KR101540852B1 - Molecular methods for identification of oyster species using species-specific probes, dna chip, and molecular kits - Google Patents
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Abstract
본 발명은 굴(oyster)의 종 특이적 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩과 키트 및 이들을 이용하는 굴의 종 감별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 굴 미토콘드리아 cox 1 DNA 증폭용 프라이머 및 굴 종 특이적 프로브를 포함하는 DNA 칩을 사용하여 굴의 종을 감별하는 방법에 따르면, 단시간 내에 정확도가 우수한 굴의 종 감별이 가능하다.The present invention relates to a species-specific probe of oyster, a DNA chip and kit comprising the same, and a method for distinguishing oysters using the same. According to the method of discriminating oyster species using a DNA chip comprising a primer for amplifying oyster mitochondrial cox 1 DNA of the present invention and an oyster-specific probe, it is possible to distinguish oysters having excellent accuracy within a short time.
Description
본 발명은 굴(oyster)의 종 특이적 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩과 키트 및 이들을 이용하는 굴의 종 감별 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a species-specific probe of oyster, a DNA chip and kit comprising the same, and a method for distinguishing oysters using the same.
굴은 종(species)에 따라 수산물로서의 상품가치가 다르거나 바이러스 감염에 대한 민감도가 서로 다를 수 있다. 또한, 수산물 검역과정에서 국내종과 외래종의 구분의 필요성이 점차 증대되고 있기 때문에 굴이 가지고 있는 종 특이적 유전자를 이용하여 정확하고도 신속하게 종을 식별할 수 있는 분자 종분류 기술개발이 필요한 상황에 놓여 있다.Depending on the species, oysters may have different product values as aquatic products or different sensitivities to viral infections. In addition, the necessity of distinction between domestic species and exotic species in the aquatic products quarantine process is gradually increasing. Therefore, it is necessary to develop a molecular species classification technology that can accurately and quickly identify species using oyster-specific gene It is settled.
한편, 우리나라 해안에 분포하는 굴들 중 주요 종으로서 약 8종 정도가 알려져 있으며, 주로 고도로 숙련된 일부 분류학자에 의해서만 상기 종의 식별이 가능하였다. 뿐만 아니라, 패각(shell) 껍질이 제거된 상태(대부분의 유통 방법)에서는 그 속에 있는 알굴(패각에 속에 있는 속살)의 형상 만을 가지고는 분류 전문가라 할지라도 대상종을 오류 없이 분류하기란 거의 불가능한 실정이다.On the other hand, about eight major species are known among the oysters distributed on the coast of Korea, and the species can be identified only by some highly skilled taxonomists. In addition, it is almost impossible to classify the target species without errors even if only the shape of the shell (shell) in the shell (shell) is removed (in most modes of distribution) It is true.
따라서, 굴 양식 산업 및 수출입 교역량의 규모가 점차 확대되고 있는 추세에 따라 수산물 관리 및 검역 과정에서도 신속하고도, 정확한 종의 동정이 필수적이지만 현재까지 개발된 종 동정 기술은 고전적인 방법중의 하나인 형태에만 의존한 분류방법을 사용하고 있기 때문에 종간 구분이 불가능할 뿐만 아니라 비록 분류 전문가라 할지라도 굴의 종을 동정하는 데에 있어 정확성, 신속성, 대용량화가 불가능한 문제점이 있다.Therefore, as the scale of oyster farming industry and import and export trade is gradually expanding, it is necessary to identify the species quickly and accurately in the fisheries management and quarantine process. However, the species identification technology developed so far is one of the classical methods It is not possible to distinguish between species because it uses classification method depending only on form, and even if it is a classification expert, there is a problem that it is impossible to be accurate, quick, and large-capacity in identification of oyster species.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 기존의 형태 형질에 의존한 분류방식으로는 해결할 수 없는 굴의 종 동정 문제를 굴의 종 특이 유전자 염기서열을 분석하고, 이를 DNA 칩 기술 개발에 적용하여 우리나라에 분포하는 굴 8종 각각에 대하여 신속하고도 정확하게 종을 종 판별할 수 있는 기술을 확보하고자 하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the problems of the prior art as described above, and it is an object of the present invention to provide a method of identifying oyster species which can not be solved by a classification method depending on the existing morphology, By analyzing the gene sequence and applying it to the development of DNA chip technology, it is aimed to secure a technology for quickly and accurately discriminating the species of each of the eight oysters distributed in Korea.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 굴(oyster)의 종(species) 특이적 프로브를 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a method for producing an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 and the oligonucleotide comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: Wherein the probe is selected from the group consisting of a probe and a probe.
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 갓굴(Crassostrea ariakensis)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 . The species is called Crassostrea ariakensis ).
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 굴(Crassostrea gigas)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: . The species is called Crassostrea gigas ).
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 포르투갈 굴(Crassostrea angulata)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: The species is the Portuguese oyster ( Crassostrea angulata .
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 바위굴(Crassostrea nippona)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: . The species is a rock oyster ( Crassostrea nippona ).
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 나도참굴(Crassostrea sikamea)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: . The species is also called Crassostrea sikamea ).
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 태생굴(Ostrea circumpicta)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: . The species is called Ostrea circumpicta ).
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 토굴(Ostrea denselamellosa)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: . Preferably, the species is Ostrea denselamellosa .
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 가시굴(Saccostrea kegaki)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: . The species is called < RTI ID = 0.0 > Saccostrea & kegaki ).
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 굴의 종 감별용 DNA 칩을 제공한다.The present invention also includes a probe comprising an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 and an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 The present invention provides a DNA chip for discriminating oyster species.
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip may include a probe selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
또한, 본 발명은 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 굴의 미토콘드리아 DNA cox1 유전자 증폭용 프라이머를 제공한다.In addition, the present invention provides a primer for amplifying the mitochondrial DNA cox1 gene of oysters, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 칩 및 본 발명의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 굴의 종 감별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for determining the species of oysters, which comprises a DNA chip of the present invention and a primer of the present invention.
바람직한 구체예로서, 상기 키트에는 발광 수단을 더 포함될 수 있다.In a preferred embodiment, the kit may further comprise light emitting means.
또한, 본 발명은 DNA 시료에 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR하는 단계; 상기 PCR의 결과물을 본 발명의 DNA 칩에 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화의 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 굴의 종 감별 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for preparing a DNA sample, comprising the steps of: performing PCR using a primer of the present invention in a DNA sample; Hybridizing the result of the PCR with the DNA chip of the present invention; And confirming the pattern of the hybridization.
본 발명의 굴 미토콘드리아 cox 1 DNA 증폭용 프라이머 및 굴 종 특이적 프로브를 포함하는 DNA 칩을 사용하여 굴의 종을 감별하는 방법에 의하면 패각(shell) 없이 유통되는 대부분의 알굴들에 대하여 신속, 정확한 종의 감별이 가능하다.According to the method of distinguishing oyster species using a DNA chip comprising a primer for amplifying oyster
도 1은 굴의 종 동정을 위한 DNA 칩 개발과정의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 DNA 칩을 이용하여 굴의 종을 동정하는 흐름도를 나타낸 것이다.
도 3은 개발된 굴의 종 동정용 DNA 칩상에서의 굴 8종에 대한 종 특이 프로브의 위치를 나타낸 것이다. P는 기준 마커 프로브를 나타내고, 1 내지 16은 하기 표 4의 프로브의 종류를 각각 나타낸다.
도 4는 굴과(family Ostreidae) 종 특이(species-specific) 프라이머를 사용한 PCR결과를 나타낸 것이다.
도 5는 분석된 굴 8종의 미토콘드리아 cox1 유전자의 염기서열을 비교한 것이다.
도 6은 굴 8종의 DNA 칩을 이용한 종 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 굴 8종에 대한 종 감별을 위한 동정용 DNA chip 개발을 위한 전체적인 작업 흐름도이다.1 is a flow chart of a DNA chip development process for identification of oysters.
FIG. 2 is a flow chart for identifying species of oysters using a DNA chip.
Figure 3 shows the location of species specific probes for eight oysters on the DNA chip for identification of the developed oysters. P denotes a reference marker probe, and 1 to 16 indicate the types of probes shown in Table 4 below.
Figure 4 shows the results of PCR using family Ostreidae species-specific primers.
Figure 5 compares the nucleotide sequences of the eight mitochondrial cox1 genes analyzed.
Fig. 6 shows results of species identification using eight DNA chips of oysters.
FIG. 7 is a general work flow chart for developing a DNA chip for identification for discrimination of eight species of oysters.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
굴(oyster)은 수산물 양식산업은 물론 양식굴 상품의 국내 소비시장 및 수출입 시장 규모에 있어서도 경제적으로 매우 중요한 수산식품의 하나이다. 그러나, 굴은 형태적으로 개체간 변이가 너무 심하며 특히 연체부를 둘러싸고 있는 패각(shell) 껍질이 제거되었을 경우에는 연체부(알굴)만을 기준으로는 종(species)을 감별하거나 분류학적으로 종을 정확히 동정(identification)하는 것이 거의 불가능하다.Oyster is one of the most economically important fishery foods in the domestic consumption market and export / import market scale of aquaculture industry as well as aquaculture product. However, the oysters are too morphologically mutated in their morphology. Especially, when shell shells surrounding the overgrowth are removed, the species can be discriminated on the basis of molluscs only, It is almost impossible to identify.
본 발명의 발명자들은 농수산 식품 중 상품가치가 큰 양식수산물의 하나인 굴 중에서 다음 표 1에 기재된 8 종에 대해 종 특이적인 미토콘드리아 유전자 cox1 영역(679 bp)의 유전자 염기서열을 이용하여 신속하고 정확한 종 감별이 가능하도록 표준화된 굴 종 동정용 DNA 칩 기술을 개발하였다.The inventors of the present invention have found that, among the oysters that are one of commercially valuable aquaculture products, the present invention can be applied to the eight species listed in the following Table 1 by using the gene sequence of the species-specific mitochondrial gene cox1 region (679 bp) DNA chip technology for standard identification of oyster species was developed to enable discrimination.
본 발명의 굴 종 감별용 DNA 칩을 개발하기 위하여, 먼저 분류하고자하는 굴과에 속하는 상기 표 1에 기재된 8종의 굴 조직 세포로부터 DNA를 추출하고, 추출한 DNA에 대한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR산물을 얻었다. In order to develop the DNA chip for identifying oyster species of the present invention, DNA was extracted from eight oyster tissue cells listed in Table 1 belonging to the oyster to be classified, and PCR was performed on the extracted DNA. PCR products were obtained.
상기 PCR은 다음 표 2의 서열번호 17(Ost_CO1_F)의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머로 사용하고, 서열번호 18(Ost_CO1_R)의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 역방향 프라이머로 각각 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행함으로써 증폭될 수 있다.The PCR used a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 (Ost_CO1_F) shown in the following Table 2 or a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary thereto as a forward primer and a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 (Ost_CO1_R) Or by performing a polymerase chain reaction (PCR) using a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary thereto as a reverse primer, respectively.
(C.gigas CO1 유전자상)Primer Location
(C.gigas CO1 gene phase)
본 발명에서 사용된 상기 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머는 굴과에 속하는 동물들로부터 추출한 DNA를 증폭시키는데 있어서 특이적인 프라이머이다. 기존에 일상적으로 사용하고있던 PCR 프라이머(LCO1490, HCO2198)는 본 발명의 굴과에 속하는 일부 대상종에서는 중합효소연쇄반응(PCR)의 산물을 얻을 수 없었다. 따라서 본 발명의 발명자들은 굴과에 속하는 종들의 미토콘드리아 COX1 유전자 전영역을 얻어 이들을 대상으로 다중염기정렬(multiple sequence alignment)하여 굴과(family Ostreidae) 특이적인 PCR 프라이머를 고안하였고, 이 프라이머는 굴과의 미토콘드리아 DNA COX1 유전자 영역을 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다(도 4). The primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 used in the present invention are specific primers for amplifying DNA extracted from animals belonging to oyster. PCR primers (LCO1490 and HCO2198) which have been routinely used conventionally can not produce products of PCR in some species belonging to the oyster of the present invention. Therefore, the inventors of the present invention have developed a PCR primer specific for oyster (family Ostreidae) by obtaining multiple regions of the mitochondrial COX1 gene of the oyster species and performing multiple sequence alignment on them, The mitochondrial DNA < RTI ID = 0.0 > COX1 < / RTI >
본 발명의 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 이용한 PCR 반응 조건은 다음 표 3과 같다.The PCR reaction conditions using the primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 of the present invention are shown in Table 3 below.
35회
35 times
본 발명의 굴 종 특이적 프로브를 디자인하기 위하여 상기 PCR의 결과 확보된 종의 염기서열은 분석프로그램을 이용하여 alignment를 진행하고, In-House program을 이용하여 1 base pair 이상의 차이를 보이는 지역에 종 특이적 프로브를 디자인하였다. 이때 혼성화 반응에 적합하도록 일정한 범위의 온도 값을 고려하였다. In order to design an oyster-specific probe of the present invention, the base sequence of the obtained species of the PCR was aligned using an analysis program, and an in-house program was used to identify the species A specific probe was designed. At this time, a certain range of temperature values was considered to be suitable for the hybridization reaction.
상기와 같이 디자인된 프로브들은 굴 종 감별용 DNA 칩의 제작에 사용될 수 있다. 굴 종 특이적 DNA 칩의 제조 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다.The probes designed as above can be used in the production of a DNA chip for oyster cell discrimination. Hereinafter, a method for producing an oyster-specific DNA chip will be described in detail.
상기 제작된 프로브는 시판되는 마이크로어레이 시스템을 사용하여 슬라이드 상에 집적시킬 수 있다. 일단 1차적으로 디자인된 프로브를 집적한 DNA 칩을 제조하면, 굴로부터 분리한 Genomic DNA를 5' 말단에 발광수단(예를 들어, 형광물질)을 표지한 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트로 타겟 영역을 PCR증폭한다. PCR 증폭산물은 상기 제작된 DNA 칩 위에서 혼성화 반응을 시키고, 혼성화 결과를 분석하여 디자인된 프로브 중 본 발명에서 원하는 프로브들을 선택할 수 있다. 이와 같은 과정은 굴 종을 정확하게 감별할 수 있는 프로브를 최종적으로 선택할 수 있을 때까지 반복적으로 실시될 수 있다. The prepared probe can be integrated on a slide using a commercially available microarray system. Once the DNA chip integrated with the initially designed probe is prepared, the genomic DNA isolated from the oysters is transferred to the 5 'end of the primer set of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 which are labeled with a light emitting means (for example, a fluorescent substance) To amplify the target region. The PCR amplification products are subjected to a hybridization reaction on the prepared DNA chip, and hybridization results are analyzed, and among the designed probes, desired probes can be selected in the present invention. Such a process can be repeatedly performed until a probe capable of accurately discriminating the bract species can finally be selected.
상기와 같은 방법으로 최종 선별된 굴 종 특이적 프로브는 다음 표 4에 나타내었다.The oyster-specific probes finally selected by the above method are shown in Table 4 below.
(그림 3)
상에서의 위치DNA chip
(Figure 3)
Location on
Crassostrea ariakensis Cave
Crassostrea gigas oyster
Crassostrea gigas
Crassostrea angulata Portugal oyster
Crassostrea angulata
Crassostra nippona Rock oyster
Crassostra nippona
Crassostrea sikamea I too
Crassostrea sikamea
Ostrea circumpicta Born oyster
Ostrea circumpicta
Ostrea denselamellosa crypt
Ostrea denselamellosa
Saccostrea kegaki Barbed oyster
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 굴(oyster)의 종(species) 특이적 프로브를 제공한다.Accordingly, the present invention provides an oligonucleotide comprising an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: specific probes of the oyster.
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 갓굴(Crassostrea ariakensis)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 . The species is preferably Crassostrea ariakensis .
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 굴(Crassostrea gigas)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: . The species is called Crassostrea gigas ).
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 포르투갈 굴(Crassostrea angulata)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: The species is the Portuguese oyster ( Crassostrea angulata .
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 바위굴(Crassostrea nippona)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: . The species is preferably a rock oyster ( Crassostrea nippona ).
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 나도참굴(Crassostrea sikamea)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: . Preferably, the species is Crassostrea sikamea .
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 태생굴(Ostrea circumpicta)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: . Preferably, the species is Ostrea circumpicta .
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 토굴(Ostrea denselamellosa)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: . Preferably, the species is Ostrea denselamellosa .
바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 종은 가시굴(Saccostrea kegaki)인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, the probe may be selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: . The species is called < RTI ID = 0.0 > Saccostrea & kegaki ).
위와 같이 최종 선별된 프로브들은 상기 설명된 바와 동일한 방법으로 슬라이드 상에 접적하여 최종적인 굴 종 감별용 DNA 칩을 제조할 수 있다.The final selected probes are brought into contact with the slides in the same manner as described above to finally produce a DNA chip for identifying oyster species.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 굴의 종 감별용 DNA 칩을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a probe comprising an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotide comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: The present invention provides a DNA chip for discriminating oyster species.
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip may include a probe selected from the group consisting of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
바람직한 구체예로서, 상기 DNA 칩은 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the DNA chip comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, and a probe selected from the group consisting of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . ≪ / RTI >
또한, 본 발명에서는 상기 설명된 바와 같은 본 발명에서 디자인된 프로브가 집적된 DNA 칩과 굴 미토콘드리아 COX1 유전자 특이적 프라이머를 포함하는 굴 종 감별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for identifying an oyster comprising the DNA chip integrated with the probe designed in the present invention as described above, and an oyster mitochondrial COX1 gene specific primer.
상기 키트에는 프라이머의 말단에 발광 수단을 부착할 수 있는 형광물질을 더 포함할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 상기 형광물질은 cyanine-3(Cy3)일 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.The kit may further include a fluorescent material capable of attaching the light emitting means to the end of the primer. In a preferred embodiment, the fluorescent material may be cyanine-3 (Cy3), but is not limited thereto.
나아가, 본 발명은 굴로부터 얻은 Genomic DNA 시료에 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR하는 단계; 상기 PCR의 증폭산물을 본 발명의 DNA 칩에 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화의 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 굴의 종 감별 방법을 제공한다.Further, the present invention relates to a method for amplifying a genomic DNA sample, which comprises: PCR using a primer of the present invention in a genomic DNA sample obtained from oysters; Hybridizing the amplification product of the PCR with the DNA chip of the present invention; And confirming the pattern of the hybridization.
이와 같은 굴 종 감별 방법은 신속하면서도 정확도가 매우 높은 굴 종 감별방법이 된다.This method of oyster classification is a rapid and highly accurate oyster classification method.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 설명한다. 본 발명의 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. It should be understood that the embodiments of the present invention are only for embodying the present invention and do not limit or limit the scope of the present invention. It will be understood by those of ordinary skill in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.
[실시예][Example]
1. COX1 유전자의 증폭1. Amplification of the COX1 gene
본 실시예에서는 분류하고자 하는 굴과에 속하는 임의의 굴 조직 세포로부터 DNA를 추출하는 단계를 거치고, 추출한 DNA에 대한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR산물을 얻었다. In this Example, DNA was extracted from any oyster tissue cells belonging to the oyster to be classified, and PCR products were obtained by performing PCR (PCR) on the extracted DNA.
이를 보다 구체적으로 설명하면, 추출된 DNA는 Ost_CO1_F의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 Ost_CO1_R의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머로 각각 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행함으로써 증폭하였다. More specifically, the extracted DNA was amplified by PCR using a forward primer having a base sequence of Ost_CO1_F and a reverse primer having a base sequence of Ost_CO1_R, respectively.
중합효소연쇄반응의 반응 혼합물 조성은 10X Reaction buffer(20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2 pH 8.0) 5μl, 2.5 mM dNTP 4μl, 양방향 프라이머 10M 2μl, genomic DNA 2.5μl, Taq DNA polymerase(TaKaRa bio INC, EX Taq) 0.25μl를 혼합하여 중합효소연쇄반응을 상기 표 3의 반응 조건으로 실행하였다.
The reaction mixture composition of the polymerase chain reaction was 5 μl of 10X Reaction buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 2 mM MgCl 2 pH 8.0), 4 μl of 2.5 mM dNTP, 2 μl of bidirectional primer, 2.5 μl of genomic DNA, (TaKaRa bio INC, EX Taq) were mixed and PCR was carried out under the reaction conditions shown in Table 3 above.
2. DNA chip 개발 및 제작2. Development and production of DNA chip
확보된 종의 염기서열은 분석프로그램을 이용하여 alignment를 진행하고, In-House program을 이용하여 1 base pair 이상의 차이를 보이는 지역에 종 특이적 프로브를 디자인하되, 교잡화 반응에 적합하도록 일정한 범위의 온도 값을 고려하였다. 모든 프로브에는 5' 쪽에 아미노 그룹과 poly T(10mer)를 합성하였다. 합성이 완료된 탐침은 100pmole/μl의 농도로 2X spotting buffer(6X SSC + 3M를 동량으로 섞은 후 집적을 위해 384 well plate에 옮긴 후 25℃와 60%의 습도를 유지한 상태에서 silylated 슬라이드(Cel Associate, USA) 위에 핀 방식의 마이크로어레이 시스템 (Cartesian Technology, USA)으로 집적하였다. 집적 후 동일한 습도가 유지된 상태로 12 시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 슬라이드는 1%의 SDS (sodium dodecyl sulfate)에서 5분, 증류수에서 5분간 두 번 세척하고, sodium borohydride solution (0.625 g NaBH4+187.5mLPBS+62.5ethanol)에서 5분간 반응시킨 후 증류수로 5분간 두 번 세척하고 800 rpm에서 5분간 원심분리하여 건조시켜 칩 제작을 완료하였다.The sequence of the acquired species is aligned using an analysis program and a species-specific probe is designed in a region with a difference of more than 1 base pair using the In-House program. Temperature values were considered. The amino group and poly T (10mer) were synthesized on the 5 'side of all probes. After the synthesis, the probe was mixed with the same volume of 2X spotting buffer (100Xole / μl, 6X SSC + 3M, transferred to a 384-well plate for integration, and kept at 25 ° C and 60% (SDS) (sodium dodecyl sulfate) was used for the reaction, and the reaction was carried out for 12 hours in the same humidity condition. After washing for 5 minutes in distilled water for 5 minutes and then for 5 minutes in sodium borohydride solution (0.625 g NaBH 4 + 187.5 mL PBS + 62.5 ethanol), the plate was washed twice with distilled water for 5 minutes, centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, So that the chip fabrication was completed.
다음으로, 10~100 ng/μl의 농도를 가진 Genomic DNA를 5' 말단에 Cyanine-3(Cy3) 형광물질을 표지한 primer set으로 target 영역을 PCR증폭하였다. 유전자 증폭조건은 상기 항목 1.에서 사용한 방법과 동일하였다. 10μl의 형광물질이 표지된 PCR 증폭산물은 정제과정 없이 90μl의 hybridization buffer (3X SSC + 0.3% sarcosyl), 0.5μl의 position marker와 섞은 후 프로브가 집적되어있는 슬라이드 위에 올린 후 55℃에서 1시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응을 마친 슬라이드는 1% SSC와 0.1% sarcosyl 섞인 용액에서 5분, 1% SSC에서 5분, 0.1% SSC에서 5분간 세척 후, 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 슬라이드를 건조시킨다. 분석은 Genepix 4000B (Aon Instruments, USA) 스캐너를 사용하여 마이크로어레이에서 일어난 혼성화 반응의 신호를 확인하고, 각 프로브의 형광신호는 Genepix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 이용하여 계산한 후 종 특이적 프로브를 선정하였다. 선정된 프로브로 상기와 같은 반복실험을 진행하여 종 특이적 탐침을 최종 선정하여 DNA칩 제작을 완료하였다.
Next, genomic DNA with a concentration of 10 to 100 ng / μl was PCR-amplified with a primer set labeled with Cyanine-3 (Cy3) fluorescent substance at the 5 'end. The gene amplification conditions were the same as those used in
3. 종 동정 방법3. Species identification method
확보한 대상 종 샘플을 Genomic DNA 추출단계를 거친 후, DNA chip 혼성화 반응을 위해 형광물질이 표지된 primer set으로 PCR 증폭하였다. 유전자 증폭방법은 상기 항목 1.과 동일하게 수행하였다.After securing the genomic DNA, the target species was PCR amplified with a fluorescent primer set for DNA chip hybridization. The gene amplification method was performed in the same manner as in
10μl의 형광물질이 표지된 PCR 증폭산물은 정제과정 없이 90℃의 hybridization buffer (3X SSC + 0.3% sarcosyl), 0.5μl의 position marker와 섞은 후, 상기 항목 2에서 제작이 완료된 슬라이드 위에 올린 후 55℃에서 1시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응을 마친 슬라이드는 1% SSC와 0.1% sarcosyl 섞인 용액에서 5분, 1% SSC에서 5분, 0.1% SSC에서 5분간 세척 후 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 슬라이드를 건조시켰다. 분석은 Genepix 4000B (Aon Instruments, USA) 스캐너를 사용하여 마이크로어레이에서 일어난 혼성화 반응의 신호를 확인하고, 각 프로브의 형광신호는 Genepix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 이용하여 계산하였다. 각 프로브의 신호는 중간 값에서 배경 값을 제거한 값이며, 위의 분석프로그램으로 표준화시켰다.The PCR products labeled with 10 μl of the fluorescent substance were mixed with the hybridization buffer (3 × SSC + 0.3% sarcosyl) at 90 ° C. and 0.5 μl of the position marker without purification, Lt; / RTI > for 1 hour. After hybridization, the slides were washed 5 min in 1% SSC and 0.1% sarcosyl, 5 min in 1% SSC, 5 min in 0.1% SSC, and then centrifuged at 800 rpm for 5 min to dry the slides. Analysis was performed using a Genepix 4000B scanner (Aon Instruments, USA) to check the signals of the hybridization reactions in the microarray. The fluorescence signals of each probe were calculated using Genepix 4.1 software (Axon Instruments, USA). The signal of each probe is the value obtained by subtracting the background value from the median value, and standardized by the above analysis program.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> MOLECULAR METHODS FOR IDENTIFICATION OF OYSTER SPECIES USING SPECIES-SPECIFIC PROBES, DNA CHIP, AND MOLECULAR KITS <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 1 gttggcgcta tttccatggt ctatc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 2 ggtctatcaa agtcacatca ttttt 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 3 caattctaag ccttcacctt gctgg 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 4 gccttcacct tgctggtatt agc 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crassostrea angulata <400> 5 atgtctaaca tcgtagaaaa cgc 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 6 ttaagcctac atttggctgg tatta 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 7 gctctgtttc cttgatcaat taaag 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 8 caattttaag tttacaccta gctgg 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 9 ttattggcgc tgtttccctg atcta 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 10 cctccactat caactttttc atatc 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 11 cgatcagtgg acggtcattt actgg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 12 caaatatacg gtcagtagac ggcca 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 13 cggccattta ttagcattgt ttccc 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 14 gacttccttt ttattgttaa ctacg 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 15 gtcaggcact tctagtatca acggg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for oyster identification <400> 16 ccatctgtta aggttgttcc catgg 25 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondria cox1 gene of oyster <400> 17 atrtchacwa aycayttrga yattgg 26 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondria cox1 gene of oyster <400> 18 cttattcttc cdggrttygg wat 23 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> MOLECULAR METHODS FOR IDENTIFICATION OF OYSTER SPECIES USING SPECIES-SPECIFIC PROBES, DNA CHIP, AND MOLECULAR KITS <160> 18 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (14)
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브는 갓굴(Crassostrea ariakensis)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, is specific to Crassostrea ariakensis .
서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브는 굴(Crassostrea gigas)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is selected from the group consisting of oysters ( Crassostrea gigas ). < / RTI >
서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 5 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브는 포르투갈굴(C rassostrea angulata)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; And an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is specific to a Portuguese oyster ( C rassostrea angulata ).
서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브는 바위굴(Crassostrea nippona)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7; And an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 is selected from the group consisting of a Crassostrea nippona ). < / RTI >
서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브는 나도참굴(Crassostrea sikamea)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; And an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, is also specific to oyster ( Crassostrea sikamea ).
서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브는 태생굴(Ostrea circumpicta)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11; And an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, is specific to Ostrea circumpicta .
서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 12 내지 서열번호 14의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는 토굴(Ostrea denselamellosa)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 14; And the oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 14 of the nucleotide sequence complementary to the base sequence consisting of a nucleotide probe crypt (Ostrea denselamellosa. < / RTI >
서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는 가시굴(Saccostrea kegaki)에 특이적인 것을 특징으로 하는 굴의 종 특이적 프로브.The method according to claim 1,
An oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; And a probe comprising an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 is specific to Saccostrea kegaki .
상기 키트는 발광 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 굴의 종 감별용 키트.13. The method of claim 12,
Wherein the kit further comprises a light emitting means.
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