KR101549137B1 - 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 키토산 코팅 나노섬유, 그 제조방법, 및 그 키토산 코팅 나노섬유를 포함하는 경점막 투여제 - Google Patents

음이온성 단백질 약물 전달을 위한 키토산 코팅 나노섬유, 그 제조방법, 및 그 키토산 코팅 나노섬유를 포함하는 경점막 투여제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 용액을 전기방사시켜 제조된 나노섬유에 키토산 또는 그 유도체가 코팅된, 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 키토산 코팅 나노섬유로서, 상기 유드라짓은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1 또는 1:2, 또는 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1인 키토산 코팅 나노섬유, 그 제조방법, 및 그 키토산 코팅 나노섬유를 포함하는 음이온성 단백질의 경점막 투여제 및 점막 염증 치료제를 제공한다.

Description

음이온성 단백질 약물 전달을 위한 키토산 코팅 나노섬유, 그 제조방법, 및 그 키토산 코팅 나노섬유를 포함하는 경점막 투여제{Chitosan-coated nanofiber for delivering anionic protein drug, a process for the preparation thereof, and transmucosal administrative agent comprising the same}
본 발명은 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 나노섬유, 그 제조방법, 및 그 나노섬유를 포함하는 경점막 투여제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 나노섬유의 구조가 점막 부위에서 안정하고, 음이온성 단백질 약물이 서서히 방출될 수 있고, 점막 부착이 용이한, 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 나노섬유, 그 제조방법, 및 나노섬유를 포함하는 경점막 투여제에 관한 것이다.
단백질 약물을 체내로 전달하기 위한 방법에는 미립구에 의한 투여, 또는 고분자 결합 방식에 의한 투여 등이 있다. 그러나, 이러한 제제를 이용하여 경구투여 할 경우, 간과 위에 의한 초회통과효과 때문에 체내로의 전달효율이 매우 낮다. 이러한 문제점을 보완하기 위해 w/o/w 이중 유제, 리포좀 등의 방법이 개발되기도 했지만, 이러한 방법들은 제조단계가 복잡하고 단백질 변성이 일어나거나 물리적으로 강도가 약하기 때문에 단백질 약물이 손상을 받게 되는 한계점이 존재했다. 또, 다른 방법인 점막투여 제형의 경우, 단백질 약물을 혈관 내에 직접 주입하여 체내로의 전달효율을 높이고자 하였다. 그러나 이 방법은 주사기 바늘에 대한 두려움과 약물이 주입될 때의 통증 때문에 환자들에게 거부감을 불러 일으킨다. 또한 주입된 단백질 약물이 혈관 내에서 순환하면서 손실되는 양이 많아, 단백질 약물의 효과가 발현되기 위해서는 다량의 단백질 약물을 주입해야 하므로 경제적 손실이 발생한다. 따라서, 단백질 약물의 체내 흡수를 증진시키기 위해서는 효율적인 약물 전달 시스템이 필요하다.
단백질 약물의 체내 흡수를 증진시키기 위한 투여 방법으로 구강 점막을 통한 약물 전달 방법이 제안되었다. 구강 점막은 혈관이 잘 발달되어 있어 단백질, 약물 등과 같은 물질 전달에 효과적이며, 효소에 의한 활성도가 낮은 특성을 가진다. 또한, 다른 점막조직과 비교하여 알레르기 항원에 잘 견디고 국소 및 전신 투여 모두를 위한 약물전달이 가능하다. 더욱 중요한 것은, 구강점막을 통해 단백질 약물이 투여되면 간과 위에 의한 초회통과효과를 피할 수 있어 약물의 손실을 최소화 할 수 있다는 점이다. 따라서, 최근에는 구강 점막을 통해 단백질 약물을 전신투여 하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
단백질 약물의 체내 흡수를 증진시키기 위해 제제로서 나노 섬유가 제안되었다. 나노 섬유는 전기방사기술을 이용해 제조되는데, 바늘 끝에 맺힌 고분자 용액에 그 표면장력보다 큰 힘의 고전압을 가하여 고분자 용액을 한 줄기의 고분자 유체(fluid)로 만들어 수집기 전극(collector electrode)에 쌓이게 하여 만들어진다. 상기 고분자로는 폴리비닐피롤리돈, 폴리카프롤락톤, 또는 폴록사머 등과 같은 고분자가 사용된다. 이렇게 만들어진 나노 섬유는 부피 대비 매우 넓은 면적을 가지며, 나노 사이즈의 섬유들이 서로 얽혀서 쌓여있는 다공성의 구조이다. 따라서 그 나노섬유의 다공성 구조의 내부에 약물 등의 물질을 함유시킬 수 있고 피부 점막에도 쉽게 접착된다.
유드라짓 또한 약물전달을 위한 나노섬유의 제조에 사용될 수 있는 것으로 보고되었다. 항염증제인 디클로페낙 소듐을 함유한 Eudragit L100-55 나노섬유를 제조하여 구강투여 후 결장까지 약물을 전달하는 것에 대해 보고된 바 있다(비특허문헌 1). 그러나, 유드라짓 나노섬유는 점막에 부착시켜 약물을 점막을 통해 흡수시키기 불가능한 점이 있었다. 왜냐하면, 유드라짓은 산도가 중성인 각종 점막, 예를 들어 구강점막, 항문점막, 귀점막, 비점막 등의 각종 점막 내에서 용해하게 되고, 이러한 용해에 의해 방출된 약물의 손실이 급격하게 일어나서 점막에 약효를 작용하거나 점막을 통해 흡수되기 전에 안정적으로 부착되어 있지 못하고 녹아 버리기 때문이다.
한편, 구내염은 구강 점막에 생기는 염증으로서, 세균ㅇ바이러스ㅇ진균(眞菌) 등의 감염에 의한 것이 많고, 대체로 구강이 불결한 경우에 나타난다. 또 의치(義齒) 등에 의한 기계적 자극, 열탕(熱湯)에 의한 온열적 자극, 약품에 의한 화학적 자극 외에 전신질환을 비롯하여 영양불량ㅇ임신, 그 밖에 저항력이 감퇴하였을 때에도 발생한다. 증세는 구강점막의 발적(發赤)ㅇ종창ㅇ작열감(灼熱感)ㅇ구취ㅇ물집ㅇ궤양 등이 생기고 동통(疼痛)이 심하다. 중증이면 발열하고 저작(咀嚼)ㅇ연하(嚥下)ㅇ발음 장애를 일으키며, 유아는 영양장애가 있기 쉽고 국소(局所) 림프절도 부어오른다. 위중한 구내염을 앓고 있는 환자는 입으로 음식을 전혀 섭취할 수 없을 정도로 심각해질 수도 있다. 이러한 구내염에는 단순성 구내염, 궤양성 구내염, 괴저성 구내염, 아프타성 구내염, 또는 헤르페스성 구내염 등이 있다.
종래에 개발된 구내염 치료용 조성물은 대부분 점착성 고분자를 함유하는 연고제, 패취제 등이다. 예를 들어, 미네랄 오일, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오즈 등을 함유하는 에멀젼으로 이루어진 생점착성 연고(bioadhesive ointment)가 있으며(특허문헌 1), 스테로이드제 약물을 포함하는 이층 필름 구조의 첩부제 및 그의 제조방법이 보고 되었다(특허문헌 2). 연고제나 패취제 이외의 제형으로서, 50 내지 50,000 cps의 점도를 갖는 생점착성(bioadhesive) 용액 또는 현탁액에 대해 보고되었고(특허문헌 3), 친수성 폴리머 및 수불용성 폴리머의 혼합물을 함유하는 액상 또는 겔상의 구강내 약물 전달 시스템이 개발되었다(특허문헌 4).
구내염 치료에 상피세포성장인자(EGF)를 사용할 수 있음이 보고되었다(특허문헌 5). 인간 성장 호르몬(hGH) 또한 손상된 조직의 재생을 촉진시키는 효과가 있어, 구내염의 치료에 효과적인 것으로 공지되어 있다(비특허문헌 2). 산성섬유아세포성장인자(aFGF)도 손상된 조직의 재생을 촉진시키는 효과가 있어, 구내염의 치료에 효과적인 것으로 공지되어 있다(비특허문헌 3). 상피세포성장인자 및 인간 성장호르몬은 등전점이 각각 4.2 및 4.8로서 모두 중성조건(pH 7.4)에서 음전하를 띠는 것으로 알려져 있으며(비특허문헌 5, 6), 산성섬유아세포성장인자 또한 중성조건에서 음전하를 띠는 것으로 알려져 있다.
이러한 음이온성 단백질을 포함하는 구내염 치료에 적절한 제제의 개발이 이루어지고 있으며, 보다 적잘한 제제의 개발이 필요하다.
1. US 5,578,310 2. KR 1994-0023469A 3. US 2002/0219634 4. KR 2005-55858A 5. WO 03/095637
1. International Journal of Pharmaceuticals 408 2011, 200-207 2. J. Control. Rel. 2001, 77, 261-272 3. J. Investigative Dermatology 1995, 104, 850-855 4. Pharmaceutical Research 1994, 11, 65-71 5. J. Biomater. Sci. Poly. Edit. 2007, 18, 1429-1441 6. J. Biomaterials Science 2013, 24, 210-223
본 발명의 목적은 음이온성 단백질 약물을 점막에 충분한 시간 동안 국소적으로 작용하거나 점막을 통해 흡수할 수 있는 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 나노섬유를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 나노섬유의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 나노섬유를 포함하는 음이온성 단백질 약물의 경점막 투여제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 나노섬유를 포함하는 점막 염증 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은
음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 용액을 전기방사시켜 제조된 나노섬유에 키토산 또는 그 유도체가 코팅된, 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 키토산 코팅 나노섬유로서,
상기 유드라짓은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1 또는 1:2, 또는 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1인 키토산 코팅 나노섬유를 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은
음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 혼합용액을 제조하는 단계로서, 상기 유드라짓은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1 또는 1:2, 또는 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1인 단계;
상기 혼합용액을 전기방사시켜 나노섬유를 제조하는 단계; 및
상기 나노섬유를 키토산 또는 그 유도체로 코팅하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 일 측면에 따른 키토산 코팅 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명의 일 측면에 따른 키토산 코팅 나노섬유를 포함하는 음이온성 단백질의 경점막 투여제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명의 일 측면에 따른 키토산 코팅 나노섬유를 포함하고, 상기 음이온성 단백질은 인간성장호르몬(hGH) 또는 상피세포성장인자(EGF)인 점막 염증 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다.
본 발명자들은 점막을 통해 음이온성 단백질을 투여할 수 있는 유드라짓 나노섬유의 제조를 위해 예의 연구한 결과, 구강 점막 등의 중성 환경에서 안정한 형태로 유지하면서도 약물의 급격한 방출이 이루어지지 않고 소정의 시간동안 약물의 방출이 이루어져 점막을 통한 약물의 흡수 또는 점막에의 약물의 작용이 충분한 시간 동안 이루어질 수 있도록 하는 유드라짓 나노섬유를 개발하게 되었다.
따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서,
음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 용액으로 전기방사시켜 제조된 나노섬유(이하, "유드라짓 나노섬유"라고 함)에 키토산 또는 그 유도체가 코팅된, 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 키토산 코팅 나노섬유로서,
상기 유드라짓은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1 또는 1:2, 또는 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1인 키토산 코팅 나노섬유를 제공한다.
상기 음이온성 단백질 약물은 인체의 중성 점막에 국소적으로 적용할 필요가 있거나 전신투여할 필요가 있는 임의의 음이온성 단백질 약물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간성장호르몬(hGH, human growth factor), 상피세포성장인자(EGF, epidermal growth factor), 산성섬유아세포성장인자(aFGF, acidic fibroblasts growth factor, pI 5.5), 소혈청 알부민(BSA), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 전신적 또는 국소적 전달을 위한 임의의 음이온성 단백질 약물이 사용될 수 있다. 상기 음이온성 단백질 약물이 조직 점막의 재생을 목적으로 전달될 경우, 상기 음이온성 단백질은 조직의 재생에 효과가 있는 것으로 공지된 임의의 단백질일 수 있으며, 예를 들어 인간성장호르몬(hGH), 상피세포성장인자(EGF), 산성섬유아세포성장인자(aFGF), 또는 이들의 조합 등이 있다.
상기 유드라짓인 폴리(메타크릴레이트-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1은 Eudragit L100으로서 시판되고 있고, 폴리(메타크릴레이트-코-메틸 메타크릴레이트) 1:2는 Eudragit S100 또는 Eudragit S12,5로서 시판되고 있고, 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1은 Eudragit L100-55 또는 Eudragit L30 D-55로서 시판되고 있으며, 산도 6.0-5.0 이상에서 녹는 고분자로서, 약제학 분야에서 장용성 제제의 제조 시 널리 사용되는 장용성 물질이다. 상기 유드라짓은 예를 들어, 유드라짓 L100일 수 있다.
상기 키토산은 갑각류의 껍질에 풍부하게 함유된 물질인 키틴을 탈아세틸화하여 얻어진 고분자로서, 글루코사민과 N-아세틸글루코사민의 공중합체이다. 키토산은 최근 FDA에 의해 의료용으로 또는 식용으로 승인이 나는 등 뛰어난 생체 적합성을 가진다. 또한, 버려지기 쉬운 게나 새우의 껍질에서 얻기 때문에 단가가 매우 저렴하고 장내 세균 등에서 분비되는 키티나제(chitinase)에 의해 체내에서 분해될 수 있다. 상기 키토산 또는 그 유도체의 분자량은 10 ~ 500 kDa 일 수 있으며, 바람직하게는 70 kDa ~ 300 kDa 이며, 가장 바람직하게는 100 kDa이다. 키토산이 상기 분자량을 벗어날 경우, 키토산 코팅 나노섬유 제조 시, 분자량 10 kDa 미만의 경우, 나노섬유에 코팅된 키토산의 용해가 금방 이루어져 수상에서 나노섬유의 구조를 유지시켜 주지 못하고 키토산과 유드라짓 나노섬유가 함께 순식간에 녹아버리는 문제가 발생된다. 또한, 분자량 300 kDa 초과의 경우, 코팅 시 사용되는 키토산 용액의 점성이 증가하여 코팅 후 나노섬유의 구조를 잃어버리고 필름의 형태가 되는 단점을 지니고 있다. 이것을 극복하기 위해서 키토산 용액의 농도를 낮춰 점성을 감소시킬 경우, 코팅되는 키토산의 양이 적어 이 또한 유드라짓 나노섬유로 수분이 쉽게 침투되어 순식간에 녹아버리는 문제가 발생될 수도 있다.
상기 키토산 유도체는 키토산의 아민기가 변형되지 않고 양이온을 띌 수 있고, 상기 나노섬유의 코팅이 가능하다면 임의의 키토산 유도체가 이용될 수 있다. 이러한 키토산 유도체의 예로는 글라이콜 키토산(glycol chitosan) 또는 글라이시딜 메타아크릴레이트 키토산 (glycidyl methacrylated chitosan)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 키토산은 키토산 구조 내의 아민기(amine group)가 띄는 양전하와 상기 유드라짓 구조 내의 카르복실기(carboxyl group)가 띄는 음전하 간의 정전기적 인력에 의해 유드라짓 나노섬유 표면에 키토산의 코팅이 용이하게 이루어질 수 있다. 또한, 키토산 코팅의 대상인 유드라짓 나노섬유는 부피대비 표면적이 넓어서 키토산 코팅이 용이하며, 코팅된 키토산의 양이 많아질 수 있다. 또한, 상기 음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 용액을 전기방사시켜 제조된 나노섬유를 키토산 코팅 없이 바로 구강 점막이나 중성에 해당하는 다른 임의의 생체 점막에 부착 시, 나노섬유가 쉽게 용해되어 점막에 음이온성 단백질 약물을 국소적으로 혹은 전신적으로 적용하기 어렵다. 그러나, 상기 본 발명의 일 측면에서와 같이 키토산 또는 그 유도체로 코팅된 유드라짓 나노섬유는 키토산 코팅에 의해 보호되어, 유드라짓 나노섬유의 용해 속도가 조절될 수 있으므로, 상기 생체 점막에서 신속하게 용해되지 않고 서서히 용해될 수 있어 유드라짓 나노섬유에 함유되어 있던 음이온성 단백질의 방출량이 조절될 수 있다. 또한, 유드라짓 나노섬유에 함유되어 있던 음이온성 단백질은 음전하를 띄므로 키토산의 아민 그룹과 정전기적 인력에 의해 결합되어 음이온성 단백질 약물의 방출이 저해되므로, 음이온성 약물의 방출이 더욱 조절될 수 있다. 또한, 생체의 점막은 음이온을 띄므로, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노섬유는 양이온을 띄는 키토산 코팅층에 의해, 생체 점막에 적용 시 부착력이 높다. 따라서, 상기 키토산 코팅 나노섬유는 오랫동안 점막에 부착하여 음이온성 단백질을 경피로 체내에 전달하는 것을 가능하게 할 수 있다. 뿐만 아니라, 손상된 점막조직 또는 구내염의 손상된 조직 부위에 부착되어 국소 부위에 음이온성 단백질 약물을 지속적으로 약물을 공급할 수 있어, 바람직하다.
또 다른 측면에서 설명하면, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 키토산 코팅 나노섬유는 중성 환경에서 용해하는 특성이 있는 장용성 유드라짓을 음이온성 단백질과 함께 나노섬유로 제조하고, 그 나노섬유를 키토산 또는 그 유도체로 코팅함으로써, 중성 환경의 생체 점막의 환경에서 유드라짓 나노섬유가 용해되는 것을 그 유드라짓 나노섬유를 코팅하고 있는 키토산 또는 그 유도체의 코팅층이 저해할 수 있어 약물의 급격한 방출을 방지할 수 있다. 또한, 유드라짓 나노섬유에서 방출된 음이온성 단백질도 키토산 코팅층과의 정전기적 인력에 의해 체액에 완전히 방출되는 것을 저해하여, 약물의 방출을 더욱 제어할 수 있다.
본 발명은 다른 일 측면에 있어서,
음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 혼합용액을 제조하는 단계로서, 상기 유드라짓은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1 또는 1:2, 또는 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1인 단계;
상기 혼합용액을 전기방사시켜 나노섬유를 제조하는 단계; 및
상기 나노섬유를 키토산 또는 그 유도체로 코팅하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 일 측면에 따른 키토산 코팅 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
상기 음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 혼합용액의 제조를 위해, 유드라짓을 용해할 수 있으면서 음이온 단백질의 활성에 영향을 미치지 않는 임의의 용매가 이용될 수 있다. 이러한 용매로는 에탄올, 메탄올, 또는 에탄올 및 디메틸아세트아미드 5:1(v/v) 혼합액, 또는 메탄올 및 디메틸아세트아미드 5:1(v/v) 혼합액 등이 있다. 상기 음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 혼합용액에서 음이온성 단백질의 농도는 10 ng/mL ~ 10 mg/mL, 유드라짓은 0.09 ~ 0.15 g/mL의 범위일 수 있다. 상기 농도 범위를 벗어날 경우는 비드 혹은 비드와 나노섬유로 구성된 불균일한 메쉬를 획득하게 되며, 상기의 농도보다 높을 경우는 제조된 섬유의 굵기가 수십에서 수백 마이크로미터의 크기로 제조될 수 있다.
상기 혼합용액을 전기방사시켜 나노섬유를 제조하는 단계는, 전기방사에 의해 나노섬유를 제조하는 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
상기 나노섬유를 키토산 또는 그 유도체로 코팅하는 단계는 키토산 또는 그 유도체의 용액에 상기 나노섬유를 소정의 시간동안, 바람직하게는약 3-10 시간 동안 담가둔 다음, 증류수로 세척 후 건조함으로써 수행할 수 있다. 키토산 또는 그 유도체를 포함하는 용액의 용매는 예를 들어 트리플루로로 아세트산 및 디클로로메탄의 혼합용매, 헥사플루오로이소프로판올 및 트리플루로로 아세트산 혼합용매와 같은 산성 용액일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 키토산 용액의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 약 0.3 내지 2.0 w/v% 범위로 조정할 수 있다. 상기 코팅시간이 길수록, 그리고 키토산 용액의 농도가 높을수록 생성되는 코팅의 두께가 두꺼워질 수 있으며, 따라서 음이온성 단백질 약물의 방출이 느려질 수 있다. 따라서, 목적하는 약물의 방출속도 등을 고려해서 통상의 기술자가 키토산 용액의 농도 및 코팅 시간을 조절할 수 있다.
상기 키토산 코팅 나노섬유 제조방법의 일 실시예에 따른 제조과정 및 키토산 코팅 나노섬유로부터의 음이온성 단백질 방출거동에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다.
도 1에 따르면, 음이온성 단백질인 인간성장호르몬(hGH) 및 유드라짓 L100(EL100)을 포함하는 혼합용액을 제조하는 단계(단계 1)을 수행한 다음, 단계 1에서 제조된 혼합용액을 전기방사시켜 나노섬유를 제조하는 단계(단계 2)를 수행하고, 그리하여 얻어진 나노섬유를 키토산으로 코팅하는 단계(단계 3)를 수행한다. 단계 3에서는 유드라짓 나노섬유에 존재하는 유드라짓의 카르복실기와 키토산의 아민기의 양이온이 서로 정전기적 인력에 의해, 키토산 코팅이 이루어진다. 최종적으로 얻어진 키토산 코팅 나노섬유(EL100/hGH 나노섬유)는 생체 점막에 부착 시 음이온성 단백질을 방출할 수 있는데, 음이온성 단백질은 코팅된 키토산과의 정전기적 인력에 의해 방출이 저해될 수 있으므로, 키토산 코팅에 의해 소정의 시간동안 지속적인 방출이 가능하다.
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 키토산 코팅 나노섬유를 포함하는 음이온성 단백질의 경점막 투여제를 제공한다.
상기 점막은 약물의 투여가 가능한 pH 6 이상의 중성 환경의 임의의 생체 점막일 수 있으며, 예를 들어 구강 점막, 눈 점막, 비 점막, 귀 점막, 또는 항문 점막 등일 수 있다. pH 6 미만의 환경에서는 유드라짓 나노섬유의 용해가 이루어지지 않아 약물의 방출이 이루어지지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 경점막 투여제는 구강 점막을 통한 투여제일 수 있다. 구강 점막은 혈관이 잘 발달되어 있어 단백질 약물 전달에 효과적이며, 구강점막을 통해 단백질 약물이 투여되면 간과 위에 의한 초회통과효과를 피할 수 있어 약물의 손실을 최소화 할 수 있다는 점에서 매우 바람직하다.
상기 본 발명에 따른 나노섬유를 실제로 경점막 투여제로 적용하기 위해서는 그대로 이용될 수도 있으며, 경점막 투여제로 제제화하기 위해 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 제제화 기술이 추가적으로 이용될 수도 있다.
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 키토산 코팅 나노섬유를 포함하고, 상기 음이온성 단백질은 인간성장호르몬(hGH) 또는 상피세포성자인자(EGF)인 점막 염증 치료제를 제공한다.
본 명세서에서 "점막 염증"이란 pH 6 이상의 중성 환경의 임의의 생체 점막에 생긴 염증으로서 조직 재생에 의해 치료 또는 개선될 수 있는 임의의 염증을 의미하며, 예를 들어 구강 점막, 눈 점막, 비 점막, 귀 점막, 또는 항문 점막 등의 염증을 의미한다. 상기 점막 염증에는 대표적으로 구내염이 있다.
상기 점막 염증 치료제는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 국소적용을 위한 다양한 제형으로 제제화될 수 있다. 이러한 제형의 예로는 국소적용 액제, 연고제, 스프레이제, 또는 패치제일 수 있으며, 바람직하게는 패치제의 형태일 수 있다. 패치제의 제조 시, 패치제의 활성약물 층으로서 상기 키토산 코팅 나노섬유를 함유할 수 있다. 이러한 패치제는, 나노섬유에 코팅된 키토산에 의한 점막과의 부착용이성에 의해, 국소적용하고자 하는 병소부위에 충분한 시간동안 부착될 수 있으므로, 점막 염증의 치료, 특히 구구내염의 치료에 매우 유리하다.
상기 상피세포성장인자(EGF)는 손상된 조직의 재생 효과에 의해 구내염의 치료에 사용할 수 있음이 개시되어 있고(WO 03/95637), 상기 인간성장호르몬(hGH) 및 산성섬유아세포성장인자(aFGF) 또한 손상된 조직의 재생을 촉진시키는 효과가 있어, 구내염을 포함한 점막염증의 치료에 효과적인 것으로 공지되어 있다(J. Control. Rel. 2001, 77, 261-272; J. Investigative Dermatology 1995, 104, 850-855; Pharmaceutical Research 1994, 11, 65-71). 이러한 상피세포성장인자, 인간성장호르몬, 또는 산성섬유아세포성장인자를 구내염 치료에 효과적인 것으로 공지된 투여량을 전달할 수 있도록, 상기 제형에 적절한 양을 함유시킬 수 있으며, 투여횟수를 결정할 수 있으며, 이는 통상의 기술자가 종래 공지된 기술 및 통상적인 실험에 기초하여 적절히 결정할 수 있다.
상기 구내염의 치료는 인간성장호르몬 및 상피세포성장인자의 조직재생 효과에 기초한 것이므로, 상기 구내염 치료제는 구내염의 원인에 상관없이 조직 손상을 수반하는 모든 구내염의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 구내염에는 예를 들어, 단순성 구내염, 궤양성 구내염, 괴저성 구내염, 아프타성 구내염, 또는 헤르페스성 구내염이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 키토산 코팅 나노섬유는 구강 점막 등의 중성 환경인 생체 점막의 조건 하에서 안정한 형태로 유지하면서 나노섬유가 함유하고 있던 음이온성 약물이 체액 내로 급격히 방출하는 것을 제어할 수 있어 소정의 시간동안 약물의 방출이 지속적으로 이루어질 수 있도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 키토산 코팅 나노섬유는 점막을 통한 음이온성 단백질 약물의 지속적인 흡수 또는 국소점막에의 약물의 지속적인 작용이 가능하다.
도 1은 키토산 코팅 나노섬유 제조방법의 일 실시예에 따른 제조과정 및 키토산 코팅 나노섬유로부터의 음이온성 단백질 방출거동에 대한 모식도이다.
도 2는 0 w/v%(a), 0.5 w/v%(b), 1.0 w/v% 농도(c)의 키토산으로 코팅된 EL100 나노섬유를 주사전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 0.5 w/v% 및 1.0 w/v% 농도의 키토산으로 코팅된 EL100 나노섬유의 인위적인 신체 조건에서의 무게 손실 중량%를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 Chit.-EL100/hGH의 시간 경과에 다른 hGH의 방출율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 0%, 0.5%, 및 1.0% 농도의 키토산으로 코팅된 Chit.-EL100/FITC-BSA 나노섬유를 돼지소장점막에 부착 후, 진탕 및 상온 조건 하에서 10, 30, 및 60분 경과 후, 얻어진 생검 펀치에 대해 형광촬영한 사진이다.
도 6은 12-well 세포배양용 플레이트에서 사람 섬유아세포를 배양 후, 각 웰에 실험예 1에서 제조한 Chit.-EL100/hGH 나노섬유를 넣고 1, 3 일 배양 후 MTT 어세이를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 키토산 0%, 0.5%, 및 1.0%로 코팅한 Chit.-EL100/hGH 나노섬유 각각으로 비글견의 손상된 구강점막을 드레싱 후 7일이 경과된 다음, 재생된 점막조직을 고정과정과 파라핀 포매 과정 후 H&E 염색 후 점막조직을 광학현미경, Nikon Ti-S로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 키토산 코팅 EL100/hGH 나노섬유의 제조
키토산이 코팅된 Eudragit L100 (chit.-EL100) 나노섬유, 키토산이 코팅된 Eudragit L100/인간성장호르몬 (chit.-EL100/hGH) 나노섬유, 및 키토산이 코팅된 Eudragit L100/모델단백질 (chit.-EL100/FITC-BSA) 나노섬유를 제조하였다.
15 w/v% EL100을 제조하기 위하여 에탄올과 디메틸아세트아미드의 5:1(v/v) 혼합액을 사용하였다. EL100 나노섬유를 제조하기 위하여 균일하게 섞인 15 w/v% EL100 용액을 금속바늘이 있는 주사기에 담아서 1ml/h의 속도로 흘려주면서 금속바늘부에 20kV의 전압을 가해주어 나노섬유를 제조하였다. 이 때 금속바늘부의 끝과 나노섬유가 쌓이는 그라운드(알루미늄 호일)간의 거리는 12cm로 고정해주었다. 이렇게 제조된 나노섬유를 12 시간동안 상온에서 건조 시킨 후, 그라운드에서 떼어내어 1 v/v% 아세트산(acetic acid) 수용액에 녹인 키토산 용액에 6 시간 동안 담가두어 키토산을 코팅하였다. 이 때, 키토산의 농도는 0, 0.5, 및 1%(w/v)를 사용하였다. 키토산 코팅을 위한 6시간이 흐른 후, 키토산이 코팅된 EL100/hGH 나노섬유는 증류수(distilled water)를 사용하여 3번 세척해 주었다. 각각의 키토산 농도에 따른 나노섬유를 주사전자현미경로 촬영한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 0, 0.5 w/v%, 1.0 w/v% 농도의 키토산으로 코팅된 EL100 나노섬유를 촬영한 사진이다.
도 2에 따르면, 키토산 코팅을 진행하여도 나노섬유 특유의 모양은 변화하지 않는 것으로 나타났다.
별도로, 키토산이 코팅된 Eudragit L100/인간성장호르몬 (chit.-EL100/hGH) 나노섬유의 제조를 위하여, 상기 15% EL100 용액 10 ml에 7.5 mg의 hGH를 균일하게 섞어 주어 위의 조건과 동일한 실험을 진행하였다.
또한, 키토산이 코팅된 Eudragit L100/모델단백질 (chit.-EL100/FITC-BSA) 나노섬유를 제조하기 위해, 형광물질(Fluorescein isothiocyanate, FITC)이 결합된 혈청단백질(bovine serum albumin, BSA) (FITC-BSA)을 상기 15% EL100 용액 10 ml에 7.5mg의 FTIC-BSA를 균일하게 섞어 주어 위의 조건과 동일한 실험을 진행하였다.
실험예 2: EL100 나노섬유 표면의 키토산 함량 측정
상기 실험예 1에서 제조된 chit.-EL100 나노섬유 중의 코팅된 키토산의 함량을 알기 위하여, 약 10mg 의 chit.-EL100 나노섬유를 5ml 에탄올에 12시간 동안 담가서 EL100을 녹여내었다. 12 시간이 지난 후, 깨끗한 에탄올로 두 번 세척하여 상온에서 완전 건조시킨 후 무게를 측정하였다.
대조군으로서 상기에 사용한 15 w/v% EL100 용액을 페트리디쉬에 부어서 상온에서 건조한 후 형성된 EL100 필름을 1.0% 키토산 용액에 담가 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 코팅한 것을 이용하여, 비교 실험을 진행하였다.
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Chit.-EL100 나노섬유 무게 대비 코팅된 키토산의 함량
코팅 시 사용된
키토산 용액의 농도 (%)		 코팅된 키토산의 함량(%)
0 9.81 ± 0.79
0.5 18.11 ± 1.07
1.0 26.48 ± 0.17
1.0% 키토산을 코팅한 EL100 필름 미검출
코팅에 사용된 키토산 용액의 농도가 높을수록 EL100 나노섬유 표면에 코팅되는 키토산의 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 이 결과에 따르면, 키토산의 농도가 높을수록 EL100 나노섬유 표면의 카르복실기와의 반응효율이 증가하여 코팅되는 키토산 함량이 많은 것으로 보인다. 또한, EL100 필름에 코팅된 키토산은 그 양이 현저히 적거나 혹은 EL100이 녹은 후 남는 물질이 존재하지 않아 정량이 불가능하였다. 따라서, 나노섬유는 부피 대비 넓은 표면적으로 인해 키토산으로의 코팅 효율이 우수하다는 것을 알 수 있다.
실험예 3:인위적인 신체조건에서의 Chit .- EL100 나노섬유의 무게손실( mass loss )
상기 실험예 1에서 제조된 chit.-EL100 나노섬유의 생체 내에서의 무게손실을 확인하기 위하여, pH 7.4의 완충액 (phosphate buffered saline, PBS) 10 ml이 담겨있는 50-ml 코니컬튜브에 10 mg의 chit.-EL100 나노섬유를 넣어 37℃, 200 rpm조건에서 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 보관하였다. 각 시간이 경과된 후, 나노섬유들을 증류수 10ml을 사용하여 세 번 세척 후 상온에서 완전 건조시켜 무게를 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 0.5 w/v% 및 1.0 w/v% 농도의 키토산으로 코팅된 EL100 나노섬유의 인위적인 신체 조건에서의 무게 손실 중량%를 측정하여 나타낸 그래프이다.
그 결과, 키토산이 코팅되지 않은 0% chit.-EL100 나노섬유의 경우, PBS 상에서 EL100이 10분 안에 모두 녹아버렸다. 반면 0.5% chit.-EL100 나노섬유와 1.0% chit.-EL100 나노섬유의 경우 6시간 이후에도 각각 약 5%와 10%의 무게가 남아있었다. 표 1의 결과와 비교해 볼 때, 섬유를 구성하고 있는 EL100은 모두 녹아나가고 남아있는 것은 키토산임을 예상 할 수 있었다. 코팅된 키토산의 함량은 0.5% chit.-EL100 나노섬유에 비해 1.0% chit.-EL100 나노섬유가 많았으나, 무게손실에서 큰 차이점을 보이지 못하였다.
실험예 4: EL100 / hGH 나노섬유의 hGH 함량 정량
나노섬유에 함유된 hGH의 양을 정량하기 위하여, EL100/hGH 나노섬유를 키토산 코팅 유사상황을 만들어 주기 위하여 1v/v% 아세트산 수용액에 6시간 동안 담가둔 후 상온에서 완전 건조한 다음 이후 실험에 사용하였다. 1mg EL100/hGH 나노섬유를 1ml PBS (pH 7.4)에 완전히 녹여주었다. 이 녹여준 용액의 상층액 100ml를 사용하여 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 통해 hGH양을 정량하였다.
그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112013100972311-pat00001
EL100/hGH의 이론적인 함량 대비 유사 키토산 코팅과정을 거친 후의 hGH 함량은 EL100/hGH 나노섬유 1mg 당 약 35.76 ng의 결과를 얻었다. 유사 키토산 코팅과정을 거치기 전에 비해 약 20%의 함량이 낮아진 이유는 나노섬유 표면에 노출되어 있던 hGH가 유사 키토산 코팅과정을 거치면서 쉽게 용해되어 나오기 때문으로 사료된다. 또한, 혈청 내 hGH 양이 최대 45ng/ml인 것과 비교해 볼 때, EL100/hGH 나노섬유 1mg 당 약 178.80ng의 hGH양은 효능을 나타내기에 충분한 양으로 사료된다.
따라서, 키토산으로 코팅하는 과정에 의해 hGH의 손실이 크지 않아, 키토산 코팅을 EL100/hGH 나노섬유에 적용할 수 있는 것으로 나타났다.
실험예 5: Chit .- EL100 / hGH 나노섬유로부터 hGH 의 방출 거동
Chit.-EL100/hGH 나노섬유로부터 hGH의 방출거동을 확인하기 위하여, 2mg chit.-EL100/hGH 나노섬유를 5ml PBS (pH 7.4)가 담긴 50-ml 코니컬 튜브에 넣어 37℃, 200 rpm에서 3시간 동안 실험을 진행하였다. 10, 30, 60, 90, 120 그리고 180 분이 되었을 때, 각 코니컬 튜브에서 200 μl의 상층액을 획득하여 ELISA 방법을 통해 방출된 hGH의 양을 정량하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 Chit.-EL100/hGH의 시간 경과에 다른 hGH의 방출율을 나타낸 그래프이다.
도 4의 결과에 따면, 본 발명에 따른 나노섬유에 코팅되는 키토산의 함량이 증가할수록 hGH의 방출속도가 느리고 최종 방출량이 적은 것으로 나타났다. 이는 hGH는 EL100 나노섬유가 녹아나오면서 함께 방출이 되는데, 코팅된 키토산이 EL100 나노섬유의 용해속도를 조절해 주기 때문인 것으로 사료된다. 이는 상기 실험예 3에서의 Chit.-EL100 나노섬유의 무게 손실(도 3)의 결과로부터 더욱 설득력이 있다. 또한, EL100 나노섬유가 용해됨에 따라 방출된 hGH는 음전하를 띠고 있어 표면에 코팅된 키토산의 아민기의 양전하에 의해 나노섬유에 잔류할 수 있기 때문에 표면에 코팅된 키토산의 함량이 증가할수록 방출된 hGH의 양이 적은 것이라고 사료된다.
실험예 6: Chit.-EL100/FITC-BSA 나노섬유의 점막 부착 능력평가 및 단백질 잔류의 정성적 평가
상기 실험예 1에서 제조된 Chit.-EL100/FITC-BSA 나노섬유를 PBS (pH 7.4)로 적신 돼지소장점막(small intestinal submucosa, SIS) 위에 부착시킨 후, 50ml PBS (pH 7.4)가 담긴 페트리디쉬에서 나노섬유의 점막 부착 능력을 평가하였다. 실험은 150rpm의 진탕(shaking)과 상온의 조건에서 진행하였으며 10분, 30분, 60분에 각 chit.-EL100/FITC-BSA 나노섬유가 부착된 SIS를 직경이 8 mm인 생검펀치(biopsypunch)를 이용하여 획득하였다. 획득한 샘플은 형광측정용 검은 96-well 플레이트의 각 well에 담아 IVIS (in vivo imaging system)을 이용하여 형광사진을 촬영하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 0%, 0.5%, 및 1.0% 농도의 키토산으로 코팅된 Chit.-EL100/FITC-BSA 나노섬유를 돼지소장점막에 부착 후, 진탕 및 상온 조건 하에서 10, 30, 및 60분 경과 후, 얻어진 생검 펀치에 대해 형광촬영한 사진이다.
그 결과에 따르면, 0% chit.-EL100/hGH 나노섬유의 경우, 페트리디쉬에 PBS를 넣어주는 순간 나노섬유가 모두 떨어져 나갔다. 그 결과 그림 5에서처럼 FITC-BSA의 형광이 아닌 SIS자체 형광만 관찰이 되었다. 반면, 키토산이 코팅된 나노섬유의 경우 SIS 위에 FITC-BSA가 60분 동안 잔류하는 것을 확인하였으며, 이는 코팅된 키토산의 특이 성질인 점막부착성의 영향이라고 사료된다. 또한, 60분 후에는 1.0% chit.-EL100/FITC-BSA 나노섬유에 단백질의 잔류량이 0.5% chit.-EL100/FITC-BSA 나노섬유에 비해 많은 것으로 확인되었다. 이는 코팅된 키토산의 함량이 많을수록 방출되는 단백질의 양이 적어 점막부위에 잔류하는 시간이 길어지고, 방출된 단백질이 표면의 키토산과 다시 한번 결합함에 따라 잔류량이 많아진 것으로 사료된다.
실험예 7: Chit.-EL100/hGH 나노섬유의 세포성장촉진 효과 평가
Chit.-EL100/hGH 나노섬유의 세포성장촉진 효과를 확인하기 위하여, 사람 섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDF)를 사용하였다. 각 나노섬유는 세포배양에 앞서 UV에 30분 동안 노출시켜 멸균처리 한 것을 사용하였다. 12-well 세포배양용 플레이트의 각 well에 1x104 cells/웰로 세포를 분주하였다. 12 시간 배양 후, 각 well에 각 나노섬유 1mg을 첨가하여 1일과 3일 동안 배양 후 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 방법을 통하여 세포의 성장 촉진 효과를 평가하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 12-well 세포배양용 플레이트에서 사람 섬유아세포를 배양 후, 각 웰에 실험예 1에서 제조한 Chit.-EL100/hGH 나노섬유를 넣고 1, 3 일 배양 후 MTT 어세이를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
그 결과에 따르면, 성장호르몬 미함유 나노섬유에 비해 성장호르몬을 함유 나노섬유들이 약 5~50%의 높은 성장 촉진효율을 보여주었다. 또한, 0.5% chit.-EL100/hGH 나노섬유가 가장 높은 성장촉진효율을 보여주고 있다. 이는 hGH의 방출거동 결과(도 4)와 비교해 볼 때, hGH의 방출을 조절하여 장시간 방출시켜 주고 그 양이 1.0% chit.-EL100/hGH 나노섬유에서 방출된 hGH의 양보다 많기 때문인 것으로 보여진다.
실험예 8: Chit.-EL100/hGH 나노섬유의 비글 구강점막염증 치료효과 평가
Chit.-EL100/hGH 나노섬유의 구강점막염증의 치료효과를 평가하기 위하여, 비글의 구강 내에 50 v/v% 아세트산 수용액을 적신 직경 5mm의 솜을 60초간 접촉시켜 구강점막의 탈락을 유도하였다. 구강점막의 탈락을 유도한지 12시간이 경과된 후, 손상점막 부위를 식염수로 세척하고 chit.-EL100/hGH 나노섬유로 드레싱 해주었다. 비글을 1시간 동안 마취를 시켜서 손상점막을 덮고 있는 각 나노섬유가 비글의 구강움직임에 의해 떨어지는 것을 방지해 주었다. 1 시간 후, 마취에서 깨어난 비글은 식도로 연결된 관을 통하여 영양분을 공급하였다. 첫 드레싱을 한지 3일이 경과 된 후, 두번째 드레싱을 진행하였다. 손상점막 부위를 식염수로 세척하고 chit.-EL100/hGH 나노섬유로 드레싱을 해준 후, 1시간 동안 마취를 시켜 손상점막을 덮고 있는 각 나노섬유가 구강움직임에 의해 떨어지는 것을 방지해 주었다. 마취에서 깨어난 비글은 식도로 연결된 관을 통하여 영양분을 공급하였다. 두번째 드레싱을 진행한지 4일이 경과된 후, 재생된 점막 조직을 획득하여 고정과정과 파라핀 포매 과정을 진행하였다. 각 조직들을 횡단면 4μm의 두께로 잘라 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색방법을 통해 염색을 진행하여 재생된 점막조직을 관찰하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
본 동물실험은 강원대학교 동물실험윤리위원회의 허가 하에 진행되었으며, 모든 실험은 동물실험윤리위원회의 내규에 맞춰 진행하였다.
도 7은 키토산 0%, 0.5%, 및 1.0%로 코팅한 Chit.-EL100/hGH 나노섬유 각각으로 비글견의 손상된 구강점막을 드레싱 후 7일이 경과된 다음, 재생된 점막조직을 고정과정과 파라핀 포매 과정 후 H&E 염색 후 점막조직을 광학현미경, Nikon Ti-S로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 7에서 빨간색의 화살표로 표시된 부분은 처음 손상된 조직의 경계이며, 파란색의 화살표로 표시된 부분은 점막 표피의 재생이 되지 않은 부분을 표시하였다.
구강점막에 50 v/v% 아세트산 수용액의 접촉 후, 점막 표피의 탈락이 진행된 것을 확인하였다(Day 0). Chit.-EL100/hGH 나노섬유로 드레싱을 한 후 7일이 경과되었을 때, 0% chit.-EL100/hGH 나노섬유와 1.0% chit.-EL100/hGH 나노섬유로 드레싱을 해준 조직의 경우는 점막표피가 완전히 재생되지 않은 것을 확인하였다. 반면, 나노섬유를 처리하지 않은 조직과 0.5% chit.-EL100/hGH 나노섬유로 드레싱을 해준 조직은 점막의 표피가 완전히 재생되어 손상된 점막표피가 모두 덮인 것을 확인하였다. 하지만, 나노섬유를 처리하지 않은 조직의 경우에 비해 0.5% chit.-EL100/hGH 나노섬유로 드레싱을 해준 조직의 재생된 점막표피가 더 두껍게 형성되어 손상되기 전의 점막표피의 두께와 유사하게 재생된 것을 확인하였다. 0.5% chit.-EL100/hGH 나노섬유의 치료효과가 1.0% chit.-EL100/hGH 보다 우수한 이유는 hGH의 방출량(도 4)과 관련이 있다고 사료된다. 즉, 같은 시간대비 hGH의 방출량이 0.5% chit.-EL100/hGH 나노섬유가 1.0% chit.-EL100/hGH 나노섬유에 비해 약 10% 많기 때문에 방출된 hGH에 의해 재생속도가 향상되었다고 사료된다.

Claims (13)

  1. 음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 용액을 전기방사시켜 제조된 나노섬유에 키토산 또는 그 유도체가 코팅된, 음이온성 단백질 약물 전달을 위한 키토산 코팅 나노섬유로서,
    상기 유드라짓은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1 또는 1:2, 또는 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1인 키토산 코팅 나노섬유.
  2. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 단백질은 조직 재생에 효과가 있는 음이온성 단백질인 키토산 코팅 나노섬유.
  3. 제2항에 있어서, 상기 음이온성 단백질은 인간성장호르몬, 상피세포성장인자(EGF), 산성섬유아세포성장인자(aFGF), 소혈청 알부민(BSA), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 것인 키토산 코팅 나노섬유.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유드라짓은 폴리(메타크릴레이트-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1인 키토산 코팅 나노섬유.
  5. 제1항에 있어서, 상기 키토산 유도체는 글라이콜 키토산 또는 글라이실 메타아크릴레이트 키토산인 키토산 코팅 나노섬유.
  6. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 단백질은 인간성장호르몬이고, 상기 유드라짓은 EL100이고, 상기 키토산 또는 그 유도체는 키토산인 키토산 코팅 나노섬유.
  7. 음이온성 단백질 및 유드라짓을 포함하는 혼합용액을 제조하는 단계로서, 상기 유드라짓은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1 또는 1:2, 또는 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1인 단계;
    상기 혼합용액을 전기방사시켜 나노섬유를 제조하는 단계; 및
    상기 나노섬유를 키토산 또는 그 유도체로 코팅하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 키토산 코팅 나노섬유의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 키토산 나노섬유를 포함하고, 상기 음이온성 단백질은 인간성장호르몬(hGH), 상피세포성장인자(EGF) 또는 산성섬유아세포성장인자(aFGF)인 점막 염증 치료제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 점막 염증은 구내염인 점막 염증 치료제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 구내염은 단순성 구내염, 궤양성 구내염, 괴저성 구내염, 아프타성 구내염, 또는 헤르페스성 구내염인 점막염증 치료제.
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