CN114072163A - 皮肤伤口愈合和瘢痕预防的新材料 - Google Patents

皮肤伤口愈合和瘢痕预防的新材料 Download PDF

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Abstract

公开了用于防止或抑制瘢痕形成的方法和组合物。所述方法和组合物包括在缓释组合物中提供的TGF‑β抑制剂。

Description

皮肤伤口愈合和瘢痕预防的新材料
相关申请交叉引用
本申请要求2019年5月9日提交的美国临时专利申请第62/845648号的优先权，其通过引用整体并入本文。
政府支持声明
这项发明是在国家卫生研究院授予的批准号为R01OD023700的政府支持下完成的。政府对发明享有一定的权利。
发明背景
1.技术领域
本发明涉及医学、有机化学和病理学领域。
2.背景技术
瘢痕通常发生在深度创伤、严重烧伤或手术切口后。它可以对患者的生活质量产生深远的影响，并对医生提出了巨大的挑战。克服瘢痕的一种方法是，通过阻断转化生长因子-β(TGF-β)抑制胶原合成。然而，TGF-β抑制的时机至关重要，因为过早阻断信号会导致伤口愈合不良，而胶原合成峰值后阻断将限制瘢痕减少的效果。因此，我们开发了一种新型复合伤口光凝胶敷料，用于TGF-β抑制剂体内的定时释放。具体地，我们采用水包油包水(W/O/W)乳液蒸发法设计了一种含有聚(乳酸-共-羟基乙酸)邻硝基苯衍生物(PLGA-NB)的定时缓释药物递送胶囊系统。然后采用高效光触发亚胺交联反应，通过透明质酸邻硝基苯衍生物(HA-NB/HA-CDH)将胶囊植入到伤口组织中。这种简便的治疗被称为原位生成定时脉冲释放敷料(ISTD)，能在精确的时间点有效地降低成纤维细胞活性和胶原沉积，从而显著减少小鼠、兔和猪模型中的瘢痕形成。
除了非常微小的损伤，几乎所有的伤口都会导致不同程度的瘢痕形成。通常，大约在两周内愈合且只有少量胶原沉积的皮肤伤口不会形成瘢痕。但是，如果修复过程需要三到四周以上的时间，则可能会视情况产生各种瘢痕，如伸展纹、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕或萎缩性瘢痕。与正常皮肤相比，皮肤瘢痕的功能通常较差。例如，它们没有汗腺和毛囊，而且它们可能会引起瘙痒和疼痛的症状。1此外，瘢痕可能有时会限制运动范围，并作为创伤事件的永久可见提醒。2
以往对瘢痕模型的研究使人们对瘢痕形成的病理生理学有了深刻的认识。TGF-β是瘢痕形成的主要调节因子之一，因为有现成的针对TGF-β的抑制剂，其成为瘢痕减少的策略的一个有吸引力的目标。然而，早期针对TGF-β的尝试因为忽视了药物递送的关键时机问题是不成功的。实际上，Mustoe等人已经证明了在受伤后第一周开始抗TGF-β抗体治疗，实际上会延迟伤口愈合而不会减少瘢痕，因为TGF-β是伤口早期愈合所必需的。相反，创伤后一周开始抑制TGF-β会减少瘢痕形成。因此，临床上需要制造一种敷料，允许在应用一周后脉冲释放TGF-β抑制剂。已经发明了许多其他的方法如涂层、多次压实。4-8虽然这些方法可能潜在地用于在最佳时间点递送TGF-β抑制剂以减少瘢痕，但它们尚未就此目的得到验证。此外，它们需要复杂的三维微型工艺设备，这限制了其临床应用的潜力。
发明内容
本文提出了一种新型的药物递送系统。所述系统包括原位生成定时脉冲释放敷料(ISTD)，其可以通过原位光触发亚胺交联预胶凝聚合物结合到到伤口中，以在最佳时间点递送至少一种TGF-β抑制剂，来促进伤口愈合并减少瘢痕形成。采用基于乳液的制备方法将至少一种TGF-β抑制剂负载在聚合物胶囊中。9-11然后给予安全且已广泛应用于临床再生医学的外部的光照射，使胶囊和预胶凝聚合物通过邻硝基苯和-NH2反应与周围组织表面快速交联。12在一些方面，外部光照射的波长为365nm。这种混合交联方法稳定了定时释药胶囊，使微掺杂物充填均匀，导致物质在伤口区域被牵引排出，从而可以提高治疗效果。13最后，聚合物屏障的定时降解导致了所述至少一种TGF-β抑制剂的脉冲释放，以达到最佳的瘢痕减少潜力。ISTD显示了极好的时间可控性、生物相容性和高效的组织结合。最重要的是，在小鼠、兔和猪皮肤损伤模型中，该系统可以明显地减少肥厚性瘢痕的形成，且不延迟伤口愈合。
在某些方面，本发明公开了在需要的对象中减少皮肤伤口瘢痕形成的方法。该方法包括将包含至少一种TGF-β抑制剂和可交联聚合物组合物的组合物施用到伤口，以及诱导可交联聚合物组合物的交联以形成经交联聚合物组合物。通过可交联聚合物组合物的交联，经交联组合物共价附着在皮肤组织上。可交联聚合物组合物的实例可在美国专利公布第2017/0313827号中找到，其通过引用整体并入本文。在某些方面，所述至少一种TGF-β抑制剂在缓释胶囊中提供。在实施方案中，缓释胶囊被配制为在1天至60天内缓释所述至少一种TGF抑制剂。在某些实施方案中，所述缓释胶囊还包括至少一种选自血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子和至少一种细胞因子的伤口愈合剂。所述至少一种细胞因子可以选自IL-7、IL-10和本领域已知的其他细胞因子。在某些实施方案中，在施用减少瘢痕形成的组合物之后，用绷带材料覆盖皮肤组织。缓释胶囊可包括邻硝基苄基官能化聚合物。在某些实施方案中，邻硝基苄基官能化聚合物的分子量为1000Da至100000Da。邻硝基苄基官能化聚合物的分子量可以是1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、10000Da、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da、60000Da、65000Da、70000Da、75000Da、80000Da、85000Da、90000Da、95000Da、100000Da或介于上述之间的任何值。在某些实施方案中，邻硝基苄基官能化聚合物为邻硝基苄基官能化的聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。在某些实施方案中，邻硝基苄基官能化PLGA的分子量为1000Da至100000Da。邻硝基苄基官能化PLGA的分子量可以是1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、10000Da、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da、60000Da、65000Da、70000Da、75000Da、80000Da、85000Da、90000Da、95000Da、100000Da或介于上述之间的任何值。在某些实施方案中，PLGA的乳酸/羟基乙酸的比例可以是1∶1000至1000∶1。PLG的A乳酸/羟基乙酸的比例可以为1∶1000、2∶1000、3∶1000、4∶1000、5∶1000、1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100、8∶100、9∶100、1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10、9∶10、1∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、80∶1、100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1、600∶1、700∶1、800∶1、900∶1、1000∶1或其中任何可推导的任何范围。在某些实施方案中，邻硝基苄基官能化聚合物为聚(乳酸)。在某些实施方案中，邻硝基苄基官能化聚合物为聚(羟基乙酸)。在某些实施方案中，聚(乳酸)的分子量为1000Da至100000Da。聚(乳酸)的分子量可以是1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000na、10000Da、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da、60000Da、65000Da、70000Da、75000Da、80000Da、85000Da、90000Da、95000Da、100000Da或介于上述之间的任何值。在某些实施方案中，聚(羟基乙酸)的分子量为1000Da至100000Da。聚羟基乙酸的分子量可以是1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、10000Da、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da、60000Da、65000Da、70000Da、75000Da、80000Da、85000Da、90000Da、95000Da、100000Da或介于上述之间的任何值。缓释胶囊还可以包括其他成分，包括但不限于聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，PVA的分子量为100Da至5000Da。PVA的分子量可以是100Da、200Da、300Da、400Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000DA或介于上述之间的任何值。在某些实施方案中，PEG的分子量为1000Da至5000Da。PEG的分子量可以是100Da、200Da、300Da、400Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000DA或上述之间的任何值。在某些实施方案中，所述至少一种TGF-β抑制剂选自SB431542、LDN-193189、格鲁尼色特(galunisertib)(LY2157299)、LY2109761、SB525334、LY3200882、SB505124、吡非尼酮、GW788388、LY364947、RepSox、LDN-193189、K02288、SD-208、LDN-214117、SIS3、伐托色替(vactosertib)(TEW-7197)、DMH1、LDN-212854、ML347、卡托吉宁(kartogenin)、橙皮素(hesperctin)、土木香内酯、GC-1008和LY550410。Lahn M等人和Yingling，J.M等人公开了可以用于本文公开的方法和组合物的TGF-β抑制剂。39，40由Lahn M.等人和Yingling，J.M.等人公开的TGF-β抑制剂通过引用并入本文。特别考虑到这些TGF-β抑制剂中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种可以从本文所述的实施方案中排除。
在某些方面，本申请公开了一种在需要的对象中促进伤口愈合的方法。该方法包括向伤口施用包括可交联聚合物组合物和至少一种选自VEGF、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、结缔组织生长因子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白、血小板衍化生长因子、血管内皮生长因子的激动剂或拮抗剂、转化生长因子β3、胸腺素和/或至少一种细胞因子的伤口愈合剂的组合物，并诱导可交联聚合物组合物的交联以形成经交联聚合物组合物。VEGF族包括五个成员，VEGF-A、胎盘生长因子(PGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。任何或所有的VEGF家族成员都可以用于本文所述的伤口愈合方法。至少一种细胞因子可以选自IL-7、IL-10和本领域其他已知的细胞因子。在某些方面，在缓释胶囊中提供至少一种伤口愈合剂。
在某些实施方案中，可交联聚合物组合物包括邻硝基苄基官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。在某些实施方案中，邻硝基苄基官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物的分子量可以是1kDa至500kDa。邻硝基苄基官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物的分子量可以是1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或者介于上述之间的任何值。在某些方面，可交联聚合物组合物还包括末端胺官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。在某些实施方案中，末端胺官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物的分子量可以是1kDa至500kDa。末端胺官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物的分子量可以是1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或者介于上述之间的任何值。在某些方面，邻硝基苄基官能化多糖为邻硝基苄基官能化透明质酸。在某些实施方案中，透明质酸的分子量为1Da至500Da。透明质酸的分子量可以是1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或者介于上述之间的任何值。在某些方面，末端胺官能化多糖为碳酰肼官能化透明质酸。
一些实施方案针对组合物。在一些实施方案中，组合物可用于减少对象的皮肤伤口瘢痕的形成。在一些实施方案中，组合物包括包含至少一种TGF-β抑制剂和可交联聚合物组合物的缓释胶囊。
在一些方面，可交联聚合物组合物包括一种或多于一种可交联聚合物。在一些方面，可交联聚合物组合物包括邻硝基苄基官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。在一些实施方案中，邻硝基苄基官能化多糖为邻硝基苄基官能化透明质酸。在一些方面，可交联聚合物组合物还包括末端胺官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。在一些实施方案中，端胺官能化多糖为碳酰肼官能化透明质酸。在一些方面，可交联聚合物组合物包括邻硝基苄基官能化透明质酸和碳酰肼官能化透明质酸。
可交联聚合物组合物的交联可以通过本领域技术人员已知的各种交联方法来完成。在一些实施方案中，交联包括用来自光源的光照射可交联聚合物组合物以激活交联反应。在一些方面，光源的照明波长范围为250nm至500nm。光源的照明波长可为250nm、255nm、260nm、265nm、270nm、275nm、280nm、285nm、290nm、295nm、300nm、305nm、310nm、315nm、320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm、350nm、355nm、360nm、365nm、370nm、375nm、380nm、385nm、390nm、395nm、400nm、405nm、410nm、415nm、420nm、425nm、430nm、435nm、440nm、445nm、450nm、455nm、460nm、465nm、470nm、475nm、480nm、485nm、490nm、495nm、500nm或介于上述之间的任何值。在一些实施方案中，诱导交联的光源的照明波长为365nm。在一些方面，可交联聚合物组合物在溶液中提供。可交联聚合物组合物溶液的浓度可以是每单位重量水中0.1重量％至50重量％的可交联聚合物组合物。在一些方面，邻硝基苄基官能化透明质酸与碳酰肼官能化透明质酸的比值为0.01∶1至100∶1。邻硝基苄基官能化透明质酸与碳酰肼官能化透明质酸的比值可以为0.01∶1、0.02∶1、0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.1∶1、0.2∶1、0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1或其中任何可推导的范围。在一些实施方案中，缓释胶囊包含一种或多于一种TGF-β抑制剂。
缓释胶囊可以包括每100g聚合物约0.1mg至1000mg的每一种TGF-β抑制剂。缓释胶囊可以包括约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、100mg或者介于上述之间的任何值。缓释胶囊可以包括邻硝基苄基官能化聚合物。在一些实施方案中，邻硝基苄基官能化聚合物是邻硝基苄基官能化聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。在一些实施方案中，PLGA的乳酸/羟基乙酸的比例可以是1∶1000至1000∶1。PLGA的乳酸/羟基乙酸的比例可以为1∶1000、2∶1000、3∶1000、4∶1000、5∶1000、1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100、8∶100、9∶100、1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10、9∶10、1∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1、600∶1、700∶1、800∶1、900∶1、1000∶1或其中可推导的任何范围。在一些实施方案中，邻硝基苄基官能化聚合物为聚(乳酸)。在其他实施方案中，邻硝基苄基官能化聚合物为聚(羟基乙酸)。缓释胶囊还可以包括其他成分，包括但不限于聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，所述至少一种TGF-β抑制剂选自SB431542、LDN-193189、格鲁尼色特(galunisertib)(LY2157299)、LY2109761、SB525334、LY3200882、SB505124、吡非尼酮、GW788388、LY364947、RepSox、LDN-193189、K02288、SD-208、LDN-214117、SIS3、伐托色替(vactosertib)(TEW-7197)、DMH1、LDN-212854、ML347、卡托吉宁(kartogenin)、橙皮素(hesperctin)、土木香内酯、GC-1008和LY550410。
可以各自独立地选择缓释胶囊邻硝基苄基官能化聚合物(例如PLGA、PLA或PGA)、邻硝基苄基官能化PLGA的乳酸/羟基乙酸比、可交联聚合物组合物聚合物分子量、可交联聚合物组合物聚合物末端基团以实现所需要的组成物的物理化学特性。这些特性中的每一个都可以被独立地选择来调整或修改选自玻璃化转变温度、缓释胶囊降解速率、缓释胶囊释放速率、经交联聚合物组合物降解速率以及TGF-β抑制剂释放速率的物理化学特性。
实施方案还包括制备所述组合物的方法。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂结合或混合交联聚合物化合物。
如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述相互组合或排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x，y，和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别预期x、y或z可以被特别地排除在一个实施方案之外。
在本申请中，术语“约”根据其在细胞生物学领域中的简单和普通的含义用以表示包括用于确定该值的装置或方法的误差标准差的值。短语“伤口愈合”指的是用活组织替换被破坏的组织。短语“促进伤口愈合”可以指的是增加被破坏的组织被活组织取代的速率，或者这个短语可以指增加被破坏的组织被活组织取代的程度。
术语“包括”和“包含”、“含有”或“以...为特征”同义，并且是包含的或开放式的，不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。短语“由...组成”排除未指定的任何元素、步骤或成分。短语“基本上由...组成”将描述的主题的范围限定在指定的材料或步骤，以及那些不会对其基本和新颖特性产生实质性影响的材料或步骤。预期在术语“包括”一词的上下文中所描述的实施方案也可以在“由...组成”或“基本由...组成”的上下文中中实施。
具体设想地，就本发明的一个实施方案所讨论的任何限制可以适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物都可以用于本发明的任何方法，并且本发明的任何方法都可以用于生产或者利用本发明的任何组合物。实施例中描述的实施方案的方面也可以是不同实施例或申请中其他地方实施的实施方案，例如发明内容、具体实施方式、权利要求和附图说明中的实施方案。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分，并被包括以进一步证明本发明的某些方面。通过参考其中的一幅附图或多于一幅附图并结合本文提出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1.原理图。胶囊采用W/O/W乳液法制备。它以不同的、定时的延迟破裂而不泄漏的情况下释放内部有效载荷(至少一种TGF-β抑制剂)。HA-NB/HA-CDH与皮肤伤口组织光凝胶化后，可作为伤口敷料施用，防止瘢痕过度增大而不延缓伤口愈合。
图2A-B.胶囊的FESEM照片和破裂的Cap-Hollow胶囊。
图3A-C.定时释放胶囊的脉冲释放动力学。(a)包封的BSA在37℃下从Cap-BSA胶囊中的体外累积释放量。(b)Cap-FRET注射小鼠的体内最大辐射效率变化曲线。注意到，与体外释放相比，其释放曲线相对不那么明显。这是因为，即使每个胶囊表现出脉动释放，在个体小鼠中释放的起始可以略有不同。(c)用IVIS收集的小鼠图像。
图4.涂抹材料前后伤口的照片。
图5.HA-NB/HA-CDH与胶囊及伤口周围组织的光交联。在紫外线照射下，HA-NB/HA-CDH中和胶囊壳内的邻硝基苯基团转化为邻亚硝基苯甲醛基团，通过邻亚硝基苯甲醛基团与-NH2基团交联，导致大分子、胶囊和周围伤口表面结合。
图6A-D.CD-1小鼠背侧皮肤瘢痕评估。(a)皮肤纤维化，通过小鼠伤口部位和未受累皮肤中胶原沉积的程度进行评估。(b)F4/80，(c)α-SMA、(d)CD4+抗体和CD8+抗体阳性细胞在伤口部位各高倍视野中的数量。*p＜0.05，**p＜0.001。
图7A-C.Cap-Hollow敷料、Cap-I敷料和生理盐水处理的受伤小鼠背部皮肤的代表性组织学实例。术后(a)第5天、(b)第10天、(c)第15天瘢痕组织的石蜡切片。
图8A-C.兔耳图片及瘢痕升高指数(SEI)的测量方法。(a)兔耳在不同时间点的照片。(b)肥厚性瘢痕的组织横切面(三色染色和H&E)。(c)SEI是包括新形成的肥厚皮肤高度(α)在内的整个皮肤高度(α+β)与下层皮肤高度(β)的比值。
图9.治疗和兔耳的照片。
图10.术后30天形成的肥厚性瘢痕的组织学横切面(三色染色和H&E)。
图11.术后60天形成的肥厚性瘢痕的组织学横切面(图7中没有显示的其他3个伤口的三色染色和H&E)。
图12A-B.兔耳瘢痕的胶原沉积及SEI评估。*p＜0.05，**p＜0.005。
图13.胶囊的光学显微镜照片。
图14.通过CCK-8测定法测定的相对于未处理组在24小时内针对Cap-Hollow、Cap-I、Cap BSA和Cap FRET的细胞的活力。
图15.用PLGA-NB胶囊递送TGFβ抑制剂可以增强皮肤伤口闭合同时抑制瘢痕形成。(a)用PLGA胶囊或装载有TGFβ抑制剂的PLGA胶囊处理的猪皮肤伤口闭合的量化。(b)经PLGA胶囊或负载有TGFβ抑制剂的PLGA胶囊处理的猪皮肤切片的苏木精和伊红(H/E)染色和三色染色。
图16A-C.PLGA-NB递送平台可促进猪皮肤伤口愈合模型的无瘢痕愈合。(a)不同处理组的猪皮肤伤口愈合和瘢痕形成的代表性图像。(b-c)创伤后不同时间点胶原沉积及SEI(瘢痕升高指数)的定量分析。所有的误差条代表SD。
具体实施方式
本公开提供了通过提供减少瘢痕过度增大的组合物和方法克服现有技术的缺陷的实施方案。在一些实施方案中，方法和组合物涉及通过阻断转化生长因子-β(TGF-β)抑制胶原合成。一种或多于一种TGF-β抑制剂可以在可结合到伤口组织中的定时缓释药物递送胶囊系统内提供。定时释放胶囊系统可通过聚合物交联反应与对象的伤口组织结合，所述反应涉及交联聚合物与伤口组织的共价结合。组合物和方法可以包括血管内皮生长因子和/或表皮生长因子以促进伤口愈合。
治疗组合物
本文公开的方法可包括施用治疗剂的组合，例如用于减少皮肤伤口瘢痕形成的第一治疗剂和用于减少皮肤伤口瘢痕形成的第二治疗剂。本文公开的方法可包括施用治疗剂的组合，例如用于减少皮肤伤口瘢痕形成的第一治疗剂和用于促进伤口愈合的第二治疗剂。例如，第二治疗剂可以是至少一种伤口愈合剂，所述伤口愈合剂选自血管内皮生长因子、表皮生长因子和/或至少一种对促进或改善伤口愈合有效的细胞因子。第二治疗剂可以可与第一治疗剂TGF-β结合使用。治疗剂可以以本领域所知道的任意合适的方式施用。例如，减少瘢痕形成的第一治疗剂、第二治疗剂可以依次(不同时)或同时(在同一次)施用。例如，可以顺依次(在不同时)或同时(在同一次)施用减少瘢痕形成的第一治疗剂和促进伤口愈合的第二治疗剂。在一些实施方案中，第一和第二治疗剂以不同的组合物施用。在一些实施方案中，第一和第二治疗剂在相同的组合物中。
本公开的实施方案涉及包含治疗组合物的组合物和方法。不同的疗法可在一种组合物或多于一种组合物中施用，例如两种、三种、四种或多于四种组合物。可以使用试剂的不同组合。
本公开的治疗剂可以根据相同的施用途径或者不同的施用途径施用。在一些实施方案中，第二治疗剂通过静脉、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、植入、吸入、鞘内、心室/脑室内或鼻内施用。可以根据治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、个人的临床情况、个人的临床病史和对治疗的反应，以及主治医生的判断来确定合适的剂量。
治疗方法可以包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为包含预定量的治疗组合物。施用量，以及特定的方式和配方，都在临床医学的技术范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，但可以包括在一段时间内的连续输注。在一些实施方案中，单位剂量包括单次施用剂量。
根据治疗次数和单位剂量，施用量取决于所需的治疗效果。有效剂量可以理解为指达到某种特定效果所必需的量。在某些实施方案的实践中，可以设想10mg/kg至20mg/kg的剂量会影响这些药物的保护能力。因此，可以设想，剂量包括约0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195和200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/kg或mg/day的剂量或其衍生的任何范围。此外，所述剂量可以在一天，和/或几天、几周或几个月内多次施用。
在特定的实施方案中，药物组合物的有效剂量约为，至少约为，或至多约为1微摩尔、2微摩尔、3微摩尔、4微摩尔、5微摩尔、6微摩尔、7微摩尔、8微摩尔、9微摩尔、10微摩尔、11微摩尔、12微摩尔、13微摩尔、14微摩尔、15微摩尔、16微摩尔、17微摩尔、18微摩尔、19微摩尔、20微摩尔、21微摩尔、22微摩尔、23微摩尔、24微摩尔、25微摩尔、26微摩尔、27微摩尔、28微摩尔、29微摩尔、30微摩尔、31微摩尔、32微摩尔、33微摩尔、34微摩尔、35微摩尔、36微摩尔、37微摩尔、38微摩尔、39微摩尔、40微摩尔、41微摩尔、42微摩尔、43微摩尔、44微摩尔、45微摩尔、46微摩尔、47微摩尔、48微摩尔、49微摩尔、50微摩尔、51微摩尔、52微摩尔、53微摩尔、54微摩尔、55微摩尔、56微摩尔、57微摩尔、58微摩尔、59微摩尔、60微摩尔、61微摩尔、62微摩尔、63微摩尔、64微摩尔、65微摩尔、66微摩尔、67微摩尔、68微摩尔、69微摩尔、70微摩尔、71微摩尔、72微摩尔、73微摩尔、74微摩尔、75微摩尔、76微摩尔、77微摩尔、78微摩尔、79微摩尔、80微摩尔、81微摩尔、82微摩尔、83微摩尔、84微摩尔、85微摩尔、86微摩尔、87微摩尔、88微摩尔、89微摩尔、90微摩尔、91微摩尔、92微摩尔、93微摩尔、94微摩尔、95微摩尔、96微摩尔、97微摩尔、98微摩尔、99微摩尔或100微摩尔或其中可衍生的任何范围。在特定的实施方案中，给对象施用的治疗剂被身体代谢为经代谢治疗剂。
治疗组合物的精确量还取决于从业者的判断并且因人而异。影响剂量的因素包括病人的身体和临床状况、施用途径、治疗的预期目标(减轻症状或治愈))以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性，或对象可能正在接受的其他治疗。
本领域技术人员将理解并意识到，可以将体重的单位剂量μg/kg或mg/kg换算并表示μg/mL或毫摩尔(血液水平)，如4微摩尔至100微摩尔。还应理解，吸收情况取决于病种和器官/组织。关于吸收和浓度测量的适用换算因子和生理学假设是众所周知的，并且将允许本领域技术人员将一种浓度测量换算为另一种，并就本文所述的剂量、功效和结果作出合理的比较和结论。
本发明的特定的方面也涉及包括本发明的组合物或者实施本发明方法的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以用来评估一种或多于一种生物标志物。在某些实施方案中，试剂盒包含、至少包含或至多包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、43、44、45、47、48、49、50、100、500、1000个或多于1000个的，或其中可衍生的任何值、范围和组合的，探针、引物或引物组、合成分子或抑制剂。在一些实施方案中，有用于评估细胞中生物标志物活性的试剂盒。
试剂盒可以包括可以单独包装或放置在容器中的组件，例如管、瓶、小瓶、注射器或其他合适的容器。
单个组分也可以在试剂盒中以浓缩量提供；在一些实施方案中，组分以与其在其他组分溶液中的浓度相同的浓度单独提供。可以提供1倍、2倍、5倍、10倍或高于20倍的组分的浓度。
预期本文所描述的任何方法和组合物可以针对本文所述的任何其他方法或组合物实施，且不同的实施方案可以组合。最初提交的权利要求旨在涵盖多重引用于任何提交的权利要求或所提交的权利要求的组合的权利要求。
实施例
下列实施例被包括以证明本公开的优选的实施方案。本领域技术人员应当理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解可以在所公开的具体实施方案中进行更改，并且在不偏离本公开的精神和范围的情况下，仍获得类似或相似的结果。
实施例1-用于减少瘢痕过度增大的原位生成的定时脉冲释放敷料
瘢痕通常发生在深度创伤、严重烧伤或手术切口后。它可以对患者的生活质量产生深远的影响，并对医生提出了巨大的挑战。克服瘢痕的一种方法是，通过阻断转化生长因子-β(TGF-β)来抑制胶原合成。然而，TGF-β抑制的时机至关重要，因为过早阻断信号会导致伤口愈合不良，而胶原合成峰值后阻断将限制瘢痕减少的效果。因此，发明人开发了一种新型复合伤口光凝胶敷料，用于至少一种TGF-β抑制剂的体内定时释放。具体地，发明者采用水包油包水(W/O/W)乳液蒸发法设计了一种含有聚(乳酸-共-羟基乙酸)-邻硝基苯衍生物(PLGA-NB)的定时缓释药物递送胶囊系统。然后采用高效光触发亚胺交联反应，通过透明质酸邻硝基苯衍生物(HA-NB/HA-CDH)将胶囊结合到伤口组织中。这种简便的治疗被称为原位生成定时脉冲释放敷料(ISTD)，能在精确的时间点有效地降低成纤维细胞活性和胶原沉积，从而显著减少小鼠、兔模型中瘢痕形成。在某些方面，定时缓释药物递送胶囊系统释放一种或多于一种TGF-β抑制剂。
A.简介
除了非常微小的损伤，几乎所有的伤口都会导致不同程度的瘢痕形成。通常，大约在两周内愈合且只有少量胶原沉积的皮肤伤口不会形成瘢痕。但是，如果修复过程需要三到四周以上的时间，各种瘢痕，如伸展纹、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕或萎缩性瘢痕可能会视情况发生。与正常皮肤相比，皮肤瘢痕的功能通常较差。例如，它们没有汗腺和毛囊，而且它们可以引起瘙痒和疼痛的症状。1此外，瘢痕有时可以限制运动范围，并作为创伤事件的永久可见提醒。2
以往对瘢痕模型的研究使人们对瘢痕形成的病理生理学有了深刻的认识。TGF-β是瘢痕形成的主要调节因子之一，因为有现成的抑制TGF-β的抑制剂，其成为瘢痕减少的策略的一个有吸引力的目标。然而，早期针对TGF-β的尝试因为忽视了药物递送的关键时机问题是不成功的。实际上，Mustoe等人已经证明了在受伤后第一周开始抗TGF-β抗体治疗，实际上会延迟伤口愈合而不会减少瘢痕，因为TGF-β是伤口早期愈合所必需的。相反，创伤后一周开始抑制TGF-β会减少瘢痕形成。因此，临床上需要制造一种敷料，允许在应用一周后脉冲释放TGF-β抑制剂。已经发明了许多其他的方法如涂层、多次压实。4-8虽然这些方法可能潜在地用于在最佳时间点递送一种或多于一种TGF-β抑制剂，以减少瘢痕，它们尚未就此目的得到验证。此外，它们需要复杂的三维微型技术设备，这限制了其临床应用的潜力。
因此，发明人展示了新的药物传递系统，即原位生成定时脉冲释放系统(ISTD)，其可通过原位光触发亚胺交联预胶凝聚合物结合到伤口中，以在最佳时间点递送TGF-β抑制剂并减少瘢痕(图1)。采用基于乳液的制备方法将TGF-β抑制剂负载到聚合物胶囊中。9-11然后给予安全且在临床再生医学中广泛应用的体外365nm光照射，使胶囊和预胶凝聚合物通过邻硝基苯和-NH2反应与周围组织表面快速交联。12这种混合交联方法稳定了定时释放胶囊，使微掺杂物充填均匀，导致物质在伤口区域被牵引排出，从而可以提高治疗效果。13最后，聚合物屏障的定时降解导致了所述至少一种TGF-β抑制剂的脉冲释放，从而达到最佳的瘢痕减少潜力。ISTD显示了极好的时间可控性、生物相容性和高效的组织结合。更重要地是，在小鼠、兔和猪皮肤损伤模型中，该系统可以明显地减少肥厚性瘢痕的形成，且不延迟伤口愈合。如上所述，药物传递系统可以被配置以释放两种或多于两种TGF-β抑制剂。
B.材料和方法
1.材料
PLGA-NB(75∶25；MW 50000)和HA-NB/HA-CDH由华东理工大学朱林勇实验室赠送。12TGF-β抑制剂SB431542购自selleckchem，Inc。聚乙烯醇(PVA；MW 95000)和聚乙二醇(PEG；MW 400)是从Sigma-Aldrich公司获得的。所有实验均使用Milli-Q185水(Waters，Saint-Quentinen-Yveline，法国)。荧光染料、1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐(DiI)和1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(DiD)，购自FisherScientific，Inc。所有其他化学品均为分析级，购自Sigma-Aldrich，Inc。
2.定时释放胶囊的制备
所有胶囊均采用先W/O/W乳液法再溶剂蒸发法进行制备。发明人首先准备含2.5mgPEG的50μL去离子水，得到内水相。超声15min后，将该溶液在强力搅拌下滴入溶解在1mL氯仿中的100mg PLGA-NB溶液中。该过程进行至少10分钟以进行乳化。然后将得到的油包水(W/O)乳液转移到15mL的含1％(重量/体积)的用作乳液稳定剂的PVA的水性溶液。使用磁力搅拌器(C-MAG HS 7；IKA Works，Inc.)以3000rpm搅拌获得双乳液(W/O/W)，然后置于实验室通风橱中6小时进行溶剂蒸发。离心后回收的具有空心的胶囊(Cap-Hollow)用去离子水洗涤，然后使用冷冻干燥器(Virtis Benchtop；SP Industries，Inc.)冻干。
具有定时释放TGF-β抑制剂的胶囊(Cap-I)通过相同的方法制备，不同的是在制备内水相期间，将5mg TGF-β抑制剂加入去离子水和PEG中。类似地，为了制造牛血清白蛋白(BSA)填充胶囊(Cap-BSA)，在生成内水相时将5mg BSA分散在去离子水和PEG中。同样地，对于含有荧光共振能量转移(FRET)荧光团的定时释放胶囊(Cap-FRET)，将DiI和DiD(2.5nmolDiI；DiD：DiI 4：1)溶解在离子水和PEG中作为内水相。
通过光学显微镜(EVOS FL；Advanced Microscopy Group)和高分辨率场发射扫描电子显微镜(FESEM；Merlin；Carl Zeiss，Inc.)确定粒度、表面形态和内部中空结构。对于光学显微镜，在成像前将胶囊冷冻干燥并重新分散到载玻片上。对于FESEM，将分散在水中的PLGA-NB胶囊滴在二氧化硅芯片上并风干。具有PLGA-NB颗粒的二氧化硅芯片在真空下以20mA的电流涂覆铂70秒。图像是在2kV的加速电压下使用FESEM拍摄。
3.胶囊的细胞毒性评估
采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法评价人结直肠癌(Caco-2)细胞和人上皮癌(HeLa)细胞的细胞毒性。这种比色细胞增殖试剂盒可以轻松可靠地比色测定活细胞数，并具有出色的灵敏度和线性度。Caco-2细胞和HeLa细胞购自南非约翰内斯堡的HighveldBiologicals。在含有80％(体积/体积)胎牛血清和10％(体积/体积)二甲亚砜的培养基中制备细胞原种(stock)，并在液氮中保存直至进一步使用。按照常规细胞培养程序保存细胞。为了确定所有细胞系暴露于不同浓度孵育24小时后的细胞活力，根据制造商的说明进行CCK-8测定。简而言之，将细胞接种到37℃、潮湿环境(90％湿度)、5％CO2、Dulbecco基本必需培养基、1％(重量/体积)非必需氨基酸、1％(重量/体积)谷氨酰胺、10％(体积/体积)胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的条件的96孔板中。当达到50％汇合时，将测试的胶囊以1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的浓度分散在细胞生长培养基中并加入孔中。孵育24小时后，除去培养基，用PBS洗涤细胞后，每孔加入CCK-8试剂，37℃孵育2小时。使用酶标仪(Synergy Neo；BioTek Instruments，Inc.)在450nm处测量吸光度。
4.定时释放胶囊的体外释放动力学
将Cap-BSA放入装有5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)的离心管中，并在37℃于摇床上孵育。然后每天使用PierceTM BCA蛋白质检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)测量释放度。使用标准曲线对结果进行量化并且标准化为总累积量释放度(n＝5)。在每个时间点，用5mL新PBS替换上清液。将总有效载荷释放超过50％的那一天报告为释放时间。
5.定时释放胶囊的体内释放动力学
WT CD1小鼠从芝加哥大学转基因核心实验室获得。所有小鼠在芝加哥大学ARC(动物资源中心)在无病原体条件下饲养，昼夜循环12小时。所有对象均未参加之前的任何步骤。实验方案经过芝加哥大学动物保护与使用机构委员会审查和批准。Cap-FRET用于3只CD1小鼠的体内动力学。在手术前使用20μL的70％乙醇滴对Cap-FRET进行消毒。在注射之前，小鼠连续吸入3％异氟醚进行麻醉，注射部位用乙醇消毒。每只动物背部皮下注射30mg胶囊。
每天使用体内成像系统(IVIS 200；Xenogen Corporation)对小鼠进行成像。在每个成像阶段，小鼠连续吸入3％异氟醚进行麻醉，并放置在加热的成像平台上。然后使用560/620nm激发/发射滤光片组收集荧光图像，曝光时间为1.00秒，F-Stop设置为1，介质分箱(medium binning)和对象高度为1.5em。累积释放度被指定为感兴趣区域中的分别匹配特定胶囊的释放度和背景信号的最大和最小整体荧光。释放时间被报告为最大辐射效率相应增加一倍的那一天。
6.小鼠皮肤伤口模型及治疗
本研究使用18只6周龄至8周龄的CD1雄性小鼠。小鼠持续吸入3％异氟醚进行麻醉。在剃毛之后，通过6毫米穿孔活组织切片切除全层皮肤，在每只小鼠的背部创建6个伤口(直径6毫米)。其中9只小鼠在6个伤口中的3个上接受了ISTD(Cap-I组)，在其他3个伤口上接受了空心胶囊(Cap-Hollow组)。敷上敷料后，将材料置于365nm LED灯(20mW/cm)下3分钟以激活交联反应。其余9只小鼠6处伤口均用生理盐水处理(生理盐水对照组)。最后，使用TegadermTM薄膜(3M公司)覆盖所有小鼠的伤口，防止水分流失，直到伤口完全形成上皮。
在术后第5天、第10天、第15天，每组3只小鼠安乐死，将受伤的皮肤切除，用福尔马林固定，石蜡包埋，切片。使用苏木精和伊红(H&E)、三色染色、F4/80抗体、抗α平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA)、CD4抗体和CD8抗体染色进行组织学观察。除非另有说明，否则按照制造商的说明稀释抗体。在显微镜(Eclipse Ti2；Nikon Inc.)放大200倍观察F4/80染色切片，在400倍放大下观察抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、CD4和CD8染色切片。每个切片随机选取5个区域计数F4/80阳性巨噬细胞、α-SMA阳性成纤维细胞、CD4和CD8阳性T细胞。免疫反应细胞被量化为每个高倍视野(HPF)表达适当的阳性标志物的平均细胞计数。通过结合基于三色染色的胶原沉积的程度(0分至3分)和密度(0分至3分)，以0到6个等级对皮肤纤维化的严重程度进行评分。对于两名盲测者对这些数值进行了两次测量，然后取平均值。组织学数据表示为平均值±标准偏差(SD)。采用配对双尾学生t检验进行统计学分析。认为p值＜0.05是显著的。
7.兔耳肥厚性瘢痕模型及治疗
发明人利用了Mustoe等人提出的可重现和可量化的皮肤溃疡模型。14该模型使用成年新西兰白母兔。用氯胺酮(60mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)肌肉注射麻醉兔子。用7毫米皮肤活检穿孔器在右耳腹侧制造6个伤口，到达软骨。在没有完全切开的情况下小心地对软骨切口，同时小心地用解剖显微镜除去表皮、皮肤和软骨膜。这一过程会延迟上皮形成，增加肥厚性瘢痕的程度，导致瘢痕持续升高。156个伤口中有2个属于Cap-I组：用ISTD处理的伤口(50μL2.5重量％HA-NB/HA-CDH和3mg Cap-I充分混合处理)；Cap-Hollow组：50μL 2.5重量％HA-NB/HA-CDH与3mg Cap-Hollow充分混合处理伤口；对照组：用盐水处理伤口。材料被应用后，伤口被放置在365nm LED灯(20mW/cm)下3分钟以激活交联。最后，用TegadermTM膜覆盖伤口，直至伤口完全形成上皮。30天后，用相同的步骤在第二个耳朵上进行第二次手术，只不过不是6个伤口，而是12个伤口，每组4个伤口。最后，左耳手术后30天，对兔子安乐死并收集耳朵。切除伤口，用福尔马林固定，然后石蜡包埋。在瘢痕的最高部分进行切片，并用H&E和三色染色。对于形态计量学分析，评估瘢痕升高指数(SEI)，该指数衡量瘢痕结缔组织总面积与下层皮肤面积的比率。15皮肤的厚度根据相邻未受伤的皮肤来确定。组织学数据表示为平均值±标准偏差(SD)。采用配对双尾学生t检验进行统计学分析。认为p值＜0.05是显著的。
C.结果与讨论
1.胶囊制备及细胞毒性
获得双相脉冲释放曲线的典型方法是建立核-壳载体。在该载体中，将活性装载物包封在不溶于水的可生物降解聚合物外壳中，以实现延迟脉冲释放。多年来，采用W/O/W双乳液法将药物例如疫苗、抗原等包封在生物可降解胶囊中。16用FESEM评估胶囊的大小和结构。如图2a所示，胶囊是轮廓分明的球形颗粒，表面光滑，没有孔洞。接下来，发明人使Cap-Hollow胶囊破裂，并在FESEM下检测它们，以检测胶囊的内部结构(图2b)。胶囊包含具有单核的中空内部结构。滞留在胶囊内部的水滴在干燥过程中蒸发，并在内壁形成半球形凹坑。胶囊的大小由光学显微镜(图13)和FESEM确定。胶囊的数均直径为220±20μm，壁厚为约20±3μm。W/O/W乳液法后跟溶剂蒸发技术能够制造经典的中空可生物降解聚合物胶囊，此前已证明这些胶囊可以根据其物理和化学性质进行各种控制，尤其是对PLGA及其衍生物等材料。17-20PLGA是一种可生物降解且具有生物相容性的共聚物，已用于许多食品和药物管理局批准的药品中。21，22通过改变乳酸/羟基乙酸的比例、分子量或共聚物的末端基团，聚合物的物理化学特性，如玻璃化转变温度和降解速率，可以根据特定需求进行定制。23PLGA及其衍生物的生物降解速率的定时可控性为创建定时脉动递送的微型载体提供了理想的平台。3，24此外，发明人制备的胶囊足够适用于生物医学应用，因为它们小到足以混合到伤口敷料中。
2.定时释放胶囊的释放动力学
根据以往的报告，发明人能够设计出具有特定成分和降解时间的聚合物，从而制造可以在预定时间窗口破裂的PLGA衍生胶囊。3，25发明人首先通过在PBS中孵育Cap-BSA胶囊并测量BSA累积水平检测了胶囊的体外脉冲释放曲线。如图3a所示，连续6天未检测到BSA水平，但BSA水平在第6天至第8天急剧上升。这表明胶囊内容物确实是以脉冲方式释放，并且在PLGA-NB降解前有最小的泄漏。
发明人接下来通过将Cap-FRET胶囊皮下注射到小鼠体内并使用IVIS监测荧光水平的变化来检测胶囊的体内释放动力学。IVIS是一种相对较新的实时无创成像技术，其有利于追踪无机或有机药物载体的遭遇。FRET是一种非辐射能量转移过程，常被用作“纳米尺”。它依赖于供体和受体荧光团在临近空间(2nm至10nm距离)上的相互作用。当供体荧光团发射光谱与受体吸收重叠时，受体存在下供体的荧光寿命和量子产率会降低。值得注意的是，这种相互作用随着供体-受体距离R的增加呈指数下降(FRET效率EFRET∝1/R6)。FRET成像技术已被应用于解决各种生物学问题，例如活细胞中酶活性的检测、蛋白质定位、分子间相互作用距离的测量和脂质膜动力学。26-30在本研究中，发明人利用具有优化的荧光团比率的DiI/DiD FRET对装载的胶囊来监测体内释放动力学。DiI和DiD最初是为细胞膜标记而设计的，它们在DiI发射和DiD吸收之间有很强的光谱重叠(
Figure BDA0003457996830000191
半径R0＝5.2nm)，这导致当它们封装在一起时产生FRET的有效相互作用。31供体是DiI，其激发波长为535nm，发射波长为640nm(±10nm)。受体为DiD，激发波长为633nm，发射波长为680nm(±10nm)。因此FRET被定义为使用535nm激发和680nm(±10nm)发射。已经证明，当共包封被破坏时，供体和受体之间的FRET相互作用将被破坏。32在本研究中，当聚合物胶囊破裂，导致DiI/DiD FRET对在小鼠体内分散和分离，DiI荧光将不再转移到DiD，其发射将恢复。33如图2b所示，从DiI通道中获取的(IVIS中的560nm/620nm激发/发射滤波器组，被发现是最有效的滤波器组，可提供高信号，同时将来自皮肤组织和头发的荧光重叠和阻碍最小化)，当Cap-FRET皮下注射到小鼠体内时，观察到与Cap-BSA的体外BSA释放类似的趋势。Cap-FRET在大约6天后释放其有效载荷，释放后荧光增加约8倍。图2c中的图表显示了使用IVIS采集的小鼠的相应图像。皮下注射后的前5天，观察到最小的荧光信号，说明Cap-FRET胶囊完好无损。然后在第6天开始观察到信号的急剧增加。这与体外实验一致，说明PLGA-NB壳在第6天至第8天开始降解，导致DiI和DiD释放到周围组织中。
3.鼠皮肤伤口敷料
确定该胶囊具有生物相容性并具有适合定时TGF-β释放的准确延迟脉冲释放时间后，发明人利用小鼠皮肤损伤模型对该系统在体内的适用性进行了评估。首先，用6毫米活检穿孔器在每只小鼠背部皮肤上制造6处开放性伤口。接下来，将Cap-I胶囊应用于HA-NB/HA-CDH水凝胶中的皮肤伤口(图4)。水凝胶已显示出具有生物相容性，并具有高效的光凝胶能力。12使用独特的光触发交联反应将HA-NB/HA-CDH与胶囊的PLGA-NB聚合物外壳和伤口组织结合(图5)。在反应中，邻亚硝基苯甲醛基基团在365nm照明下由邻硝基苯转化，并与聚合物中的-NH2和周围伤口表面快速交联。12，34它不仅提供了可快速简便地应用于临床的良好的时空可控性，而且还同时提供了便易的生物相容性和组织粘附性。35-37
术后第5天、第10天和第15天，对皮肤进行切片，用H&E染色、三色染色和各种抗体进行进一步评估。根据组织切片，与Cap-Hollow组或对照组相比，Cap-I组皮肤在第15天的纤维化更少。重要地是，Cap-I组在第5天时没有显示伤口愈合延迟，表明在早期伤口愈合阶段没有TGF-β渗漏。三色染色用于突出胶原纤维，并使用指定的评分方案量化纤维化的严重程度：首先评估纤维化程度，并给予0分至3分(0分表示无纤维化，3分表示涉及整个皮肤厚度的纤维化)，然后评估胶原纤维的密度，再给予0分至3分(类似于正常皮肤的松散胶原纤维为0分，高密度胶原纤维为3分)，最后将这两个分数相结合得到纤维化分数(0分表示无纤维化，1分至2分表示轻度纤维化，3分至4分表示中度纤维化，5分至6分表示重度纤维化)。如图6a所示，术后5天，Cap-hollow、Cap-I和盐水处理的皮肤的纤维化评分相似。然而，术后15天后，Cap-I组的纤维化评分(3.3±0.6分)明显低于Cap-hollow组(5.7±0.6分，p＜0.05)或对照组(5.3±0.6分，p＜0.05)。这些结果表明，从Cap-I敷料中定时缓释TGF-β抑制剂显著降低了受伤组织的纤维化。
为了评估TGF-β抑制在组织水平上的效果，在组织切片上进行免疫组织化学分析。F4/80抗体用于突出组织巨噬细胞，其是伤口修复和纤维化的指示器。可以使用特异性α-SMA标志物对活化的成纤维细胞进行阳性识别。最后，CD4和CD8抗体分别用于突出与组织愈合和细胞毒性反应相关的两个T细胞群。与H&E和三色染色下的结果一致，在术后10天Cap-I组的巨噬细胞、活化成纤维细胞和CD4细胞数量明显低于Cap-hollow组(图6b-d)。所有切片中几乎没有CD8+T细胞(0-1/10HPF，数据未显示)。然而，在第15天，所有三组的活化成纤维细胞和CD4+T细胞数量相似(图6c-d)。这可能是由于伤口愈合期间小鼠皮肤普遍缺乏纤维化活性，因为伤口可以通过肌肉收缩恢复。总的来说，使用小鼠模型进行的体内评估支持使用ITSD减少瘢痕形成。
4.兔耳瘢痕模型
由于小鼠皮肤在受伤后形成瘢痕组织的能力有限，发明人试图通过利用可重现和可量化的兔耳模型，在更具临床相关性的模型中复现他们的成功。该皮肤溃疡模型由Joseph和Dyson于1966年首次描述，随后由Morris发展。38由于兔耳被较低毛发密度的紧绷皮肤所覆盖，它与人类皮肤非常相似，并且作为瘢痕模型有许多优点。首先，伤口不能通过肌肉收缩愈合，因此上皮形成被延迟，并可能形成隆起的瘢痕。15此外，瘢痕组织在形态和治疗应答方面也与人类相似，可以通过肉眼和显微镜进行评估。
如图8a所示，发明人采用反向治疗顺序对耳朵进行治疗，以最大限度地减少伤口位置差异(耳的近端与远端)引起的可能偏差。所有组的伤口均正常愈合，并在术后15天完全形成上皮，三组之间的差异在术后15-30天可以大体观察到(图8a，图9)。有趣的是，与对照组相比，Cap-1和Cap-Hollow组也显示出更快的上皮向内生长，这表明单独使用光凝胶敷料有助于促进伤口愈合。皮肤隔室的组织学评估显示，术后30天，总体细胞结构和胶原纤维沉积存在显著差异(图10，12a)。与之前的小鼠模型获得结果一致，Cap-I组纤维化评分(1.7±0.2分)明显低于Cap-hollow组(3.2±1.0分)或对照组(4.8±0.5分)。还可以使用健全的SEI计算来证明ITSD的效果(图12b)。值得注意的是，Cap-I组的瘢痕减少效果在长期内仍然存在，如术后60天肉眼和显微镜下所见(图8b、图11、图12)。
5.猪皮肤模型
猪的皮肤在结构和生理学上与人的皮肤相似。猪皮肤全厚切除伤口模型是最好的临床前创伤愈合模型之一。为了确定皮肤伤口瘢痕减少方法和组合物在临床前环境中的有效性，对Yorkshire猪背部皮肤全厚皮肤伤口的愈合和瘢痕形成进行了检测。
3头25kg至30kg的Yorkshire公猪术前禁食12h。简而言之，动物先注射氯胺酮(20mg/kg，IM)麻醉，然后注射异丙酚(1mg/kg，IV)，然后气管内插管并通气。手术期间用4mgkg-1h-1丙泊酚维持麻醉。经麻醉的猪的背部脱毛、固定并置于背部位置。背部皮肤用水和肥皂清洗，用碘和75％的酒精消毒。为了形成缺损，沿胸腰区域除去背部中部3cm×3cm的全厚皮肤，形成12个皮肤伤口区域。用外科刀片切开肉膜层，并切除上面的皮肤。在应用水凝胶和胶囊后，用365nm LED灯(20mW/cm)照射伤口3分钟以激活交联。使用大型Tegaderm绷带(3M Inc.)覆盖伤口，然后在周边使用3M loban 2抗菌布巾，形成防水敷料，最后使用专门设计的护套将绷带固定到位。术后第20天、第50天采集受伤的皮肤组织。切除样品，用福尔马林固定并包埋在石蜡中，然后进行H&E和三色染色以进行组织形态学观察。
与啮齿动物皮肤模型的数据一致，通过光凝胶应用含有或不含TGF-β抑制剂的胶囊可以促进伤口闭合(图15A和图16A)。三色染色显示，在使用负载抑制剂的PLGA-NB胶囊治疗的伤口中，胶原沉积明显减少(图15B和16B)。组织学评估还表明，使用含TGF-β抑制剂的胶囊治疗的伤口的SEI显著降低(图16C)。
D.结论
发明人在此报告了独特的原位生成定时脉冲释放敷料的疗法。通过从微型载体中的确定可控的定时释放，敷料可在预定时间窗口内在体外和体内释放其装载物。发明人已经证明，在小鼠、兔和猪模型中，敷料可以容易地实施以减少肥厚性瘢痕的形成，而不损害伤口愈合。总的来说，目前的工作朝着开发可组织结合的、生物相容的和可控的定时脉冲释放系统迈出了重要的一步，该系统不仅可用于减少瘢痕形成，而且可以应用于组织工程和再生医学的更广泛方面。
***
根据本公开内容，可以在无过度实验的情况下做出和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经在优选的实施方案中描述了本发明的组合物和方法，对于本领域的技术人员是显而易见的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对所述方法和所述方法的步骤或步骤顺序中应用变化。更具体地说，显然，某些化学和生理学相关的试剂可以替代本文所述的试剂，同时可以获得相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改被视为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
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以下参考文献在他们对于本文阐述的示例性过程或其他细节补充的范围内，通过引用具体并入本文。
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Claims (45)

1.一种在所需对象中减少皮肤伤口瘢痕形成的方法，所述方法包括：
向伤口施用包含至少一种TGF-β抑制剂和可交联聚合物组合物的组合物；和
诱导可交联聚合物组合物的交联以形成经交联聚合物组合物，其中可交联聚合物组合物的交联将经交联聚合物组合物共价连接到皮肤组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种TGF-β抑制剂在缓释胶囊中提供，所述缓释胶囊被配制为在1天至60天内缓释所述至少一种TGF-β抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述缓释胶囊包含邻硝基苄基官能化聚合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述邻硝基苄基官能化聚合物为邻硝基苄基官能化聚(乳酸)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述邻硝基苄基官能化聚合物为邻硝基苄基官能化聚(羟基乙酸)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述邻硝基苄基官能化聚合物为邻硝基苄基官能化聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述缓释胶囊包括聚乙烯醇(PVA)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述缓释胶囊包括聚乙二醇(PEG)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述至少一种TGF-β抑制剂选自SB431542、LDN-193189、格鲁尼色特(LY2157299)、LY2109761、SB525334、LY3200882、SB505124、吡非尼酮、GW788388、LY364947、RepSox、LDN-193189、K02288、SD-208、LDN-214117、SIS3、伐托色替(TEW-7197)、DMH1、LDN-212854、ML347、卡托吉宁、橙皮素、土木香内酯、GC-1008和LY550410。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述可交联聚合物组合物包含邻硝基苄基官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述可交联聚合物组合物还包括末端胺官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述邻硝基苄基官能化多糖为邻硝基苄基官能化透明质酸。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中末端胺官能化多糖为碳酰肼官能化透明质酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述可交联聚合物组合物包括邻硝基苄基官能化透明质酸和碳酰肼官能化透明质酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中诱导可交联聚合物组合物的交联包括用来自光源的光照射可交联聚合物组合物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中光源包括250nm至500nm的照明波长。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中光源包括365nm的照明波长。
18.根据权利要求2至17中任一项所述的方法，其中缓释胶囊包括每100g聚合物0.1mg至1000mg的每一种TGF-β抑制剂。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述可交联聚合物组合物于溶液中提供。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述可交联聚合物组合物的溶液的浓度为每单位重量水中0.1重量％至50重量％的可交联聚合物组合物。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中邻硝基苄基官能化透明质酸与碳酰肼官能化透明质酸的比率为0.01∶1至100∶1。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中乳酸/羟基乙酸比率为1∶1000至1000∶1。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中选择邻硝基苄基官能化PLGA的乳酸/羟基乙酸比率以实现期望的物理化学特性。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中选择可交联聚合物组合物的聚合物分子量以实现期望的物理化学特性。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中选择可交联聚合物组合物的聚合物末端基团以实现期望的物理化学特性。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述物理化学特性选自玻璃化转变温度、缓释胶囊降解速率、缓释胶囊释放速率、经交联聚合物组合物降解速率和TGF-β抑制剂释放速率。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其还包括在施用减少瘢痕形成的组合物之后用绷带材料覆盖皮肤组织。
28.一种组合物，所述组合物包括：
包括至少一种TGF-β抑制剂和可交联聚合物组合物的缓释胶囊。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中缓释胶囊包括邻硝基苄基官能化聚合物。
30.根据权利要求28或29所述的组合物，其中所述邻硝基苄基官能化聚合物为邻硝基苄基官能化聚(乳酸)。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的组合物，其中所述邻硝基苄基官能化聚合物为邻硝基苄基官能化聚(羟基乙酸)。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的组合物，其中所述邻硝基苄基官能化聚合物为邻硝基苄基官能化聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的组合物，其中乳酸/羟基乙酸比率为1∶1000至1000∶1。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的组合物，其中所述缓释胶囊还包括聚乙烯醇(PVA)。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的组合物，其中所述缓释胶囊还包括聚乙二醇(PEG)。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的组合物，其中所述至少一种TGF-β抑制剂为SB431542。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的组合物，其中所述可交联聚合物组合物包含邻硝基苄基官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。
38.根据权利要求28至37中任一项所述的组合物，其中所述邻硝基苄基官能化多糖为邻硝基苄基官能化透明质酸。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的组合物，其中所述可交联聚合物组合物还包括末端胺官能化多糖、多肽、蛋白质或亲水性或水溶性聚合物。
40.根据权利要求28至39中任一项所述的组合物，其中所述末端胺官能化多糖为碳酰肼官能化透明质酸。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的组合物，其中所述可交联聚合物组合物包括邻硝基苄基官能化透明质酸和碳酰肼官能化透明质酸。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的组合物，其中邻硝基苄基官能化透明质酸与碳酰肼官能化透明质酸的比率为0.01∶1至100∶1。
43.根据权利要求28至42中任一项所述的组合物，其中缓释胶囊包括每100g聚合物0.1mg至1000mg的每一种TGF-β抑制剂。
44.根据权利要求28至43中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括浓度为每单位重量水中0.1重量％至50重量％的可交联聚合物组合物的可交联聚合物组合物。
45.根据权利要求28至45中任一项所述的组合物，其中所述缓释胶囊包含两种或多于两种TGF-β抑制剂。
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