KR101540175B1 - 금나노막대­폴리에틸렌글리콜­그래핀 산화물 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물 - Google Patents

금나노막대­폴리에틸렌글리콜­그래핀 산화물 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금나노막대­폴리에틸렌글리콜­그래핀 산화물 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO)로 이루어진 AuNR-PEG-GO 복합체는 빛의 조사에 의해 40%까지 암세포 생존율을 감소시키므로, 상기 AuNR-PEG-GO 복합체는 효과적인 암의 광역학 치료제로서 사용될 수 있다.

Description

금나노막대­폴리에틸렌글리콜­그래핀 산화물 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for photothermal cancer therapy comprising gold nanorod-PEGylated graphene oxide composite}
본 발명은 금나노막대­폴리에틸렌글리콜­그래핀 산화물 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
광역학 치료(photothermal therapy)는 체내의 풍부한 산소와 외부에서 공급되는 레이저와 레이저 빛에 예민한 반응을 보이는 광감작제(photosensitizer)을 이용한 새로운 암 치료 방법으로 최근 암 치료에 있어 가장 주목되는 치료 방법 중의 하나이다.
광감작제를 정맥 주사 하면 종양조직세포와 종양혈관조직에 선택적으로 축적된다. 일정 시간이 지난 후 광감작제 물질을 활성화시킬 수 있는 광, 예를 들어 레이저 빛을 조사함으로써 광감작제 물질의 변화나 활성 산소종의 생성 유발에 의해 세포의 구성 물질에 작용하거나 혈관 흡착을 유도하여, 암세포를 괴사 시키거나 산화적 스트레스에 따른 2차 반응으로 세포 사멸과 면역학적 반응에 따른 복합적인 방법으로 암 조직만 선택적으로 사멸시킨다.
이러한 광역학 치료의 가장 큰 장점은 정상 세포는 보존하면서 병든 세포만 선택적으로 제거할 수 있고, 임상적 측면에서 환자 치료 및 수술에 따른 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있어 간단하게 국소 마취만으로도 수술할 수 있기 때문에 시술이 용이한 것이다.
또한, 광역학 치료 방법은 암세포 특이적 제거 효과와 더불어 광역학 시술 후 환자의 회복이 다른 외과적 수술보다 빠른 편이므로 병원 입원 기간을 단축시켜 환자의 경제적 부담을 줄 일 수 있다.
그러므로, 현재 광역학 치료의 효율을 높이기 위해 제품들이 개발되고 있지만, 보다 더 광역학적 치료 효과를 높이고 인체 친화적인 안전성을 갖는 광감작제의 개발이 요구되는 실정이다.
한국공개특허 제2012-0055604호
본 발명의 목적은 금나노막대­폴리에틸렌글리콜­그래핀 산화물 복합체를 포함하는 광감작용 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 금나노막대­폴리에틸렌글리콜­그래핀 산화물 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO)로 이루어진 AuNR-PEG-GO 복합체를 포함하는 광감작용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO)로 이루어진 AuNR-PEG-GO 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO)로 이루어진 AuNR-PEG-GO 복합체를 처리하는 단계; 및 빛을 조사하는 단계를 포함하는 암의 광역학 치료에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO)로 이루어진 AuNR-PEG-GO 복합체는 빛의 조사에 의해 40%까지 암세포 생존율을 감소시키므로, 상기 AuNR-PEG-GO 복합체는 효과적인 암의 광역학 치료제로서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체의 제조공정과, 이의 광역학 치료제로서의 개념도이고,
도 2는 GO의 XRD 패턴을 나타낸 것이고,
도 3은 GO 및 PEG-GO의 라만 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 4는 적외선 분광 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 5a 및 도 5b는 각각 PEG-GO 및 HCl 처리 AuNR의 TEM 이미지를 나타낸 것이고,
도 5c는 PEG-GO 분자, AuNR 및 AuNR-PEG-GO 복합체의 흡광 분석을 나타낸 것이고,
도 6a 및 도 6b는 각각 AuNR-PEG-GO 복합체의 TEM 이미지 및 AFM 이미지를 나타낸 것이고,
도 7a는 AuNR-PEG-GO 복합체의 DFM 이미지 및 공초점 마이크로라만 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 7b에서 A는 AuNR-PEG-GO 복합체의 암세포 내 축적을 나타낸 TEM 이미지이고, B는 고배율 TEM 이미지이며, A의 스케일 바는 2 ㎛, B의 스케일 바는 100 nm이고, 흰 화살표는 AuNR-PEG-GO 복합체의 위치를 나타내며,
도 8a는 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체에 의한 암세포 생존율을 분석한 결과이고,
도 8b는 농도별 AuNR-PEG-GO 복합체에 의한 암세포 생존율을 분석한 결과이고,
도 8c는 시간별 동일 광조사에 의한 암세포 생존율을 분석한 결과이고,
도 8d는 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체 및 광조사에 의한 암세포 생존율을 분석한 결과이고,
도 9a는 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체 및 광조사에 의한 종양 조직 변화를 나타낸 이미지이고,
도 9b는 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체 및 광조사 후 체중 변화를 나타낸 것이고,
도 9c는 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체 및 광조사에 의한 종양 성장억제 정도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은, AuNR의 세포독성이 HCl과 같은 산 처리에 의해 AuNR로부터 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 제거함으로써 감소되며, HCl 처리 AuNR과 PEG-GO가 정전기적 인력에 의해 결합하여 얻어진 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체를 세포내 또는 생체내에서 처리하고 광조사를 한 경우 탁월한 암세포 사멸 효과를 나타내는 것을 밝혀내어 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체를 암의 광역학 치료제로서 사용하고자 본 발명을 완성한 것이다.
이에, HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체를 포함하는 광감작용 조성물을 제공한다.
상기 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체는 400~900 nm의 파장의 빛에 대해 광감작 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체는 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 1 내지 10 중량% 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO) 90 내지 99 중량%로 이루어진다.
특히, 상기 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체는 HCl 처리 AuNR의 최종농도가 ~5 ppm 이내, 예를들어 0.1~5 ppm, PEG로 개질된 GO의 최종농도가 ~100 ppm 내외, 예를들어 10~200 ppm으로 포함될 수 있다. 이때, 상기 함량범위를 벗어나면 AuNR 독성 문제가 야기될 수 있다.
상기 암은 편평상피암, 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암 또는 골수암에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 산은 염산 또는 염산-에탄올 혼합물에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체를 처리하는 단계; 및 빛을 조사하는 단계를 포함하는 암의 광역학 치료에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 빛은 1~60 W/cm2 이하로 5~20 분 동안 조사할 수 있다. 이때, 상기 광 조사 조건을 벗어나면 열에 의한 암세포 뿐만 아니라 정상 세포 손상 문제가 야기될 수 있다.
특히, 일실시예에 따르면 HCl 처리 AuNR-PEG-GO 복합체를 24시간 동안 처리한 후, Xe 램프 광원(60 W/cm2)을 5분 동안 조사할 경우 40%까지 암세포 생존율을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
본 명세서에서 사용된 광감작제는 적합한 파장의 광원에 노출되었을 때 광에너지를 흡수한 후, 광화학반응에 의해 목표 세포를 손상시키거나 파괴할 수 있는 생물학적 매개물질 예를 들어, 라디칼 또는 세포독성물질을 방출할 수 있는 화합물을 포괄적으로 의미한다. 상기 광감작제는 생체에 투여되는 경우 특정의 타깃 세포 예를들어, 암세포에 특이적으로 결합한 후 광원에 의해 활성화되어 암세포를 사멸시킬 수 있는 독성물질을 생성함으로써 암세포에 대한 선택적 독성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 광역학 치료는 병적 상태, 예를 들어 암 환자에게 광감작제를 처리하고 상기 광감작제를 활성화시켜 치료 효과를 얻기 위해 광을 조사하는 과정을 포함하는 치료 방법을 의미한다.
본 발명에서 광감작제를 활성화시키기 위한 광의 에너지량은 사용 환경 및 목적에 따라 적합하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를들어 적합한 파장, 전력(power), 전력밀도(power density), 에너지 밀도 및 광감작제를 처리한 시간에 비례한 적용기간 등을 적절하게 선택, 조절함으로써 조정할 수 있다. 광의 파장은 광감작제에 의해 흡수될 수 있는 어떠한 파장도 사용가능하고, 표적 세포에 원하는 생물학적 반응을 일으킬 수만 있다면 어떠한 파장도 사용가능하다.
본 발명에서 광을 생성하는 광원은 필요한 광에너지를 공급하여 광감작제를 활성화시킬 수 있는 파장을 생성하는 어떠한 광원도 사용가능하다. 광원의 구체적인 예로서 레이저(laser), 램프(lamp), 광전자기 장치(optoelectric magnetic device), 다이오드(diode), 또는 다이오드-레이저(diode-laser) 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 예를 들어 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약학조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> HCl-처리 금나노막대-그래핀 산화물(AuNR-PEG-GO) 복합체 제조
1. PEG-GO 제조
폴리에틸렌글리콜(PEG)을 기능기로 부착한 그래핀 산화물(PEG-GO)은 종래 알려진 방법(J. Am. Chem. Soc., 80, 1339-1339, 1958; J. Am. Chem. Soc., 130, 10876-10877, 2008; J. Mater. Chem,, 22, 23845-23851, 2012)을 참고하여 팽창 편상 흑연(Alfa Aesar)으로부터 합성하였다. 6-팔 폴리에틸렌글리콜-아민(Sunbio Inc., P6AM-15)을 GO 표면에 도입하여 GO를 PEG화 시켰다.
2. HCl-처리 AuNR 제조
금나노막대(AuNR)는 이전에 알려진 방법(.,126, 8648-8649, 2004)에 따라 준비하였다. 즉, 시험관 내에서 250 ㎕의 0.01M 염화금(III) 삼수화물(≥99.9%, Sigma Aldrich) 수용액을 7.5 mL의 0.10M CTAB(≥99.9%, Sigma Aldrich) 수용액에 첨가하여 시드 용액을 준비하였다. 그 후, 600 ㎕의 0.01M 찬 NaBH4(≥99.9%, Sigma Aldrich) 수용액을 첨가한 후, 혼합 용액을 2분 동안 역전 혼합시켰다. 그 후, 시험관을 25℃, 2시간 동안 유지된 수욕 상에 놓아두었다. 이렇게 준비된 시드 용액을 실온에서 보관해 두었다가 다음 실험에 사용하였다. 이렇게 준비된 금나노입자는 9.5x10-2M 농도의 CTAB를 갖는 것이었다. 4.75 mL의 0.10M CTAB, 200 ㎕의 0.01M 염화금(III) 삼수화물과, 30 ㎕의 0.01M AgNO3(≥99.9%, Sigma Aldrich) 용액을 순차적으로 시험관에 첨가하였고, 온화한 역전 진탕을 수행하였다. 그후, 반응혼합물에 32 ㎕의 0.10M 아스코르브산을 첨가하였다. 마지막으로, 10 ㎕의 시드 용액을 첨가하고, 반응용액을 10초 동안 가볍게 혼합한 후, 3시간 동안 방치하였다. AuNR 용액에 pH가 1.4가 될 때까지 HCl 용액(10M)을 첨가하여 HCl 처리된 AuNR을 준비하였다. 상기 용액을 65℃에서 3시간 동안 교반한 후, 10,000 rpm에서 30분 동안 2회 원심분리하였다. 원심분리 후, 침전물을 탈이온수로 재분산시켰다.
3. HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체 제조
AuNR-PEG-GO 복합체 형성을 위하여, 물에 용해시킨 AuNR(55.2 (±1.1) ppm, 200 ㎕)을 1 mL의 PEG-GO 용액에 첨가하였다. 밤새도록 교반한 후, 분산 용액을 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 2 mL의 물로 2회 세정하였다. 그 후, 얻어진 AuNR-PEG-GO 시료를 1 mL의 물에 재현탁시켰다. 이렇게 준비된 시료를 비발열성 필터(0.2 ㎛ 기공, Sartorius Stedium Ministart, Catalog #16534)로 여과시켜 마이크로미터 크기의 복합체를 분리하였다. 도 1은 본 실시예에 따른 HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체의 합성방법을 나타낸 개략도이다.
4. 물성 평가
XRD 패턴은 Rigaku XRD 분광계를 통해 분석하였고, 도 2에서 GO의 XRD 패턴을 나타내었다. 그리고, 라만 분석은 Renishaw RM1000를 통해 분석하였고, 도 3에서 GO 및 PEG-GO의 라만 분석 결과를 나타내었다. 또한, 적외선 분광 분석은 Thermo 6700 분광계, Mecasys 3220 분광분석기를 이용하여 UV-VIS-NIR 영역에서 분석하였고, 도 4에서 적외선 분광 분석 결과를 나타내었다.
TEM 분석은 JEOL JEM-3010 투사전자현미경을 통해 분석하였고, 도 5a 및 도 5b는 각각 PEG-GO 및 AuNR의 TEM 이미지로서, PEG-GO 분자의 크기 분포는 Otsuka ELS-Z 분석기를 통해 분석하였고, 약 100 nm로 나타났고, AuNR 분자의 장축 및 단축의 길이는 각각 39.3±7.1 및 10.0±2.4 nm로 나타났다.
그리고 표면 전하(제타 전위)는 Otsuka ELS-Z 분석기를 통해 분석하였고, AuNR에서는 표면 전하가 43.5±0.2 mV, PEG-GO에서는 표면 전하가 -20.8±2.3 mV, AuNR-PEG-GO에서는 표면 전하가 24.8±0.6 mV로 나타났다. 이러한 정전기적 상호작용으로 인하여, AuNR 분자는 PEG-GO 분자의 표면 상에 효율적으로 부착될 수 있다. 도 5c는 AuNR-PEG-GO 분자의 흡광 분석을 나타낸 것으로서, 횡모드 및 종모드의 흡광 밴드가 각각 520 nm와 760 nm에서 나타났다. 특히, 각 크기를 고려할 때, 100개의 AuNR 분자가 PEG-GO 분자 상에 결합될 수 있다.
또한, 시료 중 Au 원자 퍼센트를 평가하기 위하여, Perkin Elmer ICP-730ES 기구를 이용하여 유도플라즈마분광법(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy; ICP-AES)을 수행하였고, 그 결과 AuNR 중 Au의 양은 55.2±1.1 ppm으로 나타났으며, PEG-GO 분자 상에 AuNR 분자의 로딩 후 Au의 함량은 4.7 ppm으로 확인되었다.
그리고, 도 6a는 AuNR 로딩된 PEG-GO 분자의 TEM 이미지를 나타낸 것으로서, AuNR-PEG-GO 복합체의 TEM 이미지로부터 PEG-GO 분자 상에 AuNR의 로딩을 관찰할 수 있었다.
또한, 원자현미경(AFM) 이미지는 디지털 Instruments nanoscope를 통해 얻었고, 도 6b는 AFM 이미지로서, PEG-GO 표면에 AuNR이 담지되어 있음을 관찰할 수 있다. 또한, AFM 이미지는 AuNR에 대응하는 돌출 영역을 나타내었다. AuNR-PEG-GO 복합체 시료는 시린지 필터를 통과시켜 큰 입자를 제거하여 암세포 치료에 이용하였다.
<실시예 2> 세포내이입(endocytosis) 분석
AuNR-PEG-GO 나노복합체의 축적 여부를 JEOL JEM-1010 투사전자현미경으로 관찰하였다. 즉, 편평상피암종 A431(ATCC; CRL-2592) 세포를 100 mm 배양접시에 성장 배지를 함유한 배양접시 상에 2x106 세포의 농도로 분주하고, 37℃에서 배양하였다. 그 후, AuNR를 첨가하고 세포를 5% CO2 하 37℃에서 배양하였다. 24시간 후, 세포를 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 세정하고, Karnovsky 고정액으로 고정시켰다. 고정 후, 각 시편을 단계별 에탄올 농도로 탈수시켰다. 이러한 시료를 60℃에서 수지 혼합물(Spurr 수지)에 담구었다. 다이아몬드 나이프를 이용하여 초박절편을 준비하여 JEOL JEM-1010 투사전자현미경을 이용하여 TEM 분석을 수행하였다. 이때, Karnovsky 고정액은 0.05 M 소듐 카르코딜레이트 버퍼, 1% 오스뮴 테트라옥사이드, 0.5% 우라닐 아세테이트, 프로필렌 옥사이드 및 Spurr 수지는 각각 서울대학교 농업과학공동기기센터(nicem)로부터 구매하였다.
또한, AuNR-PEG-GO 복합체의 세포내이입(endocytosis)을 확인하기 위하여, DFM 및 라만 분석을 수행하였다. 3,3'-디에틸티아트리카보시아닌 염료가 코팅된 AuNR이 암세포 내로 이입되는 것을 라만 분석을 통해 확인하였다.
DFM 이미지로부터 세포 내부에 이입된 AuNR-PEG-GO 복합체를 확인할 수 있었다. A431 세포에서 AuNR 검출 후, 세포 내부에 이입된 AuNR-PEG-GO 복합체에 대한 z-depth 라만 분광분석을 수행하였다. 이때, 상기 z-depth 라만 분광분석은 어댑터로 Cytoviva 고해상기를 구비한 Leica DL LM 현미경을 갖는 Renishaw RM 1000 라만분광분석기를 이용하여 z-depth 라만 스펙트럼을 갖는 암시야 현미경(DFM) 이미지를 얻었다. PEG-GO 분자의 D 및 G 밴드를 모니터링 하여 AuNR-PEG-GO 복합체가 실질적으로 A431 세포 내로 이입되는 것을 확인하였다. 도 7a는 PEG-GO 분자의 D 및 G 밴드가 각각 1,335 cm-1 및 1,610 cm-1로 나타났다. AuNR-PEG-GO 복합체는 포유동물 암세포에서 세포내이입이 잘 진행되었다. 도 7b에 도시된 TEM 이미지는 A431 세포 내 AuNR-PEG-GO 복합체의 세포내이입을 나타내었다.
<실시예 3> 암세포 생존율 분석(CCK-8 분석)
편평상피암종 A431(ATCC; CRL-2592) 세포를 10% FBS 및 1% 항생제를 보강한 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 상기 A431 세포를 37℃에서 5% CO2 하에서 유지시켰다. CCK-8 분석을 위해, 각 세포를 96-웰 플레이트에 1x104 세포/웰의 농도로 분주하였다. 상기 실시예 1에서 준비된 복합체를 처리한 후, 세포를 24시간 동안 배양하였고, 그 후 Xe 램프를 이용하여 조사하였다. 그 후, 20 ㎕의 CCK-8 시약(Dojindo, CK04-11, Japan)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트 리더(Tecan, Infinite F50, Switzerland)를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
도 8a와 같이 HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체(0.1 ppm)의 독성이 매우 낮은 것으로 나타났다. 도 8b와 같이, 세포 생존율은 24시간 배양 후 AuNR-PEG-GO 복합체에 대해 농도의존적으로 감소되었다. 따라서 세포 생존율은 0.3 ppm까지의 농도에서 유의성있게 영향을 받지 않은 반면, 1 ppm 내지 2 ppm의 농도에서 유의성있게 감소되었다. 도 8c와 같이 세포 생존율은 동일 조건 하에서 Xe 램프를 이용한 조사 시간에 의해 유의성있게 감소되지 않았다.
도 8d 와 같이 HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체의 광역학 효과를 검토하기 위하여, A431 세포를 HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체로 처리한 후 5분 동안 Xe 램프를 조사한 결과, 조사된 HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체로 처리된 세포에서는 세포 생존율이 유의성있게 40% 정도로 감소되었다.
따라서, 5분 동안의 빛만 조사한 경우 또는 HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체만 처리한 세포내이입의 경우에는 유의성있는 세포 생존율 감소를 나타내지 않은 반면, 빛 조사와 HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체의 세포내이입의 상승 효과에 의한 암세포에 대한 광역학 효과임을 알 수 있었다.
<실시예 4> 이종이식 종양 마우스 모델
6주령 수컷 CAnN.Cg-Foxn1nu/CrijOri 누드 마우스를 Orientbio (Seongnam, Korea)에서 구매하였고, 조절된 온도(23℃) 및 습도(50%) 하에서 사육시켰고, 음식과 멸균수를 제공하였다. A431 세포(0.1 mL)를 1.3x107 세포/mL의 농도로 누드 마우스의 등에 피하주사하여 종양을 갖는 마우스 모델을 제작하였다.
상기 마우스를 제1군(DPBS, 대조군), 제2군(HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체를 처리한 실험군) 및 제3군(HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체 주입 후 Xe 램프를 5분 동안 조사한 실험군)와 같은 3개의 실험군으로 나누었다. 이때, AuNR-PEG-GO 복합체는 각 마우스의 종양으로 투여하였다. 캘리퍼를 이용하여 종양의 크기를 측정하여 다음 식으로부터 산출하였다.
종양 부피 = π/6 x ((종양 길이) x (종양 너비) x (종양 높이))
상기 준비된 AuNR-PEG-GO 복합체를 각 종양에 주입하여 종양의 부피가 1/10 정도로 채웠다(최종 농도는 대략 0.1 ppm). Eurosep spot.il.5180 광섬유 조명기(Christophe, France)를 이용하여 5분 동안 약 60 W/cm2 조사를 통해 in vivo 조사 실험을 수행하였다. 모든 동물 실험은 서울대학교 실험동물자원관리원의 지침에 따라 수행하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9c와 같이, DPBS-처리 마우스에서는 종양 부피가 신속하게 증가하였고, HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체 처리 마우스에서는 독성 CTAB 분자가 종양 영역에 남아있어 약간의 종양 부피가 감소한 반면, HCl-처리 AuNR-PEG-GO 복합체 처리 및 5분 동안의 Xe 램프 조사 마우스에서는 종양 부피가 유의성있게 감소하였다. 한편, 도 9b와 같이 유의성있는 체중 변화는 없었다.
따라서, AuNR-PEG-GO 복합체는 in vivo에서도 암에 대한 탁월한 광역학 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 편입된다.

Claims (8)

  1. 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO)로 이루어진 AuNR-PEG-GO 복합체를 포함하는 광감작용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 AuNR-PEG-GO 복합체는 400 내지 900 nm의 파장의 빛에 대해 광감작 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 광감작용 조성물.
  3. 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO)로 이루어진 AuNR-PEG-GO 복합체를 포함하는 암의 광역학 치료용 약학조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 AuNR-PEG-GO 복합체는 산이 처리된 금나노막대(AuNR) 1 내지 10 중량% 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 그래핀 산화물(GO) 90 내지 99 중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 암의 광역학 치료용 약학조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 암은 편평상피암, 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암 또는 골수암인 것을 특징으로 하는 암의 광역학 치료용 약학조성물.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 산은 염산 또는 염산-에탄올 혼합물에서 선택된 것을 특징으로 하는 암의 광역학 치료용 약학조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
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