KR101590220B1 - 유일 특이적 핵산 프로브 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본원에 개시된 것은, 유일 특이적 핵산 프로브 및 이의 사용 방법 및 제조 방법이다. 개시된 프로브는 하이브리드화 동안 블로킹 DNA 의 사용을 감소시키거나 제거하면서, 감소되거나 제거된 배경 신호를 갖는다. 한 예에서, 프로브는 하나 이상의 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 사전결정된 순서 및 배향으로 연결시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는데, 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적이며 상기 유일 특이적 핵산 서열은 유기체의 게놈 내에 단 1 회 나타나고 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 약 20% 이하의 게놈 표적 핵산 분자를 포함한다. 특정 예에서, 결합 부위 ("유일 특이적 결합 부위") 는 게놈 표적 핵산의 비-인접 부위에 대해 상보적이다. 개시된 프로브 및 상기 프로브를 포함하는 키트의 사용 방법 및/또는 상기 프로브 제조 또는 사용을 위한 시약이 또한 개시된다.

Description

유일 특이적 핵산 프로브 제조 방법 {METHODS FOR PRODUCING UNIQUELY SPECIFIC NUCLEIC ACID PROBES}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 가출원 제 61/291,750 호 (2009 년 12 월 31 일 출원) 및 미국 가출원 제 61/314,654 호 (2010 년 3 월 17 일 출원) 에 대해 우선권을 주장한다.

분야

본 개시물은 핵산 표적 서열 (예를 들어 게놈 DNA 또는 RNA) 의 분자적 검출 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 개시물은 유기체의 반수체 게놈 내에 단 1 회 나타나는 유일 특이적 (uniquely specific) 핵산 서열을 포함하는 핵산 프로브의 제조 방법, 및 개시된 방법에 의해 생성된 프로브에 관한 것이다.

배경

형광 제자리 하이브리드화 (FISH), 발색 제자리 하이브리드화 (CISH) 및 은 제자리 하이브리드화 (SISH) 와 같은 분자 세포유전학 기술은, 염색체의 시각적 평가 (핵형 분석) 를 분자 기술과 조합시킨다. 분자 세포유전학 방법은 핵산 프로브의 세포 내 이의 상보적 핵산에 대한 하이브리드화를 기초로 한다. 특정 염색체 부위에 대한 프로브는 중기 염색체 상의 또는 간기 핵 내 (예를 들어 조직 샘플 내) 이의 상보적 서열을 인지하며 이에 대해 하이브리드화된다. 프로브는 다양한 진단 및 연구 목적으로 개발되어 왔다. 예를 들어, 특정 프로브는 전통적인 세포유전학적 염색 절차를 모방하는 염색체 밴딩 패턴을 생성하며, 핵형 분석을 위한 개별적인 염색체의 확인을 가능하게 한다. 기타 프로브는 단일 염색체로부터 유래하며, 표지되는 경우 "염색체 페인트" 로서 사용되어 세포 내 특정 염색체를 확인할 수 있다. 또다른 기타 프로브는 염색체의 동원체 및 말단소체와 같은 특정 염색체 구조를 확인한다. 추가적인 프로브는 특정 염색체 부위 또는 유전자 내에서 단일 카피 DNA 서열에 대해 하이브리드화된다. 이들은 관심 증후군 또는 상태와 관련되는 중요한 염색체 부위 또는 유전자를 확인하는데 사용되는 프로브이다. 중기 염색체 상에서, 이러한 프로브는, 통상 염색체 당 2 개의 작고 개별적인 신호를 주는 각각의 크로마티드에 대해 하이브리드화된다.

이러한 염색체 또는 유전자-특이적 프로브의 하이브리드화는, 미세결실 증후군, 염색체 전위, 유전자 증폭 및 이수성 증후군, 종양성 질환 뿐 아니라 병원체 감염과 같은 구성요소 유전적 이상을 포함하는 수많은 질환 및 증후군과 관련되는 염색체 이상을 검출할 수 있게 하였다. 가장 통상적으로, 이들 기술은 현미경 슬라이드 상의 표준 세포유전적 제조물에 적용된다. 또한, 이들 절차는 포르말린-고정 조직, 혈액 또는 골수 도말, 및 직접 고정 세포 또는 기타 핵 단리물의 슬라이드 상에 사용될 수 있다. 염색체 또는 유전자-특이적 프로브는 또한 비교 게놈 하이브리드화 (CGH) 에서 사용되어 게놈 내 유전자 카피 수를 측정할 수 있다.

많은 유기체의 게놈은 반복 핵산 서열을 함유하는데, 이는 종종 탠덤 (tandem) 어레이에서 수회 반복되는 일련의 뉴클레오티드이다. 프로브 내 이러한 반복 서열의 존재는 배경 염색의 증가를 야기하며 하이브리드화 동안 블로킹 DNA 의 사용을 필요로 한다. 이러한 반복 서열이 결여된 "반복물-미함유" 프로브가 종종 생성되어 (예를 들어 컴퓨터 알고리즘을 사용하여) 이러한 문제점을 감소시킨다. 그러나, "반복물-미함유" 프로브 조차도, 허용가능한 수준으로 배경 염색을 감소시키기 위해서 실제적 양의 블로킹 DNA 의 사용을 필요로 한다.

발명의 개요

본원에 개시된 것은, 유일 특이적 핵산 프로브 및 이의 사용 방법 및 제조 방법이다. 개시된 프로브는 하이브리드화 동안 블로킹 DNA 의 사용을 감소시키거나 제거하면서, 감소되거나 제거된 배경 신호를 갖는다. 일부 예에서, 프로브는 하나 이상의 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 사전결정된 순서 및 배향으로 연결시키는 방법에 의해 제조되는데, 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적이며 상기 유일 특이적 핵산 서열은 유기체의 게놈 내에 단 1 회 나타나고 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 약 20% 이하 (예를 들어 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하) 의 게놈 표적 핵산 분자를 포함한다. 일부 예에서, 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 약 10% 이하의 게놈 표적 핵산 분자를 포함한다. 특정 예에서, 결합 부위 ("유일 특이적 결합 부위") 는 게놈 표적 핵산의 비-인접 부위에 대해 상보적이다. 일부 예에서, 유일 특이적 결합 부위는 적어도 약 20 염기쌍 (bp) 길이이다 (예를 들어, 약 35-500 bp, 예컨대 약 100 bp). 일부 예에서, 게놈 표적 핵산은 진핵세포 게놈 (예컨대 포유동물 게놈, 예를 들어 인간 게놈) 으로부터의 것이다.

특정 구현예에서, 유일 특이적 결합 부위는 하기 중 하나 이상에 의해 생성된다: 게놈 표적 핵산을 다수의 분절로 분리하고 (예를 들어, 게놈 핵산 서열을 예컨대 가상환경에서 (in silico) 분절로 분리함); 각각의 분절을 게놈 표적 핵산을 포함하는 게놈과 비교하고 (예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 예컨대 BLAT 을 사용하여); 게놈 표적 핵산에 대해 유일 특이적인 2 개 이상의 분절 (예컨대 각 게놈 표적 핵산 분자 내에서 각각 단 1 회 나타나는 2 개 이상의 분절) 을 선택하고; 반복 DNA 서열을 게놈 표적 핵산으로부터 제거하고 (예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 예컨대 RepeatMasker 를 사용하여); 약 30% 내지 70% 의 GC 뉴클레오티드 함량을 갖는 2 개 이상의 분절을 선택함.

다른 구현예에서, 유일 특이적 결합 부위는 하기 중 하나 이상에 의해 생성된다: 게놈 표적 핵산을 다수의 분절로 분리하고 (예를 들어, 게놈 핵산 서열을 예컨대 가상환경에서 분절로 분리함); 다수의 핵산 분절을 합성하고; 합성된 다수의 핵산 분절을 어레이에 부착시키고; 상기 어레이를 총 게놈 DNA 및 블로킹 DNA 와 하이브리드화하고; 게놈 표적 핵산에 대해 유일 특이적인 2 개 이상의 분절 (예컨대 각 게놈 표적 핵산 분자 내에서 각각 1 회 나타나는 2 개 이상의 분절) 을 선택하고; 반복 DNA 를 게놈 표적 핵산으로부터 제거하고 (예를 들어 컴퓨터 알고리즘 예컨대 RepeatMasker 를 사용하여); 약 30% 내지 70% 의 GC 뉴클레오티드 함량을 갖는 2 개 이상의 분절을 선택함.

일부 예에서, 유일 특이적 결합 부위는, 표적 게놈 부위를 포함하는 다수의 핵산 분절을 합성하고, 합성된 다수의 핵산 분절을 어레이에 부착시키고, 상기 어레이를 총 게놈 DNA 및 블로킹 DNA 와 하이브리드화하고, 게놈 표적 핵산에 대해 유일 특이적인 2 개 이상의 분절 (예컨대 각 게놈 표적 핵산 분자 내에서 각각 1 회 나타나는 2 개 이상의 분절) 을 선택함으로써 생성된다.

일부 예에서, 사전결정된 순서 및 배향은 하기에 의해 생성된다: 선택된 유일 특이적 결합 부위를 배열하여 후보 핵산 프로브를 제조하고 (예를 들어, 염색체 순서 및 배향으로 배열); 후보 핵산 프로브를 다수의 분절로 분리하고 (예를 들어, 게놈 핵산 서열을 예컨대 가상환경에서 분절로 분리함); 각각의 분절을 게놈 표적 핵산을 포함하는 게놈과 비교하고 (예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 예컨대 BLAT 을 사용하여); 게놈 표적 핵산에 대해 유일 특이적인 선택된 분절 (예를 들어, 유기체의 게놈 내에서 1 회 초과로 나타나는 임의의 서열을 포함하지 않음) 의 하나 이상의 순서 및 배향을 선택하고; 선택된 순서 및 배향으로 선택된 유일 특이적 결합 부위를 연결시킴. 다른 예에서, 사전결정된 순서 및 배향은, 핵산 프로브를 제조하기 위해 (예를 들어 염색체 순서 및/또는 배향으로) 선택된 유일 특이적 결합 부위를 배열하고, 선택된 순서 및 배향으로 선택된 유일 특이적 결합 부위를 연결시킴으로써 생성된다.

개시된 프로브 사용 방법은, 예를 들어 게놈 표적 핵산 서열을 검출 (및 일부 예에서는 정량화) 하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 개시된 프로브를, 샘플 내 핵산 분자와 프로브의 다수의 핵산 분자 사이의 하이브리드화를 허용하기에 충분한 조건 하에 핵산 분자 함유 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 그 결과로 생긴 하이브리드화가 검출되는데, 여기서 하이브리드화의 존재는 게놈 표적 핵산 서열의 존재 (및 일부 예에서는 양) 를 나타낸다.

프로브 및/또는 프로브 제조 또는 사용을 위한 시약을 포함하는 키트가 또한 개시된다.

전술한 특징 및 기타 특징은, 수반하는 도면을 참조로 진행되는 하기 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 100 bp 단편으로 나열되며 분리되는 Met 전암 유전자 게놈 핵산 서열 (SEQ ID NO: 1) 일부의 예를 나타낸다. 반복 서열은 "n" 으로 대체된 후, "n" 의 수는 이의 수치 값으로 대체된다. 예를 들어, "600" 으로 표시된 라인에서 "*38*" 에 의해 대체된 38 개 "n" 이 존재한다.

도 2A 는 인간 염색체 7 의 비-유일 특이적 100 bp 분절에 대한 BLAT 결과를 나타낸다.

도 2B 는 인간 염색체 7 의 유일 특이적 100 bp 분절에 대한 BLAT 결과를 나타낸다.

도 3 은 멤브레인 상에 고정되며 인간 DNA 프로브와 하이브리드화된 100 bp 올리고뉴클레오티드 형태의 예시적 Met 전암 유전자 (MET) 프로브의 선택된 분절 185 내지 271 의 도트 블롯의 디지털 이미지이다. 멤브레인의 우측 바닥에서의 3 개 스팟은 인간 DNA 대조군에 상응한다 (1 ng, 10 ng 및 100 ng).

도 4A 는 이전의 방법을 사용하여 제조된 반복물-미함유 MET 프로브를 사용하는 ISH (인간 태반 블로킹 DNA 가 하이브리드화 동안 포함됨) 를, 본 개시물의 유일 특이적 MET 프로브를 사용하는 ISH 와 비교하는 MDA-361 세포의 디지털 이미지이다. 인간 블로킹 DNA 는 유일 특이적 프로브 하이브리드화 동안 포함되지 않았으나; 연어 정자 DNA 는 예를 들어 핵산의 비-핵산 반응 성분에 대한 배경 결합에 대응하기 위해 하이브리드화에 포함되었다. SISH 표색 검출법을 통해 검출하였다.

도 4B 는 이전의 방법을 사용하여 제조된 반복물-미함유 IGF1R 프로브를 사용하는 ISH (인간 태반 블로킹 DNA 가 하이브리드화 동안 포함됨) 를, 본 개시물의 유일 특이적 IGF1R 프로브를 사용하는 ISH 와 비교하는 MDA-361 세포의 디지털 이미지이다. 인간 태반 블로킹 DNA (반복물-미함유 프로브 하이브리드화에 비해 최소량) 및 연어 정자 DNA 는 유일 특이적 프로브 하이브리드화 동안 포함되었다. SISH 표색 검출법을 통해 검출하였다.

도 5A 는 인간 태반 블로킹 DNA 의 존재 하 (좌측) 및 부재 하 (우측) 폐암 조직 샘플 내의 IGF1R 표적 핵산에 대한 유일 특이적 IGF1R 프로브로 수행한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지 쌍이다.

도 5B 는 인간 태반 블로킹 DNA 의 존재 하 (좌측) 및 부재 하 (우측) 폐암 조직 샘플 내의 TS 표적 핵산에 대한 유일 특이적 TS 프로브로 수행한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지 쌍이다.

도 5C 는 인간 태반 블로킹 DNA 의 존재 하 (좌측) 및 부재 하 (우측) 폐암 조직 샘플 내의 Met 전암 유전자 표적 핵산에 대한 유일 특이적 MET 프로브로 수행한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지 쌍이다.

도 5D 는 인간 태반 블로킹 DNA 의 존재 하 (좌측) 및 부재 하 (우측) 폐암 조직 샘플 내의 KRAS 표적 핵산에 대한 유일 특이적 KRAS 프로브로 수행한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지 쌍이다.

도 6A 는 NimbleGen 어레이를 사용하여 분석한 CCND1 유전자를 표적하는 서열의 하이브리드화로부터의 신호 플롯이다. 일련의 양성 및 음성 대조군을 포함시키고 절삭값에 대한 역치를 확립하기 위해 데이터를 사용하여, 합격/불합격 기준을 확립하였다.

도 6B 는 NimbleGen 어레이를 사용하여 분석한 CDK4 유전자를 표적하는 서열의 하이브리드화로부터의 신호 플롯이다. 일련의 양성 및 음성 대조군을 포함시키고 절삭값에 대한 역치를 확립하기 위해 데이터를 사용하여, 합격/불합격 기준을 확립하였다.

도 6C 는 NimbleGen 어레이를 사용하여 분석한 Myb 유전자를 표적하는 서열의 하이브리드화로부터의 신호 플롯이다. 일련의 양성 및 음성 대조군을 포함시키고 절삭값에 대한 역치를 확립하기 위해 데이터를 사용하여, 합격/불합격 기준을 확립하였다.

도 7A 는 인간 태반 블로킹 DNA 부재 하 폐암 조직 샘플 내의 유일 특이적 CCND1 프로브로 수행한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지이다.

도 7B 는 인간 태반 블로킹 DNA 부재 하 폐암 조직 샘플 내의 유일 특이적 CDK4 프로브로 수행한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지이다.

도 7C 는 인간 태반 블로킹 DNA 부재 하 폐암 조직 샘플 내의 유일 특이적 Myb 프로브로 수행한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지이다.

도 8 은 인간 태반 블로킹 DNA 부재 하 폐암 조직 샘플 내의 유일 특이적 EGFR 프로브로 수행하고, 티라미드 신호 증폭으로 검출한 ISH 를 나타내는 디지털 이미지이다.

서열 목록

본원 또는 수반하는 서열 목록에 열거된 임의의 핵산 및 아미노산 서열을, 뉴클레오티드 염기에 대해서는 표준 기호 약어를 사용하고, 아미노산에 대해서는 3 문자 코드를 사용하여 나타낸다 (37 C.F.R.§1.822 에 정의된 바와 같음). 적어도 일부 경우에서, 각각의 핵산 서열의 오직 한 가닥을 나타내지만, 표시된 가닥에 대한 임의의 참조로써 상보적 가닥이 포함되는 것으로 이해된다.

서열 목록은 2010 년 12 월 28 일에 생성된 파일명 Sequence_Listing.txt 의 형태로 ASCII 텍스트 파일로서 제출되며, 본원에 참조로 포함된다.

SEQ ID NO: 1 은 반복 서열이 "n" 으로 대체되는 예시적인 열거되고 분리된 Met 전암 유전자 게놈 서열이다.

발명의 상세한 설명

I. 도입

분자 분석을 위한, 선택된 표적 핵산 서열 (예를 들어 게놈 표적 핵산 서열) 에 상응하는 프로브의 제조는 배경 신호량을 잠재적으로 증가시킬 수 있는 프로브 내 원치 않는 서열의 존재에 의해 복잡해질 수 있다. 원치 않는 서열의 예는 진핵세포 (예를 들어 인간) 게놈 전체에 존재하는 산재성 반복 핵산 요소 및 게놈 내에 1 회 초과로 존재하는 핵산 서열 (예를 들어 "비-고유" 서열) 을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

역사적으로, 프로브의 선택은 통상 비-특이적 배경의 수준에 대한 표적 특이적 신호의 강도를 균형 잡으려고 시도한다. 예를 들어, 이전의 방법에서, 표적에 상응하는 프로브를 선택하는 경우, 신호는 일반적으로 프로브의 서열 함량을 증가시킴으로써 최대화된다. 그러나, (예를 들어, 게놈 표적 핵산 서열에 대한) 프로브의 서열 함량이 증가함에 따라, 원치 않는 (예를 들어, 반복 및/또는 비-고유한) 핵산 서열의 양이 프로브 내에 포함된다. 프로브의 서열 함량을 감소시킴으로써 프로브의 특이성을 증가시키기 위한 시도는, 관심 게놈 (예를 들어, 인간 게놈) 내에 수 회 존재하는 비-고유한 핵산 서열을 유지하는 DNA 서열의 포함물을 제거시키지 않는다. 이러한 프로브는 게놈 내에 수많이 존재하는 (예를 들어, 150-200 회 이하) 서열을 함유할 수 있다.

프로브가 표지되는 경우 (형광단과 같은 검출가능한 부분으로 직접 표지되거나, 추가적인 성분의 결합 및 검출을 기초로 간접적으로 검출될 수 있는 합텐과 같은 부분으로 간접적으로 표지됨), 원치 않는 (예를 들어, 반복 및/또는 비-고유한) 핵산 서열 요소는 표적 서열 내 표적-특이적 요소와 함께 표지된다. 하이브리드화 동안, 표지된 원치 않는 (예를 들어, 반복 및/또는 비-고유한) 핵산 서열의 결합은 분산된 배경 신호를 야기하는데, 이는 예를 들어 수치적 또는 정량적 데이터 (예컨대 서열의 카피 수 또는 게놈 사이의 카피 수 차이) 가 필요한 경우 해석이 잘못되었음을 입증할 수 있다. 프로브 내 표지된 반복적 또는 기타 원치 않는 핵산 서열의 하이브리드화로 인한 배경의 감소는 통상 블로킹 DNA (예를 들어, 비표지된 반복 DNA, 예컨대 Cot-1^TM DNA 또는 총 게놈 DNA) 를 하이브리드화 반응에 추가하여 이루어진다.

본 개시물은 프로브 내 반복적 또는 기타 원치 않는 (예를 들어, 비-고유한) 핵산 서열의 존재로 인한 배경 신호를 감소시키거나 제거하기 위한 접근법을 제공한다. 특히, 본 개시물은 블로킹 DNA (예컨대 인간 블로킹 DNA, 예를 들어 인간 태반 DNA) 의 사용을 감소시키거나 제거하면서, 감소되거나 제거된 배경 신호를 갖는 프로브의 제조 방법 및 이러한 프로브를 제공한다. 본원에 개시된 일부 예시적 프로브는 실제적으로 또는 전체적으로 반복 또는 기타 비-고유한 핵산 서열이 없다 (예컨대 실제적으로 단지 유일 특이적 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 내에서 단 1 회 나타나는 서열) 을 포함하는 프로브).

II . 약어

aCGH : 어레이 비교 게놈 하이브리드화

BLAT : BLAST-유사 정렬 도구

bp : 염기 쌍(들)

CCND1 : 시클린 D1

CDK4 : 시클린-의존적 키나아제 4

CGH : 비교 게놈 하이브리드화

CISH : 발색 제자리 하이브리드화

EGFR : 상피 성장 인자 수용체

FISH : 형광 제자리 하이브리드화

IGF1R : 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체

ISH : 제자리 하이브리드화

MET : Met 전암 유전자 (또한 간세포 성장 인자 수용체로도 알려져 있음)

SISH : 은 제자리 하이브리드화

III . 용어

달리 나타내지 않는 한, 기술적 용어는 통상적인 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의는 Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X); Kendrew et al . (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); 및 George P. Redei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2nd Edition, 2003 (ISBN: 0-471-26821-6) 에서 발견할 수 있다.

용어 및 방법의 하기 설명은 본 개시물을 더 양호하게 설명하고 당업자가 본 개시물을 실행하는 것을 안내하기 위해 제공된다. 문맥에서 달리 명백히 나타내지 않는 한, 단수형 표현은 하나 이상의 것을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "세포를 포함하는" 은 단수 또는 복수 세포를 포함하며 어구 "하나 이상의 세포를 포함하는" 과 동등한 것으로 간주된다. 문맥에서 달리 명백히 나타내지 않는 한, 용어 "또는" 은 언급된 대체 요소의 단일 요소 또는 둘 이상의 요소의 조합을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "포함한다" 는 "함유한다" 를 의미한다. 따라서, "A 또는 B 를 포함하는" 은, 추가적인 요소를 배제함이 없이, "A, B, 또는 A 및 B 를 함유하는 (포함하는)" 을 의미한다.

본원에 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 언급된 GenBank 수탁 번호와 관련되는 모든 서열은, 2009 년 12 월 31 일에 제출된 바와 같이, 적용가능한 규칙 및/또는 법률에 의해 허용가능한 정도로, 그 전체가 참조로 포함된다

본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 개시된 기술을 실행하거나 시험하는데 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 물질, 방법 및 예는 단지 설명을 위한 것이며 제한하고자 의도되지 않는다.

본 개시물의 다양한 구현예의 편람을 촉진하기 위해서, 구체적 용어의 하기 설명을 제공한다:

어레이: 생물학적 거대분자 (예컨대 펩티드 또는 핵산 분자) 또는 생물학적 샘플 (예컨대 조직 박편) 과 같은 분자를 지정가능한 위치 또는 기질 내에 배치하는 것. "마이크로어레이" 는 평가 또는 분석을 위한 현미경 검사를 필요로 하거나 이에 의해 보조되도록 축소되는 어레이이다. 어레이는 때때로 칩 또는 바이오칩으로 지칭된다.

분자의 어레이 ("특성") 는 샘플에 대한 대단히 다수의 분석을 한번에 실행할 수 있게 한다. 특정 예의 어레이에서, 하나 이상의 분자 (예컨대 핵산 분자) 는 예를 들어 내부 대조군이 제공되도록 수 회 (예컨대 2 회) 어레이 상에 발생한다. 어레이 상 지정가능한 위치의 수는 다양할 수 있으며, 예를 들어 1 이상, 내지 2 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 300 이상, 500 이상, 550 이상, 600 이상, 800 이상, 1000 이상, 10,000 이상일 수 있다. 특정 예에서, 어레이는 핵산 분자, 예컨대 20 뉴클레오티드 이상의 길이, 예컨대 약 20-500 뉴클레오티드 길이인 핵산 분자를 포함한다. 특정 예에서, 어레이는 예를 들어 본원에 제공된 방법을 사용하여 게놈 표적 핵산을 다수의 분절로 분리시켜 생성된 핵산 분자를 포함한다.

어레이 내에서, 각각의 어레이화된 샘플은 지정가능하며, 이의 위치는 어레이의 2 차원 이상 내에서 안정적이고 일관적으로 결정될 수 있다. 어레이 상의 특성 적용 위치는 상이한 형상을 취할 수 있다. 예를 들어, 어레이는 규칙적 (예컨대 균일한 행 및 열로 배열된) 이거나 불규칙적일 수 있다. 따라서, 순서화된 어레이에서 각 샘플의 위치는 이것이 어레이에 적용될 때 샘플에 할당되며, 각각의 위치를 적절한 표적 또는 특성 위치와 상관관계시키기 위해 키 (key) 가 제공될 수 있다. 종종, 순서화된 어레이는 대칭 격자 패턴으로 배열되나, 샘플은 다른 패턴으로도 배열될 수 있다 (예컨대 방사형 분포선, 나선형 선, 또는 정돈된 클러스터). 지정가능한 어레이는 통상 컴퓨터 판독가능한데, 컴퓨터는 어레이 상의 특정 어드레스를 상기 위치에서의 샘플에 대한 정보 (예컨대 하이브리드화 또는 결합 데이터, 예를 들어 신호 세기 포함) 와 상관관계시키도록 프로그래밍될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 포맷의 일부 예에서, 어레이에서의 개별적인 특성은 규칙적으로, 예를 들어 컴퓨터에 의한 어드레스 정보와 상관관계될 수 있는 카티션 (Cartesian) 격자 패턴으로 배열된다.

일부 예에서, 어레이는 양성 대조군, 음성 대조군 또는 둘 모두 (예를 들어 알려져 있는 반복 요소에 대해 특이적인 핵산 분자 또는 관련되지 않은 게놈 또는 유기체에 대해 특이적인 핵산 분자) 를 포함한다. 한 예에서, 어레이는 1 내지 100 개의 대조군, 예컨대 1 내지 60 개 또는 1 내지 20 개의 대조군을 포함한다.

결합 또는 안정한 결합: 2 개 물질 또는 분자 사이의 결합, 예컨대 1 개의 핵산 분자 (예를 들어 결합 부위) 의 또다른 것 (또는 그 자체) (예를 들어, 표적 핵산 분자) 에 대한 하이브리드화. 핵산 분자 (예컨대 결합 부위) 는 충분량의 핵산 분자가 염기 쌍을 형성하거나 이의 표적 핵산 분자에 대해 하이브리드화되어 상기 결합을 검출할 수 있게 하는 경우 표적 핵산 분자에 결합하거나 안정적으로 결합한다.

결합은 당업자에게 알려져 있는 임의의 절차에 의해, 예컨대 표적:결합 부위 복합체의 물리적 또는 기능적 특성에 의해 검출될 수 있다. 핵산 분자의 상보적 가닥의 결합을 검출하는 물리적 방법은 예를 들어 DNase I 또는 화학적 풋프린팅 (footprinting), 겔 이동 및 친화성 분열 검정, 노던 블롯팅, 도트 블롯팅 및 광 흡수 검출 절차와 같은 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또다른 예에서, 상기 방법은 하나 또는 둘 모두의 핵산 분자에 존재하는 검출가능한 표지 (예를 들어 결합 부위와 관련되는 표지) 와 같은 신호를 검출하는 것을 포함한다.

결합 부위: 표적 핵산 분자의 분절 또는 일부 (예를 들어, 20 bp 이상, 예컨대 약 20-500 bp, 또는 약 100 bp) 로서, 표적 분자에 대해 유일 특이적임. 결합 부위의 핵산 서열 및 이의 상응하는 표적 핵산 분자는 충분한 핵산 서열 상보성을 가져, 상기 두 가지가 적절한 하이브리드화 조건 하에 인큐베이션되는 경우 2 개 분자가 하이브리드화되어 검출가능한 복합체를 형성한다. 표적 핵산 분자는 다수의 상이한 결합 부위, 예컨대 10 개 이상, 50 개 이상, 100 개 이상, 1000 개 이상, 1500 개 이상의 고유한 결합 부위를 함유할 수 있다. 특정 예에서, 결합 부위는 대략 20 내지 500 bp 길이이다. 표적 핵산 서열로부터 결합 부위를 수득하는 경우, 표적 서열은 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 선천적 형태, 또는 클로닝된 형태 (예를 들어 벡터 내에서) 로 수득될 수 있다.

상보성: 핵산 분자는, 예를 들어 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 호그스텐 (Hoogsteen) 또는 역 호그스텐 염기 쌍을 형성시킴으로써, 가닥이 서로 결합 (하이브리드화) 할 때 두 분자가 충분한 수의 상보적 뉴클레오티드를 공유하여 안정한 2중체 또는 3중체를 형성하는 경우, 또다른 핵산 분자와 상보적이라고 일컬어진다. 필요한 조건 하에 핵산 분자 (예를 들어 유일 특이적 핵산 분자) 가 표적 핵산 (예를 들어 게놈 표적 핵산) 에 검출가능하게 결합한 채로 남아 있는 경우, 안정한 결합이 발생한다.

상보성은 한 핵산 분자 (예를 들어 프로브 핵산 분자) 에서의 염기에 대한 제 2 핵산 분자 (예를 들어 게놈 표적 핵산 분자) 에서의 염기와의 염기 쌍 정도이다. 상보성은 %, 즉, 2 개 분자 사이 또는 2 개 분자의 특정 부위 또는 도메인 내에 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드의 비율에 의해 편리하게 설명된다. 예를 들어, 프로브 핵산 분자의 15 개 인접 뉴클레오티드 부위의 10 개 뉴클레오티드가 표적 핵산 분자와 염기 쌍을 형성한다면, 프로브 핵산 분자의 상기 부위는 표적 핵산 분자에 대해 66.67% 상보성을 갖는 것으로 일컬어진다.

본 개시물에서, "충분한 상보성" 은 1 개의 핵산 분자 또는 이의 부위 (예컨대 고유 특이적 결합 부위) 및 표적 핵산 서열 (예를 들어 게놈 표적 핵산 서열) 사이에 존재하는, 검출가능한 결합을 얻기에 충분한 염기 쌍의 수를 의미한다. 결합 조건을 확립하는데 있어서 포함되는 정성 및 정량적 고려사항의 철저한 처리가 Beltz et al . Methods Enzymol . 100:266-285, 1983, 및 Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 에 의해 제공된다.

컴퓨터 실행 알고리즘: 사용자의 명령에 따라 컴퓨터 장치에 의해 수행되거나 실행되는 알고리즘 또는 프로그램 (컴퓨터 판독가능 매체 내의 실행가능 코드 집합). 본 개시물의 문맥에 있어서, 컴퓨터 실행 알고리즘은 특정한 특징을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열의 선택을 촉진 (예를 들어 자동화) 하는데 사용될 수 있다 (예컨대 표적 핵산 서열의 유일 특이적 핵산 서열의 확인). 통상, 사용자는 서열 데이터베이스에 접근할 수 있는 컴퓨터에 명령어를 입력하고 하나 이상의 선택 기준을 설정함으로써 알고리즘의 실행을 개시한다. 서열 데이터베이스는 컴퓨터의 저장 매체 내에 포함될 수 있거나, 인트라넷 또는 인터넷을 통해 인근 또는 먼 위치에서 컴퓨터와 저장 매체 사이의 연결을 통해 원격으로 저장되고 접근될 수 있다. 알고리즘의 개시 후, 알고리즘 또는 프로그램은 예를 들어 표적 핵산의 하나 이상의 분절을 표적 핵산 분자를 포함하는 게놈과 비교하기 위해 컴퓨터에 의해 실행된다. 가장 통상적으로는, 비교 결과를 이후 나타내거나 (예를 들어 스크린 상에), 출력한다 (예를 들어 프린트 형태로 또는 컴퓨터 판독가능한 매체 상에).

검출가능한 표지: 분자의 검출을 촉진하기 위해 또다른 분자 (예컨대 유일 특이적 핵산 분자) 에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이션되는 화합물 또는 조성물. 표지의 구체적, 비-제한적 예는 형광 및 형광생성 부분, 발색 부분, 합텐, 친화성 태그 및 방사성 동위원소를 포함한다. 표지는 직접적으로 검출가능하거나 (예를 들어 광학적으로 검출가능) 간접적으로 검출가능하다 (예를 들어 그 다음에 검출가능한 하나 이상의 추가적인 분자와의 상호작용을 통해). 본원에 개시된 프로브의 문맥에 있어서의 예시적 표지를 하기에 기재한다. 핵산을 표지하는 방법, 다양한 목적에 유용한 표지의 선택에 있어서의 안내는 예를 들어 Sambrook and Russell, in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3^rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 및 Ausubel et al ., in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987, 업데이트 포함) 에서 토의된다.

DNA 블로킹 시약: 샘플 내 비-표적 핵산 (예를 들어 반복 핵산 서열) 에 대한 핵산 프로브의 결합 (예를 들어 하이브리드화) 을 감소시키기 위해 하이브리드화 반응에 포함되는 게놈 DNA (예컨대 인간 게놈 DNA, 예를 들어 인간 태반 DNA) 의 제조물. 일부 예에서, 블로킹 시약은 미표지된 반복 DNA, 예를 들어, Cot-1^TM DNA 이다. 블로킹 DNA 는 담체 DNA (예컨대 연어 정자 DNA 또는 청어 정자 DNA) 와 구별되는데, 이는 비-핵산 성분 (예를 들어, 튜브, 슬라이드, 멤브레인, 단백질, 또는 프로브가 실험적 취급 동안 접촉하는 기타 비-핵산 성분) 에 대한 프로브의 비-특이적 결합을 감소시키기 위해 하이브리드화 반응에 포함된다.

게놈: 유기체의 총 유전적 구성성분. 진핵세포 유기체의 경우, 게놈은 세포 염색체의 반수체 집합물 내에 함유된다. 유기체의 게놈은 또한 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA 와 같은 비-염색체 DNA 를 포함한다. 특정 예에서, 게놈은 포유동물 게놈 (예를 들어, 인간 게놈) 이다.

하이브리드화 : DNA 와 RNA 사이, 또는 DNA, RNA 의 2 개 가닥의 상보성 부위 사이에 염기 쌍을 형성함으로써 2중체 분자를 형성하기 위한 것. 특정 엄격도 정도를 야기하는 하이브리드화 조건은 하이브리드화 방법 및 조성물의 성질 및 하이브리드화하는 핵산 서열의 길이에 가변적으로 의존적일 것이다. 일반적으로, 하이브리드화 온도 및 하이브리드화 완충제의 이온 강도 (예컨대 Na⁺ 농도) 가 하이브리드화 엄격도를 결정할 것이다. 하이브리드화 완충제 내의 하이브리드화를 감소시키는 화학 물질 (예컨대 포름아미드) 의 존재가 또한 엄격도를 결정할 것이다 (Sadhu et al ., J. Biosci . 6:817-821, 1984). 특정 정도의 엄격도를 획득하기 위한 하이브리드화 조건에 관한 계산은 Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (제 9 장 및 제 11 장) 에서 토의된다. ISH 에 대한 하이브리드화 조건은 또한 Landegent et al ., Hum . Genet . 77:366-370, 1987; Lichter et al ., Hum . Genet . 80:224-234, 1988; 및 Pinkel et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:9138-9142, 1988 에서 토의된다.

단리된: 유기체의 세포, 또는 유기체 자체에서의 다른 생물학적 성분 (상기 성분은 자연적으로 발생함, 예컨대 기타 염색체 및 과잉 염색체 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포) 으로부터 실제적으로 분리되거나 정제된 "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 분자, 단백질 또는 세포). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 분자 및 단백질 뿐 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다.

연결된 또는 연결되는: 물리적으로 이어지거나 연합됨. 특정 예에서, 본원에서 기재된 결합 부위 (예컨대 유일 특이적 결합 부위) 는 함께 연결되거나 연합되어 유일 특이적 프로브가 제조된다. 통상, 결합 부위는 라이게이션 반응에서 리가아제에 의해 효소적으로 연결된다. 그러나, 결합 부위는 또한 화학적으로, 예를 들어 적절한 변형된 뉴클레오티드를 혼입하거나 (Dolinnaya et al ., Nucleic Acids Res . 16:3721-38, 1988; Mattes and Seitz, Chem .. Commun . 2050-2051, 2001; Mattes and Seitz, Agnew. Chem . Int . 40:3178-81, 2001; Ficht et al ., J. Am . Chem . Soc . 126:9970-81, 2004 에서 기재된 바와 같음), 결합 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성함으로써 연결될 수 있다. 대안적으로, 재조합효소를 사용하여, 또는 증폭 반응에서 2 개의 결합 부위가 연결될 수 있다.

핵산: 달리 제한하지 않는 한, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 핵산에 대해 하이브리드화하는 자연적 뉴클레오티드의 유사체를 포함하는, 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체. 용어 "뉴클레오티드" 는 펩티드 핵산 (PNA) 에서와 같이 당 (예컨대 리보오스, 데옥시리보오스 또는 이의 합성 유사체) 에 연합된 염기 (예컨대 피리미딘, 퓨린 또는 이의 합성 유사체) 를 포함하는 단량체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 중의 하나의 단량체이다. 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드에서의 염기 서열을 지칭한다.

핵산 "분절" 은 표적 핵산 분자의 하위부분 또는 하위서열이다. 핵산 분절은 다양한 방법으로 표적 핵산 분자로부터 이론적으로 또는 실제로 유래될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 분자의 분절 (예컨대 게놈 표적 핵산 분자) 은 제한 단편인 핵산 분절이 생성되도록 하나 이상의 제한 효소로 소화시킴으로써 수득될 수 있다. 핵산 분절은 또한 증폭, 하이브리드화 (예를 들어, 감수 하이브리드화), 인공적 합성, 또는 표적 핵산 분자에 대한 서열에 상응하는 하나 이상의 핵산을 제조하는 임의의 기타 절차에 의해 표적 핵산 분자로부터 생성될 수 있다. 핵산 분절은 또한 가상환경에서, 예를 들어 컴퓨터 실행 알고리즘을 사용하여 생성될 수 있다. 핵산 분절의 특정 예는 결합 부위이다.

프로브 : 표적물과 하이브리드화하는 경우, 표적 핵산 분자 (예를 들어, 게놈 표적 핵산 분자) 와 하이브리드화할 수 있으며, 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있는 핵산 분자. 따라서, 프로브는 표적 핵산 분자의 검출, 및 일부 예에서는 정량화를 가능하게 한다. 특정 예에서, 프로브는 2 개 이상의 결합 부위, 예컨대 표적 핵산 분자의 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 2 개 이상의 결합 부위를 포함함으로써, 일부 이상의 표적 핵산 분자에 대해 특이적으로 하이브리드화할 수 있다. 일반적으로, 하나 이상의 결합 부위 또는 결합 부위 일부가 표적 핵산 분자에 대해 하이브리드화되고 나면 (및 하이브리드화한 채로 남아 있으면), 프로브의 다른 부위는 이들 다른 부위의 표적 내 관련 결합 위치 (예를 들어, 이러한 다른 위치는 그의 관련 결합 위치로부터 지나치게 멀리 떨어져 있음) 에 대해 하이브리드화되는 것으로부터 물리적으로 제약될 수 있으나 (제약될 필요는 없음); 프로브에 존재하는 다른 핵산 분자는 서로 결합할 수 있어, 프로브로부터의 신호를 증폭시킨다. 프로브는 "표지된 핵산 프로브" 로서 지칭될 수 있는데, 이는 상기 프로브가 프로브를 검출가능하게 하는 "표지" 또는 검출가능한 부분에 직접 또는 간접적으로 결합되는 것을 나타낸다.

반복물 -미함유 서열: 적절한 양의 반복 핵산 (예를 들어 DNA) 서열 또는 "반복물" 을 포함하지 않는 핵산. 그러나 일부 예에서 "반복물-미함유" 서열은, 게놈의 여러 부위에 대해 상동성 또는 서열 동일성을 갖거나 반복 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 여전히 포함할 수 있다. 반복 핵산 서열은 종종 탠덤 어레이에서 수 회 반복되는 일련의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 내 핵산 서열이다 (예컨대 게놈, 예를 들어 포유동물 게놈). 반복 핵산 서열은 2 내지 다수의 카피 범위의 여러 카피로 핵산 서열 (예를 들어 포유동물 게놈) 내에서 발생할 수 있으며, 게놈 전체에 걸쳐 하나 이상의 염색체 상에 덩어리화되거나 배치될 수 있다. 일부 예에서, 프로브 내 유의한 반복 핵산 서열의 존재는 배경 신호를 증가시킬 수 있다. 반복 핵산 서열은 예를 들어 인간에서, 말단소체 반복물, 하위말단소체 (subtelomeric) 반복물, 부수체 반복물, 미소부수체 반복물, Alu 반복물, L1 반복물, 알파 위성 DNA 및 위성 1, H 및 III 반복물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

샘플: 대상으로부터 수득한, DNA (예를 들어, 게놈 DNA), RNA (mRNA 포함), 단백질, 또는 이의 조합을 함유하는 생물학적 표본. 이의 예는 염색체 제조물, 말초 혈액, 소변, 타액, 조직 생검, 수술 표본, 골수, 양수천자 샘플 및 부검 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 예에서, 샘플은 게놈 DNA 를 포함한다. 일부 예에서, 샘플은 예를 들어 현미경 슬라이드 상에 위치할 수 있는 세포 유전학적 제조물이다. 특정 예에서, 샘플은 직접 사용되거나, 사용 전, 예를 들어 고정 (예를 들어 포르말린을 사용하여) 에 의해 조작될 수 있다.

서열 동일성: 둘 이상의 핵산 서열 사이의 동일성 (또는 유사성) 을 서열 사이의 동일성 또는 유사성의 면에 있어서 표현한다. 서열 동일성은 동일성 % 의 면에 있어서 측정될 수 있으며; % 가 높을수록 서열이 보다 더 동일하다. 서열 동일성은 유사성 % 의 면에 있어서 측정될 수 있으며 (보존적 아미노산 치환을 고려함); % 가 높을수록 서열이 보다 더 유사하다.

비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 하기에 기재되어 있다: Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al ., Nuc . Acids Res . 16:10881-90, 1988; Huang et al . Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al., Meth . Mol . Bio . 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10, 1990 은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항을 제시한다.

NCBI 기본 국지적 정렬 탐색 도구 (NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)) (Altschul et al ., J. Mol . Biol . 215:403-10, 1990) 는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx 과 연결하여 사용하기 위해, 생물정보센터 (National Center for Biotechnology (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)) 를 포함하는 여러 공급원으로부터, 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 추가적인 정보는 NCBI 웹 사이트에서 발견될 수 있다.

BLASTN 은 핵산 서열을 비교하는데 사용될 수 있는 한편, BLASTP 는 아미노산 서열을 비교하는데 사용될 수 있다. 2 개의 비교된 서열이 상동성을 공유하는 경우, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열로서 상동성의 이들 부위에 존재할 것이다. 2 개의 비교된 서열이 상동성을 공유하지 않는 경우, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열에 존재하지 않을 것이다.

BLAST-유사 정렬 도구 (BLAT) 가 또한 핵산 서열을 비교하는데 사용될 수 있다 (Kent, Genome Res . 12:656-664, 2002). BLAT 은 Kent Informatics (Santa Cruz, CA) 를 포함하는 여러 공급원으로부터, 및 인터넷 상에서 이용가능하다 (genome.ucsc.edu).

정렬되고 나면, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 계수하여 매치 수를 측정한다. 서열 동일성 % 는 매치 수를 확인된 서열에 제시된 서열의 길이, 또는 분명히 표현된 길이 (예컨대 확인된 서열에 제시된 서열로부터의 100 개 연속 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기) 로 나눈 후 생성된 값을 100 으로 곱하여 측정된다. 예를 들어, 1554 개 뉴클레오티드를 갖는 시험 서열로 정렬되는 경우 1166 매치를 갖는 핵산 서열은 시험 서열에 대해 75.0 % 동일하다 (1166÷1554*100=75.0). 서열 동일성 % 값은 10 의 자리로 반올림된다. 예를 들어, 75.11, 75.12, 75.13 및 75.14 는 75.1 로 버림이 되는 한편, 75.15, 75.16, 75.17, 75.18 및 75.19 는 75.2 로 올림된다. 길이 값은 항상 정수일 것이다. 또다른 예에서, 하기와 같이 확인된 서열로부터의 15 개 연속 뉴클레오티드로 정렬되는 20 개-뉴클레오티드 부위를 함유하는 표적 서열은 확인된 서열에 대해 75% 의 서열 동일성을 공유하는 부위를 함유한다 (즉, 15÷20*100=75).

대상: 인간 및 비-인간 포유동물 (예를 들어 가축 대상) 과 같은 임의의 다세포성 척추동물 유기체.

표적 핵산 서열 또는 분자: 핵산 분자의 정의된 부위 또는 특정 부분, 예를 들어 게놈 부분 (예컨대 관심 유전자를 함유하는 포유동물 게놈 DNA 의 부위 또는 유전자). 표적 핵산 서열이 표적 게놈 서열인 예에서, 이러한 표적은 예를 들어 염색체 상의 특정 위치를 참조로 하여; 유전자 지도 상에서의 이의 위치를 참조로 하여; 이론적 또는 결집된 콘틱 (contig) 을 참조로 하여; 이의 특이적 서열 또는 기능에 의해; 이의 유전자 또는 단백질 명칭에 의해; 또는 게놈의 다른 유전적 서열 중에서 이를 유일하게 확인시키는 임의의 다른 수단에 의해 세포유전학적 명명법에 따라, 염색체 상의 이의 위치 (예를 들어 정상 세포에서) 에 의해 정의될 수 있다. 일부 예에서, 표적 핵산 서열은 포유동물 게놈 서열이다 (예를 들어 인간 게놈 서열).

일부 예에서, 표적 핵산 서열의 변경물 (예를 들어, 게놈 핵산 서열) 은 질환 또는 병상과 "관련된다". 즉, 표적 핵산 서열의 검출은 질환 또는 병상에 대한 샘플의 상황을 추론하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 서열은 2 가지 (또는 그 이상) 의 구별가능한 형태로 존재할 수 있는데, 제 1 형태는 질환 또는 병상의 부재와 상관관계가 있으며, 제 2 (또는 상이한) 형태는 질환 또는 병상의 존재와 상관관계가 있다. 2 가지 상이한 형태는 예컨대 폴리뉴클레오티드 다형성에 의해 정성적으로 구별가능할 수 있고/있거나, 2 가지 상이한 형태는 예컨대 세포 내에 존재하는 표적 핵산 서열의 카피 수에 의해 정량적으로 구별가능할 수 있다.

유일 특이적 서열: 유기체의 게놈 내에 단 1 회 존재하는 임의 길이의 핵산 서열. 특정 예에서, 유일 특이적 핵산 서열은 표적 핵산과 100% 서열 동일성을 가지며 표적 핵산을 포함하는 특정 게놈 내에 존재하는 임의의 다른 핵산 서열과 유의한 동일성을 갖지 않는 표적 핵산으로부터의 핵산 서열이다. 일부 예에서, 유일 특이적 핵산 서열은 컴퓨터-실행 알고리즘, 예를 들어 BLAT 을 사용하여 확인될 수 있다. 다른 예에서, 유일 특이적 핵산 서열은 예를 들어 어레이 상 핵산 서열에 대한 하이브리드화를 사용하여 경험적으로 확인될 수 있다.

벡터: 벡터에 대해 선천적이 아닌 다른 ("외래") 핵산 서열에 대한 담체로서 역할하는 임의의 핵산. 적절한 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 벡터는 스스로 (및, 그로 인해 외래 핵산 서열을) 복제할 수 있거나, 일부 이상의 외래 핵산 서열을 발현할 수 있다. 한 문맥에서 벡터는, 표준 재조합 핵산 기술을 사용하는 조작 (예를 들어, 제한 소화) 및/또는 복제 (예를 들어, 생성) 의 목적을 위해 관심 핵산 서열이 도입되는 선형 또는 환형 핵산이다. 벡터는 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선별가능 마커 유전자 및 당업계에 알려져 있는 기타 유전적 요소를 포함할 수 있다. 통상의 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 (예를 들어 BAC, PAC, HAC, YAC) 및 하이브리드 (벡터의 이들 유형 중 하나 초과의 특성을 혼입함) 를 포함한다. 전형적으로, 벡터는 하나 이상의 고유한 제한 위치 (및 일부 경우 다수-클로닝 위치) 를 포함하여 표적 핵산 서열의 삽입을 촉진시킨다.

본원에서 토의된 한 예에서, 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 둘 이상의 결합 부위를 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 인공 염색체 (예를 들어, 효모 인공 염색체, P1 기재 인공 염색체, 박테리아 인공 염색체 (BAC)) 내에 도입하고 복제한다.

IV . 유일 특이적 프로브 제조 방법

표적 핵산 분자의 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 결합 부위를 포함하는 핵산 프로브의 제조 방법이 본원에 개시된다. 특정 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 사전결정된 순서 및 배향으로 연결시키는 것을 포함하며, 상기 결합 부위는 유일 특이적 핵산 서열 (예를 들어, 유기체의 게놈 내에 단 1 회 나타나는 서열) 에 대해 상보적이고 상기 결합 부위는 약 20% 이하의 게놈 표적 핵산 분자를 포함한다.

한 예에서, 2 개 이상의 유일 특이적 결합 부위 (예컨대 적어도 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 1800, 2000, 2500, 3000 개 이상의 결합 부위) 가 핵산 프로브에 포함된다. 특정 예에서, 약 200 내지 3000 개 (예컨대 약 300 내지 600 개, 약 350 내지 550 개, 약 500 내지 600 개, 또는 약 500 내지 3000 개, 약 500 내지 2000 개, 또는 약 2000 내지 3000 개) 의 유일 특이적 결합 부위가 핵산 프로브에 포함된다.

본원에 개시된 방법은 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 2 개 이상의 결합 부위를 포함하는 핵산 프로브의 생성을 제공한다. 많은 유기체 (예를 들어, 진핵세포 게놈, 예컨대 포유류, 예를 들어 인간) 의 게놈은 비-유일 특이적 핵산 서열 (예를 들어, 반복 서열 또는 게놈 내에 1 회 초과로 나타나는 서열) 로 이루어진다. 예를 들어, 반복 서열로 이루어지는 포유동물 게놈의 비율은 대략 40-50% 인 것으로 추정된다 (예를 들어, Lander et al ., Nature 409:860-921, 2001). 따라서, 유일 특이적인 게놈 표적 핵산 분자의 비율은 표적 핵산 분자의 단지 일부일 것이다. 게놈, 예를 들어 인간 게놈 내에 지역적 차이가 또한 존재한다. 예를 들어, 지역적 차이는 동원체 DNA, 말단소체 DNA 등 사이의 차이를 포함한다. 일부 예에서, 프로브에 대해 선택된 결합 부위는 비-인접하고/하거나 게놈 표적 핵산 분자 전체에 걸쳐 분포된다. 특정 예에서, 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 결합 부위는 약 20% 미만 (예컨대, 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만) 의 게놈 표적 핵산 분자를 나타낸다. 예를 들어, 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 결합 부위는 약 1-20% (예컨대 약 15-20%, 약 10-15%, 약 2-8%, 약 3-6%, 또는 약 2-3%) 의 게놈 표적 핵산 분자를 나타낼 수 있다.

A. 유일 특이적 서열의 확인

개시된 방법은 표적 핵산에 대해 유일 특이적인 2 개 이상의 핵산 분절을 확인하는 것을 포함한다. 유일 특이적 핵산 서열은 표적 핵산이 존재하거나 이로부터 표적 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 내에 단 1 회 존재하는 20 bp 이상 (예컨대 적어도 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp 이상) 의 핵산 서열이다. 예를 들어, 유일 특이적 핵산 서열은, 표적 핵산의 부위와 100% 서열 동일성을 가지며 표적 핵산 분자를 포함하는 게놈 내의 임의의 다른 핵산 서열과 유의한 동일성을 갖지 않는 표적 핵산의 부위로부터의 핵산 서열일 수 있다.

특정 예에서, 관심 게놈 표적 핵산 분자 (예컨대 하기 섹션 V 에서 토의된 것들 중 하나 이상) 가 선택된다. 게놈 표적 핵산의 핵산 서열이, 예를 들어 가상환경 방법 (예컨대 데이터베이스로부터) 또는 직접 서열분석에 의해 수득된다. 일부 예에서, 게놈 표적 핵산 (예를 들어, 진핵세포 유전자 표적) 은 적어도 약 10,000 bp, 예컨대 적어도 약 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 100,000, 250,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 3,000,000, 4,000,000 bp 이상 (예컨대 전체 염색체 또는 심지어는 전체 게놈) 을 포함한다.

게놈 표적 서열의 선택 후, 반복 서열을 임의로 검출하고 서열로부터 제거한다. 일부 예에서, 대부분 또는 실제적으로는 모든 반복 핵산 서열 (예를 들어, 실제적으로는 특정 게놈에 대한 모든 알려져 있는 반복물 서열) 을 확인하고 서열로부터 제거한다. 예를 들어, 반복 서열 (예컨대 말단소체 반복물, 하위말단소체 반복물, 부수체 반복물, 미소부수체 반복물, Alu 반복물, L1 반복물, 알파 위성 DNA 및 위성 1, H 및 III 반복물) 은 컴퓨터 실행 알고리즘을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 알고리즘은 당업계에 알려져 있으며 RepeatMasker (repeatmasker.org 에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능) 및 CENSOR (Kohany et al., BMC Bioinformatics 7:474, 2006; girinst.org/censor/index.php 에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능) 와 같은 소프트웨어 적용물을 포함한다. 특정 예에서, RepeatMasker 는 반복 서열을 확인하는데 사용된다. 반복 서열이 확인되고 나면, 이는 게놈 표적 핵산 서열로부터 제거되거나 "차폐" 된다 (예를 들어, 반복 서열은 비-뉴클레오티드 부호, 예컨대 "N" 또는 차폐되는 연속 염기 쌍의 수를 나타내는 수로 대체될 수 있다). 반복 핵산 서열을 확인하기 위한 일부 컴퓨터 알고리즘 또한 반복 서열을 "차폐" 한다 (예를 들어, RepeatMasker 및 CENSOR). 이는 실제적으로 반복물-미함유 게놈 표적 핵산 서열을 생성한다.

DNA 프로브에 대한 서열 선택의 자동화를 촉진하기 위해서, 한 예에서는, 선택된 게놈 표적 핵산 서열 (예컨대 실제적으로 반복물-미함유 게놈 표적 핵산 서열) 을 나열하고 (번호 매기고) 가상환경에서 분절, 예컨대 약 20-500 bp (예를 들어, 약 50-250 bp, 약 75-250 bp, 약 100-200 bp, 약 250-500 bp, 또는 약 35-50 bp) 의 분절로 분리한다. 특정 예에서, 분절은 각각 약 100 bp 이다. 게놈 표적 핵산 서열은 나열되고, 비-중복성, 연속 분절 또는 중복성, 연속 분절 (예를 들어, 1 이상의 염기 쌍, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50 이상의 bp 로 중복됨) 로 분리될 수 있다. 한 예에서, 게놈 표적 핵산 서열은 연속 비-중복성 100 염기 쌍 분절 (예를 들어, 게놈 표적 핵산 서열의 염기 1-100, 101-200, 201-300 등) 로 분리된다. 또다른 예에서, 게놈 표적 핵산 서열은 1 이상의 염기 쌍으로 중복되는 연속 100 염기 쌍 분절 (예컨대 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80 염기 쌍 등의 중복), 예를 들어 게놈 표적 핵산 서열의 염기 1-100, 2-101, 3-102, 4-103 등; 또는 게놈 표적 핵산 서열의 염기 1-100, 5-105, 10-110 등; 또는 게놈 표적 핵산 서열의 염기 1-100, 10-110, 20-120 등으로 분리된다. 특정 예에서, 게놈 표적 핵산 서열은 10 이상의 염기 쌍으로 중복되는 연속 100 염기 쌍 분절로 분리된다 (예컨대 게놈 표적 핵산 서열의 염기 1-100, 10-110, 20-120, 30-130 등).

당업자는 예를 들어 표적 서열의 크기 또는 표적 내에 존재하는 비-반복 및/또는 고유 서열의 양을 기준으로 하여, 개시된 방법에서 사용되는 서열 중복물의 양을 선택할 수 있다. 일부 예에서, 표적 서열이 상대적으로 작거나 높은 수의 반복 서열을 포함하는 경우, 큰 중복물을 이용하는 것이 필요할 수 있다 (예를 들어, 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 또는 90 염기 쌍으로 중복되는 100 bp 분절). 다른 예에서, 표적 서열이 상대적으로 크거나 적은 수의 반복 서열을 함유하는 경우, 작은 중복물 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 염기 쌍으로 중복되는 100 bp 분절) 이 이용될 수 있거나 중복물이 이용되지 않을 수 있다. 일부 예에서, 게놈 표적 부위로부터의 유일 특이적 서열의 선택된 수가 특정 중복물로 수득되지 않는 경우, 중복물 양은 게놈 표적 부위로부터의 유일 특이적 서열의 원하는 수가 수득될 때까지 증가된다.

다른 예에서, 서열의 나열 및 분리는 컴퓨터 실행 알고리즘을 사용하여 실행된다 (예를 들어, 마크로-임배디드 워드 프로세싱 파일 (macro-embedded word processing file)). 한 예에서, MATLAB

프로그래밍 언어 (버전 7.9.0.529 (R2009b); The MathWorks, Inc., Natick, MA) 가, 1 이상의 염기 쌍 (예컨대 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50 이상의 염기 쌍) 으로 타일링되는 (중복) 다수의 100 bp 분절을 확인하기 위해 알고리즘을 개발하는데 사용된다. 또다른 예에서, 서열의 나열 및 분리는 슬라이딩 윈도우 리딩 프레임을 사용하여 실행되는데, 여기서는 선택된 길이 (예컨대 20-500 bp) 의 모든 가능한 서열을 임의의 주어진 표적 핵산 서열에 대해 분석한다.

일부 예에서, 핵산 분절은 약 100 bp 이다. 예를 들어, 약 20-500 bp 의 분절을 개시된 방법에 대해 사용할 수 있다. 프로브 표지를 위해 통상 사용되는 방법은 (예컨대 틈 번역) 대략 100-500 bp 의 표지된 단편을 야기한다. 따라서, 약 500 bp 초과의 유일 특이적 분절을 갖는 것은 프로브 신호 강도를 향상시키지 않을 수 있다. 또한, 표지된 프로브 단편이 일반적으로 유일 특이적 핵산 서열보다 길기 때문에, 각각의 표지된 단편은 표적 핵산 서열의 다수 비-연속 부위를 함유할 수 있다. 이는 프로브 단편이 스캐폴드 (scaffold) 를 형성하게 함으로써 프로브의 신호 강도를 증가시킨다. 약 20-500 bp 의 유일 특이적 분절은 또한 프로브가 큰 표적 핵산 서열에 걸쳐 퍼지게 한다. 일부 예에서, 선택된 유일 특이적 분절은 게놈 표적 핵산에서 적어도 약 100 bp 내지 약 70,000 bp (예컨대 적어도 약 200-50,000 bp, 약 500-25,000 bp, 약 1000-10,000 bp, 또는 약 500-5000 bp) 에 의해 분리된다. 특정 예에서, 선택된 유일 특이적 분절은 비-인접하며, 예를 들어 게놈 표적 핵산에서 약 1500-2500 bp 에 의해 분리된다.

선택된 게놈 표적 핵산 서열의 분절은 임의로는 G/C 뉴클레오티드 함량 (예를 들어, 구아닌 또는 시토신인 핵산 서열 내 염기 %) 에 대해 스크리닝된다. 일부 예에서, 프로브에 포함되는 선택된 분절은 유사한 하이브리드화 조건 하에 게놈 표적 핵산에 대해 하이브리드화된다. 보다 동질한 프로브 단편-표적 하이브리드화를 잠재적으로 유지시키는 것에 추가로, 65% 미만의 프로브 G/C 함량은 DNA 의 화학적 합성을 촉진시킬 수 있다. 그러므로, 약 65% 초과 또는 약 30% 미만 (예컨대 약 70% 또는 80% 초과 또는 약 30% 미만, 예컨대 약 20% 또는 15% 미만) 의 G/C 뉴클레오티드 함량을 갖는 분절이 제거될 수 있다. 서열의 G/C 뉴클레오티드 함량을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 예에서, G/C 함량은 식 [(G + C)/(A + T + G + C)] x 100 을 사용하여 계산될 수 있다. 다른 예에서, G/C 함량을 측정하기 위한 방법은 컴퓨터 실행 알고리즘, 예컨대 OligoCalc (Kibbe, Nucl . Acids Res . 35:W43-46, 2007; basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html 에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능) 또는 마크로-임배디드 스프레드시트 파일을 포함한다. 또다른 예에서, MATLAB

프로그래밍 언어를 사용하여 서열의 G/C 함량% 를 분석할 수 있다.

선택된 게놈 표적 핵산 서열의 분절은 임의로는 엔도뉴클레아제 제한 위치 (예컨대 유형 II 제한 위치, 예를 들어, AscI/PacI, BbsI, BsmBI, BsaI, BtgZI, AarI 및 SapI) 에 대해 스크리닝된다. 이러한 서열의 존재는 유전자 합성 및/또는 이후의 서브클로닝을 어렵게 할 수 있고, 이러한 서열을 제거하는 것은 광범위한 DNA 클로닝 선택사항을 생성시킨다. 그러므로 일부 예에서, AscI/PacI, BbsI, BsmBI, BsaI, BtgZI, AarI 및 SapI 에서 선택되는 하나 이상의 유형 II 제한 위치를 포함하는 분절이 제거된다. 제한 위치의 존재를 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 예에서, 제한 효소 위치를 확인하는 방법은 컴퓨터 실행 알고리즘, 예컨대 NEBcutter (New England BioLabs, Ipswich, MA; tools.neb.com/NEBcutter2/index.php 에서 인터넷 상에서 이용가능) 또는 Sequencher

(Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI) 를 포함한다. 다른 예에서, 제한 위치를 확인하는 방법은 MATLAB

프로그래밍 언어 및 소프트웨어를 이용한다.

숙련된 기술자는 프로브가 이전에 알려져 있는 방법을 사용하여 제조된 프로브 (예컨대 "반복물-미함유" 프로브) 또는 본 개시물의 유일 특이적 프로브임에 관계없이, 프로브와 표적 서열 사이의 하이브리드화가 많은 인자에 의존적이라는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 핵산 프로브와 이의 표적 서열 사이의 상동성은, 개별적인 적용에 따라 가변적일 수 있는 하이브리드화 조건에서와 같이, 하이브리드화 속도 (kinetics) 에 있어서 중요하다. 예를 들어, 하이브리드화 조건의 엄격도, 세척 등, 예컨대 마이크로어레이 분석 동안 통상적으로 이용되는 것들은, 예를 들어 조직 샘플에 대한 제자리 하이브리드화를 위해 통상 이용되는 하이브리드화 조건보다 프로브/표적 하이브리드화를 보존시키기 위해 상이한 G/C 함량을 필요로 할 수 있다. 이로써, 프로브/표적 하이브리드화를 유지시키는데 있어서 유용한 프로브의 G/C 함량은 여러 적용에서 가변적일 수 있다. 예를 들어, 프로브가 마이크로어레이 적용에서 사용하기 위해 의도되는 경우, 약 60% 초과 또는 약 30% 미만 (예컨대 약 65%, 70% 또는 80% 초과 또는 약 30% 미만, 예컨대 약 20% 또는 15% 미만) 의 G/C 뉴클레오티드 함량을 갖는 분절이 제거될 수 있다. 다른 예에서, 약 50% 초과 (예컨대 약 55%, 60% 또는 65% 초과) 의 G/C 뉴클레오티드 함량을 갖는 분절이, 마이크로어레이 적용에서 사용하기 위해 의도되는 프로브에 대해 제거된다.

1. 유일 특이적 분절의 가상환경적 확인

일부 구현예에서, 게놈 표적 핵산 서열의 선택, 임의의 반복물 차폐, 선택된 길이의 분절로의 분리, 및 G/C 뉴클레오티드 함량 및/또는 선택된 제한 위치 존재에 대한 임의의 스크리닝 후, 개별적인 분절 (예컨대 100 염기 쌍 분절) 을 가상환경에서 스크리닝하여, 유일 특이적인 서열 (예컨대 유기체의 게놈 내에서 단 1 회 나타나는) 을 갖는 분절을 확인한다. 유일 특이적인 분절을 결합 부위로서 선택하는데, 이후 이는 연결되어 (예를 들어, 라이게이션 또는 연합됨) 원하는 유일 특이적 핵산 프로브가 제조된다.

일부 예에서, 각각의 분절은 게놈 표적 핵산 서열이 선택되는 유기체의 게놈 핵산 서열과 비교된다. 표적 핵산 서열 뿐 아니라 게놈 내 임의의 비-표적 핵산 서열과의 상동성 (예를 들어, 서열 동일성) 이 확인된다 (예를 들어, 서열 정렬로서 표시됨). 특정 예에서, 유기체의 게놈과의 상동성을 컴퓨터 알고리즘 BLAT (Blast-유사 분석 도구; Kent, Genome Res . 12:656-644, 2002) 을 사용하여 확인하고 나타낸다.

BLAT 은 입력 서열을 전체 게놈 어셈블리에서 유래한 지표와 비교하는 정렬 도구이다. DNA BLAT 은 랜덤 액세스 메모리 (random access memory) 내에 전체 게놈의 모든 비-중복성 11-mer 로 이루어지는 지표를 보유한다 (높은 수준의 반복 서열을 포함하는 영역은 제외함). BLAT 은 가능성이 있는 상동성 영역을 발견하기 위해 입력 서열을 통해 스캔하여, 이후 상세한 정렬을 위해 메모리에 로딩한다. DNA BLAT 은 25 개 이상의 염기 길이의 95% 이상의 서열 유사성을 발견하기 위해 설계된다. 이는 보다 상이하거나 짧은 서열 정렬을 놓칠 수 있으나; BLAT 은 20-25 개 염기만큼 적은 완벽한 서열 매치를 발견할 것이다. 일부 예에서, 약 20 bp 초과의 (예컨대 20, 21, 22, 23, 24, 25 bp 이상) 완벽한 서열 매치를 포함하는 임의의 분절이 제거된다.

반대로, BLAST 는 입력 서열을 GenBank 서열의 데이터베이스와 비교하는 정렬 도구이다 (Altschul et al ., J. Mol . Biol . 215:403-410, 1990; Altschul et al., Nucl . Acids Res . 25:3389-3402, 1997). BLAST 는 입력 서열로부터 지표를 구축하며 데이터베이스를 통해 선형으로 스캔한다. BLAST 는 게놈 표적 핵산 서열에서 유일 특이적 핵산 서열을 검출하기 위한 BLAT 보다 덜 민감하다. BLAST 에서 사용한 알고리즘으로 인해, 민감도는 속도에 대해 희생되어, BLAST 는 "최적합 (best fit)" 을 측정하며 유일 특이적 핵산 서열을 생성시키지 않는다. 예를 들어, BLAST 는 위양성을 생성시킨다 (예를 들어, 게놈 내에 단 1 회 발생하는 바로서 서열 분절을 확인하는데, 여기서 BLAT 은 동일 서열 정렬에 대한 게놈에서의 상동성의 다수 영역을 확인함). 그러므로, BLAST 은 일반적으로 본원에서 기재된 방법에서 사용하기에 적합하지 않다.

유일 특이적 프로브에 분절을 포함시키기 위한 허용 기준은, 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 분절, 예컨대 게놈의 한 부위 및 오직 한 부위에 상동성인 분절이다 (예를 들어, 게놈 표적 핵산 분자). 허용되는 분절 ("결합 부위" 또는 "유일 특이적 결합 부위" 로 지정됨) 은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 핵산 프로브에 포함될 수 있다. 게놈의 하나 초과 부위에 대해 상동성을 갖는 임의의 분절 (예를 들어, 적어도 약 20-25 연속 bp 에 걸쳐 또다른 서열과 동일한) 은 허용 기준에 불합격이며, 핵산 프로브에 포함되지 않는다. 프로브 표적 영역이 충분한 유일 특이적 핵산 서열을 산출하지 않는 경우, 게놈의 하나 초과 부위 (예를 들어, 10 개 이하, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 부위) 와 동일한 일부 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 25 개 이하) 를 포함하는 핵산 분절이 보충되어 프로브에 포함될 수 있다.

상기 기재된 가상환경적 방법을 사용하여 선택된 유일 특이적 결합 부위는 임의로는 반복 또는 다른 비-고유 서열 (예컨대 이전에 확인되지 않은 반복 서열) 의 존재에 대해 경험적으로 시험될 수 있다. 일부 예에서, 선택된 결합 부위가 제조 (예를 들어 올리고뉴클레오티드 합성에 의해) 되고 게놈 표적 핵산을 함유하는 유기체로부터의 게놈 DNA 와의 하이브리드화에 대해 시험된다. 하이브리드화 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 멤브레인-기재 하이브리드화 기술 (예를 들어, 서던 블롯, 슬롯-블롯 또는 도트-블롯) 이 있다. 특정 예에서, 하이브리드화는 도트-블롯팅에 의해 시험된다. 예를 들어, 서열 분절은 올리고뉴클레오티드로서 합성되고, 멤브레인에 스팟 처리되고, 표지된 게놈 DNA 프로브와 하이브리드화될 수 있다. 게놈 DNA 프로브에 대해 하이브리드화가 존재하지 않는 경우 (예를 들어, 검출가능한 하이브리드화가 없음), 분절은 유일 특이적 결합 부위인 것으로 확인되며, 본원에서 개시된 방법에 의해 제조된 핵산 프로브에 포함시키기 위해 선택될 수 있다. 게놈 DNA 에 대해 임의의 하이브리드화가 존재하는 경우 (예를 들어, 임의의 검출가능한 하이브리드화가 존재함), 분절은 핵산 프로브로부터 배제될 수 있다.

다른 예에서, 선택된 결합 부위를 포함하는 마이크로어레이가 제조된다. 일부 예에서, 어레이는 임의로는 양성 및 음성 대조군을 포함한다. 양성 대조군은 상기 주어진 예와 유사한 반복 요소 서열, 예를 들어 AluI 알파 위성 (예컨대 D17Z1), LINE 요소 (예컨대 Sau3) 및/또는 말단소체 서열 (예컨대 pHuR93Telo) 을 포함할 수 있다. 음성 대조군은 관련이 없는 유기체 (예컨대 벼) 로부터의 게놈 서열 또는 무작위화된 서열 (예컨대 시판되는 어레이 상에서 통상 사용되는 것들) 을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 마이크로어레이는 표지된 총 게놈 DNA (예컨대 인간 총 게놈 DNA) 및 표지된 반복 DNA (예컨대 Cot-1^TM DNA) 로 프로브된다. 일부 예에서, 어레이는 총 게놈 DNA 및 반복 DNA 로 동시에 프로브된다. 다른 예에서, 2 개의 개별적이고 동일한 어레이가 프로브되는데, 하나는 총 게놈 DNA 로, 그리고 다른 하나는 반복 DNA 로 프로브된다. 데이터를 수집하고 표준 방법 및 소프트웨어 (예를 들어, NimbleScan 소프트웨어, Roche Nimblegen) 에 의해 분석한다.

일부 예에서, 선택 기준은 모든 양성 대조군 서열의 선형 회귀를 유도하고 1 표준 편차로 선형 회귀를 감소시킴으로써 시험 서열을 스크리닝하기 위해 확립된다. 또한, 양성 대조군 (예컨대 AluI 양성 대조군) 으로부터의 최소 인간 게놈 스코어, 및 반복 DNA 프로브 (예컨대 Cot-1^TM) 에 대한 사전결정된 값 (예컨대 12) 을 추가적인 양성 대조군 절삭값으로서 확립한다. 음성 대조군에 대한 절삭값은, 음성 대조군 서열의 총 게놈 DNA 스코어의 평균을 사용함으로써 확립된다. 이러한 절삭값은 시험 서열의 하위집합물의 하이브리드화 세기를 구분시켜, 양성 및 음성 대조군과 보다 유사하게 수행하는 서열을 분리시킨다. 선택 기준 내에 포함되는 서열은 프로브에 포함되는 한편, 선택 기준 외부에 포함되는 서열은 제거된다. 일부 예에서, 선택 기준 내에 포함되는 서열은 유일 특이적 서열인 것으로 고려된다 (예컨대 유기체의 게놈 내에서 단 1 회 발생하는 서열). 어레이 데이터 분석의 당업자는, 시험 서열을 배제/포함시키는데 사용될 수 있는 의미 있는 절삭값을 유도하기 위해 많은 상이한 통계적 방법이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

2. 유일 특이적 분절의 경험적 확인

다른 구현예에서, 나열된 서열의 경험적 시험을 사용하여 유일 특이적 결합 부위를 확인한다. 경험적 분석은 섹션 I (상기) 에서 기재된 가상환경적 방법 (예를 들어, BLAT 분석) 대신 사용될 수 있다.

일부 예에서, 게놈 표적 핵산 서열의 선택, 임의의 반복물 차폐, 선택된 길이의 분절로의 분리, 및 G/C 뉴클레오티드 함량 및/또는 선택된 제한 위치의 존재에 대한 임의의 스크리닝 후, 개별적 분절 (예컨대 15-500 염기 쌍 분절, 예를 들어, 100 염기 쌍 분절) 을 합성하고 어레이에 부착시킨다. 시험을 위한 임의 수의 개별적 분절 (예컨대 적어도 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 4000, 5000, 8000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000 이상) 을 어레이에 부착시킬 수 있다. 일부 예에서, 어레이는 임의로는 양성 및 음성 대조군을 포함한다. 양성 대조군은 반복 요소 서열, 예를 들어 AluI 알파 위성 (예컨대 D17Z1), LINE 요소 (예컨대 Sau3) 및/또는 말단소체 서열 (예컨대 pHuR93Telo) 을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 양성 대조군은 표적 게놈 서열을 포함하는 유기체의 게놈에서의 알려져 있는 카피 수를 갖는 서열이다. 일부 예에서, 음성 대조군은 무작위화된 서열, 예컨대 유기체의 게놈에 대해 상동성을 약간 갖거나 갖지 않는 서열이다. 음성 대조군은 또한 관련되지 않은 유기체, 예컨대 식물 (예를 들어, 벼), 박테리아, 바이러스 또는 효모 게놈으로부터의 게놈 서열을 포함할 수 있다.

본 개시물의 어레이는 다양한 접근방법에 의해 제조될 수 있다. 한 예에서, 핵산 분자는 별도로 합성된 후 고형 지지체에 부착된다 (미국 특허 제 6,013,789 호 참조). 또다른 예에서, 핵산 분자는 지지체에 직접적으로 합성되어 원하는 어레이를 제공한다 (미국 특허 제 5,554,501 호 참조). 고형 지지체에 핵산을 공유 결합시키고 지지체에 핵산을 직접 합성시키기에 적합한 방법은 해당 분야의 당업자에게 알려져 있으며; 적합한 방법의 개요는 Matson et al ., Anal . Biochem. 217:306-10, 1994 에서 발견될 수 있다. 한 예에서, 핵산 분자는 고형 지지체 상에 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 통상적인 화학적 기술 (예컨대 PCT 출원 WO 85/01051 및 WO 89/10977, 또는 미국 특허 제 5,554,501 호) 을 사용하여 지지체에 합성된다. 어레이의 고형 지지체는 유기 중합체로부터 형성될 수 있다. 고형 지지체에 대해 적합한 물질은 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리이소부틸렌, 폴리부타디엔, 폴리이소프렌, 폴리비닐피롤리딘, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리플루오로에틸렌-프로필렌, 폴리에틸렌비닐 알코올, 폴리메틸펜텐, 폴리클로로트리플루오로에틸렌, 폴리술폰, 히드록실화 이축 연신 폴리프로필렌, 아민화 이축 연신 폴리프로필렌, 티올화 이축 연신 폴리프로필렌, 에틸렌아크릴산, 에틸렌 메타크릴산 및 이의 공중합체의 배합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (미국 특허 제 5,985,567 호 참조).

일부 예에서, 마이크로어레이는 관심 유기체로부터의 표지된 총 게놈 DNA 및 유기체의 게놈으로부터의 표지된 반복 DNA 로 프로브된다. 특정 예에서, 인간 총 게놈 DNA 및 Cot-1^TM DNA 가 사용된다. 일부 예에서, 어레이는 실제적으로 총 게놈 DNA 및 반복 DNA 로 프로브된다. 다른 예에서, 2 개의 개별적이고 동일한 어레이가 프로브되는데, 하나는 총 게놈 DNA 로 프로브되며 다른 하나는 반복 DNA 로 프로브된다. 데이터를 수집하고 표준 방법 및 소프트웨어 (예를 들어, NimbleScan 소프트웨어, Roche Nimblegen) 에 의해 분석한다.

일부 예에서, 유일 특이적 서열은 총 게놈 DNA 및 블로킹 DNA 의 하이브리드화 스코어의 선형 회귀를 유도하고 하나 이상의 사전결정된 절삭값 내에 포함되는 서열을 선택함으로써 선택된다. 일부 예에서, 선택 기준은 모든 양성 대조군 서열의 선형 회귀를 유도하고 1 표준 편차로 선형 회귀를 감소시킴으로써 시험 서열을 스크리닝하기 위해 확립된다. 또한, 양성 대조군 (예컨대 AluI 양성 대조군) 으로부터의 최소 인간 게놈 스코어, 및 블로킹 DNA (예컨대 Cot-1^TM DNA) 에 대한 사전결정된 값 (예컨대 11, 12, 13 또는 14, 예를 들어, 12) 이 추가적인 양성 대조군 절삭값으로서 확립된다. 음성 대조군에 대한 절삭값은 음성 대조군 서열의 총 인간 게놈 DNA 스코어의 평균을 사용하여 확립될 수 있다. 이러한 절삭값은 시험 서열의 하위집합물의 하이브리드화 세기를 구분시켜, 양성 및 음성 대조군과 보다 유사하게 수행하는 서열을 분리시킨다. 선택 기준 내에 포함되는 서열은 프로브에 포함되는 한편, 선택 기준 외부에 포함되는 서열은 제거된다. 일부 예에서, 선택 기준 내에 포함되는 서열은 유일 특이적 서열인 것으로 고려된다 (예컨대 유기체의 게놈 내에서 단 1 회 발생하는 서열). 어레이 데이터 분석의 당업자는, 시험 서열을 배제/포함시키는데 사용될 수 있는 의미 있는 절삭값을 유도하기 위해 많은 상이한 통계적 방법이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가의 예에서, 어레이가 양성 및 음성 대조군을 포함하지 않는 경우 서열 선택 기준은 어레이에 포함되는 모든 서열의 평균의 집단 원점(origin)으로부터의 거리이다. 이러한 경우, 정의된 수의 서열이 상기 원점으로부터의 이의 방사 거리에 대해 선택되는데, 이는 위계적으로 확립될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 기재된 기준을 사용하여 선택된 유일 특이적 서열은 게놈 표적 내에 발생하는 순서 및 배향으로 위치한다. 다른 예에서, 프로브 내의 선택된 서열의 순서 및 배향을 결정하는 방법은 파트 IV, 섹션 B (하기) 에서 기재된 이들 방법을 포함할 수 있다.

B. 유일 특이적 서열의 순서 및 배향 결정

상기 방법은 또한 핵산 프로브를 생성시키기 위해 결합 부위를 연결시키기 전에 (사전결정된 순서 및 배향을 확인함) 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 선택된 결합 부위의 순서 및 배향을 결정하는 것을 포함한다. 유일 특이적 결합 부위는 섹션 IV, 파트 A (상기) 에서 기재된 바와 같이 선택된다. 그러나, 선택된 유일 특이적 결합 부위가 연결되는 경우, 비-유일 특이적 핵산 서열 (예컨대 반수체 게놈 내에서 1 회 초과로 나타나는 핵산 서열, 예를 들어 반복 서열 또는 비-표적 핵산에 대한 상동성) 이 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-유일 특이적 서열은 2 개 이상의 결합 부위 사이의 중복 부위를 포함하는 서열로부터 생성될 수 있다 (예컨대 2 개의 유일 특이적 서열이 연결되는 위치에서). 그러므로 핵산 프로브 서열은, 생성된 프로브가 비-유일 특이적 핵산 서열을 포함하지 않는다는 것을 확인하기 위해 분석될 수 있다. 프로브가 비-유일 특이적 핵산 서열을 함유하는 경우, 프로브 내 결합 부위의 순서 및/또는 배향은 변화되고 재분석된다.

프로브 내 결합 부위의 순서 및 배향을 결정하는 것은, 선택된 유일 특이적 결합 부위를 초기 순서 및 배향으로 두는 것을 포함한다. 일부 예에서, 초기 순서를 생성시키기 위해 이용한 결합 부위는 통상적인 총 서열 길이를 제공하는 여러 유일 특이적 결합 부위를 포함한다. 총 서열 길이는 벡터 (예컨대 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체) 내에 포함될 수 있는 임의 길이를 포함할 수 있는데, 이는 1000 bp 이상, 10,000 bp 이상, 20,000 bp 이상, 50,000 bp 이상, 예를 들어 약 1000 bp 내지 약 60,000 bp (예를 들어, 약 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp, 4500 bp, 5000 bp, 5500 bp, 6000 bp, 7000 bp, 8000 bp, 10,000 bp, 20,000 bp, 30,000 bp, 40,000 bp, 50,000 bp 또는 60,000 bp) 의 유일 특이적 결합 부위 총 길이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 예에서, 게놈 표적 핵산 서열로부터의 선택된 유일 특이적 결합 부위의 총 크기는 플라스미드 벡터에 편리하게 포함될 수 있는 서열 길이를 초과할 수 있다. 이러한 예에서, 선택된 유일 특이적 결합 부위는 군으로 나뉠 수 있어, 각각의 군이 벡터 (예컨대 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체) 내 삽입에 적합한 총 서열 길이를 포함한다.

일부 예에서, 선택된 유일 특이적 결합 부위의 초기 배열은 유일 특이적 결합 부위가 게놈 표적 핵산 내에서 발생하는 순서일 수 있다. 예를 들어, 게놈 표적 핵산 내 거의 5' 에 위치하는 선택된 결합 부위는 초기 배열로 먼저 위치한 후, 게놈 표적 핵산 내 거의 3' 에 위치하는 선택된 결합 부위가 마지막으로 초기 배열로 위치할 때까지, 게놈 표적 핵산 내에서 다음으로 발생하는 선택된 결합 부위가 5' 에서 3' 방향 등으로 이동한다. 또한, 각각의 결합 부위는 게놈 표적 핵산에서 발생하는 바와 같이 초기 배열로 동일 배향으로 위치한다. 대안적으로는, 각각의 결합 부위는 게놈 표적 핵산에서 발생하는 바와 같이 초기 배열로 역 배향으로 위치할 수 있거나, 정 배향 및 역 배향의 혼합이 사용될 수 있다.

또다른 예에서, 선택된 유일 특이적 결합 부위의 초기 배열은 게놈 표적 핵산에서 이들이 발생하는 바와 같이 1+n 결합 부위마다 일 수 있다 (상기 n 은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 임). 예를 들어, 초기 배열은 두 번째 선택된 결합 부위마다, 세 번째 선택된 결합 부위마다, 네 번째 선택된 결합 부위마다, 다섯 번째 선택된 결합 부위마다 등일 수 있다. 선택된 유일 특이적 결합 부위의 초기 배열은 또한 게놈 표적 핵산에서 발생하는 순서에 대한 역 순서를 포함할 수 있다. 선택된 유일 특이적 결합 부위의 배향은 게놈 표적 핵산에서 발생하는 배향, 역 배향, 또는 무작위일 수 있다. 다른 예에서, 선택된 유일 특이적 결합 부위의 초기 배열은 게놈에서 발생하는 것으로부터 역 순서일 수 있거나, 무작위하게 선택된 순서일 수 있다.

결합 부위의 초기 배열 후, 생성된 서열은 임의의 비-유일 특이적 핵산 서열의 드 노보 (de novo) 생성에 대해 분석된다. 이는 유일 특이적 분절의 선택에 대해 기재된 바와 같이 수행된다 (섹션 IV, 파트 A, 상기). 일부 예에서, 결합 부위의 초기 순서 및 배향은 임의의 비-유일 특이적 핵산 서열을 포함하지 않는다. 이러한 예에서, 초기 배열은 프로브를 생성시키기 위한 결합 부위의 연합에 대해 선택된 동일한 순서 및 배향이다 ("사전결정된" 순서 및 배향).

다른 예에서, 결합 부위의 초기 순서 및 배향은 하나 이상의 비-유일 특이적 분절을 생성시킨다. 초기 배열이 하나 이상의 비-유일 특이적 분절을 생성하는 경우, 선택된 결합 부위의 순서 및 배향은 유일 특이적 핵산 서열로 이루어지는 순서 및 배향이 확인되도록 조정된다. 한 예에서, 초기 배열로의 비-유일 특이적 핵산 서열의 형성을 야기하는 결합 부위는 순서화된 결합 부위의 말단부로 이동된다 (예를 들어, 순서화된 결합 부위의 5' 말단 또는 3' 말단).

다른 예에서, 비-유일 특이적 핵산 서열의 형성을 야기하는 결합 부위는 동일한 순서로 남아 있을 수 있으나, 반대 방향으로 위치하거나, 순서화된 결합 부위의 말단부로 이동하고 반대 배향으로 위치할 수 있다. 또다른 예에서, 비-유일 특이적 핵산 서열의 형성을 야기하는 결합 부위는 프로브에서 배제될 수 있다. 추가의 예에서, 모든 선택된 결합 부위는 예를 들어 상이한 순서 및/또는 배향을 선택함으로써 (예컨대 초기 배열에 대해 상기 기재된 것들) 재순서화될 수 있다. 조정되거나 재순서화된 분절로 이루어지는 서열은 이후 임의의 비-유일 특이적 핵산 서열의 드 노보 생성에 대해 분석된다. 이는 유일 특이적 분절의 선택에 대해 기재된 바와 같이 수행된다 (섹션 IV, 파트 A, 상기).

일부 예에서, 결합 부위의 조정된 순서 및 배향은 임의의 비-유일 특이적 핵산 서열을 포함하지 않는다. 이러한 예에서, 조정된 순서 및 배향은 프로브를 생성시키기 위해 결합 부위를 연결시키는 것에 대해 선택된 순서 및 배향이다 ("사전결정된" 순서 및 배향). 다른 예에서, 조정된 배열은 하나 이상의 비-유일 특이적 분절을 생성시킨다. 조정된 배열이 하나 이상의 비-유일 특이적 분절을 생성하는 경우, 선택된 결합 부위의 순서 및 배향은 상기 기재된 바와 같이 유일 특이적 핵산 서열로 이루어지는 순서 및 배향이 확인되도록 재조정된다. 이러한 방법은 임의의 비-유일 특이적 핵산 서열을 포함하지 않는 선택된 결합 부위의 순서 및 배향을 확인하는데 필요한 만큼 수 회 반복된다.

유일 특이적 결합 부위의 순서 및 배향이 결정되고 나면, 상기 결합 부위는 사전결정된 순서 및 배향으로 연결된다 (예를 들어, 라이게이션 또는 연합됨). 일부 예에서, 개별적인 결합 부위 서열이 생성 (예를 들어 올리고뉴클레오티드 합성에 의해, 또는 게놈 표적 핵산으로부터의 서열의 증폭에 의해) 되며 선택된 순서 및 배향으로 함께 연결된다. 다른 예에서, 핵산 프로브는 일련의 올리고뉴클레오티드 (예컨대 약 20-500 bp 의 개별적인 올리고뉴클레오티드) 로서 합성되며 이는 함께 연결된다. 예를 들어, 결합 부위는 서로 효소적으로 연결되거나 라이게이션될 수 있다 (예를 들어 리가아제를 사용하여). 예를 들어, 결합 부위는 블런트-말단 라이게이션으로 또는 제한 위치에서 연결될 수 있다. 또다른 예에서, 결합 부위는 상보적 핵산 오버행 (overhang) (예컨대 3 bp 이상의 오버행) 으로 합성되고, 어닐링되고, 서로 연결될 수 있다 (예를 들어 리가아제를 사용하여). 화학적인 라이게이션 및 증폭을 또한 사용하여 결합 부위를 연결시킬 수 있다. 일부 예에서, 결합 부위는 링커에 의해 분리된다. 또다른 예에서, 선택된 순서 및 배향의 선택된 결합 부위를 포함하는 전체 핵산 프로브가 합성되며 결합 부위는 합성 동안 직접 연결된다. 특정 예에서, 다수의 연결된 (예를 들어 라이게이션 또는 연합된) 결합 부위가 플라스미드 벡터에 삽입되어 표준 분자 생물학적 기술에 의해 핵산 프로브가 제조되게 한다.

V. 표적 핵산 서열

표적 핵산 서열 또는 분자는 게놈 DNA 표적 서열을 포함한다. 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 하나 이상의 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 포함하는 핵산 분자가 생성될 수 있는데, 이는 본질적으로 임의의 게놈 표적 서열에 상응한다. 일부 예에서, 질환 또는 병상과 관련되는 표적 서열이 선택되어, 상기 질환 또는 병상에 관련되는 정보 (예컨대 샘플을 수득한 대상에 대한 진단적 또는 예후적 정보) 를 추론하는데 하이브리드화의 검출이 사용될 수 있다. 특정 예에서, 게놈 표적 핵산 서열은 표적 게놈 예컨대 진핵세포 게놈, 예를 들어 포유동물 게놈, 예컨대 인간 게놈에서 선택된다.

개시된 유일 특이적 핵산 분자가 생성될 수 있는데, 이는 유일 특이적 DNA 의 일부 이상을 포함하는 임의의 게놈 표적 서열에 본질적으로 상응한다. 예를 들어, 게놈 표적 서열은 진행세포 게놈, 예컨대 포유동물 (예를 들어 인간) 게놈의 일부일 수 있다. 유일 특이적 핵산 분자 및 이러한 분자를 포함하는 프로브는 하나 이상의 개별적인 유전자 (유전자의 코딩 및/또는 비-코딩 부위 포함), 하나 이상의 염색체 부위 (예를 들어 관심 유전자 하나 이상을 포함하거나 알려져 있는유전자를 포함하지 않는 부위) 또는 심지어 하나 이상의 전체 염색체에 상응할 수 있다.

표적 핵산 서열 (예를 들어 게놈 표적 핵산 서열) 은 임의 수의 염기 쌍에 걸쳐질 수 있다. 한 예에서, 예컨대 실제적으로 산재된 반복 핵산 서열을 갖는 포유동물 또는 다른 게놈 (예를 들어 인간 게놈) 에서 선택된 게놈 표적 핵산 서열에서, 표적 핵산 서열은 100,000 bp 이상 걸쳐진다. 특정 예에서, 표적 핵산 서열 (예를 들어 게놈 표적 핵산 서열) 은 약 100,000 bp 이상, 예컨대 적어도 약 150,000, 250,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 3,000,000, 4,000,000 bp 이상이다 (예컨대 전체 염색체).

특정한 비-제한적 예에서, 신생물 (예를 들어, 암) 과 관련되는 게놈 표적 핵산 서열이 선택된다. 수많은 염색체 이상 (전좌 및 기타 재배치, 재복제 (증폭) 또는 결실 포함) 이 신생물 세포, 특히 암 세포, 예컨대 B 세포 및 T 세포 백혈병, 림프종, 유방암, 결장암, 신경암 등에서 확인되었다. 그러므로, 일부 예에서, 일부 이상의 표적 핵산 서열 (예를 들어 게놈 표적 핵산 서열) 은 샘플 내 세포의 하나 이상의 하위집합에서 재복제되거나 결실된다.

암유발유전자를 포함하는 전좌는 여러 인간 악성 종양에 대해 알려져 있다. 예를 들어, 염색체 18q11.2 의 중단점 부위에 위치한 SYT 유전자를 포함하는 염색체 재배치는 활막육종 연조직 종양 중에서 흔하다. t(18q11.2) 전좌가, 예를 들어 상이한 표지를 갖는 프로브를 사용하여 확인될 수 있는데: 제 1 프로브는 SYT 유전자로부터 원위부로 연장되는 표적 핵산 서열로부터 생성된 유일 특이적 핵산 분자를 포함하고, 제 2 프로브는 SYT 유전자에 대해 3' 또는 근부로 연장되는 표적 핵산 서열로부터 생성된 유일 특이적 핵산 분자를 포함한다. 이들 표적 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 표적 핵산 서열) 에 상응하는 프로브가 제자리 하이브리드화 절차에서 사용되는 경우, SYT 유전자 부위 내에 t(18q11.2) 이 결여된 정상 세포는, (가깝게 근접한 2 개 표지에 의해 생성된) 2 개의 융합 신호를 나타내는데, 이는 SYT 의 2 개 미손상 카피를 반영한다. t(18q11.2) 를 갖는 비정상 세포는 단일 융합 신호를 나타낸다.

신생물 형질전환에 포함되는 유전자 재복제의 수많은 예 (또한 유전자 증폭으로도 알려져 있음) 가 관찰되었으며, 개시된 프로브를 사용하는 제자리 하이브리드화에 의해 세포유전학적으로 검출될 수 있다. 한 예에서, 게놈 표적 핵산 서열은 하나 이상의 악성 종양 (예를 들어, 인간 악성 종양) 에서 재복제되는 유전자 (예를 들어, 암유발유전자) 를 포함하도록 선택된다. 예를 들어, c-erbB2 또는 HER2/neu 로도 알려져 있는 HER2 는 세포 성장의 조절에 있어서 역할하는 유전자이다 (대표 인간 HER2 게놈 서열은 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000017, 뉴클레오티드 35097919-35138441 에서 제공됨). 185 kD 트랜스멤브레인 세포 표면 수용체에 대한 유전자 코드는 티로신 키나아제 패밀리의 일원이다. HER2 는 인간 유방암, 난소암, 위암 및 기타 암에서 증폭된다. 그러므로, HER2 유전자 (또는 HER2 유전자를 포함하는 염색체 17 의 일부) 를 게놈 표적 핵산 서열로서 사용하여, HER2 에 대한 유일 특이적 결합 부위를 포함하는 프로브를 생성할 수 있다.

다른 예에서, 게놈 표적 핵산 서열이 선택되는데, 이는 악성 세포에서 결실된 (소실된) 종양 억제자 유전자이다. 예를 들어, 염색체 9p21 상에 위치한 p16 부위 (D9S1749, D9S1747, p16(INK4A), p14(ARF), D9S1748, p15(INK4B) 및 D9S1752 포함) 는 특정 방광암에서 결실된다. 염색체 1 의 단완의 원위 부위 (예를 들어, SHGC57243, TP73, EGFL3, ABL2, ANGPTL1 및 SHGC-1322 포함) 및 염색체 19 의 동원체주변 (pericentromere) 부위 (예를 들어 19p13-19q13) (예를 들어, MAN2B1, ZNF443, ZNF44, CRX, GLTSCR2 및 GLTSCR1 포함) 를 포함하는 염색체 결실은 중추신경계의 특정 유형 고형 종양의 특징적인 분자적 특성이다.

전술한 예는 단지 설명을 목적으로 제공되며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 신생물 형질전환 및/또는 성장과 상관관계가 있는 수많은 다른 세포유전학적 이상은 당업자에게 알려져 있다. 신생물 형질전환과 상관관계가 있으며 개시된 방법에서 유용하고 이에 대해 개시된 프로브가 제조될 수 있는 게놈 표적 핵산 서열은 또한 EGFR 유전자 (7p12; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000007, 뉴클레오티드 55054219-55242525), MET 유전자 (7q31; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호 NC_000007, 뉴클레오티드 116099695-116225676), C-MYC 유전자 (8q24.21; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000008, 뉴클레오티드 128817498-128822856), IGF1R (15q26.3; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000015, 뉴클레오티드 97010284-97325282), D5S271 (5p15.2), KRAS (12p12.1; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호 NC_000012, 보체, 뉴클레오티드 25249447-25295121), TYMS (18p11.32; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호 NC_000018, 뉴클레오티드 647651-663492), CDK4 (12q14; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호 NC_000012, 뉴클레오티드 58142003-58146164, 보체), CCND1 (11q13, GENBANK^TM 수탁 번호 NC_000011, 뉴클레오티드 69455873-69469242), MYB (6q22-q23, GENBANK^TM 수탁 번호 NC_000006, 뉴클레오티드 135502453-135540311), 리포단백질 리가아제 (LPL) 유전자 (8p22; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000008, 뉴클레오티드 19840862-19869050), RB1 (13q14; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000013, 뉴클레오티드 47775884-47954027), p53 (17p13.1; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000017, 보체, 뉴클레오티드　7512445-7531642), N-MYC (2p24; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000002, 보체, 뉴클레오티드 15998134-16004580), CHOP (12q13; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000012, 보체, 뉴클레오티드 56196638-56200567), FUS (16p11.2; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000016, 뉴클레오티드 31098954-31110601), FKHR (13p14; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000013, 보체, 뉴클레오티드 40027817-40138734) 뿐 아니라 예를 들어: ALK (2p23; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000002, 보체, 뉴클레오티드　29269144-29997936), Ig 중쇄, CCND1 (11q13; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호 NC_000011, 뉴클레오티드 69165054-69178423), BCL2 (18q21.3; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000018, 보체, 뉴클레오티드 58941559-59137593), BCL6 (3q27; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000003, 보체, 뉴클레오티드 188921859-188946169), AP1 (1p32-p31; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000001, 보체, 뉴클레오티드 59019051-59022373), TOP2A (17q21-q22; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000017, 보체, 뉴클레오티드　35798321-35827695), TMPRSS (21q22.3; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000021, 보체, 뉴클레오티드 41758351-41801948), ERG (21q22.3; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000021, 보체, 뉴클레오티드 38675671-38955488); ETV1 (7p21.3; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000007, 보체, 뉴클레오티드 13897379-13995289), EWS (22q12.2; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000022, 뉴클레오티드 27994017-28026515); FLI1 (11q24.1-q24.3; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000011, 뉴클레오티드 128069199-128187521), PAX3 (2q35-q37; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000002, 보체, 뉴클레오티드 222772851-222871944), PAX7 (1p36.2-p36.12; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000001, 뉴클레오티드 18830087-18935219), PTEN (10q23.3; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000010, 뉴클레오티드 89613175-89718512), AKT2 (19q13.1-q13.2; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000019, 보체, 뉴클레오티드 45428064-45483105), MYCL1 (1p34.2; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000001, 보체, 뉴클레오티드 40133685-40140274), REL (2p13-p12; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000002, 뉴클레오티드 60962256-61003682) 및 CSF1R (5q33-q35; 예를 들어 GENBANK^TM 수탁 번호　NC_000005, 보체, 뉴클레오티드 149413051-149473128) 을 포함한다. 개시된 프로브 또는 방법은 전술한 유전자 중 임의의 하나 (또는 적용가능한 바에 따라 그 이상) 의 일부 이상을 함유하는 각각의 인간 염색체 부위를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 게놈 표적 핵산 분자에 대해 특이적인 프로브를 (동일하거나 상이하지만 유사한 샘플에서), 염색체 수의 표시를 제공하는 제 2 프로브, 예컨대 염색체 특이적 (예를 들어 동원체) 프로브와 조합으로 검정한다. 예를 들어, HER2 유전자의 적어도 유일 특이적 핵산 서열을 함유하는 염색체 17 의 부위에 대해 특이적인 프로브 (HER2 프로브) 를, 염색체 17 의 동원체에 위치한 알파 위성 DNA 에 대해 하이브리드화하는 CEP 17 프로브 (17p11.1-q11.1) 와 조합으로 사용할 수 있다. CEP 17 프로브를 포함시키는 것은, HER2 유전자의 상대적 카피 수가 측정되도록 한다. 예를 들어, 정상 샘플은 2 미만의 HER2/CEP17 비를 갖는 한편, HER2 유전자가 재복제되는 샘플은 2.0 초과의 HER2/CEP17 비를 갖는다. 유사하게, 임의의 다른 선택된 게놈 표적 서열에 상응하는 CEP 동원체 프로브는 또한 동일 (또는 상이한) 염색체 상의 고유 표적에 대한 프로브와 조합으로 사용될 수 있다.

VI . 검출가능한 표지 및 표지 방법

개시된 방법에 의해 생성된 핵산 프로브는 하나 이상의 표지를 포함하여, 예를 들어 개시된 프로브를 사용하여 표적 핵산 분자가 검출되게 한다. 다양한 적용, 예컨대 제자리 하이브리드화 절차에서, 핵산 프로브는 표지 (예를 들어 검출가능한 표지) 를 포함한다. "검출가능한 표지" 는 샘플 내 프로브 (특히 결합한 또는 하이브리드화된 프로브) 의 농도 또는 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 분자 또는 물질이다. 따라서, 표지된 핵산 분자는 샘플 내 표적 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 표적 핵산 서열) (표지된 유일 특이적 핵산 분자가 이에 결합하거나 하이브리드화됨) 의 농도 또는 존재의 표시자를 제공한다. 본 개시물은 특정 표지의 사용에 제한되지는 않으나, 예시를 제공한다.

하나 이상의 핵산 분자 (예컨대 개시된 방법에 의해 생성된 프로브) 와 관련된 표지는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 표지는 임의의 공지된, 또는 아직 발견되지 않은 메커니즘에 의해 검출될 수 있는데, 이는 광자 (무선 주파수, 마이크로웨이브 주파수, 적외선 주파수, 가시광선 주파수 및 자외선 주파수 광자 포함) 의 흡수, 방출 및/또는 산란을 포함한다. 검출가능한 표지는 착색된, 형광, 인광 및 발광 분자 및 물질, 한 물질을 또다른 물질로 전환시켜 검출가능한 차이를 제공하는 (예컨대 무색의 물질을 유색의 물질로 전환시키거나 그 반대에 의해, 또는 침전물을 생성시키거나 샘플 탁도를 증가시킴으로써) 촉매 (예컨대 효소), 항체 결합 상호작용에 의해 검출될 수 있는 합텐, 및 상자성 및 자성 분자 또는 물질을 포함한다.

검출가능한 표지의 특정예는 형광 분자 (또는 형광색소) 를 포함한다. 많은 형광색소가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 Life Technologies (이전의 Invitrogen) 로부터 선택될 수 있다 (예를 들어, The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies 참조). 핵산 분자 (예컨대 유일 특이적 결합 부위) 에 부착 (예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이션) 될 수 있는 특정한 형광단의 예가 Nazarenko et al . 에 대한 미국 특허 제 5,866,366 호에서 제공되는데, 예컨대 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산, 아크리딘 및 유도체 예컨대 아크리딘 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디술포네이트 (루시퍼 옐로우 (Lucifer Yellow) VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우 (Brilliant Yellow), 쿠마린 및 유도체 예컨대 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린 (쿠마린 151); 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI); 5',5"-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인 (브로모피로갈롤 레드 (Bromopyrogallol Red)); 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아나토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산; 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산; 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드 (DNS, 단실 클로라이드); 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (DABCYL); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트 (DABITC); 에오신 및 유도체 예컨대 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트; 에리트로신 및 유도체 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티디움; 플루오레세인 및 유도체 예컨대 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 QFITC (XRITC); 2',7'-디플루오로플루오레세인 (OREGON GREEN

); 플루오레스카민; IR144; IR1446; 말라키트 그린 (Malachite Green) 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르소 크레솔프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드 (Phenol Red); B-피코에리트린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 레드 (Reactive Red) 4 (시바크론 브릴리언트 레드 (Cibacron Brilliant Red) 3B-A); 로다민 및 유도체 예컨대 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 로다민 그린, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101 의 술포닐 클로라이드 유도체 (텍사스 레드 (Texas Red)); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA); 테트라메틸 로다민; 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC); 리보플라빈; 로졸산 및 테르븀 킬레이트 유도체이다.

다른 적합한 형광단은 대략 617 nm 에서 방사되는 티올-반응성 유로퓸 킬레이트 (Heyduk and Heyduk, Analyt . Biochem . 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem . 274:3315-22, 1999) 뿐 아니라 GFP, Lissamine^TM, 디에틸아미노쿠마린, 플루오레세인 클로로트리아지닐, 나프토플루오레세인, 4,7-디클로로로다민 및 잔텐 (Lee et al. 에 대한 미국 특허 제 5,800,996 호에 기재된 바와 같음) 및 이의 유도체를 포함한다. 당업자에게 알려져 있는 기타 형광단이 또한 사용될 수 있는데, 예를 들어 Life Technologies (Invitrogen; Molecular Probes (Eugene, OR)) 에서 이용가능한 것들 및 염료 ALEXA FLUOR

시리즈 (예를 들어, 미국 특허 제 5,696,157 호, 제 6,130,101 호 및 제 6,716,979 호에 기재된 바와 같음), 염료 BODIPY 시리즈 (디피로메텐보론 디플루오라이드 염료, 예를 들어 미국 특허 제 4,774,339 호, 제 5,187,288 호, 제 5,248,782 호, 제 5,274,113 호, 제 5,338,854 호, 제 5,451,663 호 및 제 5,433,896 호에 기재된 바와 같음), 캐스케이드 블루 (Cascade Blue) (미국 특허 제 5,132,432 호에 기재된 술폰화 피렌의 아민 반응성 유도체) 및 마리나 블루 (Marina Blue) (미국 특허 제 5,830,912 호) 를 포함한다.

상기 기재된 형광색소에 추가로, 형광 표지는 형광 나노입자, 예컨대 반도체 나노결정, 예를 들어 QUANTUM DOT^TM (예를 들어, Life Technologies (QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, OR) 에서 수득됨; 또한, 미국 특허 제 6,815,064 호; 제 6,682596 호; 및 제 6,649,138 호 참조) 일 수 있다. 반도체 나노결정은 크기 의존적 광학 및/또는 전기 특성을 갖는 미세한 입자이다. 반도체 나노결정이 제 1 에너지원으로 조명이 비추어지는 경우, 반도체 나노결정에서 사용된 반도체 물질의 밴드갭에 상응하는 주파수로 제 2 에너지 방사가 발생한다. 이러한 방사는 특정 파장 또는 형광의 유색 광으로서 검출될 수 있다. 상이한 스펙트럼 특징을 갖는 반도체 나노결정이 예를 들어 미국 특허 제 6,602,671 호에 기재된다. 반도체 나노결정은, 예를 들어 Bruchez et al ., Science 281:2013-2016, 1998; Chan et al ., Science 281:2016-2018, 1998; 및 미국 특허 제　6,274,323 호에 기재된 기술에 의해 다양한 생물학적 분자 (dNTP 및/또는 핵산 포함) 또는 기질에 커플링될 수 있다.

다양한 조성물의 반도체 나노결정 형성은 예를 들어 미국 특허 제 6,927,069 호; 제 6,914,256 호; 제 6,855,202 호; 제 6,709,929 호; 제 6,689,338 호; 제 6,500,622 호; 제 6,306,736 호; 제 6,225,198 호; 제 6,207,392 호; 제 6,114,038 호; 제 6,048,616 호; 제 5,990,479 호; 제 5,690,807 호; 제 5,571,018 호; 제 5,505,928 호; 제 5,262,357 호 및 미국 특허 공보 제 2003/0165951 호 뿐 아니라 PCT 공보 제 99/26299 호 (1999 년 5 월 27 일 공개) 에서 개시된다. 반도체 나노결정이 개별적인 집단이 제조될 수 있는데, 이는 그의 상이한 스펙트럼 특징을 기준으로 확인가능하다. 예를 들어, 그의 조성, 크기 또는 크기 및 조성을 기준으로 상이한 색의 광을 방사하는 반도체 나노결정이 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 프로브에서의 형광 표지로서 적합한, 크기를 기준으로 상이한 파장 (565 nm, 655 nm, 705 nm 또는 800 nm 방사 파장) 에서 광을 방사하는 QUANTUM DOTS 가 Life Technologies (Carlsbad, CA) 로부터 이용가능하다.

추가적인 표지는 예를 들어 방사성동위원소 (예컨대 ³H), 금속 킬레이트 예컨대 방사성 또는 상자성 금속 이온 (예컨대 Gd^{3 +}) 의 DOTA 및 DPTA 킬레이트, 및 리포솜을 포함한다.

핵산 분자 (예컨대 개시된 방법에 의해 생성된 프로브) 와 함께 사용될 수 있는 검출가능한 표지는 또한 효소, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 산 포스파타아제, 글루코오스 옥시다아제, β-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제 또는 β-락타마아제를 포함한다. 검출가능한 표지가 효소를 포함하는 경우, 크로모겐, 형광생성 화합물 또는 광생성 화합물이 효소와 조합으로 사용되어 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있다 (수많은 이러한 화합물은 예를 들어 Life Technologies, Carlsbad, CA 에서 시판됨). 발색 화합물의 특정 예는 디아미노벤지딘 (DAB), 4-니트로페닐포스페이트 (pNPP), 패스트 레드 (fast red), 패스트 블루 (fast blue), 브로모클로로인돌릴 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 (nitro blue) 테트라졸륨 (NBT), BCIP/NBT, AP 오렌지, AP 블루, 테트라메틸벤지딘 (TMB), 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린 술포네이트] (ABTS), o-디아니시딘, 4-클로로나프톨 (4-CN), 니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (ONPG), o-페닐렌디아민 (OPD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토피라노시드 (X-Gal), 메틸움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드 (MU-Gal), p-니트로페닐-α-D-갈락토피라노시드 (PNP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로니드 (X-Gluc), 3-아미노-9-에틸 카르바졸 (AEC), 푹신 (fuchsin), 요오도니트로테트라졸륨 (INT), 테트라졸륨 블루 및 테트라졸륨 바이올렛을 포함한다.

대안적으로, 효소는 금속조직 검출 계획에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 은 제자리 하이브리드화 (SISH) 절차는 하이브리드화된 게놈 표적 핵산 서열의 확인 및 국지화를 위한 금속조직 검출 계획을 포함한다. 금속조직 검출 방법은 알칼리 포스파타아제와 같은 효소를 수용성 금속 이온 및 효소의 산화환원-비활성 기질과 조합으로 사용하는 것을 포함한다. 기질은 효소에 의해 산화환원-활성제로 전환되며, 산화환원-활성제는 금속 이온을 환원시켜, 검출가능한 침전물이 형성되도록 한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호　2005/0100976, PCT 공개 번호 2005/003777 및 미국 특허 출원 공개 번호　2004/0265922 참조). 금속조직 검출 방법은 또한, 산화환원효소 (예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제) 를 수용성 금속 이온, 산화제 및 환원제와 함께 사용하여, 검출가능한 침전물을 다시 형성시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제 6,670,113 호 참조).

비제한적인 예에서, 핵산 프로브 (예컨대 개시된 방법에 의해 생성된 프로브) 는 합텐 분자 (예컨대 니트로-방향족 화합물 (예를 들어 디니트로페닐 (DNP), 비오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌 등) 에 공유 결합된 dNTP 로 표지된다. 합텐과 다른 표지를 dNTP 에 컨쥬게이션시키는 방법 (예를 들어, 표지된 프로브 내로 혼입을 촉진시키기 위한) 은 당업계에 잘 알려져 있다. 절차의 예는, 예를 들어 미국 특허 제 5,258,507 호, 제 4,772,691 호, 제 5,328,824 호 및 제 4,711,955 호를 참조한다. 실제로, 수많은 표지된 dNTP 가, 예를 들어 Life Technologies (Molecular Probes, Eugene, OR) 에서 시판된다. 표지는 dNTP 상의 임의의 위치에서 dNTP 에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다 (예컨대 포스페이트 (예를 들어, α,β 또는 γ 포스페이트) 또는 당). 표지된 핵산 분자의 검출은 게놈 표적 서열에 결합한 합텐-표지된 핵산 분자를 1 차 항-합텐 항체와 접촉시켜 이루어질 수 있다. 한 예에서, 1 차 항-합텐 항체 (예컨대 마우스 항-합텐 항체) 는 효소로 직접 표지된다. 또다른 예에서, 효소에 컨쥬게이션된 2 차 항-항체 (예컨대 염소 항-마우스 IgG 항체) 가 신호 증폭에 사용된다. CISH 에서 발색 기질이 추가되고, SISH 에 대해서, 참조된 특허/출원물에서 개요된 바와 같은 기타 시약 및 은 이온이 추가된다.

일부 예에서, 프로브는 효소적 (중합) 반응을 사용하여 하나 이상의 표지된 dNTP 를 혼입함으로써 표지된다. 예를 들어, 핵산 프로브 (예컨대 2 개 이상의 유일 특이적 결합 부위, 예컨대 플라스미드 벡터 내로 혼입됨) 는 틈 번역 (예를 들어, 비오틴, 2,4-디니트로페놀, 디곡시게닌 등을 사용하여) 또는 말단 트랜스퍼라아제로의 무작위 프라이머 연장 (예를 들어, 3' 말단 테일링) 에 의해 표지될 수 있다. 일부 예에서, 핵산 프로브는 변형된 틈 번역 반응에 의해 표지되는데, 여기서 데옥시리보뉴클레아제 I (DNase I) 에 대한 DNA 중합효소 I 의 비는 100% 초과의 출발 물질이 만들어지도록 변형된다. 특정 예에서, 틈 번역 반응은 DNA 중합효소 I 대 DNase I 를 적어도 약 800:1, 예컨대 적어도 2000:1, 적어도 4000:1, 적어도 8000:1, 적어도 10,000:1, 적어도 12,000:1, 적어도 16,000:1, 예컨대 약 800:1 내지 24,000:1 의 비로 포함하며, 상기 반응은 실제적으로 등온의 온도, 예를 들어 약 16℃ 내지 25℃ (예컨대 실온) 에서 밤새 (예를 들어, 약 16-22 시간 동안) 실행된다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 2009 년 12 월 31 일에 출원한 미국 특허 가출원 제 61/291,741 호 (표제 "Methods and Compositions for Nucleic Acid Labeling and Amplification") 를 참조한다.

핵산 프로브가 다수의 플라스미드 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 플라스미드) 를 포함하는 경우, 플라스미드는 표지 반응 (예컨대 틈 번역 또는 변형된 틈 번역) 을 수행하기 전에 등몰비로 혼합되어, 모든 결합 부위가 표지 후 동등하게 충만한지를 확인할 수 있다.

다른 예에서, 화학적 표지 절차가 또한 이용될 수 있다. 많은 시약 (합텐, 형광단 및 기타 표지된 뉴클레오티드 포함) 및 기타 키트가 핵산의 효소 표지에 대해 시판된다 (본원에 개시된 방법에 의해 제조된 핵산 프로브 포함). 당업자에게 명백한 바와 같이, 상기 개시된 임의의 표지 및 검출 절차는 프로브 표지의 문맥에 있어서, 예를 들어 제자리 하이브리드화 반응에서 사용하기 위해 적용가능하다. 예를 들어, Amersham MULTIPRIME

DNA 표지 시스템, 각종 특정 시약 및 키트 (Molecular Probes/Life Technologies 로부터 이용가능), 또는 임의 기타 유사한 시약 또는 키트가 본원에 개시된 핵산을 표지하는데 사용될 수 있다. 특정 예에서, 개시된 프로브는 합텐, 리간드, 형광 부분 (예를 들어 형광단 또는 반도체 나노결정), 발색 부분 또는 방사성동위원소로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 간접 표지를 위해서는, 표지는 링커 (예를 들어, PEG 또는 비오틴) 를 통해 핵산 분자에 부착될 수 있다.

프로브 핵산 분자를 표지하는데 사용될 수 있는 추가적인 방법이 미국 출원 공개 번호 2005/0158770 에서 제공된다.

VII . 프로브 사용 방법

개시된 방법을 사용하여 제조된 프로브는 핵산 검출, 예컨대 ISH 절차 (예를 들어, 형광 제자리 하이브리드화 (FISH), 발색 제자리 하이브리드화 (CISH) 및 은 제자리 하이브리드화 (SISH)) 또는 비교 게놈 하이브리드화 (CGH) 에 대해 사용될 수 있다. 예시적인 용도를 하기에서 토의한다.

A. 제자리 하이브리드화

제자리 하이브리드화 (ISH) 는 중기 또는 간기 염색체 제조물의 맥락에 있어서 (예컨대 슬라이드 상에 얹은 세포 또는 조직 샘플) 표적 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 표적 핵산 서열) 을 함유하는 샘플을, 표적 핵산 서열 (예를 들어 게놈 표적 핵산 서열) 에 대해 특이적으로 하이브리드화가능하거나 이에 대해 특이적인 표지된 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 슬라이드는, 예를 들어 균일한 하이브리드화를 방해할 수 있는 파라핀 또는 기타 물질을 제거하기 위해 임의로는 전처리된다. 염색체 샘플 및 프로브 모두는 예를 들어 이중 가닥 핵산을 변성시키기 위해 가열 처리된다. 프로브 (적합한 하이브리드화 완충제 중 제형화된) 및 샘플을 하이브리드화가 발생하게 하는데 (통상 평형에 도달시키기에) 충분한 시간 동안 및 조건 하에 조합한다. 염색체 제조물을 세척하여 과량의 프로브를 제거하고, 표준 기술을 사용하여 염색체 표적의 특이적 표지 검출을 수행한다.

예를 들어, 비오틴화 표지는 플루오레세인-표지된 아비딘 또는 아비딘-알칼리 포스파타아제를 사용하여 검출될 수 있다. 형광색소 검출에 대해서, 형광색소는 직접적으로 검출될 수 있거나, 샘플은 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-컨쥬게이션된 아비딘과 함께 인큐베이션될 수 있다. FITC 신호의 증폭은, 필요시, 비오틴-컨쥬게이션된 염소 항-아비딘 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척하고 FITC-컨쥬게이션된 아비딘과 함께 2 차 인큐베이션함에 의해 영향받을 수 있다. 효소 활성에 의한 검출에 대해서, 샘플을 예를 들어 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션하고, 세척하고 비오틴-컨쥬게이션된 알칼리 포스파타아제와 함께 인큐베이션하고, 다시 세척하고 사전-평형화 (예를 들어, 알칼리 포스파타아제 (AP) 완충제 중) 시킬 수 있다. 효소 반응은 예를 들어 NBT/BCIP 를 함유하는 AP 완충제에서 수행될 수 있으며, 2 X SSC 중 인큐베이션에 의해 중단될 수 있다. 제자리 하이브리드화 절차의 일반적 설명에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 제 4,888,278 호를 참조한다.

FISH, CISH 및 SISH 에 대한 많은 절차는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, FISH 를 수행하기 위한 절차는 미국 특허 제 5,447,841 호; 제 5,472,842 호; 및 제 5,427,932 호; 예를 들어, Pinkel et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . 83:2934-2938, 1986; Pinkel et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . 85:9138-9142, 1988; and Lichter et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . 85:9664-9668, 1988 에서 기재되어 있다. CISH 는 예를 들어 Tanner et al ., Am . J. Pathol . 157:1467-1472, 2000 및 미국 특허 제 6,942,970 호에 기재되어 있다. 추가적인 검출 방법은 미국 특허 제 6,280,929 호에서 제공된다.

수많은 시약 및 검출 계획이 FISH, CISH 및 SISH 절차와 함께 이용되어, 감수성, 분해능 또는 기타 필요한 특성을 향상시킬 수 있다. 상기 토의한 바와 같이, 형광단 (형광 염료 및 QUANTUM DOTS

포함) 으로 표지된 프로브는 FISH 수행시 직접적으로 광학 검출될 수 있다. 대안적으로, 프로브는 비-형광 분자, 예컨대 합텐 (예컨대, 이의 비제한적인 예가 하기와 같음: 비오틴, 디곡시게닌, DNP 및 각종 옥사졸, 피라졸, 티아졸, 니트로아릴, 벤조푸라잔, 트리테르펜, 우레아, 티오우레아, 로테논, 쿠마린, 쿠마린계 화합물, 포도필로톡신, 포도필로톡신계 화합물 및 이의 조합), 리간드 또는 기타 간접적으로 검출가능한 부분으로 표지될 수 있다. 이러한 비-형광 분자로 표지된 프로브 (및 이들이 결합하는 표적 핵산 서열) 는 이후 샘플 (예를 들어, 프로브가 결합하는 세포 또는 조직 샘플) 을 표지된 검출 시약, 예컨대 선택된 합텐 또는 리간드에 특이적인 항체 (또는 수용체, 또는 기타 특이적 결합 파트너) 와 접촉시킴으로써 검출될 수 있다. 검출 시약은 형광단 (예를 들어 QUANTUM DOTS

) 또는 또다른 간접적으로 검출가능한 부분으로 표지될 수 있거나, 결국 형광단으로 표지될 수 있는 하나 이상의 추가적인 특이적 결합제 (예를 들어, 2 차 또는 특이적 항체) 와 접촉될 수 있다. 임의로는, 검출가능한 표지는 항체, 수용체 (또는 기타 특이적 결합제) 에 직접적으로 부착된다. 대안적으로는, 검출가능한 표지는 링커, 예컨대 히드라지드 티올 링커, 폴리에틸렌 글리콜 링커, 또는 유사 반응성을 갖는 임의의 다른 유연 부착 부분에 부착된다. 예를 들어, 특이적 결합제, 예컨대 항체, 수용체 (또는 기타 항-리간드), 아비딘 등은 이종이관능성 폴리알킬렌글리콜 링커 예컨대 이종이관능성 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 링커를 통해 형광단 (또는 기타 표지) 으로 공유 변형될 수 있다. 이종이관능성 링커는 예를 들어 카르보닐-반응성 기, 아민-반응성 기, 티올-반응성 기 및 광-반응성 기에서 선택되는 2 개의 상이한 반응성 기를 조합하는데, 이 중 첫 번째 것은 표지에 부착되며 두 번째 것은 특이적 결합제에 부착된다.

다른 예에서, 프로브 또는 특이적 결합제 (예컨대 항체, 예를 들어 1 차 항체, 수용체 또는 기타 결합제) 는 형광생성 또는 발색 조성물을 검출가능한 형광, 유색 또는 다르게는 검출가능한 신호 (예를 들어, SISH 에서의 검출가능한 금속 입자의 침착에서와 같은) 로 전환시킬 수 있는 효소로 표지된다. 상기 나타낸 바와 같이, 효소는 링커를 통해 관련 프로브 또는 검출 시약에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 적합한 시약 (예를 들어, 결합 시약) 및 화학 물질 (예를 들어, 링커 및 부착 화학 물질) 의 예가 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0246524; 2006/0246523 및 2007/0117153 에 기재되어 있다.

추가의 예에서, 신호 증폭 방법은 예를 들어 프로브의 민감성을 증가시키기 위해 이용된다. 특정 예에서, 신호 증폭은 약 5000 bp 이하 (예컨대 약 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900. 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 또는 100 bp) 의 프로브를 이용한다. 당업자는 이에 대해 신호 증폭이 적절한 프로브를 선택할 수 있다. 예를 들어, 티라미드 신호 증폭법 (Tyramide Signal Amplification (TSA^TM)) 으로도 알려져 있는 촉매 리포터 침착법 (Catalyzed Reporter Deposition (CARD)) 을 이용할 수 있다. 이러한 방법의 한 변형에서, 비오틴화 핵산 프로브는 이에 대한 결합에 의해 표적의 존재를 검출한다. 다음으로 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 컨쥬게이트가 추가된다. 상기 스트렙타비딘은 비오틴에 결합한다. 비오틴화 티라미드의 기질 (티라민은 4-(2-아미노에틸)페놀임) 이 사용되는데, 이는 퍼옥시다아제 효소와 상호작용하는 경우 자유 라디칼이 될 가능성이 있다. 페놀 라디칼은 이후 주변 물질과 신속히 반응함으로써, 부근에서 비오틴을 침착시키거나 고정시킨다. 이러한 방법은 보다 많은 기질 (비오틴화 티라미드) 을 제공하고 보다 국지화된 비오틴을 구축함으로써 반복된다. 마지막으로, "증폭된" 비오틴 침착물은 형광 분자에 부착된 스트렙타비딘으로 검출된다. 대안적으로는, 증폭된 비오틴 침착물은 아비딘-퍼옥시다아제 복합체로 검출될 수 있는데, 이는 이후 3,3'-디아미노벤지딘이 공급되어 갈색이 생성된다. 형광 분자에 부착된 티라미드가 또한 효소에 대한 기질로서 역할함으로써, 단계를 제거시켜 절차를 단순화시킨다는 것이 발견되었다.

다른 예에서, 신호 증폭 방법은 분지화된 DNA 신호 증폭을 이용한다. 일부 예에서, 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 (표지 연장제 및 포획 연장제) 가 표적 핵산에 대해 고엄격도로 하이브리드화된다. 포획 연장제는 표적에 대해 하이브리드화되고 프로브를 포획하도록 설계된다 (마이크로웰 플레이트에 부착됨). 표지 연장제는 표적 상 인접 부위에 대해 하이브리드화되고 예비증폭제 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화를 위한 서열이 제공되도록 설계된다. 신호 증폭은 표지 연장제에 대해 하이브리드화하는 예비증폭제 프로브로 시작된다. 상기 예비증폭제는 2 개의 인접 표지 연장제에 대해 하이브리드화하는 경우에만 안정적인 하이브리드를 형성한다. 예비증폭제 상의 다른 부위는 분지화된 구조를 생성시키는 다수의 bDNA 증폭제 분자에 대해 하이브리드화하도록 설계된다. 마지막으로, 알칼리 포스파타아제 (AP)-표지된 올리고뉴클레오티드 (bDNA 증폭제 서열에 대해 상보적임) 가 하이브리드화에 의해 bDNA 분자에 결합한다. bDNA 신호는 AP 반응의 화학발광 산물이다. 예를 들어 Tsongalis, Microbiol . Inf . Dis . 126:448-453, 2006; 미국 특허 제 7,033,758 호를 참조한다.

추가의 예에서, 신호 증폭 방법은 중합된 항체를 이용한다. 일부 예에서, 표지된 프로브는 표지에 대한 1 차 항체 (예컨대 항-DIG 또는 항-DNP 항체) 를 사용하여 검출된다. 1 차 항체는 중합된 2 차 항체 (예컨대 중합된 HRP-컨쥬게이션된 2 차 항체 또는 AP-컨쥬게이션된 2 차 항체) 에 의해 검출된다. AP 또는 HRP 의 효소 반응은 가시화될 수 있는 강력한 신호 형성을 일으킨다.

당업자는, 표지된 프로브-특이적 결합제 쌍을 적절히 선택함으로써 다중 검출 계획이 만들어져 단일 검정 (예를 들어, 단일 세포 또는 조직 샘플 또는 하나 초과의 세포 또는 조직 샘플에 대한) 으로 다수의 표적 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 표적 핵산 서열) 의 검출이 촉진될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 제 1 표적 서열에 상응하는 제 1 프로브는 제 1 합텐, 예컨대 비오틴으로 표지될 수 있는 한편, 제 2 표적 서열에 상응하는 제 2 표지는 제 2 합텐, 예컨대 DNP 로 표지될 수 있다. 샘플을 프로브에 노출시킨 후, 결합한 프로브는 샘플을 제 1 특이적 결합제 (이 경우 제 1 형광단으로 표지된 아비딘, 예를 들어 제 1 의 스펙트럼적으로 구별되는 QUANTUM DOTS

, 예를 들어 585 nm 에서 방사됨) 및 제 2 의 특이적 결합제 (이 경우 제 2 형광단으로 표지된 항-DNP 항체, 또는 항체 단편, 예를 들어, 제 2 의 스펙트럼적으로 구별되는 QUANTUM DOTS

, 예를 들어 705 nm 에서 방사됨) 와 접촉시켜 검출될 수 있다. 추가적인 프로브/결합제 쌍이, 기타 스펙트럼적으로 구별되는 형광단을 사용하는 다중 검출 계획에 추가될 수 있다. 직접 및 간접법 (1 단계, 2 단계 또는 그 이상) 의 수많은 변형이 상상될 수 있으며, 이들 모두는 개시된 프로브 및 검정의 맥락에 있어서 적합하다.

예를 들어 CISH 및 SISH 절차에서 이용되는 바와 같은 특정 검출 방법에 관련된 추가적인 세부사항을 [Bourne, The Handbook of Immunoperoxidase Staining Methods, published by Dako Corporation, Santa Barbara, CA] 에서 찾을 수 있다.

B. 마이크로어레이 적용

비교 게놈 하이브리드화 (CGH) 는 세포의 DNA 함량물에서의 카피 수 변화 (획득/손실) 분석을 위한 분자-세포유전학적 방법이다. 인간 질환에 대한 게놈 구조적 변형의 분포는 희귀한 게놈 장애 (예를 들어, 삼염색체 21, 프라더-윌리 증후군) 및 광범위한 인간 질환, 예컨대 유전적 질환, 자폐증, 정신분열증, 암 및 자가면역 질환에서 발견된다. 한 예에서, 상기 방법은 상이하게 형광 표지된 샘플 DNA (예를 들어, 플루오레세인-FITC 로 표지된) 및 정상 DNA (예를 들어, 로다민 또는 텍사스 레드로 표지된) 를 정상 인간 중기 제조물에 대해 하이브리드화시키는 것을 기반으로 한다. 표면형광 (epifluorescence) 현미경법 및 정량 영상 분석과 같은 당업계에 알려져 있는 방법을 사용하여, 샘플 대 대조군 DNA 의 형광 비에 있어서의 지역차를 검출하고 샘플 세포 게놈에서의 이상 부위를 확인하는데 사용할 수 있다. CGH 는 비균형 염색체 변화 (예컨대 DNA 카피 수에 있어서의 증가 또는 감소) 를 검출한다. 예를 들어 Kallioniemi et al ., Science 258:818-821, 1992; 미국 특허 제 5,665,549 호 및 제 5,721,098 호를 참조한다.

게놈 DNA 카피 수는 또한 어레이 CGH (aCGH) 에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어 Pinkel and Albertson, Nat . Genet . 37:S11-S17, 2005; Pinkel et al ., Nat. Genet . 20:207-211, 1998; Pollack et al ., Nat . Genet . 23:41-46, 1999 를 참조한다. 표준 CGH 와 유사하게, 샘플 및 참조 DNA 는 별도로 표지되고 혼합된다. 그러나 aCGH 에 대해서, DNA 혼합물은 다수의 정의된 DNA 프로브 (예컨대 관심 게놈 표적 핵산에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 프로브) 를 함유하는 슬라이드에 대해 하이브리드화된다. 어레이 내 각각의 프로브에서의 형광 세기 비는 샘플에서의 DNA 획득 또는 손실의 부위를 평가하는데 사용되는데, 이는 변경된 형광 세기를 나타내는 특정 프로브를 기준으로, CGH 보다 미세하게 세부적으로 맵핑될 수 있다.

일반적으로, CGH (및 aCGH) 는 특정 게놈 DNA 또는 염색체 부위의 정확한 카피 수에 대한 것과 같은 정보를 제공하지 않는다. 대신에, CGH 는 한 샘플 (예컨대 종양 샘플) 의 또다른 샘플 (예컨대 참조 샘플, 예를 들어 비-종양 세포 또는 조직 샘플) 과 비교한 상대 카피 수에 대한 정보를 제공한다. 따라서, CGH 는 표적 핵산의 게놈 DNA 카피 수가 참조 샘플 (예컨대 비-종양 세포 또는 조직 샘플) 과 비교하여 증가하거나 감소하는지 여부를 측정함으로써 참조 샘플에 대한 표적 핵산 샘플의 카피 수 변화를 측정하는데 가장 유용하다.

특정 예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 프로브 (예를 들어, 하나 이상의 개별적인 유전자 (유전자의 코딩 및/또는 비-코딩 부위 포함), 염색체의 하나 이상의 부위 (예를 들어, 하나 이상의 관심 유전자 또는 알려져 있지 않은 유전자 포함 부위) 또는 하나 이상의 전체 염색체로부터의 유일 특이적 결합 부위를 포함하는 프로브) 를 aCGH 에 대해 이용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조된 미표지 프로브는 고형 표면 (예컨대 니트로셀룰로오스, 나일론, 유리, 셀룰로오스 아세테이트, 플라스틱 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌), 종이, 세라믹, 금속 등) 상에 고정될 수 있다. 고형 표면 상에 핵산을 고정시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Bischoff et al ., Anal . Biochem . 164:336-344, 1987; Kremsky et al ., Nuc . Acids Res. 15:2891-2910, 1987 참조). 상기 토의한 바와 같이, 상이하게 형광 표지된 샘플 DNA (예를 들어, 플루오레세인-FITC 로 표지된) 및 참조 DNA (예를 들어, 로다민 또는 텍사스 레드로 표지된) 를 프로브 어레이에 대해 하이브리드화하고, 샘플 대 참조 DNA 의 형광 비에 있어서의 지역차를 검출하고 샘플 세포 게놈 내의 이상 부위를 확인하는데 사용할 수 있다.

또다른 예에서, 본원에 기재된 바와 같이 설계된 유일 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 고형 표면 (예컨대 니트로셀룰로오스, 나일론, 유리, 셀룰로오스 아세테이트, 플라스틱 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌), 종이, 세라믹, 금속 등) 상에서 제자리 합성된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정의된 유일 특이적 분절은 컴퓨터 기반 마이크로어레이 프린팅 방법 (예컨대 미국 특허 제 6,315,958 호; 제 6,444,175 호; 및 제 7,083,975 호 및 미국 특허 출원 번호 2002/0041420, 2004/0126757, 2007/0037274 및 2007/0140906 에 기재된 것들) 을 이용하여 고형 표면 상에 올리고뉴클레오티드 프로브를 제자리 프린팅하는데 이용된다. 일부 예에서, 마스크리스 (maskless) 어레이 합성 (MAS) 기기를 사용하여, 마이크로어레이 상에 제자리 합성된 올리고뉴클레오티드는 조사자의 특정 필요사항을 기준으로 어레이가 개별적으로 맞춤화되게 하는 소프트웨어 제어 하에 있다. 마이크로어레이 상에 합성된 유일 특이적 올리고뉴클레오티드의 수는, 예를 들어 다양한 형태로, 현재 도처에 50,000 내지 2,100,000 개 프로브로 가변적이며, 단일 마이크로어레이 슬라이드 상에 합성될 수 있다 (예를 들어, Roche NimbleGen CGH 마이크로어레이는 어레이 당 385,000 내지 4,000,000 개 이상의 프로브/어레이를 함유함).

유일 특이적 올리고뉴클레오티드는 MAS 기기에 의해, 또는 대안적으로는 미국 특허 제 5,143,854 호; 제 5,424,186 호; 제 5,405,783 호; 및 제 5,445,934 호에서 기재된 바와 같은 사진 석판술 방법을 이용하여 제자리 합성된다. 마이크로어레이 적용을 위해 개시된 유일 특이적 프로브를 이용하는 것은 이의 제조 방법에 의해 제한되지 않으며, 숙련된 기술자는 그에 대해 동일하게 적용가능한 유일 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브로 마이크로어레이를 생성시키는 추가적인 방법을 이해할 것이다. 예를 들어, 핵산 서열을 고체 지지체 상에 스팟화시키는 조직화적 방법이 또한 고려되어, 조직학적으로 이용된 핵산 프로브가 본원에 기재된 유일 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 대체된다. 마이크로어레이 상에 프로브를 위치시키는데 사용한 방법에 관계없이, 유일 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 개별적으로 또는 동일 어레이 상에서 하나 이상의 핵산 샘플을 표적화하는데 사용될 수 있다.

제자리 합성되거나 다르게는 마이크로어레이 슬라이드 상에 고정된 본원에 설계된 바와 같은 유일 특이적 프로브의 적용은 aCGH 뿐 아니라 기타 마이크로어레이 기반 게놈 표적 농축 적용 (예컨대 미국 특허 공보 제 2008/0194413 호, 제 2008/0194414 호, 제 2009/0203540 호 및 제 2009/0221438 호에 기재된 것들) 에 대해 이용될 수 있다. 제자리 합성된 마이크로어레이를 생성시키기 위해 유일 특이적 프로브를 이용하는 것은 현재 마이크로어레이 프로브 설계에 대해 많은 향상을 제공한다. 예를 들어, 유일 특이적 프로브의 사용은 현재의 프로브에 비해 표적 서열의 더욱 특이적인 결합을 가능하게 하여, 표적 당 많은 프로브가 필요하지 않고/않거나 이와 함께 추가적인 표적을 포획하기 위해 더 많이 추가할 수 있다. 또한, 유일 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하는 경우, 통상 마이크로어레이 실험에서 블로킹 DNA (예를 들어, Cot-1^TM DNA) 를 이용할 필요성이 감소되거나 제거된다.

CGH 적용에 대해서, 통상 표적 및 참조 게놈 DNA 모두가, 하나의 마이크로어레이 기질에 대한 비교를 위해 한 어레이 상에서 하이브리드화된다. CGH 분석 사용자 지침 (버전 5.1, Roche NimbleGen, Madison, WI; nimblegen.com 에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능함) 은 마이크로어레이를 이용하여 CGH 분석을 수행하기 위한 방법을 기재한다. 일반적으로, 2 개 게놈 DNA 샘플, 표적 샘플 및 표준 샘플은 단편화되며 상이한 검출 부분 (예를 들어, Cy-3 및 Cy-5 형광 부분) 으로 표지된다. 2 개의 표지된 샘플은 혼합되고 마이크로어레이 지지체에 대해 하이브리드화되는데, 이러한 경우 마이크로어레이는 유일 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고, 상기 마이크로어레이는 이후 검출 부분 모두에 대해 검정된다. 예를 들어 마이크로어레이를 마이크로어레이 스캐너 (예를 들어, MS200 마이크로어레이 스캐너; Roche NimbleGen) 로 스캐닝하여, 마이크로어레이를 스캐닝하고 검출 데이터를 캡쳐한다. 분석 소프트웨어 (예를 들어, NimbleScan; Roche NimbleGen) 를 사용하여 데이터를 분석한다. 표적 게놈 서열 데이터를 참조물과 비교하고, 표적 샘플 내 DNA 카피 수 획득 및 손실을 이로써 분석한다. 표적 게놈 서열은, 예를 들어 하나 이상의 염색체(들) (하나는 전체 염색체) 의 표적 부위(들), 또는 유기체의 총 게놈 보체 (예를 들어, 포유동물 게놈, 예를 들어 인간 게놈과 같은 진핵세포 게놈) 로부터의 것일 수 있다.

게놈 농축 (genomic enrichment) (서열 포획으로도 알려져 있음) 에 대해서, 통상 게놈 샘플은 서열분석과 같은 다운스트림 적용 전에 특정 표적 농축에 대한 표적화된 서열 특이적 프로브를 포함하는 마이크로어레이 지지체에 대해 하이브리드화된다. 서열 포획 사용자 지침 (버전 3.1, Roche NimbleGen, 본원에 참조로 포함됨) 은 게놈 농축을 수행하기 위한 방법을 기재한다. 일반적으로, 게놈 DNA 샘플은 마이크로어레이 지지체에 대한 하이브리드화를 위해 제조되며, 이러한 경우 마이크로어레이는 농축을 위해 게놈 샘플로부터 표적화 서열을 포획하도록 설계된 개시된 유일 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 포획된 게놈 서열은 이후 마이크로어레이 지지체로부터 용리되고 서열분석되거나, 다른 적용에 사용된다.

C. 블로킹 DNA

게놈-특이적 블로킹 DNA (예컨대 인간 DNA, 예를 들어, 총 인간 태반 DNA 또는 Cot-1^TM DNA) 가 통상 하이브리드화 용액 (예컨대 제자리 하이브리드화 또는 CGH 용) 에 포함되어, 반복 DNA 서열에 대한 프로브 하이브리드화를 억제하거나 고도로 상동인 (종종 동일한) 비표적 (off target) 서열에 대응한다 (인간 게놈 표적 핵산에 대해 상보적인 프로브를 이용하는 경우). 게놈-특이적 블로킹 DNA 의 부재 하, 표준 프로브와의 하이브리드화에서, 심지어 "반복물-미함유" 프로브를 사용하는 경우에도, 허용가능하지 않게 높은 수준의 배경 염색 (예를 들어, 비-특이적 결합, 예컨대 비-표적 핵산 서열에 대한 하이브리드화) 이 통상 존재한다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 핵산 프로브는, 블로킹 DNA 의 부재 하에서도 감소된 배경 염색을 나타낸다. 특정 예에서, 개시된 유일 특이적 프로브를 포함하는 하이브리드화 용액은 게놈-특이적 블로킹 DNA (예를 들어, 총 인간 태반 DNA 또는 Cot-1^TM DNA, 프로브가 인간 게놈 표적 핵산에 대해 상보적인 경우) 를 포함하지 않는다. 이러한 이점은 핵산 프로브 내에 포함되는 표적 서열의 유일 특이적 성질에서 유래하며; 각각의 표지된 프로브 서열은 오직 관련이 있는 유일 특이적 게놈 서열에만 결합한다. 이는 ISH 및 CGH 기술을 위한 노이즈 비율에 대한 신호에 있어서 극적인 증가를 야기한다.

하이브리드화 실험에 블로킹 DNA 를 포함시키는 것은, 배경 염색의 원인이 될 수 있는 추가적인 원치 않는 변수를 추가하는 것뿐 아니라 하이브리드화 실험의 고가 성분을 추가한다. 일부 예에서, 본 개시물의 방법을 사용하여 생성된 유일 특이적 프로브를 이용함으로써, 실험적 가변성, 배경 염색 및 추가적인 실험 비용이 우회될 수 있다.

일부 예에서 하이브리드화 용액은 상이한 유기체로부터의 담체 DNA (예를 들어, 연어 정자 DNA 또는 청어 정자 DNA, 게놈 표적 핵산이 인간 게놈 표적 핵산인 경우) 를 함유하여, 음성으로 하전된 프로브 DNA 에 대해 비-특이적으로 결합할 수 있는 높은 순 양전하를 갖는 비-DNA 물질 (예를 들어 반응 용기 또는 슬라이드) 에 대한 프로브의 비-특이적 결합을 감소시킬 수 있다.

VIII . 키트

상기 기재된 바와 같이 생성된 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 2 개이상의 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 프로브를 포함하는 키트가 또한 본 개시물의 특성이다. 예를 들어, FISH, CISH 및/또는 SISH 와 같은 제자리 하이브리드화 절차에 대한 키트는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 프로브 (예컨대 2 개 이상, 3 개 이상, 5 개 이상 또는 10 개 이상의 프로브) 를 포함한다. 또다른 예에서, 어레이 CGH 에 대한 키트는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 프로브를 포함한다. 따라서, 키트는 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 2 개 이상의 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 프로브를 포함할 수 있다.

키트는 또한 제자리 하이브리드화 또는 CGH 검정을 수행하기 위한, 또는 프로브를 제조하기 위한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 유일 특이적 핵산 프로브 (또는 이러한 프로브 집단) 을, 하나 이상의 완충제, 표지된 dNTP, 표지 효소 (예컨대 중합효소), 프라이머, 뉴클레아제 미함유수, 및 표지된 프로브 제조에 대한 지시사항과 함께 포함할 수 있다.

한 예에서, 키트는 하나 이상의 유일 특이적 핵산 프로브 (미표지 또는 표지된) 를, 제자리 하이브리드화를 수행하기 위한 완충제 및 기타 시약과 함께 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 미표지된 유일 특이적 핵산 프로브가 키트에 포함되는 경우, 표지 시약이 또한, 제자리 하이브리드화 검정을 수행하기 위한 특이적 검출제 및 기타 시약, 예컨대 파라핀 전처리 완충제, 프로테아제(들) 및 프로테아제 완충제, 예비하이브리드화 완충제, 하이브리드화 완충제, 세척 완충제, 대비염색제(들), 봉입제 또는 이의 조합과 함께 포함될 수 있다. 일부 예에서, 이러한 키트 성분은 별개의 용기에 존재한다.

키트는 임의로는, 프로브의 신호 및 하이브리드화를 평가하기 위한 대조군 슬라이드를 추가로 포함할 수 있다.

특정 예에서, 키트는 아비딘, 항체 및/또는 수용체 (또는 기타 항-리간드) 를 포함한다. 임의로는, 하나 이상의 검출제 (1 차 검출제, 및 임의로는 2 차, 3 차 또는 추가적인 검출 시약) 는 예를 들어 합텐 또는 형광단 (예컨대 형광 염료 또는 QUANTUM DOT

) 으로 표지된다. 일부 예에서, 검출 시약은 상이한 검출가능한 부분 (예를 들어, 상이한 형광 염료, 스펙트럼적으로 구별가능한 QUANTUM DOT

, 상이한 합텐 등) 으로 표지된다. 예를 들어, 키트는 상이한 게놈 표적 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 개시된 임의의 표적 서열) 에 대해 하이브리드화할 수 있으며 이에 상응하는 둘 이상의 상이한 유일 특이적 핵산 프로브를 포함할 수 있다. 제 1 프로브는 제 1 의 검출가능한 표지 (예를 들어, 합텐, 형광단 등) 로 표지될 수 있으며, 임의의 추가적인 프로브 (예를 들어, 제 3, 제 4, 제 5 등) 는 추가적인 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 다른 검출 계획이 가능하지만, 제 1, 제 2, 및 임의의 후속 프로브는 상이한 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 프로브(들) 가 합텐과 같은 간접적으로 검출가능한 표지로 표지되는 경우, 상기 키트는 일부 또는 모든 프로브에 대한 검출제 (예컨대 표지된 아비딘, 항체 또는 기타 특이적 결합제) 를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 키트는 다중 ISH 에 적합한 검출 시약 및 프로브를 포함한다.

한 예에서, 키트는 또한 항체 컨쥬게이트, 예컨대 표지 (예를 들어, 효소, 형광단 또는 형광 나노입자) 에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다. 일부 예에서, 상기 항체는 링커, 예컨대 PEG, 6X-His, 스트렙타비딘 및 GST 를 통해 표지에 컨쥬게이션된다.

또다른 예에서, 키트는 고형 지지체 (예컨대 어레이) 에 부착된 하나 이상의 유일 특이적 핵산 프로브를, CGH 를 수행하기 위한 완충제 및 기타 시약과 함께 포함한다. 샘플 및 대조군 DNA 를 표지하기 위한 시약이 또한, aCGH 검정을 수행하기 위한 기타 시약, 예비하이브리드화 완충제, 하이브리드화 완충제, 세척 완충제 또는 이의 조합과 함께 포함될 수 있다. 키트는 임의로는, 표지된 DNA 의 신호 및 하이브리드화를 평가하기 위해 대조군 슬라이드를 추가로 포함할 수 있다.

하기의 비제한적인 실시예에 의해 본 개시물을 추가로 설명한다.

실시예

실시예 1

유일 특이적 유전자 프로브의 생성

이 실시예는 유일 특이적 핵산 서열로 이루어지는 유전자 프로브의 설계 및 제조를 기재한다.

유일 특이적 유전자 프로브를 생성하기 위해서, 염기 쌍 115809695-116513594 사이에 위치한 MET 유전자를 포함하는 인간 염색체 7q31.2 의 대략 700,000 bp 부위 (2006 년 3 월 [hg18] 인간 게놈의 구축; UCSC 게놈 브라우저; genome.ucsc.edu 사용) 를 선택하였다. RepeatMasker 를 사용하여 반복 핵산 서열을 확인하기 위해 서열을 스크리닝하고, 나열하고, 반복 요소 내 bp 수에 의해 대체된 반복 서열을 갖는 100 bp 분절로 분리하였다 (도 1). 상기 부위 내 반복물-미함유 100 bp 분절을 이후 BLAT (BLAST-유사 정렬 도구) 로 분석하였다. 염색체 7 또는 임의 다른 인간 염색체의 임의 다른 부위에 대해 어떠한 서열 동일성도 갖지 않은 분절을 유일 특이적 핵산 서열로서 확인하였다.

예를 들어, 100 bp 분절 (염색체 7 의 뉴클레오티드 116103296-116103395) 은 염색체 3, 16 및 10 상의 서열에 대한 서열 동일성 부위를 가졌다 (도 2A). 그러므로, 이러한 서열은 유일 특이적 핵산 서열이 아니며 유일 특이적 유전자 프로브에 포함되지 않았다. 반대로, 또다른 100 bp 분절 (염색체 7 의 뉴클레오티드 115809695-115809794) 은 인간 게놈의 임의 다른 부위에 대한 서열 동일성의 임의 부위를 갖지 않았다 (도 2B). 그러므로, 이러한 서열은 유일 특이적 핵산 서열이며 유일 특이적 유전자 프로브에 포함되었다.

유일 특이적 MET 프로브 서열의 요약
플라스미드 명칭	플라스미드 삽입물 크기 (프 로브 길이)	염색체 7 과의 동일성	염색체 7 bp 시작	염색체 7 bp 종료	염색체 스팬 (bp 스팬 )
MET 플라스미드 1	5500	100.00%	115809695	116504794	695,099
MET 플라스미드 2	5499	100.00%	115812695	116505594	692,899
MET 플라스미드 3	5500	100.00%	115817594	116512994	695,400
MET 플라스미드 4	5300	100.00%	115820694	116513194	692,500
MET 플라스미드 5	5400	100.00%	115822495	116513594	691,099
총 합	27199	100.00%			703,899

700,000 염기 쌍 부위의 1 패스 후, 273 개의 유일 특이적 100 bp 서열을 확인하였다. 각각의 유일 특이적 100 bp 서열을 올리고뉴클레오티드로서 합성하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드를 멤브레인 상에 스팟화하였다 (스팟 당 15 ㎍ 올리고뉴클레오티드). 멤브레인을 2 시간 동안 42℃ 에서, 50% 포름아미드 및 1 mg/㎖ 연어 정자 DNA (Life Technologies, Carlsbad, CA) 를 함유하는 완충제로 예비하이브리드화하였다. 틈 번역된 인간 태반 DNA 프로브 (틈 번역을 통해 DNP-dCTP 로 표지됨; Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, ³²P-dNTP 에 대해 합텐-표지된 dCTP 치환함) 를 최종 농도 1 ㎍/㎖ 로 추가하고, 18 내지 24 시간 동안 42℃ 에서 인큐베이션하였다. 프로브 하이브리드화 후, 멤브레인을 1% Brij 35 와 함께 2x SSC 를 함유하는 완충제로 42℃ 에서 3 회 세척하였다. 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이션된 마우스 단일클론 항-DNP 항체 (Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 066K4842) 를 사용하여, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 사제 CDP Star 검출 키트를 사용하여 프로브 하이브리드화를 검출하였다. 프로브는 임의의 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하지 않았는데 (도 3), 이는 모든 확인된 서열이 인간 게놈에 대해 유일 특이적이었다는 것을 나타낸다.

서열을, 5 개의 대략 5500 bp 분절에서 초기에 구조화하였다. 표적 내에서 발생하는 순서로 서열을 구조화한 후, 제 1 플라스미드가 서열 1, 6, 11, 16 등을 함유하고; 제 2 플라스미드가 서열 2, 7, 12, 17 등을 함유하고; 제 3 플라스미드가 서열 3, 8, 13, 18 등을 함유하고; 제 4 플라스미드가 서열 4, 9, 14, 19 등을 함유하고; 제 5 플라스미드가 서열 5, 10, 15, 20 등을 함유하도록 플라스미드 내에 위치시켰다. 각각의 초기 순서화된 5500 bp 분절을 BLAT 를 사용하여 분석하여, 임의의 비-유일 특이적 핵산 서열이 생성되었는지를 측정하였다. 초기 5500 bp 분절 중 하나는 비-유일 특이적 핵산 서열을 야기하였다. 비-유일 특이적 핵산 서열을 생성시킨 100 bp 분절을 3' 말단 순서로 이동시켰으며; 이러한 배치는 유일 특이적 핵산 서열로만 이루어지는 5500 bp 분절을 야기하였다.

각각의 5500 bp 서열을 시험관내 합성하고 (GeneArt, Regensburg, Germany) 변형된 pUC 플라스미드 백본 내로 삽입하였다. 총 27,199 bp 의 서열을 함유하는 5 개 플라스미드를 생성시켰다. 플라스미드를 등몰비로 함께 수집하고, 제자리 하이브리드화에서 사용하기 위해 틈 번역에 의해 표지하였다 (실시예 2 참조). 틈 번역 반응물은 DNA 1 ㎍ 당 8 U DNA 중합효소 I (Roche Applied Science) 및 0.0025 U DNaseI (Roche Applied Science), 3 mM MgCl₂, 및 2:1 DNP-dCTP:dCTP (66 μM:34 μM) 를 포함하였고, 22℃ 에서 17 시간 동안 인큐베이션되었다.

인간 염색체 15q26 의 대략 1,000,000 bp 부위를 선택하여 IGF1R 프로브를 생성시켰다. 서열 분석, 도트-블롯팅 및 배열을 MET 프로브에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 생성된 플라스미드는 하기 표 2 에 나타낸 바와 같다.

유일 특이적 IGF1R 프로브 서열의 요약
플라스미드 명칭	플라스미드 삽입물의 크기 (프 로브 길이)	염색체 15 와의 동일성	염색체 15 염기 쌍 시작	염색체 15 염기 쌍 종료	염색체 스팬 (염기 쌍 스팬)
IGF1R 플라스미드1	5300	100.00%	96661884	96826583	164,700
IGF1R 플라스미드2	5303	100.00%	96828084	97015583	187,500
IGF1R 플라스미드3	5300	100.00%	97016784	97107783	91,000
IGF1R 플라스미드4	5300	100.00%	97112884	97216783	103,900
IGF1R 플라스미드5	5200	100.00%	97216984	97309083	92,100
IGF1R 플라스미드6	5000	100.00%	97309584	97481983	172,400
IGF1R 플라스미드7	5200	100.00%	97482284	97674883	192,600
TOTAL	36,603	100.00%			1,012,999

인간 염색체 12p12.1 의 대략 1,000,000 bp 부위를 선택하여 KRAS 프로브를 생성하였다. 서열 분석, 도트-블롯팅 및 배열을 MET 프로브에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 생성된 플라스미드는 하기 표 3 에 나타낸 바와 같다.

유일 특이적 KRAS 프로브 서열의 요약
플라스미드 명칭	플라스미드 삽입물의 크기 (프 로브 길이)	염색체 12 와의 동일성	염색체 12 염기 쌍 시작	염색체 12 염기 쌍 종료	염색체 스팬 (염기 쌍 스팬 )
KRAS 플라스미드1	5300	100.00%	25610831	25783130	172,300
KRAS 플라스미드2	5600	100.00%	25426731	25601430	174,700
KRAS 플라스미드3	5500	100.00%	25265931	25425430	159,500
KRAS 플라스미드4	5500	100.00%	25045731	25261430	215,700
KRAS 플라스미드5	5500	100.00%	24886231	25042430	156,200
KRAS 플라스미드6	5500	100.00%	24788631	24885730	971,00
TOTAL	33,100	100.00%			994,499

인간 염색체 18p11.32 의 대략 1,000,000 bp 부위를 선택하여 TS 프로브를 생성하였다. 서열 분석, 도트-블롯팅 및 배열을 MET 프로브에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 생성된 플라스미드는 하기 표 4 에 나타낸 바와 같다.

유일 특이적 TS 프로브 서열의 요약
플라스미드 명칭	플라스미드 삽입물의 크기 (프 로브 길이)	염색체 18 과의 동일성	염색체 18 염기 쌍 시작	염색체 18 염기 쌍 종료	염색체 스팬 (염기 쌍 스팬 )
TS 플라스미드 1	4858	100.00%	649404	763303	113,900
TS 플라스미드 2	4859	100.00%	763304	895303	132,000
TS 플라스미드 3	4859	100.00%	896704	1040903	144,200
TS 플라스미드 4	4855	100.00%	1063804	1294103	230,300
TS 플라스미드 5	4855	100.00%	1294804	1480703	185,900
TS 플라스미드 6	4460	100.00%	1490104	1642803	152,700
TOTAL	28,746	100.00%			993,399

실시예 2

유일 특이적 프로브와 반복물 -미함유 프로브와의 비교

이 실시예는 유일 특이적 프로브 및 반복물-미함유 프로브의 제자리 하이브리드화에 대한 성능을 비교한다.

유일 특이적 MET 프로브를 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 제조하였다. 염색체 7q31.2 의 500,000 bp 부위 내 156 개 비-반복 DNA 서열을 PCR 증폭하여 반복물-미함유 MET 프로브를 제조하였다. 반복물 미함유 MET 프로브는 MET 유전자 서열을 포함하는 7q31.2 에서 염색체 7 상의 대략 425,000 bp 의 전체 범위를 갖는다. PCR 후, 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 도트 블롯을 사용하여 정제된 암플리콘을 스크리닝하였다. 인간 DNA 프로브에 대해 하이브리드화하지 않은 PCR 단편을 등몰 농도로 함께 모으고, DNA 리가아제를 사용하여 함께 무작위 라이게이션하였다. Whole Genome Amplification (Qiagen, Valencia, CA) 을 사용하여, 생성된 라이게이션된 연결 DNA 산물을 증폭하였다.

유일 특이적 프로브 및 반복물-미함유 프로브 모두를 은 제자리 하이브리드화 (SISH) 검출과 함께 Ventana BENCHMARK XT 상에서 사용하였다. 프로브를 실시예 1 에서 기재된 바와 같은 틈 번역을 사용하여 DNP-dCTP 로 표지하였다. 반복물-미함유 프로브를, 2 mg/㎖ 인간 태반 블로킹 DNA 와 함께 10 ㎍/㎖ 의 농도로 사용하였다 (도 4A, 좌측 패널). 유일 특이적 프로브를, 1 mg/㎖ 전단 연어 정자 DNA (Life Technologies) 와 함께 20 ㎍/㎖ 의 농도로 사용하였다 (도 4A, 우측 패널). 유일 특이적 프로브로의 염색은 반복물-미함유 프로브로의 염색과 비슷하였으나, 인간 DNA 블로킹 시약은 필요하지 않았다.

유일 특이적 IGF1R 프로브를 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 제조하였다. 염색체 15q26.3 의 500,000 bp 부위 내 200 개 비-반복 DNA 서열을 PCR 증폭시켜 반복물-미함유 IGF1R 프로브를 제조하였다. PCR 후, 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 도트 블롯을 사용하여, 정제된 암플리콘을 스크리닝하였다. 인간 DNA 프로브에 대해 하이브리드화하지 않은 PCR 단편을 등몰 농도로 함께 모으고, DNA 리가아제를 사용하여 함께 무작위 라이게이션하였다. Whole Genome Amplification (Qiagen) 을 사용하여, 생성된 라이게이션된 연결 DNA 산물을 증폭하였다.

유일 특이적 IGF1R 프로브 및 반복물-미함유 IGF1R 프로브를 은 제자리 하이브리드화 (SISH) 검출과 함께 Ventana BENCHMARK XT 상에서 사용하였다. 프로브를 실시예 1 에서 기재된 바와 같은 틈 번역을 사용하여 DNP-dCTP 로 표지하였다. 반복물-미함유 IGF1R 프로브를, 2 mg/㎖ 전체 남성 태반 인간 DNA 와 함께 10 ㎍/㎖ 의 농도로 사용하였다 (도 4B, 좌측 패널). 유일 특이적 IGF1R 프로브를, 0.25 mg/㎖ 인간 태반 블로킹 DNA 및 1.75 mg/㎖ 전단 연어 정자 DNA 와 함께 30 ㎍/㎖ 의 농도로 사용하였다 (도 4B, 우측 패널).

실시예 3

블로킹 DNA 존재 및 부재 하의 프로브 하이브리드화 비교

이 실시예는 제자리 하이브리드화에서 본 개시물의 유일 특이적 프로브를 사용하는 경우 블로킹 DNA 가 필요하지 않다는 것을 입증하는 실험을 기재한다.

폐암 시험 조직 어레이 슬라이드를 US Biomax, Inc. (Rockville, MD; 카탈로그 번호 TMA-T044) 에서 입수하였다. MET, IGF1R, KRAS 및 TS 에 대한 유일 특이적 프로브를 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 생성하였다.

폐암 슬라이드를 BENCHMARK XT 시스템 (Ventana Medical Systems) 상에서 처리하고 염색하고, SISH 검출에 의해 검출하였다. 제자리 하이브리드화를, 담체 DNA (1 mg/㎖ 의 청어 DNA; Roche Diagnostics) 의 존재 하 0.1 mg/㎖ 인간 태반 블로킹 DNA (hpDNA) 의 존재 또는 부재 하에 10 ㎍/㎖ 의 틈-표지된 유일 특이적 프로브 DNA 로 수행하였다. 도 5A-D 에서 나타낸 바와 같이, 유일 특이적 프로브를 사용하는 경우, 하이브리드화 동안 블로킹 DNA 가 필요하지 않았다. 일반적으로, 인간 블로킹 DNA 를 생략한 경우, 프로브 신호는 동등하거나 심지어 더 양호하였다.

실시예 4

경험적 선택을 이용하는 유일 특이적 프로브 생성

인간 염색체 11q31.2 의 대략 1,000,000 bp 부위를 선택하여 CCND1 프로브를 생성하였다. MATLAB

소프트웨어를 사용하여, 획득한 표적 서열을 10 bp 로 타일링하여 100 bp 서열로 분리하였다. 모든 100 bp 후보 서열의 나열 후, 구아노신 및 시토신의 % 를 MATLAB

에서 측정하고, 65% 초과 및 35% 미만의 모든 서열을 제거하였다. 남아 있는 후보 100 bp 서열을 NimbleGen 2.1M CGH 슬라이드 상에서 프린팅하고, 총 인간 게놈 프로브, 및 Cot-1^TM DNA 프로브로 NimbleGen 방법에 따라 동시에 프로브하였다. 양성 대조군 (양성 DNA 서열은 ALU1, D17Z1 알파 위성, Sau3 LINE 요소 및 pHuR93Telo 말단소체 반복 요소임) 및 음성 대조군 (벼 게놈으로부터의 DNA 서열) 을 어레이에 포함시켜, 선택 기준에 대한 절삭값을 확립하였다. 58 개 벼 게놈 서열을 오리자 사티바 (Oryza sativa) 의 염색체 5 로부터 선택하였다 (염기 쌍 20,000,000 에서 21,000,000). 데이터 획득 및 정규화는 NimbleGen 에 의해 제공되었다. MATLAB

을 사용하여 NimbleGen 데이터를 분석하고, 모든 양성 대조군 서열의 선형 회귀를 유도한 후 1 표준 편차에 의해 선형 회귀를 감소시켜 서열 선택 기준을 확립하였다. 음성 대조군 서열의 총 인간 게놈 DNA 스코어의 평균을 사용하여 음성 대조군 (벼 DNA 서열) 에 대한 절삭값을 확립하였다. ALU1 서열로부터의 최소 인간 게놈 스코어를 사용하여 2 개의 추가적인 절삭값을 생성시키고, Cot-^TM 스코어에 대한 명백한 (hard) 절삭값을 12 에서 설정하였다 (도 6A).

이후 MATLAB

를 이용하여 중복 후보 서열을 제거하였다. 게놈 표적 상에 나타나게 하기 위해서, 500 개의 100 bp 유일 특이적 후보 서열을 5000 bp 연결 서열로 구조화하였다. 5000 bp 서열을 이후 시험관내 합성하고 (GeneWiz, South Plainfield, NJ) 변형된 pUC 플라스미드 백본 내로 삽입하였다. 각각 5000 bp 의 서열을 함유하는 10 개 플라스미드를 합성하였다.

인간 염색체 12q14.1 의 대략 1,000,000 bp 부위를 선택하여 CDK4 프로브를 생성하였다. 서열 분석, 어레이 분석 및 배열을 CCND1 프로브에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다 (도 6B).

인간 염색체 6q23.3 의 대략 1,000,000 bp 부위를 선택하여 Myb 프로브를 생성하였다. 서열 분석, 어레이 분석 및 배열을 CCND1 프로브에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다 (도 6C).

플라스미드 수집, 각각의 프로브로의 표지 및 염색을 MET 프로브에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다 (실시예 1). 각각의 프로브를 인간 태반 블로킹 DNA 를 사용하지 않고 BioMax 폐암 어레이에 대해 하이브리드화하고, SISH 를 사용하여 검출하였다 (도 7A-C).

실시예 5

단일 플라스미드 프로브로의 제자리 하이브리드화

인간 염색체 7p11.2 의 대략 60,000 bp 부위를 선택하여 EGFR 프로브를 생성하였다. 서열 분석, 어레이 분석 및 배열을 CCND1 프로브에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으나 (실시예 4), 단, 단일 5000 bp 플라스미드만을 프로브로서 사용하였다. EGFR 프로브 (5 ㎍/㎖) 를 인간 태반 블로킹 DNA 를 사용하지 않고 BioMax 폐암 어레이에 대해 하이브리드화하고, 히드록시퀴녹살린 (HQ) 에 컨쥬게이션된 HRP 활성화 티라미드를 사용하여 검출한 후, HRP 에 컨쥬게이션된 항-HQ 단일클론 항체를 사용하여 SISH 검출하였다 (도 8).

실시예 6

마이크로어레이 방법

이 실시예는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 유일 특이적 프로브의 성능을, 비교 게놈 하이브리드화 (CGH) 어레이에 대해 하이브리드화된 이전에 이용한 방법에 의해 생성된 반복물-미함유 프로브와 비교하기 위한 방법을 기재한다.

유일 특이적 프로브를 실시예 1 또는 실시예 4 에서 기재된 바와 같이 생성하였다 (예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 프로브). 동일한 표적 핵산 (예컨대 EGFR) 에 대해 하이브리드화하는 반복물-미함유 프로브를 당업계에 이전에 알려져 있는 방법에 의해 생성하였다 (예를 들어, 실시예 2 에 기재된 방법). 유일 특이적 프로브로부터의 개별적인 결합 부위 (유일 특이적 분절) 를 하나의 CGH 어레이 상에 프린팅하였다. 반복물-미함유 프로브로부터의 개별적인 반복물-미함유 분절을 두 번째 CGH 어레이 상에 프린팅하였다.

CGH 를 일상적 방법을 사용하여 수행하였다 (예를 들어, NimbleGen 어레이 사용자 지침, CGH 분석 버전 4.0, Roche NimbleGen, Madison, WI). 게놈 DNA 샘플을 제조하고 표지하였다 (예를 들어, Cy3 또는 Cy5 로). 표지된 게놈 DNA 를 각각의 CGH 어레이에 대해 하이브리드화하였다. 하이브리드화 후, 적절한 엄격도의 세척을 수행하였다. 어레이를 이후 스캐닝하고 (예를 들어, GenePix 4000B 스캐너를 사용하여), 데이터를 분석하였다 (예를 들어, NimbleScan 소프트웨어로).

유일 특이적 프로브 어레이로의 하이브리드화는 반복물-미함유 프로브 어레이로의 하이브리드화와 비슷하였다.

실시예 7

진단 방법

이 실시예는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 프로브를 이용하여 대상 (예컨대 암을 앓는 대상) 의 진단 및 예후를 결정하는데 사용될 수 있는 특정 방법을 기재한다. 그러나, 당업자는 이러한 특정 방법에서 벗어나는 방법이 또한 대상의 진단 또는 예후를 성공적으로 제공하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

종양 샘플과 같은 샘플을 대상으로부터 획득하였다. 조직 샘플을, 탈파라핀화 및 프로테아제 소화를 포함하여, ISH 에 대해 제조하였다.

한 예에서, 종양 (예를 들어, 폐 종양, 예컨대 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)) 의 진단을, 대상으로부터 획득한 종양 샘플에서의 제자리 하이브리드화에 의해 MET 유전자 카피 수를 측정함으로써 결정하였다. 예를 들어, 샘플, 예컨대 기질 (예컨대 현미경 슬라이드) 상에 존재하는 조직 또는 세포 샘플을 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 MET 프로브, 예컨대 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 생성된 MET 프로브와 함께 인큐베이션하였다. 하이브리드화를 인간 DNA 블로킹 시약의 부재 하에 (예를 들어, Cot-1^TM DNA 의 부재 하) 실행하였다. MET 프로브의 샘플에 대한 하이브리드화를, 예를 들어 현미경 검사법을 사용하여 검출하였다. 샘플 내 핵 당 MET 신호 수를 계수하고 세포 당 평균 MET 유전자 카피 수를 계산하여, MET 유전자 카피 수를 측정하였다. 종양 세포에서의 세포 당 MET 유전자 카피 수에 있어서의 증가 (예컨대 MET 유전자 카피 수 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 그 이상을 초과) 또는 대조군 (예컨대 비-신생물 샘플 또는 참조값) 에 대한 MET 유전자 카피 수에 있어서의 증가는 암의 진단을 표시한다 (예컨대 NSCLC). 반대로, MET 유전자 카피 수에 있어서 실제적인 변화가 없거나 (예컨대 MET 유전자 카피 수 약 2 이하) 대조군 (예컨대 비-신생물 샘플 또는 참조값) 에 대한 MET 유전자 카피 수에 있어서 실제적인 변화가 없는 것은 암의 진단을 표시하지 않는다 (예컨대 NSCLC 의 부재).

또다른 예에서, 종양 (예를 들어, 폐 종양, 예컨대 NSCLC) 의 예후를, 대상으로부터 획득한 종양 샘플에서의 제자리 하이브리드화에 의해 IGF1R 유전자 카피 수를 측정함으로써 결정하였다. 예를 들어, 샘플, 예컨대 기질 (예컨대 현미경 슬라이드) 상에 존재하는 조직 또는 세포 샘플을 유일 특이적 핵산 서열에 대해 상보적인 IGF1R 프로브, 예컨대 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 생성된 IGF1R 프로브와 함께 인큐베이션하였다. 하이브리드화를 인간 DNA 블로킹 시약의 부재 하에 (예를 들어, Cot-1^TM DNA 의 부재 하) 실행하였다. IGF1R 프로브의 샘플에 대한 하이브리드화를, 예를 들어 현미경 검사법을 사용하여 검출하였다. 샘플 내 핵 당 IGF1R 신호 수를 계수하고 세포 당 평균 IGF1R 카피 수를 계산하여, IGF1R 유전자 카피 수를 측정하였다. 종양 세포에서의 세포 당 IGF1R 유전자 카피 수에 있어서의 증가 (예컨대 IGF1R 유전자 카피 수 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 그 이상을 초과) 또는 대조군 (예컨대 비-신생물 샘플 또는 참조값) 에 대한 IGF1R 유전자 카피 수에 있어서의 증가는 대상에 대한 양호한 예후, 예컨대 생존 가능성에 있어서의 증가를 표시한다. 반대로, IGF1R 유전자 카피 수에 있어서 실제적인 변화가 없거나 감소하거나 (예컨대 IGF1R 유전자 카피 수 약 2 이하), 대조군 (예컨대 비-신생물 샘플 또는 참조값) 에 대한 IGF1R 유전자 카피 수에 있어서 실제적인 변화가 없거나 감소하는 것은 대상에 대한 불량한 예후, 예컨대 생존 가능성에 있어서의 감소를 표시한다.

본 개시물의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 구현예의 관점에 있어서, 설명한 구현예가 단지 예이며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 취해져서는 안 된다는 것이 인지되어야 한다. 오히려, 본 발명의 범주는 하기의 특허청구범위에 의해 정의된다. 그러므로, 발명자는 본 발명을 이들 특허청구범위의 범주 및 취지 내에 모두 포함되는 것으로서 청구한다.

<110> Ventana Medical Systems, Inc. Alexander, Nelson Stanislaw, Stacey Grille, James Leick, Mark B <120> METHODS FOR PRODUCING UNIQUELY SPECIFIC NUCLEIC ACID PROBES <130> 7668-82613-05 <150> US 61/291,750 <151> 2009-12-31 <150> US 61/314,654 <151> 2010-03-17 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 970 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (662)..(730) <223> N is A, C, G, or T (masked repetitive region) <220> <221> misc_feature <222> (734)..(818) <223> N is A, C, G, or T (masked repetitive region) <400> 1 gatccaacct tcatggtata aacagacata ggtccccgga aataggatgc tactatgtga 60 aaaataaatg ggtaaaccat aaaagagtaa gcatttacca aaaaaagact gtgttaaacc 120 caagtaagat tattttaaac tagaagaaac taagataatg caaattaaca agcttgcctg 180 tctcactttc tccactccac actcagccca ccactaacca gatgaacaga gcttgagggc 240 aacattatct caattacaga agattagaaa ttacaattat ttttgtatat ctgactttta 300 gcatgtgtat ttgaccctat aggaccatca ttaaataaat gaatctatac tattatatgg 360 cattacccat gtaagaggtg aattgtaaac ccttgcattc tagaggctgt actcatgtga 420 cttttgattt aggatcattc tgcaaggtta aaaatatgtt tggggtattt ctcccaagtg 480 gcagttgtag cttcttggga ggagaaatga acaactccaa gatcttctcc caggaccact 540 gatgtagccc atgtattaag tcagcccatc taaagcataa catccaaatt taagacaatc 600 catccagtta gttctcttgt tgtggtagca ctcaacatgt aattttatgt atacaaataa 660 tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 720 nnnnnnnnnn ggannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 780 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntc agccagaaga acaaaactta 840 aaaaaaaaaa tccatcctgg ctttcaactt catgtcccca ccatgaccat catcacaact 900 ttcaccttac tctttttatt ccacatatac tagccaattt gagtgacttg ctccagttag 960 gtggtatcac 970

Claims (32)

1. 하기를 포함하는, 핵산 프로브 제조 방법:
   하나 이상의 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 생성시키고, 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 생성시키는 것이 하기를 포함하고:
   (a) 게놈 표적 핵산 분자 서열을 다수의 분절로 분리;
   (b) 각각의 분절을 게놈 표적 핵산 분자를 포함하는 게놈과 비교; 및
   (c) 게놈 표적 핵산 분자에 대해 유일 특이적인 2 개 이상의 분절을 선택하는데, 상기 유일 특이적 분절은 게놈 표적 핵산 분자를 포함하는 게놈 내에 단 1 회만 나타나고 상기 분절은 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위이며, 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 20% 이하의 게놈 표적 핵산 분자를 포함하고, 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위가 게놈 표적 핵산 분자의 비-인접 부위에 대해 상보적임;
   사전결정된 순서 및 배향으로 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 연결시킴으로써, 핵산 프로브를 제조함.
2. 제 1 항에 있어서, 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 생성시키는 것이 하기를 추가로 포함하는 방법:
   (d) 2 개 이상의 선택된 유일 특이적 분절을 합성하고;
   (e) 합성된 분절을 게놈 표적 핵산 분자를 포함하는 게놈 DNA 와 하이브리드화하고;
   (f) 게놈 DNA 와 합성된 분절과의 하이브리드화의 존재 또는 부재를 검출하고;
   (g) 프로브에 포함시키기 위해, 게놈 DNA 와의 하이브리드화가 부재하는 하나 이상의 분절을 선택함.
3. 하기를 포함하는 핵산 프로브 제조 방법:
   하나 이상의 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 생성시키고, 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 생성시키는 것이 하기를 포함하고:
   (a) 게놈 표적 핵산 서열을 다수의 핵산 분절로 분리;
   (b) 다수의 핵산 분절을 합성;
   (c) 합성된 다수의 핵산 분절을 총 게놈 DNA 및 블로킹 DNA 와 하이브리드화; 및
   (d) 게놈 표적 핵산 분자에 대해 유일 특이적인 2 개 이상의 분절을 선택하는데, 상기 유일 특이적 분절은 게놈 표적 핵산 분자의 게놈 내에 단 1 회만 나타나고 상기 분절은 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위이며, 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 20% 이하의 게놈 표적 핵산 분자를 포함하고, 적어도 상기 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위가 게놈 표적 핵산 분자의 비-인접 부위에 대해 상보적임;
   사전결정된 순서 및 배향으로 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 연결시킴으로써, 핵산 프로브를 제조함.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 반복물-미함유인 게놈 표적 핵산 서열이 생성되도록 반복 DNA 서열을 게놈 표적 핵산 분자로부터 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 표적 핵산 서열을 다수의 핵산 분절로 분리시키는 것이 가상환경에서 (in silico) 수행되는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 핵산 분절이 20-500 뉴클레오티드 길이인 방법.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 핵산 분절이 10 개 이상의 뉴클레오티드에 의해 중복되는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
   다수의 분절의 G/C 뉴클레오티드 함량을 측정하고;
   30% 내지 70% 의 G/C 뉴클레오티드 함량을 갖는 2 개 이상의 분절을 선택함.
9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위의 사전결정된 순서 및 배향을 하기에 의해 생성하는 방법:
   (a) 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 배열 (ordering) 하여 하나 이상의 후보 핵산 프로브를 제조하고;
   (b) 후보 핵산 프로브를 다수의 분절로 분리하고;
   (c) 후보 핵산 프로브의 각각의 분절을 게놈 표적 핵산 분자를 포함하는 게놈과 비교하고;
   (d) 사전결정된 순서 및 배향인, 게놈 표적 핵산 분자에 대해 유일 특이적인 선택된 분절의 하나 이상의 순서 및 배향을 선택함.
10. 제 9 항에 있어서, 단계 (a) 의 배열이 게놈 표적 핵산의 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위의 순서 및 배향인 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 각각의 분절을 게놈 표적 핵산 분자를 포함하는 게놈과 비교하는 것, 게놈 표적 핵산 분자에 대해 유일 특이적인 2 개 이상의 분절을 선택는 것, 또는 둘 모두를 가상환경에서 수행하는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 유일 특이적 핵산 서열이 5% 이하의 게놈 표적 핵산 분자를 포함하는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 연결시키는 것이 올리고뉴클레오티드 합성, 효소 라이게이션 반응, 화학적 라이게이션 반응, 핵산 증폭 또는 이의 둘 이상의 조합을 포함하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 효소 라이게이션 반응이 리가아제 또는 재조합효소를 포함하는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 프로브를 DNA 블로킹 시약의 부재 하에 게놈 표적 핵산 분자에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 방법.
16. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 프로브를 표지하는 것을 추가로 포함하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 핵산 프로브 표지가 틈 번역 (nick translation) 을 사용하는 방법.
18. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 표적 핵산 분자가 진핵세포 게놈으로부터의 것인 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 진핵세포 게놈이 인간 게놈인 방법.
20. 삭제
21. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 프로브가 5 개 이상의 결합 부위를 포함하는 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 핵산 프로브가 50 개 이상의 결합 부위를 포함하는 방법.
23. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위가 각각 50 개 이상의 뉴클레오티드 길이인 방법.
24. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위가 벡터 내에 포함되는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 방법.
26. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 합성된 핵산 분절을 하이브리드화하는 것이, 합성된 핵산 분절의 어레이를 총 게놈 DNA 및 블로킹 DNA 와 하이브리드화하는 것을 포함하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 어레이가 하나 이상의 양성 대조군, 하나 이상의 음성 대조군 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 하나 이상의 양성 대조군이 게놈 표적 핵산 서열을 포함하는 유기체의 게놈에서의 알려져 있는 카피 수를 갖는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 음성 대조군이 게놈 표적 핵산 서열을 포함하는 유기체와 관련이 없는 유기체로부터의 게놈 서열 또는 무작위화된 서열, 또는 이의 조합을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 방법.
29. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 유일 특이적인 2 개 이상의 분절을 선택하는 것이, 총 게놈 DNA 및 블로킹 DNA 의 하이브리드화 스코어의 선형 회귀를 유도하고, 1 표준 편차에 의해 감소된 양성 대조군 서열의 선형 회귀, 음성 대조군 서열의 총 게놈 DNA 스코어 평균, 및 모든 서열 평균의 원점(origin)으로부터의 선택된 거리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사전결정된 절삭값 내로 포함되는 서열을 선택하는 것을 포함하는 방법.
30. 삭제
31. 게놈 표적 핵산이 진핵세포 게놈으로부터의 것인, 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 생성된 단리된 핵산 프로브.
32. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 생성된 하나 이상의 핵산 프로브를 포함하는 키트.
    

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