KR101590337B1 - 아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법 - Google Patents

아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노클레이, 외래 핵산 및 원핵 또는 진핵생물을 혼합하는 단계를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법, 아미노클레이를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물 형질전환용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 발명의 아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법은 공정이 간소하고, 효율적이며, 고가의 장비가 불필요한 방법으로 본 발명의 원핵 또는 진핵생물 형질전환 방법은 신재생 에너지사업, 식량산업, 고부가 유용물질 및 화장품원료 생산을 위한 유용 균주의 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법{Method for transformation of prokaryote or eukaryote using aminoclay}
본 발명은 아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법에 관한 것으로, 아미노클레이, 외래 핵산 및 원핵 또는 진핵생물을 혼합하는 단계를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법, 아미노클레이를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물 형질전환용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
외래 DNA의 세포로의 형질전환은 그람-음성 및 그람-양성 박테리아, 효모, 및 곰팡이와 같은 미생물의 유전자 조작에 있어서 중요한 핵심 단계이다. 가장 널리 사용되는 형질전환 방법에는 열충격(heat shock), 화학처리(2가의 금속이온이나 계면활성제 또는 항생제 처리), 기계적 처리(milling, 초음파), 전기천공(electroporation) 및 바이러스-/나노캐리어-매개 접근법이 포함된다. 전형적인 처리법들은 세포막이나 세포벽, 세포생리, 전처리에 따른 스트레스 유발, 사멸률에 따라 특정 수준 이상의 형질전환율(transformation efficiency)을 보여 주나 분리 체계나 세포생리에 상관없이 일반적으로 적용 가능한 기술은 존재하지 않는다. 이러한 기술 중, 온석면, 탄소 나노튜브, 탄화규소, 및 해포석과 같은 나노섬유 또는 휘스커(whiskers)를 이용해 DNA를 나노섬유 상에 감거나 또는 흡착시키는 세포의 물리적 침투(마찰력이나 shear stress 이용)가 DNA를 세포, 주로 박테리아에 옮기기 위한 간단하고, 신속하며 비용면에서도 효율적인 방법으로 최근에 많이 연구되어 지고 있다. 또한 이러한 나노 물질을 사용하는 방법은 보다 넓은 범위의 숙주에 보편적으로 적용 가능할 수 있는 기술적 특성을 지니고 있다. 이런 장점에도 불구하고, DNA 담체로서의 바늘형 나노 침투 물질들은 암을 유발하거나 또는 인화제로 추측되거나 공지되어 있고, 따라서 박테리아에 예상치 못한 스트레스(자기 방어 기작이나 변이 유발, 보다 극단적으로는 사멸 유도)를 유발할 수 있다. 이러한 물리화학적인 위해성으로 인해 생물(체) 적용을 위한 나노소재는 비침투성 혹은 비침략성(non-invasive)의 특성을 지닌 물질이 선호되는 이유를 제공한다. 따라서 발효 또는 의학적 용도에서의 추가적인 산업상 적용을 위해 미생물 형질전환을 위한 무해하며 생물적합성(biocompatability 혹은 safety)을 지닌 대안적인 방법이 매우 필요하다.
아미노클레이(3-아미노프로필 관능화된 금속 층상 규산염)는 1997년에 개발되었다. 아미노클레이는 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 양이온성 금속(일반적으로 Mg2+ 또는 Ca2+)을 함유하는 에탄올 용액에 대기 조건(상온/상압) 하에 적가하여, 즉, 원-팟 졸-겔 반응(one-pot sol-gel reaction)에 의해 합성된다. 결과로서 수득되는 생성물은 각각 마그네슘- 및 칼슘-아미노클레이로 지칭된다. 아미노클레이는 APTES 가수분해 및 축합에 의해 유도되는, 공유 결합을 통해 연결되는 아미노-관능화된 작용기들 사이에 끼어 있는 단위 구조 백본 중의 금속 양이온들로 이루어진다. 그렇게 제조된 pKa가 9.6인 백색 아미노클레이는 수용액에서 용이하게 박리되어, 5분간의 초음파 예비처리 후에는 투명해지며 수용성이 된다. 신규한 생무기성 나노구조물은 내재적인 특성을 보유하면서도 화학적, 열적 및 기계적 안정성을 강화하도록 제조되었다. 자체로 어셈블된 (나노)대상체를 유도하는 구동력은 수용액 내에서 양성자화된 아민기의 반발력으로 인한, 탈아민화된 아미노클레이 나노입자들의 양으로 하전된 제타 퍼텐셜과 주로 관련되어 있다. 아미노클레이의 유기-빌딩 블록은 약 30nm의 평균 유체역학적 직경을 나타내는데, 아미노클레이-기재의 랩핑 또는 표적 음이온성 물질로 코팅된 것은 응축된 침전물을 나타내는데, 이는 수용액 중의 아미노클레이의 유기-빌딩 블록이 평형 상태에서 대상 물질을 빽빽하고 균일하게 덮고 있음을 의미한다. 따라서, 아미노클레이의 유기-빌딩 블록은 수용액 내의 음으로 하전된 분자구조물(생체 소재를 예를 들면 DNA 나 RNA)과 강력하게 상호작용한다. 그 결과 극도로 얇은 아미노클레이 피복으로 랩핑된 DNA를 제공하게 되는데, 상기 방법은 효소, 지질 및 박테리오로돕신의 중간층판 구조와 유사한, 비-바이러스성 유전자 형질감염 전달체로서 예상되었음에도 불구하고, 미생물의 형질전환에는 실제로 적용되지 않았다. 상기에 따른 구조적 특이성은 아미노클레이 피복 나노구축물 중의 DNA가 엔도뉴클레아제 공격으로부터 보호될 수 있겠다는 새로운 가능성을 제공한다. 이는 전형적인 나노구조물을 이용한 형질전환방법에서 문제시 되어지는 단점을 근본적으로 극복할 수 있다는 가능성을 제시한다. 또한 상기 수용성 아미노클레이는 적절한 농도범위에서 포유류 세포에 독성을 나타내지 않으며, 슈도키르크네리엘라 서브카피타타 (Pseudokirchneriella subcapitata) 및 다프니아 마그나 (Daphnia magna)에 대해 아주 적은 생태 독성을 나타낸다. 이러한 사실은 적절한 농도범위에서 세포의 사멸은 유도하지 않으면서 물리적으로 경미한 결함(damage)이 유도된 세포막으로 아미노클레이 혹은 아미노클레이에 흡착된 분자구조물을 전달할 수 있는 가능성을 제시한다. 이 과정에 보다 효율적인 전달 혹은 내재화(internalization)를 위한 마찰력(아미노클레이 복합체와 세포를 혼합해 물리적인 힘을 가함)의 도입을 고려할 수 있다. 반대로, 원하는 수준으로의 농도 조절로 인해 위해성 해양 조류의 선택적 제어가 가능하기도 한다.
앞선 연구에서, 아미노클레이 유기-빌딩 블록과 박테리아 사이의 상호작용이 정전기적 인력 때문에 세포막 또는 벽을 탈안정화시키는 중대한 역할을 할 수 있음을 보고하였다. 구체적으로, 아미노클레이 나노입자들은 박테리아 세포 표면으로의 신속한 흡착 및 후속적으로 세포의 내부 구성성분으로의 투과를 유도하여, 세포막에 상해(균열)을 유발하므로, 이는 결국 적절한 범위 이상의 농도에서는 항박테리아제로서 작용한다는 것을 의미한다. 양으로 하전된 아미노클레이를 이용해 세포막을 투과하는 그러한 독특한 특성 및 자체-어셈블되는 구조를 통해 하이브리드 나노물질 내에서 DNA를 효소적 제한으로부터 보호할 가능성으로 인해, 심각한 손상없이 아미노클레이의 로딩 양이 형질전환을 위한 적절한 수준으로 유지된다면, 아미노클레이는 박테리아 형질전환제로서 적용될 수 있다. 이 과정에 효율 증진을 위한 마찰력의 도입은 필요에 따라 접목할 수 있다.
한국등록특허 제87-000510호에서는 형질전환된 미생물의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 아미노클레이를 이용하여 그람-음성의 대장균 및 그람-양성의 스트렙토코커스 뮤탄스, 효모 및 곰팡이에 대한 형질전환이 성공적으로 이루어지는 것을 확인하여, 방법이 간편하면서도 재현성이 높고 형질전환 후 생존률이 우수한 미생물의 형질전환법을 구축함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아미노클레이, 외래 핵산 및 원핵 또는 진핵생물을 혼합하는 단계를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 아미노클레이를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물 형질전환용 조성물을 제공한다
또한, 본 발명은 아미노클레이를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물 형질전환용 키트를 제공한다.
본 발명의 아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법은 공정이 간소하고, 효율적이므로, 본 발명의 박테리아, 곰팡이 또는 효모 형질전환 방법은 신재생 에너지사업, 식량산업, 의약산업, 고부가 유용물질 및 화장품원료 생산을 위한 유용 균주의 개발에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 박테리아 형질전환 과정을 도식으로 나타낸 것이다. (A) 무기 섬유 상에 DNA를 흡착시키는 방법(요시다(Yosida) 유효 형질전환법), (B) 아미노클레이 유기-빌딩 블록으로 DNA를 랩핑하여 상기 언급한 구조의 하이브리드를 구축하는 방법.
도 2는 플라스미드 DNA의 양 및 스프레딩 시간에 따른 형질전환 효율을 나타낸다. (A) 플라스미드 DNA 양의 유효성, (B) 스프레딩 시간의 영향. 막대 그래프는 3회의 독립적인 실험들의 평균±SD를 나타낸다.
도 3은 액체 배지 중 형질전환된 세포의 형광 현미경 영상을 나타낸다. (A) pBBR122-gfp가 있는 대장균 XL1-Blue의 녹색 형광 영상, (B) pBBR122-gfp가 있는 스트렙토코커스 뮤탄스의 녹색 형광 영상. 두 세포 모두 스프레딩에 의해 칼슘-아미노클레이/플라스미드 혼합물로 형질전환하였다. 영상은 DIC 및 형광 영상에 대한 500ms 노출을 이용해 DP71 디지털 카메라로 포착했으며, 소프트웨어(DP-BSW, TOMORO 디지털 이미지 패키지)를 이용해 조정하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아미노클레이, 외래 핵산, 및 원핵 또는 진핵생물을 혼합하는 단계를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물의 형질전환 방법을 제공한다.
용어 "아미노클레이"란 점토모방 소재로서 오가노클레이(organoclay)의 한 종류이다. 구체적으로는 금속성 양이온(Mg2 +，Ca2 +, Zn2 +, Mn2 +，Al3 + 및 Fe3 +)과 (3-아미노프로필)트리에톡시설란 [(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES]의 졸-겔 반응(sol-gel reaction)으로 생성되는 물질이며, 금속성 양이온이 중심부에 위치하고，공유결합으로 연결된 아민기(amine group)에 의해 2:1 삼·팔면체 구조(trioctahedral structure)로 둘러싸여 있거나 또는 1:1 이중팔면체 구조(dioctahedral structure)로 짝을 이룬 구조를 갖는 물질을 말한다. 본 발명에서，아미노클레이는 [H2N(CH2)3]8Mg6Si8016(OH)4의 화학성분으로 이루어질 수 있다. 이와 같은 아미노클레이는 물리적 방법에 의해 외래 핵산을 원핵 또는 진핵생물로 도입하는 효율을 높이고，형질전환 후에도 생존율이 높게 유지될 수 있게 한다. 상기의 아미노클레이는 상업적으로 판매되는 것, 또는 제조한 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 방법에 있어서, 상기 아미노클레이는 마그네슘 클로라이드 헥사히드레이트(MgCl2·6H2O)와 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)을 혼합하여 수용성 아미노클레이를 제작하였다.
본 발명에서 용어 "외래 핵산"이란 내생성이 아닌 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 의미한다. 구체적으로는 핵산분자의 기본 구성 단위인 뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 말하며 특히 유기체의 형질을 변화시키기 위해서 외부에서 조작된 핵산분자를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 외래 핵산은 도입된 원핵 또는 진핵생물의 형질 또는 성질을 변화시킬 수 있는 핵산일 수 있으며, 바람직하게는 도입된 원핵 또는 진핵생물의 유용성(의약용 단백질이나 대사공학/회로 재설계에 의한 고부가 화합물 과생산)을 높이거나，성장 촉진，적절치 못한 환경에서의 생장을 증가시킬 수 있는 핵산일 수 있다.
본 발명의 외래 핵산은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 프로모터, 형질전환용 핵산 또는 유전자, 항생제 내성 유전자 등이 작동 가능하게 연결된 벡터일 수 있다.
상기의 "작동 가능하게 연결"은 발현 조절 서열이 형질전환용 핵산 등의 구성 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 말하며, 프로모터를 포함하는 발현 조절 서열에 의해 코딩되는 형질전환용 핵산 등의 구성 요소가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 또한，상기의 "벡터"는 적절한 숙주 세포에서 목적하는 단백질을 발현할 수 있도록 하는 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 제작물(construct)을 말한다. 또한，상기의 "항생제 내성 유전자"는 형질전환시에 외래 핵산의 삽입 여부를 판단하고 선별하기 위해 형질전환용 핵산과 연결하여 발현되도록 하는 구성 요소를 말하며, 이에 제한되지는 않으나 당업자는 상기의 목적에 따라 적절한 항생제 내성 유전자를 사용할 수 있다.
용어 "원핵생물"은 원핵이라고 불리는 원시적인 세포핵을 가지는 생물로 진핵생물에 대응되는 말이다. 대부분 단세포로 되어 있으며, 광합성 미생물과 고세균 등을 포함한다. 이들은 핵산(DNA)이 막으로 둘러싸이지 않고, 분자 상태로 세포질 내에 존재하며, 미토콘드리아 등의 세포소기관 구조체가 없는 것이 특징이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 방법에 있어서, 상기 원핵생물은 박테리아일 수 있으며, 바람직하게는 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 대장균 (Escherichia coli), 스트렙토코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 프로피오니박테리아 아크네스 (Propionibacteria acnes), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "진핵생물"은 진핵세포를 가진 생물을 말하는 것으로, 진핵세포는 세포 내에 핵으로 대표되는 다양한 세포소기관을 가진 세포들을 통칭하는 이름이다. 전형적인 다세포 생물을 포함함은 물론, 남조류나 녹조류를 포함한 다양한 미세조류(algae), 효모류와 같은 단세포, 곰팡이와 같은 진균류까지 이에 해당된다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 방법에 있어서, 상기 진핵생물은 효모 또는 곰팡이일 수 있으며, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 딕티오스텔리움 디스코데움 (Dictyostelium discodeum), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한，본 발명의 아미노클레이는 수화된 것일 수 있다. 본 발명에서 용어 "수화"란 용매가 물인 경우에 용질분자 또는 이온 분자가 용매에 둘러싸여 하나의 분자처럼 행동하는 현상을 나타내는 경우를 말한다. 구체적으로는 물속에 분산되어 있는 입자，수용액 속의 용질，이온 또는 콜로이드 분자가 물 분자를 끌어당겨 집단적 성질을 나타내고 있는 상태를 말한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 방법에 있어서, 상기의 아미노클레이는 10㎎/㎖의 농도로 증류수에서 24시간 동안 혼합하여 수화하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 방법에 있어서, 상기 수화물과 핵산(DNA 나 RNA)을 혼합하는 단계는 와류혼합(vortexing)을 통해서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "와류혼합"이란 대상 용액에 외부 진동, 자석막대 등을 이용하여 와류를 유발하는 방법으로 혼합 처리하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 와류혼합 단계는 30 내지 120초 동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 80초 동안 이루어질 수 있고, 더욱 바람직하게는 60초 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기의 혼합하는 단계 이후에 혼합물을 형질전환을 위한 숙주와 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 혼합물과 숙주를 배양하는 단계는 상기 혼합물-숙주 용액을 평판배지에 도말(핵산의 보다 효율적인 세포내 도입을 위한 마찰력 제공)하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
용어 "평판배지"란 액체 배지를 한천 또는 젤라틴 등을 이용하여 평면으로 굳힌 고체 배지를 의미한다. 또한, 용어 "도말"이란 미생물을 고체 배지 위에 접종하는 한가지 방법으로서 획선 도말(streaking) 또는 평면 도말(spreading) 방법에 의해서 접종액을 고체 배지에 스며들도록 하는 것을 말한다. 이 과정에 혼합물과 세포의 마찰력이 제공된다. 당업자는 목적에 따라 적절한 평판배지의 한천 농도，도말 강도 및 도말되는 혼합물의 부피를 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 혼합물을 배양하는 단계 이후에 형질전환된 원핵 또는 진핵생물을 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면 상기의 평판배지에서 배양된 형질전환된 원핵 또는 진핵생물을 연속계대 방법을 이용하여, 항생제가 포함된 액체 배지에 계대하여 항생제에 내성이 있는 형질전환체를 선택하였다.
본 발명의 일 구현 실시예에 의한 아미노클레이를 이용한 형질전환 방법의 효율을 기존의 형질전환 방법과 비교하기 위해，기존의 대표적인 형질전환 방법인 열 충격법(Kindle. et al., J Cell Biol. 1989 109(6 Pt1):2589-601)과 전기천공법(Shimogawara. et al., Genetics. 1998 148:1821-8)을 사용한 방법 및 시중에 판매되는 키트를 사용한 방법에 대해서도 형질전환 효율을 각각 확인하였다(표 1). 그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이，아미노클레이를 이용한 형질전환 효율은 다른 형질전환 방법들에 비해 우수한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 또한, 아미노클레이를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물 형질전환용 조성물을 제공한다. 본 발명의 원핵 또는 진핵생물 형질전환용 조성물은 아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환을 위해 필요한 증류수, 형질전환을 위한 핵산, 식염수 완충액 또는 평판배지 조성물 등을 추가로 포함하는 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 원핵 또는 진핵생물은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 아미노클레이를 포함하는, 원핵 또는 진핵생물 형질전환용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 아미노클레이를 이용한 원핵 또는 진핵생물의 형질전환을 위해 필요한 증류수, 형질전환을 위한 핵산, 식염수 완충액 또는 평판배지 조성물 등을 추가로 포함하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 화학물
양이온성 금속으로서의 마그네슘 클로라이드 헥사히드레이트(MgCl2·6H2O) 및 칼슘 클로라이드 디히드레이트(CaCl2·2H2O)를 쥰세이(일본)에서 구입하였고, 아미노클레이 합성을 위한 아미노실란으로서의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES, C9H23NO3Si)을 시그마-알드리치(미국)에서 구입하였다. Luria-Bertani(LB) 및 뇌 심장 인퓨젼(BHI) 배지는 백톤(Becton), 딕킨슨 앤드 컴퍼니(Dickinson and Company, 미국)로부터 공급받았다. DNA 준비과정이나 형질전환 과정에서는 3차 증류수(>18 mΩ, DI 물)를 모든 실험에 사용하였다.
2. 플라스미드, 균주 및 성장 조건
광범위 숙주 범위 벡터 pBBR122(Mostafa et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2619-2623)를 대장균 (Escherichia coli) XL1-Blue 및 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)(KCTC 3065)의 형질전환에 이용하였다. 녹색 형광 단백질 GFPuv을 코딩하는 유전자를, 주형으로서의 pGFPuv 플라스미드(Clontech, 미국)와 함께 프라이머 세트(정방향: 5'-AAAGTACTATGAGTAAAG-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머: 5'-AACCGAATTCTTATTTGTAG-3'(서열번호 2))를 이용해 PCR로 증폭하여 GFP 발현-재조합 벡터를 제조하였다. 증폭된 유전자 및 pBBR122를 ScaI 및 EcoRI로 절단하고, 표준 방법으로 라이게이션을 수행하였다. 결과로서 수득한 구축물을 pBBR122-gfp(5.6 kb)로 명명해, 클로닝하고 GFP 발현에 이용하였다. 각기 숙주에 형질전환된 모든 재조합 플라스미드는 미니-프렙 키트(Promega, 미국)를 이용해 분리한 후, 염기서열을 분석해 추후 실험과정에 이용하였다.
재조합 플라스미드를 지닌 대장균 및 스트렙토코커스 뮤탄스를 각각 LB 및 BHI 배지에서 성장시켰다. 고체 플레이트는 플라스미드-아미노클레이/세포 혼합물의 스프레딩 과정 동안 마찰력(고체 표면에서 액체층에 존재하는 플라스미드-아미노클레이 혼합물과 숙주 세포 사이의 마찰력)을 다양하게 하기 위해 농도를 달리(2-4%)해 제조하였다. 선택마커로서 사용한 항생제 카나마이신은 아가 플레이트에 25㎍/㎖의 농도로 첨가해 형질전환된 균주를 선별하는데 이용하였다.
3. 아미노클레이 스톡 용액의 제조
아미노클레이의 화학합성, 3차 증류수(deionized water)에 분산된 아미노클레이의 투과 전자 현미경 영상, 동적인 광산란 데이터, 푸리에 변환 적외선 스펙트럼 및 X-선 회절 패턴을 포함하는, 마그네슘- 및 칼슘-아미노클레이에 대한 특징적 정보가 선행 문헌으로 제시되었다(Han et al., 2011. ACS Appl. Mater. Interfaces 3, 2564-2572; Lee et al., 2013. Sci. Rep. 3, 1292 (1-8); Lee et al., 2011. J. Hazard. Mater. 196, 101-108; Lee et al., 2011. J. Hazard. Mater. 190, 652-658; Lee et al., 2012. Adv. Sci. Lett. 6, 882-887). 10mg의 각 아미노클레이를 1㎖의 3차 증류수에 24시간 동안 현탁시켜 클레이를 완전히 가용화시켰다. 상기 스톡 용액을 추가 처리없이 모든 형질전환 실험에 이용하였다.
4. 형질전환 프로토콜
대장균 XL1-Blue(4×108 CFU) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(6×108 CFU)의 배양 세포를 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 초기 지수 성장기에서 수합한 후, 500㎕의 3차 증류수 또는 인산염-완충 식염수(PBS, pH 7.0)에 재현탁시켰다. 정제된 플라스미드 pBBR122(0.05, 0.1, 0.25, 0.5 및 1.0㎍)를 50㎕의 수화된 아미노클레이 용액(10mg/ml)에 첨가하고, DI 물로 추가로 500㎕로 조정하였다. 500㎕의 분취한 재현탁 세포를 최종적으로 혼합하여 상기 용액과 1분간 와류시켜 완전히 혼합시킨 후 반응(세포 표면에 흡착유도)시켰다. 상기 과정으로 준비된 혼합물을 카나마이신(25㎍/㎖)을 포함하는 2% LB 또는 BHI 고체 배지를 포함한 아가 플레이트 상에 스프레딩했다. 이때 사용한 플레이트는 클린 벤치 상에서 10분간 미리 건조시켰다. 세포 및 아미노클레이/플라스미드를 포함하는 혼합물(100㎕)을 아가 플레이트(9cm 직경)에 스프레딩하여 플라스미드를 박테리아에 형질전환시켰다. 액체 혼합물이 아가 플레이트에 완전히 흡수될 때까지 유리 스프레더를 이용해 스프레딩을 실행하였다. 최적 조건 탐색을 위해 각 시료를 3개씩 준비해, 각각 30, 60 및 120초 동안 추가(마찰력에 의한 형질전환률 증가 효과 기대)로 스프레딩하였다. 처리된 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 콜로니를 관찰하며, 콜로니가 형성된 클론들은 미니-프렙으로 플라스미드를 분리해 형질전환 여부를 확인하였다. 실험은 3회씩 수행하여 형질전환 효율을 계산하였고 평균 및 표준 편차를 시그마플롯 버전 10.0(Systat Software Inc. Chicago, 미국)을 이용해 계산하였다.
5. 플라스미드 안정성 및 세포 성장에 대한 유효성
플라스미드 안정성 및 세포 성장에 대한 아미노클레이/플라스미드 처리 효과를 확인하기 위해, 250㎖ 플라스크에서 LB 또는 BHI 액체배지 50㎖을 이용해 플라스미드 pBBR122-gfp로 형질전환된 두 균주를 37℃에서 배양하였다. 배양물을 약 80세대 동안 성장시키고, 동일한 조건의 또 다른 플라스크에 연속으로 옮겨가며 플라스미들 안정성과 세포성장 정도를 비교하였다. 이를 위해 각 배양액에서 일정양의 시료를 취하고, 적절한 농도로 희석시킨 배양액을 선별 마커 카나마이신(25㎍/㎖)의 존재하는 조건과 그렇지 않은 조건의 동일 고체 배지에 스프레딩하였다. 상기 과정에서 플라스미드의 안정성(소실된 비율)은, 전체 클론에서 항생제에 내성을 지닌 세포의 비율로 결정하였다. 플라스미드 존재 여부의 최종 확인은, 항생제가 존재하는 조건에서 배양된 세포에서 미니-프렙 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하는 과정으로 검증하였다. 실험 동안, 아미노클레이-매개 형질전환 대장균 세포의 성장 지연(나노 물질이나 마찰력에 의한 성장저해)이나 스트레스에 의한 열-쇼크(heat shock protein) 단백질 발현 유도 가능성은 전형적인 형질전환 방법(열충격)으로 동일 플라스미드로 형질전환한 세포를 이용해 비교하였다.
실시예 1. 플라스미드 DNA의 아미노클레이와의 상호작용
형질전환에 유리한 아미노클레이-DNA 복합체(아미노클레이로 랩핑된 DNA) 형성 유무와 정도(랩핑에 유리한 상대농도)를 결정하기 위해, 아미노클레이 농도를 고정하고 다양하게 농도를 달리한 플라스미드를 24시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 각 아미노클레이로 랩핑된 플라스미드 DNA의 양을 조사하였다. 잘 알려진 바와 같이 넓은 영역(pH 2-12)에서 양(+)으로 하전된 아미노클레이 표면 (Chaturbedy et al., 2010. ACS Nano 4, 5921-5929; Lee et al., 2011. J. Hazard. Mater. 196, 101-108) 때문에, 음(-)전하를 지닌 플라스미드 DNA와 쉽게 상호작용하여 아미노클레이로 코팅된 플라스미드 DNA를 제공할 수 있는 것으로 추측되었다. 전기영동 결과, 각각 약 2.75 내지 3.25㎍/mg 및 1.75 내지 2.25㎍/mg까지의 플라스미드가 마그네슘- 및 칼슘-아미노클레이에 흡착(복합체 형성)됨을 확인하였다. 이는 복합체를 형성한 DNA의 경우, 겔 상에서 EtBr로 형광염색이 되지 않는 특성을 이용해 결정한 결과이다. 상기 결과는 흡광광도계(spectrophotometer)를 이용해 280nm에서 광학 밀도를 재는 방법으로 결합되지 않은 DNA의 정량적 분석에 의해 재검증을 시도하였다. 결과적으로, 아미노클레이 상에 완전하게 흡착된 농도 범위(2.75 내지 3.25㎍ 플라스미드/mg 마그네슘-아미노클레이; 1.75 내지 2.25㎍ 플라스미드/mg 칼슘-아미노클레이)에서의 마그네슘- 및 칼슘-아미노클레이의 혼합 용액에서는 DNA 특이적 스펙트럼(260 내지 280nm)이 관찰되지 않았다. 자체-어셈블된 하이브리드 구조 중의 DNA는 안정한 상기 언급된 구조를 나타내어, 코팅 재료로서 아미노클레이가 플라스미드 DNA 생분자에 대한 외장(armor)으로 작용했음을 보여 주는 결과이다. 또한, 상기 언급된 구조는 HindⅢ 제한 효소 또는 DNaseI를 이용한 약 30 내지 60분간의 처리에 의한 DNA 절단에 대해 보호되어, 절단된 DNA 단편이 관찰되지 않았다(데이터 미제시). 따라서 생체내로 도입될 경우, 제한효소나 핵산가수분해 효소로부터 보호되어 상대적으로 높은 형질전환 효율을 보일 수 있음이 예상되었다.
실시예 2. 형질전환 효율에 대한 플라스미드 DNA 양 및 스프레딩 시간의 유효성
다양한 미생물 숙주의 일반적인 형질전환 벡터로서 폭 넓게 사용되는 pBBR122 플라스미드를 벡터로 임의로 선택하여 아미노클레이의 전형적 그람-음성(대장균) 및 그람-양성(스트렙토코커스 뮤탄스) 세포에 대한 형질전환 능력을 평가하였다. 이는 전술한 벡터가 광범위한 그람-음성 숙주에서 성공적으로 기능할 수 있으며, 스트렙토코커스 뮤탄스가 상기 벡터로 형질전환될 수 있음을 본 연구실의 형질전환 연구 과정에서 발견하였기 때문이다. 예비 실험 결과에서는 다양한 세포 성장 단계(적응기, 지수 성장기 및 세포성장 정지기)에서 수확된 숙주세포로 아미노클레이/플라스미드 복합체가 형질전환됨을 확인하였다. 따라서 성장 전주기의 세포를 컴피턴트 세포(형질전환용 숙주)로 이용할 수 있음이 확인되었다. 그러나, 세포 생리 및 상대적으로 높은 형질전환체 빈도를 고려하여 초기 지수 성장 단계(600nm에서 광학 밀도가 0.8 내지 1.5)의 세포를 컴피턴트 세포(competent cells)로 이용했다. 본 발명에 사용한 컴피턴트 세포는 임의의 첨가제 없이 오직 원심분리를 이용한 수합(harvesting)에 의해서만 제조했다. 반면에 기존의 전형적인 형질전환방법(열충격이나 전기 천공)에서는 복잡한 물리/화학적 처리(글리세롤 용액이나 금속이온 용액으로 반복 세척한 후, 냉장조건에서 원심분리)가 요구되어진다.
준비된 컴피턴트 세포를 이용해, 요시다 유효법(도 1A)으로 인한 박테리아 형질전환의 작동원리를 근간으로 하여, DNA-코팅된 아미노클레이를 스프레딩-유도성 마찰력에 의해 세포에 도입했다(도 1B). 아미노클레이-DNA 복합체 농도를 다양하게 처리하여 시험한 최적의 형질전환 조건은 4 내지 6×108 CFU 세포를 숙주로 이용하였을 때, 0.25mg으로 결정되었다. 상기 조건에서 최적의 형질전환 효율을 보이는 DNA의 양 및 아미노클레이/DNA 혼합물을 이용한 세포의 스프레딩 시간은, 대장균 XL1-Blue 및 스트렙토코커스 뮤탄스 숙주 모두에서 0.1㎍ 및 1분으로 결정되었다. 이때 박테리아의 형질전환 효율은 약 2×105 내지 약 6×103 CFU/㎍ 플라스미드 DNA를 나타냈다(도 2). 특히, 대장균 XL1-Blue에서 칼슘-아미노클레이를 이용한 형질전환 효율은 마그네슘-아미노클레이를 이용한 것보다 더 높았지만, 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해서는 반대의 결과가 나왔다. 형질전환 효율은 상대적으로 더 많은 양의 DNA를 로딩하거나 스프레딩 시간을 증가시킴에 따라 감소하였다. 이는 DNA 로딩 양을 증가시켰을 때, 세포로의 내재화(안으로 들어가는 비율)에 적정한 양보다 많은 DNA-아미노클레이 복합체가 세포막에 축적되어 막이나 세포벽의 결함을 유도하는 결과로써 나타난 현상으로 추정된다. 따라서, 막 구조 변형에 의한 세포 손상 및 유동성 저해는 부정적인 결과를 낳음을 재확인하였다. 또한 박테리아 세포는 마찰력을 유도하는 스프레딩 시간을 늘리면, shear 스트레스에 의해 부분적인 세포 사멸을 초래하는 것으로 생균수 측정(viable cell counting) 실험 과정에서 확인되었다.
동일한 조건에서, 스트렙토코커스 뮤탄스를 숙주로 이용하여 기보고된 세피오라이트(DNA가 침착하는 바늘형 나노 구조물, Wilharm et al., 2010. J. Microbiol. Methods 80, 215-216)를 이용한 플라스미드 DNA 형질전환(요시다 효과에 의한 방법)에서는 단 한 개의 콜로니도 검출되지 않았다. 추가적인 대조군으로서, 성장 전주기 동안의 다양한 시점에서 수확한 스트렙토코커스 뮤탄스를, 일반적 형질전환 프로토콜(열 쇼크 처리 및 전기천공)에 적용한 결과에서도 형질전환체가 생성되지 않았다. 따라서 본 발명의 기법으로 야생형 스트렙토코커스 뮤탄스의 형질전환을 상대적으로 수월하고 효율적으로 유도할 수 있음이 증명되었다. 야생형 대장균 형질전환체의 경우는, pBBR122를 이용해 열 쇼크로 형질전환하였을 때, 동일한 세포를 아미노클레이/DNA 방법으로 처리한 것과 유사하거나 약간 낮은 형질전환율(~2배)을 보여 주었다.
실시예 3. 산업용 미생물에 대한 아미노클레이 / DNA 방법의 형질전환 효율
전기천공방법을 이용한 플라스미드 DNA의 삽입은 많은 균주 및 동물세포에서 수행되며, 열-쇼크방법에 비하여 효율과 사용 범위가 넓어 진균 및 동물세포에도 형질전환이 가능하다. 때문에 열-쇼크방법과 같은 방법으로 형질전환을 유도할 수 없는 많은 산업용 미생물을 전기천공 방법으로 형질전환을 수행하며, 대표적으로 사용되는 박테리아의 형질전환 효율은 스트렙토코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 1X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA, 스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes) 1X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 3X105 CFU/㎍ 플라스미드 DNA, 프로피오니박테리아 아크네스 (Propionibacteria acnes) 1.5X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 1X103 CFU/㎍ 플라스미드 DNA, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 3X103 CFU/㎍ 플라스미드 DNA, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 2X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA, 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 2X105 CFU/㎍ 플라스미드 DNA 등으로 사용되는 플라스미드 DNA 크기와 세포벽 유무에 영향을 받지만 일반적으로 1X103 내지 1X106 CFU/㎍ 플라스미드 DNA 정도로 나타난다. 같은 균주에 아미노클레이/DNA 방법을 적용할 경우 그람 양성균의 경우 최소 1X103 CFU/㎍ 플라스미드 DNA에서 최대 1X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA 수준의 형질전환체를 확인할 수 있으며, 그람 음성균의 경우 최소 1X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA에서 최대 1X106 CFU/㎍ 플라스미드 DNA 수준의 형질전환체를 확인할 수 있다(표 1). 이때 실험 조건은 실시예 1과 2에서 언급한 과정에 따랐으며, 적절한 세포 농도는 흡광도 600nm에서 광학 밀도가 0.7 내지 1.3 정도이고, 사용한 아미노클레이의 양은 0.2 내지 0.3mg, 재조합 DNA 농도는 0.1 내지 0.2㎍ 이었다. 모든 균주는 공시균주(type strain)를 사용하였다. 결과적으로 모든 경우에서, 전형적인 전기천공방법과 유사한 수준의 형질전환체가 확인되나, 실제 형질전환에 사용되는 DNA의 양과 세포 수를 비교 하였을 때 더 적은 양으로 높은 효율을 보이는 수치이며, 전기천공 방법에 필요한 값 비싼 천공 장치가 필요 없기 때문에 산업적으로도 매우 유리하다.
실시예 4. 산업용 진균에 대한 아미노클레이/DNA 방법의 형질전환 효율
산업용으로 사용되는 대표적인 진균으로는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 딕티오스텔리움 디스코데움 (Dictyostelium discodeum), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) 등이 있다. 진균의 경우 박테리아와 다르게 형질전환을 위해서 세포 내 핵막까지 플라스미드 DNA를 전달시켜야 한다. 따라서 박테리아에 사용되는 열-쇼크방법은 사용하기 어려우며, 일반적으로 전기천공방법과 시중에 판매되는 형질전환용 키트를 사용하게 된다. 이러한 방법의 형질전환 효율은 플라스미드 DNA의 크기에 영향을 받지만 일반적으로 1X103 내지 1X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA 정도이다. 같은 균주에 아미노클레이/DNA 방법을 적용할 경우 최소 1X103 CFU/㎍ 플라스미드 DNA에서 최대 1X104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA 수준의 형질전환체를 확인할 수 있었다(표 1). 이때 실험 조건은 실시예 1과 2에서 명시된 과정에 따랐으며, 적절한 세포 농도는 흡광도 600nm에서 광학 밀도가 0.5 내지 1.1 정도이었다. 균사(hyphae 혹은 pseudo hyphae)를 형성하거나 형태발생(morphogenesis)이 심한 하등한 균류(lower fungi)의 경우, 건조중량(dry cell weight) 기준으로 0.02 내지 0.07mg 정도의 세포를 사용하였다. 형질전환에 사용한 아미노클레이 양은 0.4 내지 0.8mg, 재조합 DNA 농도는 0.5 내지 1.1㎍ 이었다. 모든 균주는 공시균주(type strain)를 사용하였다. 결과적으로 실시예에서 실험한 모든 경우에서 알려진 전기천공방법이나 상용화된 키트와 유사하거나 높은 수준의 형질전환율을 보여주었다. 하지만 실험에 사용된 DNA의 양과 세포 수를 비교 하였을 때, 더 적은 양으로 높은 효율을 보이는 수치이며, 고가의 전기천공 장치나 상용화된 키트 사용, 특별한 전처리 과정이 필요하지 않기 때문에 산업적으로도 매우 유리한 결과로 추정된다.
Figure 112014067073507-pat00001
실시예 5. 형질전환된 플라스미드의 안정성 및 세포 성장
대장균 및 스트렙토코커스 뮤탄스에 형질전환시킨 각 플라스미드는 성장 동안(80세대까지) 선택인자(항생제) 없이 세포에서 안정하게 유지되었다. 미처리 및 아미노클레이-처리 세포 사이의 성장 비교는 또한 심한 성장 저해를 나타내지 않았다. 추가로, 배양물을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 비교했을 때 스트레스 응답 단백질에 해당하는 밴드가 관찰되지 않았다(데이터 미제시). pBBR122 플라스미드가 복제 기원 및 광범위한 그람-음성 숙주에서 기능하는 발현 시스템을 갖고 있어, 그람-양성 세포에 삽입된 DNA의 발현을 모니터링하기에는 적합한 발현을 보장할 수는 없지만, 상기 실험과정에서 pBBR122-gfp로 형질전환한 2종의 재조합 미생물 모두에서 상기 기재된 배양 조건 동안 특징적인 녹색 형광을 보여 주었다(도 3). 상기 결과는 본원에 기재된 형질전환 시스템이 비침습적 방식(non-invasive manner)으로 잘 작동한다는 증거를 제공한다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for transformation of prokaryote or eukaryote using aminoclay <130> PN14189 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aaagtactat gagtaaag 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaccgaattc ttatttgtag 20

Claims (13)

  1. 아미노클레이, 외래 핵산, 및 원핵생물, 곰팡이 또는 효모를 혼합하는 단계를 포함하는, 원핵생물, 곰팡이 또는 효모의 형질전환 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 원핵생물은 박테리아인 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노클레이는 수화된 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 와류혼합(vortexing)을 통해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 와류혼합은 30 내지 120초 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기의 혼합하는 단계 이후에 혼합물을 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혼합물을 배양하는 단계는, 상기 혼합물을 평판배지에 마찰력을 이용해 도말하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 혼합물을 배양하는 단계 이후에 형질전환된 원핵생물, 곰팡이 또는 효모를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  10. 아미노클레이를 포함하는, 원핵생물, 곰팡이 또는 효모의 형질전환용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 원핵생물은 박테리아인 것을 특징으로 하는 형질전환용 조성물.
  12. 삭제
  13. 아미노클레이를 포함하는, 원핵생물, 곰팡이 또는 효모의 형질전환용 키트.
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