KR101549121B1 - 강독화된 인플루엔자 바이러스 변이주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강독화된 인플루엔자 바이러스의 변이주에 관한 것으로, 본 발명에 따른 강독화된 바이러스는, 감염에 의한 마우스의 현격한 체중 감소 또는 높은 치사율을 나타내므로 백신의 효능평가를 하는 데에 사용될 수 있다.

Description

강독화된 인플루엔자 바이러스 변이주 {Strengthened mutant strain of influenza virus}

본 발명은 강독화된 인플루엔자 바이러스 변이주에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 매년 겨울철 유행하는 호흡기 감염성 질환으로 인구의 10-20%가 감염되며, 노인 및 만성질환자 등의 고위험군에 속하는 환자군에서는 합병증의 발생과 사망을 초래할 수 있다.

인플루엔자 바이러스는 크게 A, B, C 3가지 형으로 구분되며 표면 항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 변화에 따른 항원 변이(Antigenic drift 또는 shift)를 통하여 인구집단에서 기존의 인플루엔자 바이러스에 형성되어 있던 면역을 회피하여 유행을 초래하게 된다. 2009년 4월 북중미에서 발생한 swine/avian/human 복합 기원의(Mixed Origin) 인플루엔자바이러스는 기존에 항원 소변이(Antigenic drift)에 의해 거의 매년 유행하던 계절인플루엔자와는 다른 항원 대변이(Antigenic shift)에 의한 새로운 항원형을 갖는 인플루엔자로 이에 대한 집단(Population)에 면역력이 형성되어 있지 않아 대유행(pandemic)을 초래하였다. 2009년 신종인플루엔자 대유행 이후, 대유행의 원인 바이러스는 현재 이전의 계절 H1N1바이러스를 대신해 계절인플루엔자 바이러스로 유행하는 양상을 보이며, A(H1N1)pdm09로 명명하였다. 이러한 인플루엔자 바이러스에 대한 면역학적 특성 및 분자생물학적 특성에 대한 연구가 필요하다.

본 발명은 바이러스의 백신 개발 단계에서 백신의 효능 평가를 위해 강독화된 인플루엔자 바이러스주를 확보하는 것을 목적으로 한다.

일반적으로 범용백신을 포함한 새롭게 개발되는 인플루엔자바이러스 백신의 효능평가를 위한 비임상 동물실험에는 마우스가 사용된다. A/Korea/01/2009를 포함하는 2009년에 신종인플루엔자로 대유행 했고, 이후 계절인플루엔자로 지속적으로 유행하고 있는 A(H1N1)pdm09형의 인플루엔자 바이러스의 경우 마우스에서 치사율 및 병원성이 높지 않은 것으로 보고되고 있다. 백신의 마우스에서의 효능평가를 위해서는 마우스를 치사하거나 심함 체중의 감소를 나타낼 수 있는 마우스가 필요하다.

본 발명은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 헤마글루티닌, 서열번호 4로 표시되는 뉴라미니다아제 또는 이들의 조합을 포함하는 강독화된 인플루엔자 바이러스 변이주에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서 A(H1N1)pdm/Korea/01/2009의 바이러스에서, 뉴라미니다아제의 272번째 아미노산 프롤린(P)을 류신(L)으로 치환한 바이러스를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 "인플루엔자 바이러스 (influenza virus)"는 오르쏘믹소바이러스(Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의 RNA (ribonucleic acid)를 유전체로 가지고, A, B 및 C 그룹으로 분류되며, 주요 표면 단백질인 HA (hemaggutinin)와 NA (neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 16종의 HA와 9종의 NA가 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 "헤마글루티닌 (hemaggutinin, 이하 "HA"라 칭함)"은 인플루엔자 바이러스의 외피 (envelope) 당단백질을 나타낸다. HA는 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포에 흡착하여 관통하는 것을 매개한다. 현재까지 16 종류의 서브타입이 보고되어 있다.

본 발명에서 사용되는 “뉴라미니다아제 (neuraminidase, 이하 “NA”라 칭함)는 바이러스의 외피막에 있는 당단백질의 효소로 뉴라민 분해 효소라고도 한다. 바이러스가 숙주 세포로부터 빠져나오는 데에 필요한 효소이다.

본 발명에서 사용되는 “회피 변이”는, 헤마글루티네이션 저해 능력을 갖는 단일 클론 항체를 제작 시 사용된 인플루엔자 바이러스를 단일 클론 항체와 공배양하면, 단일 클론 항체의 저해를 피해 생존하는 변이체 인플루엔자바이러스가 생기는데, 이러한 바이러스는 주로 단일 클론 항체가 작용하는 인플루엔자바이러스 표면항원에 변이를 갖게 되는 것을 의미하며, 단일 클론 항체의 작용을 회피한다고 하여 회피 변이라 한다.

본 발명에서 사용되는 “강독화”는 바이러스에 감염된 감염체의 발열 또는 체중 감소와 같은 증상 악화뿐만 아니라 생존률 감소를 야기할 수 있는 바이러스의 인위적 변이를 의미한다.

진단 조성물에 사용되는 본 발명의 상기 화합물들은 검출가능하게 표식되는 것이 바람직하다. 생분자들을 표식시키는데 사용가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주내에서 고려된다. 상기 방법들은 Tijssen, 'Practice and theory of enzyme immuno assays', Burden, RH and von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985), 'Basic methods in molecular biology'; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer et al., (Eds) 'Immunochemical methods in cell and molecular biology' Academic Press, London (1987), or in the series 'Methods in Enzymology', Academic Press, Inc에 기술되어 있다.

당업자에게 공지되어 있는 표식 방법과 많은 다른 표식들이 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다.

통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(가령, 32 P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당 분야에 잘 알려져 있다.

검출 방법들로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 검출 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 이들은 그중에서도 웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(Immune Radioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 및 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.

본 발명에 따른 강독화된 바이러스는, 감염에 의한 마우스의 현격한 체중 감소 또는 높은 치사율을 나타내므로 백신의 효능평가를 하는 데에 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 회피 변이 주입에 따른 시간대별 체중감소율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 회피 변이 주입에 따른 시간대별 생존율을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

회피 돌연변이의 제조

회피돌연변이의 제조는 A/Korea/01/2009 바이러스를 10일령의 유정란에 10⁵~10⁴ pfu/ml농도로 하여 접종하고 배양 시에 HA에 특이적인 단일클론 항체인 mAb360, mAb383 1 mg/ml 농도로 처리하여 2~3일간 배양한 후, 제한 희석법(Limit dilution)을 사용하여 단일한 클론의 바이러스로 배양함으로써 제조하였다. 상기 배양된 바이러스가 혈구응집억제검사(Hemagglutination Inhibition assay)를 통해 mAb360, mAb383와 반응하지 않는 것을 확인함으로써 회피 돌연변이주임을 확인 하였으며, 이들의 HA 및 다른 유전자 염기서열을 분석하였다.

그 결과, HA 단백질에서 G172E(HA), D144E(HA) 및 A203D(HA) 및 NA 단백질에서 P272L(NA) 돌연 변이된 4가지 균주를 얻을 수 있었다.

회피 돌연변이의 독성 검사

상기 실시예 1에서 얻어진 인플루엔자 바이러스 균주를 6주령 마우스에 5X10⁴ 또는 10⁵ pfu를 50 ml로 비강을 통해 감염시킨 후, 10일간 상기 감염된 마우스의 체중 변화 및 생존률을 측정하였으며, 대조군으로는 A/Korea/01/2009를 사용하였다. 대조군으로 사용된 A/Korea/01/2009는 인플루엔자바이러스로 인플루엔자바이러스를 특정할 수 있는 세그먼트들 (Genbank accession numbers): 세그먼트 1 (GQ160811), 세그먼트 2 (GQ160813), 세그먼트 3 (GQ160812), 세그먼트 4 (GQ131023), 세그먼트 5 (GQ131024), 세그먼트 6 (GQ132185), 세그먼트 7 (GQ131025), 세그먼트 8 (GQ131026) 을 포함하는 염기서열을 지니고 있는 바이러스이다.

그 결과, 체중 감소율에 있어서, 대조군인　A/Korea/01/2009를 포함한 A(H1N1)pdm09 는 마우스에 감염 실험 시, 도 1에 도시된 바와 같이, 20% 정도의 체중 감소를 나타낸 반면, 본 발명에 따른 HA G172E는 약 30%의 체중 감소가 나타났다.

또한, 치사율에 있어서 대조군인　A/Korea/01/2009를 포함한 A(H1N1)pdm09 는 마우스에 감염 실험 시, 도 2에 도시된 바와 같이, 20% 이하의 치사율을 보여 약한 병원성을 나타내는 것으로 나타났으나, G172E(HA), D144E(HA), A203D(HA), P272L(NA)의 경우 마우스에 감염 시 80% 이상의 치사율을 보였으며, 특히 G172E(HA)의 경우 7일째에 100% 치사율을 나타냈다.

따라서 본 발명에 따른 강독화된 인플루엔자 바이러스는 감염에 의한 마우스의 현격한 체중 감소 혹은 치사율을 나타내므로, 인플루엔자 범용백신의 개발 단계에서 백신의 효능평가를 위한 마우스 실험에 사용할 수 있다.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> Strengthened mutant strain of influenza virus <130> IPDB46749 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza virus HA <400> 1 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160 Phe 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Claims (1)

1. 서열번호 4로 구성된 뉴라미니다아제를 포함하는 A(H1N1)pdm/Korea/01/2009 바이러스.

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