids passed through the column, they were washed three times with phosphate buffer solution and eluted with an elution buffer (Thermo scientific). The eluted antibody was again applied to a PD-10 column (GE heathcare) and eluted with phosphate buffer to final purification.
실시예Example 2: 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 2: monoclonal antibody specifically binds MERSMERS -- CoVCoV 뉴클레오캡시드Nucleocapsid 내의 undergarment 에피토프의Epitope 확인 Confirm
실시예 1에서 제조한 단일클론 항체가 MERS-CoV 뉴클레오캡시드(NP)의 어느 부위의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는지 여부를 확인하기 위해 하기와 같이 실시하였다. MERS-CoV NP 유전자을 5등분하여 펩티드로 합성하고, 합성된 펩티드와 Bovine serum albumine(BSA)를 콘주게이션(conjugation)하였다. 콘주게이트(conjugate)는 실험의 효율을 위하여 Ab Frontier에 의뢰하여 제조하였다. BSA가 콘주게이트된 MERS-CoV NP P1, MERS-CoV NP P2, MERS-CoV NP P3, MERS-CoV NP P4, 및 MERS-CoV NP P5는 각각 서열번호 1의 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 22 내지 40번째 아미노산, 126 내지 146번째 아미노산, 164 내지 202번째 아미노산, 234 내지 259 번째 아미노산, 및 362 내지 388번째 아미노산이다. In order to confirm whether the monoclonal antibody prepared in Example 1 specifically recognized the amino acid sequence of the MERS-CoV nucleocapsid (NP), the following procedure was carried out. The MERS-CoV NP gene was divided into 5 equal parts and synthesized as a peptide, and the synthesized peptide was conjugated with Bovine serum albumine (BSA). Conjugate was prepared by Ab Frontier for the efficiency of the experiment. The MERS-CoV NP P1, MERS-CoV NP P2, MERS-CoV NP P3, MERS-CoV NP P4, and MERS-CoV NP P5 in which the BSA was congated correspond to the 22 nucleosides of the nucleoside of MERS- To 40th amino acid, 126th to 146th amino acid, 164th to 202nd amino acid, 234th to 259th amino acid, and 362th to 388th amino acid.
SDS-PAGE를 위해, 10%의 폴리아크릴아미드 겔을 제조한 다음, 상기 겔에 대조군으로 사용한 소혈청알부민(BSA) (EQUITECH-BIO, INC) 및 상기 제조한 BSA가 결합된 5개의 MERS-CoV NP P1 내지 P5의 폴리펩티드를 각각 1.25 ㎍씩 로딩하였다. 이후, 160V, 400 mA의 조건으로 1시간 동안 SDS-PAGE를 수행한 다음, Mini-Protean 3 Electrophoresis(BIO-RAD)를 이용하여, 니트로셀룰로즈 멤브레인(GE healthcare)에 160V, 400 mA의 조건으로 1시간 동안 상기 폴리펩티드들을 트랜스퍼(transfer)하였다. 도 3a는 MERS-CoV NP P1 내지 P5의 폴리펩티드의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 도면이다. For SDS-PAGE, 10% polyacrylamide gel was prepared, and then the bovine serum albumin (BSA) (EQUITECH-BIO, INC) used as a control and the 5 MERS-CoV The polypeptides of NP P1 to P5 were each loaded in 1.25 쨉 g. SDS-PAGE was then carried out for 1 hour at 160 V and 400 mA. Cells were electrophoresed on a nitrocellulose membrane (GE healthcare) using Mini-Protean 3 Electrophoresis (BIO-RAD) The polypeptides were transferred for a period of time. 3A shows the results of SDS-PAGE of the polypeptides of MERS-CoV NP P1 to P5.
웨스턴 블롯을 위해, SDS-PAGE gel을 NC-mebrane에 트랜스퍼하였다(200V, 200mA, 1시간). 5% 스킴 밀크에 넣고, 상온에서 30분간 블로킹시킨 다음, 10 μg/mL의 항-MERS CoV P1 단일클론항체 (in 5% Skim milk/TBS)과 항-MERS CoV P3 단일클론항체 (in 5% Skim milk/TBS)를 각각 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 세척액(1M Tris, 0.0025% Proclin 300, 0.1% Tween 20, 및 0.15 mM NaCl)을 사용하여 5분간 3회 세척을 반복하여 멤브레인 상의 폴리펩티드와 결합하지 않은 단일클론 항체를 제거하였다. 그 후, 2 μg/mL의 Anti mouse IgG AP(SIGMA Cat.NoA4312)를 상기 스킴 밀크에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 상기 세척 과정을 반복하여 반응하지 않은 Anti mouse IgG AP(SIGMA Cat.NoA4312)를 제거하고, BCIP/NBT solution(SIGMA Cat.NoB6404)으로 발색하였다.For Western blot, SDS-PAGE gel was transferred to NC-mebrane (200 V, 200 mA, 1 hour). (5% skim milk / TBS) and anti-MERS CoV P3 monoclonal antibody (in 5% SDS) in a 5% skim milk and blocked for 30 minutes at room temperature. Skim milk / TBS) were reacted at room temperature for 1 hour. Subsequently, washing was repeated three times for 5 minutes using a washing solution (1M Tris, 0.0025
웨스턴 블롯의 결과, 도 3b는 항-MERS CoV P1 단일클론항체의 웨스턴블롯 결과를 나타낸 도면이다. 도 3b에 보이는 바와 같이, 본 발명의 단일클론 항체는 레인 2의 22 내지 40번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과로부터 상기 실시예 1에서 제작한 MERS-CoV에 대한 본 발명의 단일클론 항체는 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드(서열번호 1)의 22 내지 40번째 아미노산 서열 부분(서열번호 2)이 에피토프임을 확인할 수 있었다.As a result of western blot, Fig. 3B shows Western blot results of anti-MERS CoV P1 monoclonal antibody. As shown in FIG. 3B, it was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention specifically reacted with the polypeptide comprising the 22nd to 40th amino acids of
또한, 도 3c는 항-MERS CoV P3 단일클론항체의 웨스턴블롯 결과를 나타낸 도면이다. 도 3c에 보이는 바와 같이, 본 발명의 단일클론 항체는 레인 4의 164 내지 202번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과로부터 상기 실시예 1에서 제작한 MERS-CoV에 대한 본 발명의 단일클론 항체는 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드(서열번호 1)의 164 내지 202번째 아미노산 서열 부분(서열번호 4)이 에피토프임을 확인할 수 있었다.
Figure 3C also shows the Western blot results of the anti-MERS CoV P3 monoclonal antibody. As shown in FIG. 3C, it was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention specifically reacted with the polypeptide comprising the 164th to 202nd amino acids of
실시예Example 3: 3: MERSMERS -- CoVCoV 에 대한 항체를 사용한 Using antibodies against MERSMERS -- CoVCoV 바이러스 진단 실험 Virus diagnosis experiment
MERS-CoV의 진단을 위하여 본 발명의 항체를 사용하여 81마리의 낙타(Camel)의 비강에 면봉을 넣어 채취된 체액을 시료로 하여 MERS-CoV 바이러스 여부를 진단하였다. In order to diagnose MERS-CoV, MERS-CoV virus was diagnosed by using the antibody of the present invention as a sample of swab samples taken from nasal cavities of 81 Camel.
1. 사용 1. Use 키트Kit
MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론항체('P1' 이라고 지칭)와 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론항체('P3'이라고 지칭)를 포함하는 키트를 제조하였다. 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 수탁번호 KCLRFBP00331인 것인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것이다. 또한, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 수탁번호 KCLRFBP00331인 것인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것이다. (Referred to as 'P1') that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the nucleoside of MERS-CoV and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the nucleoside of MERS-CoV A kit was prepared containing a monoclonal antibody (designated ' P3 ') that specifically binds to the displayed epitope. The monoclonal antibody that specifically binds to the epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the nucleocapsid is the accession number KCLRFBP00331. In addition, the monoclonal antibody specifically binding to the epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the nucleoside of MERS-CoV is produced in hybridoma cells having accession number KCLRFBP00331.
도 4는 본 발명의 일 구체예에서 사용되는 키트의 작동을 개략적으로 나타낸 그림이다. 도 4의 (a), (b) 및 (c)는 그 순서대로 분석물(400)이 모세관 이동에 의하여 움직이는 것을 나타내며, 상기 분석물(400)이 본 발명의 일 구체예에 따른 키트와 작동하는 원리를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 4에서 상기 키트의 저장 패드에의 제1 항체(100)와 골드 입자의 접합체가 있고, 크로마토그래피 막 물질의 검출 영역(T)에는 제2 항체(200)가 고정화되어 있고, 대조 영역(C)에는 제1 항체와 골드 입자의 접합체에 특이적인 항체(300)이 위치되어 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 제2 항체(200)인 P1의 단일클론항체가 상기 검출 영역(T)에 고정되어 있고, 제1 항체(100)인 P3의 단일클론항체과 골드 입자와 접합되어 있어, MERS-CoV('MERS'라고 지칭)을 포함하는 분석물(400)의 경우 검출 영역에서 P1과 P3의 복합체의 존재를 검출하여 MERS-CoV의 존재를 알 수 있다.4 is a diagram schematically illustrating the operation of the kit used in one embodiment of the present invention. Figures 4 (a), 4 (b) and 4 (c) show that the
구체적으로, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 플레이트에 코팅시켰다. Specifically, a plate was coated with a monoclonal antibody that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the nucleocapsid of MERS-CoV.
또한, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 골드 입자와 접합되어 있다. 상기 골드 입자와의 접합은 다음과 같이 실시하였다: Gold chloride를 0.01%로 증류수에 용해한 뒤, 0.1% sodium citrate 용액을 첨가하면서 가열한다. 약 10분간 가열한 후 냉각하여 냉장 보관하여 콜로이드 골드 용액을 제조하였다. 그 후, 항 MERS-CoV P3 단일클론항체가 최종 20 ㎍/㎖의 농도가 되게 콜로이드 골드용액에 10분간 반응시켜 접합반응을 유도하였다. 골드 입자를 안정화시킨 후 10,000 g에서 30분간 원심하여 침전을 만든다. 침전을 다시 생리식염액에 용해하고 0.45 ㎛의 여과기로 여과한 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 최종 20이 되도록 희석하여 사용하여 항-MERS-CoV P3에 골드를 접합하였다. In addition, the monoclonal antibody that specifically binds to the epitope shown by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the nucleocapsid of MERS-CoV is conjugated with gold particles. The gold particles were bonded as follows: Gold chloride was dissolved in distilled water at a concentration of 0.01%, and the mixture was heated while adding 0.1% sodium citrate solution. The mixture was heated for about 10 minutes, cooled, and stored in a refrigerator to prepare a colloidal gold solution. Thereafter, the conjugation reaction was induced by reacting the anti-MERS-CoV P3 monoclonal antibody to the colloidal gold solution at a final concentration of 20 μg / ml for 10 minutes. The gold particles are stabilized and centrifuged at 10,000 g for 30 min to make a precipitate. The precipitate was again dissolved in physiological saline, filtered through a filter of 0.45 mu m, and then absorbed at 540 nm and diluted to a final 20 to bind gold to anti-MERS-CoV P3.
플레이트 중 검출 영역에 고정된 P1 단일클론 항체와 저장 패드에 포함된 골드 입자가 접합된 P3 단일클론 항체를 포함하는 키트를 MERS-CoV 진단 키트로 사용하였다. A kit containing a P1 monoclonal antibody fixed in the detection region of the plate and a P3 monoclonal antibody conjugated with gold particles contained in the storage pad was used as the MERS-CoV diagnostic kit.
2. 사용 검체2. Use samples
81 마리의 낙타(Camel)의 비강에 면봉(nasal swap) 넣어 채취한 체액을 사용 하였다A body fluid was collected from a nasal swap in the nasal cavities of 81 Camel (Camel)
3. 결과3. Results
상기 MERS-CoV 진단 키트와 RT-PCR을 사용하여 사용 검체에 대한 MERS-CoV 유무 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다. Table 3 and Table 4 show the MERS-CoV presence results for the samples used using the MERS-CoV diagnostic kit and RT-PCR.
표 3에서 P는 양성(positive), N은 음성(negative)을 의미하고, 표 4는 표 3의 내용을 요약한 것이다. 따라서, 본 발명의 키트의 민감도(sensitivity)는 73.68%이며, 특이도(specificity)는 91.94%이다. In Table 3, P means positive and N means negative, and Table 4 summarizes the contents of Table 3. Thus, the sensitivity of the kit of the present invention is 73.68% and the specificity is 91.94%.
또한 양성 가능성 비(positive likelihood ratio)는 9.14이고, 음성 가능성 비는 0.29이다. 상기 양성 가능성 비는 {(14/19)/(5/62)}에 의해 산출되었다. 상기 양성 가능성 비가 9.14이므로 본 발명의 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원을 포함하는 진단 키트가 진단 키트로서의 유의성을 가짐을 확인하였다. 상기 음성 가능성 비는 {(5/19)/(57/62)}에 의해 산출되었다. 또한, MERS-CoV에 의한 유병률(disease prevalence)은 23.46%이다.
The positive likelihood ratio is 9.14 and the negative likelihood ratio is 0.29. The positive likelihood ratio was calculated by {(14/19) / (5/62)}. Since the above-mentioned positive probability ratio is 9.14, it was confirmed that the diagnostic kit comprising the antigen specifically binding to the epitope of the nucleocapsid of MERS-CoV of the present invention had significance as the diagnostic kit. The speech likelihood ratio was calculated by {(5/19) / (57/62)}. In addition, the prevalence of disease by MERS-CoV is 23.46%.
실시예Example 4: 4: MERSMERS -- CoVCoV 에 대한 항체를 사용한 Using antibodies against MERSMERS -- CoVCoV 바이러스 진단 실험 Virus diagnosis experiment
MERS-CoV의 진단을 위하여 본 발명의 항체를 사용하여 20명의 인간의 비강에 면봉을 넣어 채취된 체액을 시료로 하여 MERS-CoV 바이러스 여부를 진단하였다.
For the diagnosis of MERS-CoV, MERS-CoV virus was diagnosed by using the antibody of the present invention and using body fluids collected from 20 human nasal cavities as samples.
1. 사용 1. Use 키트Kit
실시예 3에 기재된 상기 MERS-CoV 진단 키트와 동일한 상기 MERS-CoV 진단 키트를 사용하였다.
The same MERS-CoV diagnostic kit as the MERS-CoV diagnostic kit described in Example 3 was used.
2. 사용 검체2. Use samples
20명의 인간으로부터 검체를 획득하였다. 시료 유형은 가래, 비인두 세척액, 기관지폐포세척액(branchioalveolar lavage), 또는 흉수(Pleural fluid)이었다. 검체를 연속적으로 -80 내지 -60 ℃에서 20분 동안, -60 내지 -20 ℃에서 20분 동안, -20 내지 -8 ℃동안 20분 동안, -8 ℃ 내지 얼음 온도에서 20분 동안, 및 얼음 온도 내지 상온에서 30분 동안 해동하고 저장하였다. 모든 해동된 검체를 2개의 분취량(aliquot)으로 나누고, 그 중 하나의 분취량을 실시간 PCR (real-time PCR: 이하 'RT-PCR'이라고 지칭)을 위한 RNA 추출을 위해 사용하고 다른 하나의 분취량은 상기 사용키트를 사용하였다.
Specimens were obtained from 20 humans. Sample types were sputum, nasopharyngeal wash, branchioalveolar lavage, or pleural fluid. The specimens are continuously heated at -80 to -60 占 폚 for 20 minutes, at -60 to -20 占 폚 for 20 minutes, at -20 to -8 占 폚 for 20 minutes, at -8 占 폚 to 20 占 폚 for 20 minutes, And thawed for 30 minutes at room temperature or room temperature. All thawed samples were divided into two aliquots and one aliquot was used for RNA extraction for real-time PCR (hereinafter referred to as 'RT-PCR') and the other Aliquots were used for the above use kits.
3. 결과3. Results
표 5는 상기 MERS-CoV 진단 키트를 사용하여 진단된 검체의 결과를 나타낸 표이다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 음성 검체의 경우 상기 MERS-CoV 진단 키트를 사용한 결과 밴드가 없어 음성 결과를 나타내었다. 9개의 검체가 상기 MERS-CoV 진단 키트와 RT-PCR에 의한 진단 결과 모두 음성이었다. 상기 MERS-CoV 진단 키트는 100%의 특이도를 보여준다. 6개의 검체의 경우, 상기 MERS-CoV 진단 키트에서 생생한 양성 결과 밴트를 보였고, 이는 RT-PCR에서의 28 - 30의 Ct 값과 일치하였다. 3개의 검체의 경우, 상기 MERS-CoV 진단 키트에서 명확하지만 덜 강한 밴드를 보여주었다. 이들 3개 검체는 RT-PCR 결과에서 33-35 범위의 Ct 값을 갖는다. 2개의 검체의 경우 약한 양성을 반영하는 희미한 밴드를 보여주었다. 이들 2개 샘플에 대한 Ct 값은 33.1이었다. Table 5 shows the results of the samples diagnosed using the MERS-CoV diagnostic kit. As shown in Table 5, in the case of the negative specimens, there was no band due to the use of the MERS-CoV diagnostic kit, and the result was negative. Nine samples were negative for both the MERS-CoV diagnostic kit and RT-PCR. The MERS-CoV diagnostic kit shows 100% specificity. For the six specimens, a positive positive result band was seen in the MERS-CoV diagnostic kit, consistent with a Ct value of 28-30 in RT-PCR. For the three samples, the MERS-CoV diagnostic kit showed a clear but less robust band. These three specimens have a Ct value in the range of 33-35 in RT-PCR results. Two specimens showed a faint band reflecting weak positivity. The Ct value for these two samples was 33.1.
(진한 밴드 세기)Strong positive result
(Dark band intensity)
(평균 밴드 세기)Mild positive results
(Average band intensity)
(희미한 밴드 세기)Weak positive results
(Dim band intensity)
<110> BioNote, Inc. <120> Antibody recognizing nucleocapsid of Middle East respiratory syndrome coronavirus and use thereof <130> PN110251 <150> KR 14/160059 <151> 2014-11-17 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 413 <212> PRT <213> Middle East respiratory syndrome coronavirus <400> 1 Met Ala Ser Pro Ala Ala Pro Arg Ala Val Ser Phe Ala Asp Asn Asn 1 5 10 15 Asp Ile Thr Asn Thr Asn Leu Ser Arg Gly Arg Gly Arg Asn Pro Lys 20 25 30 Pro Arg Ala Ala Pro Asn Asn Thr Val Ser Trp Tyr Thr Gly Leu Thr 35 40 45 Gln His Gly Lys Val Pro Leu Thr Phe Pro Pro Gly Gln Gly Val Pro 50 55 60 Leu Asn Ala Asn Ser Thr Pro Ala Gln Asn Ala Gly Tyr Trp Arg Arg 65 70 75 80 Gln Asp Arg Lys Ile Asn Thr Gly Asn Gly Ile Lys Gln Leu Ala Pro 85 90 95 Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ala Leu Pro 100 105 110 Phe Arg Ala Val Lys Asp Gly Ile Val Trp Val His Glu Asp Gly Ala 115 120 125 Thr Asp Ala Pro Ser Thr Phe Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asp Ser 130 135 140 Ala Ile Val Thr Gln Phe Ala Pro Gly Thr Lys Leu Pro Lys Asn Phe 145 150 155 160 His Ile Glu Gly Thr Gly Gly Asn Ser Gln Ser Ser Ser Arg Ala Ser 165 170 175 Ser Val Ser Arg Asn Ser Ser Arg Ser Ser Ser Gln Gly Ser Arg Ser 180 185 190 Gly Asn Ser Thr Arg Gly Thr Ser Pro Gly Pro Ser Gly Ile Gly Ala 195 200 205 Val Gly Gly Asp Leu Leu Tyr Leu Asp Leu Leu Asn Arg Leu Gln Ala 210 215 220 Leu Glu Ser Gly Lys Val Lys Gln Ser Gln Pro Lys Val Ile Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Ala Ala Ala Ala Lys Asn Lys Met Arg His Lys Arg Thr Ser 245 250 255 Thr Lys Ser Phe Asn Met Val Gln Ala Phe Gly Leu Arg Gly Pro Gly 260 265 270 Asp Leu Gln Gly Asn Phe Gly Asp Leu Gln Leu Asn Lys Leu Gly Thr 275 280 285 Glu Asp Pro Arg Trp Pro Gln Ile Ala Glu Leu Ala Pro Thr Ala Ser 290 295 300 Ala Phe Met Gly Met Ser Gln Phe Lys Leu Thr His Gln Asn Asn Asp 305 310 315 320 Asp His Gly Asn Pro Val Tyr Phe Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Ile Lys 325 330 335 Leu Asp Pro Lys Asn Pro Asn Tyr Asn Lys Trp Leu Glu Leu Leu Glu 340 345 350 Gln Asn Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Lys Lys Glu Lys Lys Gln 355 360 365 Lys Ala Pro Lys Glu Glu Ser Thr Asp Gln Met Ser Glu Pro Pro Lys 370 375 380 Glu Gln Arg Val Gln Gly Ser Ile Thr Gln Arg Thr Arg Thr Arg Pro 385 390 395 400 Ser Val Gln Pro Gly Pro Met Ile Asp Val Asn Thr Asp 405 410 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV NP P1 <400> 2 Asn Leu Ser Arg Gly Arg Gly Arg Asn Pro Lys Pro Arg Ala Ala Pro 1 5 10 15 Asn Asn Thr <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV NP P2 <400> 3 Asp Gly Ala Thr Asp Ala Pro Ser Thr Phe Gly Thr Arg Asn Pro Asn 1 5 10 15 Asn Asp Ser Ala Ile 20 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV NP P3 <400> 4 Gly Thr Gly Gly Asn Ser Gln Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Val Ser 1 5 10 15 Arg Asn Ser Ser Arg Ser Ser Ser Gln Gly Ser Arg Ser Gly Asn Ser 20 25 30 Thr Arg Gly Thr Ser Pro Gly 35 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV NP P4 <400> 5 Gln Pro Lys Val Ile Thr Lys Lys Asp Ala Ala Ala Ala Lys Asn Lys 1 5 10 15 Met Arg His Lys Arg Thr Ser Thr Lys Ser 20 25 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV NP P5 <400> 6 Pro Lys Lys Glu Lys Lys Gln Lys Ala Pro Lys Glu Glu Ser Thr Asp 1 5 10 15 Gln Met Ser Glu Pro Pro Lys Glu Gln Arg Val 20 25 <110> BioNote, Inc. <120> Antibody recognizing nucleocapsid of Middle East respiratory syndrome coronavirus and use thereof <130> PN110251 <150> KR 14/160059 <151> 2014-11-17 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 413 <212> PRT <213> Middle East respiratory syndrome coronavirus <400> 1 Met Ala Ser Pro Ala Ala Pro Arg Ala Val Ser Phe Ala Asp Asn Asn 1 5 10 15 Asp Ile Thr Asn Thr Asn Leu Ser Arg Gly Arg Gly Arg Asn Pro Lys 20 25 30 Pro Arg Ala Ala Pro Asn Asn Thr Val Ser Trp Tyr Thr Gly Leu Thr 35 40 45 Gln His Gly Lys Val Pro Leu Thr Phe Pro Pro Gly Gln Gly Val Pro 50 55 60 Leu Asn Ala Asn Ser Thr Pro Ala Gln Asn Ala Gly Tyr Trp Arg Arg 65 70 75 80 Gln Asp Arg Lys Ile Asn Thr Gly Asn Gly Ile 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Claims (17)
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 MERS-CoV의 복합체를 검출하는 단계;를 포함하는 개체의 MERS-CoV를 검출하는 방법.Contacting the sample with the antibody of claim 1 or an antigen-binding fragment thereof; And
Detecting a complex of MERS-CoV with said antibody or antigen-binding fragment thereof; and detecting the MERS-CoV of said individual.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 MERS-CoV의 복합체를 검출하는 단계;를 포함하는 개체의 MERS-CoV를 검출하는 방법.Contacting the sample with the antibody of claim 2 or an antigen-binding fragment thereof; And
Detecting a complex of MERS-CoV with said antibody or antigen-binding fragment thereof; and detecting the MERS-CoV of said individual.
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