KR101588246B1 - 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법 - Google Patents

미세버블수를 함유한 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 방법에 관한 것으로서, 상기 세포 배양 배지는 미세버블수를 포함함으로써 세포 생장에 필요한 배지에 함유되는 고가인 우태혈청의 사용량을 줄이면서도 우태혈청을 포함한 배양 배지와 동등하거나 그 이상의 세포 생장 촉진 효과를 나타낼 수 있을 뿐 아니라, 상기 미세버블수 자체가 안전한 것이므로, 경제적이면서도 안전하게 세포를 배양할 수 있다.

Description

미세버블수를 함유한 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법 {CELL CULTURE MEDIUM CONTAINING FINE-BUBBLE WATER AND CELL CULTURING METHOD USING THE SAME}
본원은, 경제성과 안정성을 모두 만족하는, 미세버블수를 함유하는 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것이다.
혈청은 여러 물질이 혼합된 복합 산물이며 세포 배양실에서 기본 배양 배지에 첨가제로서 사용되며, 세포 배양에 있어서 성장인자, 호르몬, 및 세포를 자극하는 성분 등을 포함하고 있으며, 세포의 종류에 따라 다양한 혈청이 사용되고 있으나, 일반적으로 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 가장 널리 사용되고 있다. 상기 우태혈청은 임신기간 중에 소 혈액으로부터 분리되는 혈청으로서, 특히 바이오 기술 관련 실험의 기초적 단계에 속하는 동물세포 배양뿐만 아니라 최근 몇 년 동안 전 세계적으로 기술 속도가 점점 더 빨라지고 있는 백신, 단백질 의약품, 치료용 항체 등 개발에 사용되는 원료물질이다. 그러나, 최근 상기 우태혈청이 광우병 파동으로 공급이 제한되어, 그 가격이 폭등한 바 있으며, 광우병에 감염될 수 있는 문제점이 있어 대상 생성물의 안전이 충분히 보장되지 못하는 문제가 있다. 상기 우태혈청의 한국 시장은 약 200억원대이며, 전 세계 시장 크기는 약 2조원에 이른다. 이 중 미국산이 약 85%를 차지하고 호주와 뉴질랜드산이 약 15%를 이룬다. 한국에서 생산판매는 전무하며 수입금지 조치가 내려지면 대처할 수 있는 상황이 현재로서는 매우 미흡한 상황이다. 따라서, 우태혈청을 대체할 수 있는 다른 혈청 또는 배양 배지 구성 성분의 개발에 대한 필요성이 크게 대두되고 있다. 대한민국 등록특허 제10-0394430호에는 인간세포 배양에 사용되는 배지에 있어서 인간혈청을 포함하는 인간세포 배양 방법에 관한 것이 개시되어 있다. 그러나, 상기 특허는 에이즈 등 인간 바이러스 등에 감염될 수 있고, 공급에 한계가 있으며, 다른 동물세포 배양에는 효과가 크지 않고, 인간세포 배양 시에도 우태혈청을 이용한 배지보다도 그 효과가 크게 떨어지며, 우태혈청을 완전히 대체할 수는 없다. 다만 우태혈청의 사용량을 다소 줄일 수는 있으나, 경제성 또한 크게 떨어지는 문제점이 있었다. 따라서, 현재까지 우태혈청을 대신할 수 있는 혈청 또는, 우태혈청의 사용량을 줄이면서도 세포 생장을 촉진시킬 수 있는 다른 배지 성분의 개발이 요구된다. 이에, 세포 배양 시 구성 성분으로서 나노버블수를 함유시킴으로써 고가의 우태혈청의 사용량을 감소시켰다.
본원은, 고가인 우태혈청의 사용을 감소시킴으로써 경제적이면서도 안전한, 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지, 및 이를 이용한 세포 배양 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 혈청 및 항생제를 포함하는 세포 배양 배지에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 미세버블수를 함유하며, 상기 미세버블수 약 1 mL 당 약 103개 내지 약 1018개의 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세버블을 포함하는 것인, 세포 배양 배지를 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 세포를 배양 배지에서 컨플루언트(confluent)하게 배양하는 단계; 및, 상기 세포의 배양 배지를 미세버블수를 함유한 배양 배지로 교체하는 단계를 포함하며, 상기 미세버블수 약 1 mL 당 약 103개 내지 약 1018개의 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세버블을 포함하는 것인, 세포 배양 방법을 제공한다.
본원에 의하면, 세포 배양 배지에 미세버블수를 포함함으로써 고가인 우태혈청의 사용량을 줄이면서도 우태혈청을 포함한 배양 배지와 동등하거나 그 이상의 세포 생장 촉진 효과를 나타낼 수 있을 뿐 아니라, 미세버블수 자체가 안전한 것이므로, 경제적이면서도 안전하게 세포를 배양할 수 있는 장점이 있다.
도 1a 및 도 1b는 본원의 일 실시예에 따른 수소 미세버블수의 버블 크기 및 농도 측정 검사표이다.
도 2a 및 도 2b는 본원의 일 실시예에 따른 산소 미세버블수의 버블 크기 및 농도 측정 검사표이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 수소 미세버블수 및 산소 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지에서 다양한 시간 별로 배양한 폐암세포 A549의 생장을 광학 이미지 세포 카운팅을 사용하여 분석한 것이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 폐암세포 A549의 세포 이미지를 분석한 것이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 수소 미세버블수 및 산소 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지에서 다양한 시간 별로 배양한 폐암세포 A549D9K의 생장을 광학 이미지 세포 카운팅을 사용하여 분석한 것이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 폐암세포 A549D9K의 세포 이미지를 분석한 것이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 수소 미세버블수 및 산소 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지에서 다양한 시간 별로 배양한 조골세포 MC3T3의 생장을 광학 이미지 세포 카운팅을 사용하여 분석한 것이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 조골세포 MC3T3의 세포 이미지를 분석한 것이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 수소 미세버블수 및 산소 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지에서 다양한 시간 별로 배양한 섬유모세포 NIH3T3의 생장을 광학 이미지 세포 카운팅을 사용하여 분석한 것이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 섬유모세포 NIH3T3의 세포 이미지를 분석한 것이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 수소 미세버블수 및 산소 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지에서 다양한 시간 별로 배양한 신장세포 HEK293 의 생장을 광학 이미지 세포 카운팅을 사용하여 분석한 것이다.
도 12는 본원의 일 실시예에 따른 신장세포 HEK293 의 세포 이미지를 분석한 것이다.
도 13은 본원의 일 실시예에 따른 미세버블수를 생성하는 장치를 나타낸 것이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “미세버블”은 마이크로미터 크기의 마이크로버블 및/또는 나노미터 크기의 나노버블을 포함하는 것이며, 상기 미세버블의 크기는 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 마이크로버블의 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 것일 수 있고, 상기 나노버블의 크기는 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎚의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서, 미세버블 형성에 사용되는 기체는 수소, 산소, 이산화탄소, 일산화탄소, 질소, 제논, 아르곤, 네온, 공기, 오존, 크립톤, 헬륨, 질소-함유 화합물 기체, 탄소-함유 화합물 기체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 기체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 질소-함유 화합물 기체는 질소를 함유한 화합물로서 기체 상태인 것이라면 특별히 제한 되지 않으며, 예를 들어, 암모니아, 산화질소류 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 탄소-함유 화합물 기체는 탄소를 함유한 화합물로서 기체 상태인 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 탄소수 1 내지 4의 탄화수소 화합물 기체 (메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 혈청 및 항생제를 포함하는 세포 배양 배지에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 미세버블수를 함유하며, 상기 미세버블수 약 1 mL 당 약 103 개 내지 약 1018 개의 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세버블을 포함하는 것인, 세포 배양 배지를 제공한다.
먼저, 상기 미세버블수는 가압용해식, 회전액체류식, 정적믹서식, 에제쿠타식, 벤투리식, 기공식, 회전식, 초음파식, 증기응축식, 전기분해식 등의 방법으로 제조할 수 있다.
상기 미세버블수는 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세버블을 포함하며, 상기 미세버블수 약 1 mL 당 약 103 개 내지 약 1018 개의 미세버블을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 미세버블수에 포함된 미세버블의 평균 직경은, 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 약 300 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 약 500 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 약 700 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 약 900 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 900 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 900 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 900 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 900 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 900 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 900 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 900 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 900 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 900 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 900 ㎛, 약 300 ㎛ 내지 약 900 ㎛, 약 500 ㎛ 내지 약 900 ㎛, 약 700 ㎛ 내지 약 900 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 700 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 700 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 700 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 700 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 700 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 700 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 700 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 300 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 500 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 500 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 500 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 500 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 500 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 500 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 500 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 300 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 300 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 300 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 300 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 300 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 300 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 300 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 100 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 100 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 100 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 100 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 100 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 100 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 100 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 10 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 10 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 10 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 10 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 10 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 10 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 10 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 약 10 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 약 100 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 약 300 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 약 500 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 약 700 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 약 900 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 약 1 ㎚ 내지 약 900 ㎚, 약 10 ㎚ 내지 약 900 ㎚, 약 100 ㎚ 내지 약 900 ㎚, 약 300 ㎚ 내지 약 900 ㎚, 약 500 ㎚ 내지 약 900 ㎚, 약 700 ㎚ 내지 약 900 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 700 ㎚, 약 10 ㎚ 내지 약 700 ㎚, 약 100 ㎚ 내지 약 700 ㎚, 약 300 ㎚ 내지 약 700 ㎚, 약 500 ㎚ 내지 약 700 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 500 ㎚, 약 10 ㎚ 내지 약 500 ㎚, 약 100 ㎚ 내지 약 500 ㎚, 약 300 ㎚ 내지 약 500 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 300 ㎚, 약 10 ㎚ 내지 약 300 ㎚, 약 100 ㎚ 내지 약 300 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 100 ㎚, 약 10 ㎚ 내지 약 100 ㎚, 또는 약 1 ㎚ 내지 약 10 ㎚일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 미세버블은, 예를 들어, 상기 미세버블수 1 mL 당 약 103 개 내지 약 1018 개, 약 104 개 내지 약 1018 개, 약 105 개 내지 약 1018 개, 약 106 개 내지 약 1018 개, 약 107 개 내지 약 1018 개, 약 108 개 내지 약 1018 개, 약 109 개 내지 약 1018 개, 약 1010 개 내지 약 1018 개, 약 1011 개 내지 약 1018 개, 약 1012 개 내지 약 1018 개, 약 1013 개 내지 약 1018 개, 약 1014 개 내지 약 1018 개, 약 1015 개 내지 약 1018 개, 약 1016 개 내지 약 1018 개, 약 1017 개 내지 약 1018 개, 약 103 개 내지 약 1017 개, 약 104 개 내지 약 1017 개, 약 105 개 내지 약 1017 개, 약 106 개 내지 약 1017 개, 약 107 개 내지 약 1017 개, 약 108 개 내지 약 1017 개, 약 109 개 내지 약 1017 개, 약 1010 개 내지 약 1017 개, 약 1011 개 내지 약 1017 개, 약 1012 개 내지 약 1017 개, 약 1013 개 내지 약 1017 개, 약 1014 개 내지 약 1017 개, 약 1015 개 내지 약 1017 개, 약 1016 개 내지 약 1017 개, 약 103 개 내지 약 1016 개, 약 104 개 내지 약 1016 개, 약 105 개 내지 약 1016 개, 약 106 개 내지 약 1016 개, 약 107 개 내지 약 1016 개, 약 108 개 내지 약 1016 개, 약 109 개 내지 약 1016 개, 약 1010 개 내지 약 1016 개, 약 1011 개 내지 약 1016 개, 약 1012 개 내지 약 1016 개, 약 1013 개 내지 약 1016 개, 약 1014 개 내지 약 1016 개, 약 1015 개 내지 약 1016 개, 약 103 개 내지 약 1015 개, 약 104 개 내지 약 1015 개, 약 105 개 내지 약 1015 개, 약 106 개 내지 약 1015 개, 약 107 개 내지 약 1015 개, 약 108 개 내지 약 1015 개, 약 109 개 내지 약 1015 개, 약 1010 개 내지 약 1015 개, 약 1011 개 내지 약 1015 개, 약 1012 개 내지 약 1015 개, 약 1013 개 내지 약 1015 개, 약 1014 개 내지 약 1015 개, 약 103 개 내지 약 1014 개, 약 104 개 내지 약 1014 개, 약 105 개 내지 약 1014 개, 약 106 개 내지 약 1014 개, 약 107 개 내지 약 1014 개, 약 108 개 내지 약 1014 개, 약 109 개 내지 약 1014 개, 약 1010 개 내지 약 1014 개, 약 1011 개 내지 약 1014 개, 약 1012 개 내지 약 1014 개, 약 1013 개 내지 약 1014 개, 약 103 개 내지 약 1013 개, 약 104 개 내지 약 1013 개, 약 105 개 내지 약 1013 개, 약 106 개 내지 약 1013 개, 약 107 개 내지 약 1013 개, 약 108 개 내지 약 1013 개, 약 109 개 내지 약 1013 개, 약 1010 개 내지 약 1013 개, 약 1011 개 내지 약 1013 개, 약 1012 개 내지 약 1013 개, 약 103 개 내지 약 1012 개, 약 104 개 내지 약 1012 개, 약 105 개 내지 약 1012 개, 약 106 개 내지 약 1012 개, 약 107 개 내지 약 1012 개, 약 108 개 내지 약 1012 개, 약 109 개 내지 약 1012 개, 약 1010 개 내지 약 1012 개, 약 1011 개 내지 약 1012 개, 약 103 개 내지 약 1011 개, 약 104 개 내지 약 1011 개, 약 105 개 내지 약 1011 개, 약 106 개 내지 약 1011 개, 약 107 개 내지 약 1011 개, 약 108 개 내지 약 1011 개, 약 109 개 내지 약 1011 개, 약 1010 개 내지 약 1011 개, 약 103 개 내지 약 1010 개, 약 104 개 내지 약 1010 개, 약 105 개 내지 약 1010 개, 약 106 개 내지 약 1010 개, 약 107 개 내지 약 1010 개, 약 108 개 내지 약 1010 개, 약 109 개 내지 약 1010 개, 약 103 개 내지 약 109 개, 약 104 개 내지 약 109 개, 약 105 개 내지 약 109 개, 약 106 개 내지 약 109 개, 약 107 개 내지 약 109 개, 약 108 개 내지 약 109 개, 약 103 개 내지 약 108 개, 약 104 개 내지 약 108 개, 약 105 개 내지 약 108 개, 약 106 개 내지 약 108 개, 약 107 개 내지 약 108 개, 약 103 개 내지 약 107 개, 약 104 개 내지 약 107 개, 약 105 개 내지 약 107 개, 약 106 개 내지 약 107 개, 약 103 개 내지 약 106 개, 약 104 개 내지 약 106 개, 약 105 개 내지 약 106 개, 약 103 개 내지 약 105 개, 약 104 개 내지 약 105 개, 또는 약 103 개 내지 약 104 개가 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 미세버블은 미세 기포가 가지는 자기가압 효과로 상기 미세버블이 안정화되어 오랜 기간 물 속에 존재할 수 있다. 그러나, 상기 미세버블의 평균 직경이 상기 범위보다 커지면 버블의 부력 (buoyancy) 효과로 인해 상기 미세버블이 물 속에 머무는 시간이 단축되어 물에 대한 용존량이 저해되는 문제가 야기될 수 있다. 또한 상기 미세버블수 약 1 mL 당 상기 미세버블의 개수가 상기 범위를 벗어나 약 103 개 미만이 되면 상기 미세버블의 자기가압 효과로 소멸되는 개체수로 인하여 물에 대한 용해도, 미세버블의 살균작용, 계면 활성 작용 및 미세버블수 내의 균일한 미세버블의 개체수 균일화 등의 문제가 야기될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 미세버블수는 상기 세포 배양 배지 총 100 부피부에 대하여 약 1 부피부 내지 약 50 부피부, 바람직하게는 약 1 부피부 내지 약 20 부피부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 미세버블수가 약 1 부피부 미만의 경우, 세포 생장에 필요한 미세버블의 개체의 감소가 야기될 수 있는 반면, 상기 미세버블수가 약 50 부피부를 초과하는 경우, 세포 생장을 위한 세포 배양 배지의 영양분 감소로 인한 세포 생장 감소 등의 문제가 야기될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 미세버블수는 그 기능에 따라 다양한 기체를 적용할 수 있으며, 예를 들어, 상기 기체는 수소, 산소, 이산화탄소, 일산화탄소, 질소, 제논, 아르곤, 네온, 공기, 오존, 크립톤, 헬륨, 질소-함유 화합물 기체, 탄소-함유 화합물 기체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 기체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 미세버블수는 상기 기체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 배양 배지를 적용할 수 있는 세포로는 폐암세포, 전립선암세포, 위암세포, 유방암세포, 췌장암세포, 대장암세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 암세포, 조골세포, 신장세포, 섬유모세포, 연골세포, 간세포, 신경세포, 근육세포, 줄기세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 혈청은 우태혈청(FBS), 우태아혈청(FCS), 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 세포를 배양 배지에서 컨플루언트(confluent)하게 배양하는 단계; 및, 상기 세포의 배양 배지를 미세버블수를 함유한 배양 배지로 교체하는 단계를 포함하며, 상기 미세버블수 약 1 mL 당 약 103 개 내지 약 1018 개의 약 1 ㎚ 내지 약 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세버블을 포함하는, 세포 배양 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 미세버블수는 세포 배양 배지 총 100 부피부에 대하여 약 1 부피부 내지 약 50 부피부, 바람직하게는 약 1 부피부 내지 약 20 부피부로 상기 세포 배양 배지에 포함될 수 있으며, 상기 미세버블수는 상기 세포 배양 배지에 첨가하기 전에 UV 하에서 멸균하여 사용하는 것이 바람직하다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 세포는 폐암세포, 전립선암세포, 위암세포, 유방암세포, 췌장암세포, 대장암세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 암세포, 조골세포, 신장세포, 섬유모세포, 연골세포, 간세포, 신경세포, 근육세포, 줄기세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 혈청은 우태혈청(FBS), 우태아혈청(FCS), 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 실시예로서, 도 3 내지 도 12에 도시된 바와 같이, 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지를 이용하여 폐암세포 A549, A549D9K, 조골세포 MC3T3, 섬유모세포 NIH3T3, 및 신장세포 HEK293 각각의 세포를 배양한 결과, 미세버블수를 함유하지 않은 배지를 이용하여 세포를 배양한 대조군에 비해 세포 생장을 촉진하는 것을 확인할 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.
[ 실시예 ]
<실시예 1> 나노버블수 제조
본 실시예에 따른 세포 배양 배지를 생성하기 위해, 먼저 나노버블수를 제조하였다.
1) 수소 나노버블수 제조
대한민국 특허출원 제2012-0060390호에 개시된 미세버블수 제조장치(도 13 참조)를 사용하되 초음파를 인가하지 않고, 미세 다공질 필터를 이용하여 기체를 주입하여 가압용해 방법으로 수소 나노버블수를 제조하였다.
상기 제조된 수소 나노버블수를 나노 입자 추적 분석(nano particle tracking analysis, NTA, LM10-HSBFT14, UK) 방법으로 실시한 결과, 도 1a 및 도 1b와 같이 상기 수소 나노버블수에 포함된 수소 나노버블의 평균 직경은 약 87 ㎚, 농도는 약 1 mL 당 약 2.12 × 1017 개였다.
2) 산소 나노버블수 제조
대한민국 특허출원 제2012-0060390호에 개시된 미세버블수 제조장치(도 13 참조)를 사용하되 초음파를 인가하지 않고, 미세 다공질 필터를 이용하여 기체를 주입하여 가압용해 방법으로 산소 나노버블수를 제조하였다.
상기 제조된 산소 나노버블수의 수질검사를 나노 입자 추적 분석(nano particle tracking analysis, NTA, LM10-HSBFT14, UK) 방법으로 실시한 결과, 도 2a 및 도 2b와 같이 상기 산소 나노버블수에 포함된 산소 나노버블의 평균 직경은 약 87 ㎚, 농도는 약 1 mL 당 약 2.62 × 1017 개였다.
< 실시예 2> 세포 배양
본 실시예에 따른 세포 배양 방법은 먼저, 4가지 세포주를 먼저 각각의 배지에 분주하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 컨플루언트(confluent)하게 배양하였다. 이때, 폐암세포 A549 (ATCC에서 구매)는 DMEM (Cellgro)에 10% FetalClone III (Lonza)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 (MP)을 함유하며, A549D9K (D9K mutated CXCR2 expressed in A549)는 DMEM (Cellgro)에 10% FetalClone III (Lonza), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (MP) 및 600 ㎍/mL G418 (Cellgro)를 함유하며, 조골세포 MC3T3 (ATCC에서 구매)은 MEM Alpha Modification (HyClone)에 10% 우태혈청 (FBS, Lonza) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (MP)을 함유하며, 섬유모세포 NIH3T3 (ATCC에서 구매) 및 신장세포 HEK293 (ATCC에서 구매)은 DMEM (Cellgro)에 10% 우태혈청(FBS, Lonza) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(MP)을 함유하였다.
< 실시예 3> 세포 성장 및 생존 분석
1. 세포 성장 분석
트립신-EDTA (1X, GibcoBRL)를 이용하여 세포를 분리하여 계대배양 하였다. 세포 생존율을 조사하기 위하여, 약 4 × 104 세포/mL의 세포 밀도로 세포를 24웰 배양 접시 및 96웰 배양접시에 분주하여 광학 이미지 세포 카운팅을 사용하였다. 이때, 세포 카운팅을 위해 Image-J (Wayne Rasband)를 사용하였다. 세포 분주 1일 후, 세포 배지를 5 부피%, 10 부피% 및 20 부피%의 각 나노버블수를 함유한 배지로 교체하여 다양한 시간 별로 배양하였다. 이때, 나노버블수는 배지에 혼합되기 전에 UV 멸균 후 사용하였다. 한편, 음성 대조군으로 배지만을 포함한 세포를 사용하였다.
그 결과, 도 3, 도 5, 도 7, 도 9, 및 도 11에 도시된 바와 같이 폐암세포 A549, A549D9K, 조골세포 MC3T3, 섬유모세포 NIH3T3, 및 신장세포 HEK293에서 각각 세포 성장이 증가함을 확인할 수 있었다.
2. 광학 성장률 분석
위상차 현미경 (Nikon TiU), 카메라 (Quantiem: 512SC) 및 NIS-엘리먼트 소프트웨어 (Nikon Instruments Inc.)를 포함하는 광학 측정 시스템을 이용하였다. 나노버블수가 함유된 배지로 교체한 후, 일정 시간 마다 각 웰에서 각 세포들의 이미지 (15x)를 분석하였다.
도 4, 도 6, 도 8, 도 10, 및 도 12에서 폐암세포 A549, A549D9K, 조골세포 MC3T3, 섬유모세포 NIH3T3, 및 신장세포 HEK293 각각의 세포 이미지를 나타냈으며, 나노버블수를 이용한 배지에서 72 시간 처리한 경우 대조군에 비해 세포 성장이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
100: 액체 탱크 101: 배출구 102: 유입구
200: 액체 순환 라인부 210: 순환관 220: 순환모터
300: 기체 공급 라인부 310: 기체봄베 320: 공급관
330: 압력조절밸브 340: 분배관 400: 미세버블 방출부재

Claims (8)

  1. 혈청 및 항생제를 포함하는 세포 배양 배지에 있어서,
    상기 세포 배양 배지는 UV 하에서 멸균된 수소-함유 미세버블수를 함유하며, 상기 수소-함유 미세버블수 1 mL 당 103 개 내지 1018 개의 1 ㎚ 내지 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세버블을 포함하는 것인,
    세포 배양 배지.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 수소-함유 미세버블수는 세포 배양 배지 총 100 부피부에 대하여 1 부피부 내지 50 부피부로 포함되는 것인, 세포 배양 배지.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 수소-함유 미세버블수는 수소와, 산소, 이산화탄소, 일산화탄소, 질소, 제논, 아르곤, 네온, 공기, 오존, 크립톤, 헬륨, 질소-함유 화합물 기체, 탄소-함유 화합물 기체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 기체를 포함하는 것인, 세포 배양 배지.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 폐암세포, 전립선암세포, 위암세포, 유방암세포, 췌장암세포, 대장암세포, 암세포, 조골세포, 신장세포, 섬유모세포, 연골세포, 간세포, 신경세포, 근육세포, 줄기세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 세포를 포함하는 것인, 세포 배양 배지.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈청은 우태혈청(FBS), 우태아혈청(FCS), 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것인, 세포 배양 배지.
  6. 세포를 배양 배지에서 컨플루언트(confluent)하게 배양하는 단계; 및,
    상기 세포의 배양 배지를 수소-함유 미세버블수를 함유한 배양 배지로 교체하는 단계를 포함하며,
    상기 수소-함유 미세버블수는 상기 배양 배지에 첨가하기 전 UV 하에서 멸균되는 것을 포함하는 것이고,
    상기 수소-함유 미세버블수 1 mL 당 103 개 내지 1018 개의 1 ㎚ 내지 1,000 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세버블을 포함하는 것인,
    세포 배양 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 수소-함유 미세버블수는 세포 배양 배지 총 100 부피부에 대하여 1 부피부 내지 50 부피부로 포함되는 것인, 세포 배양 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 세포는 폐암세포, 전립선암세포, 위암세포, 유방암세포, 췌장암세포, 대장암세포, 암세포, 조골세포, 신장세포, 섬유모세포, 연골세포, 간세포, 신경세포, 근육세포, 줄기세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 세포를 포함하는 것인, 세포 배양 방법.

KR1020130140181A 2012-12-04 2013-11-18 미세버블수를 함유한 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법 KR101588246B1 (ko)

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JP2010075180A (ja) 2008-09-01 2010-04-08 Hiroyuki Tanaka Ｎｋ活性増強剤およびその利用

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