KR101523428B1 - 그래핀-분자각인 중합체의 복합체 및 이를 포함하는 바이오센서 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전도성 그래핀(graphene)을 포함하는 분자 각인 중합체 및 이를 이용한 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 분자 각인 기술(Molecular imprinting technique)로부터 제조되어 표적 바이오물질과 선택적으로 결합하며 전도성이 우수한 그래핀-분자각인 중합체를 제공하고, 이를 전극 표면에 적층시킴으로써 높은 감응성 및 선택성을 나타내는 바이오센서 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

그래핀-분자각인 중합체의 복합체 및 이를 포함하는 바이오센서 및 그 제조방법{GO-MIP composite, biosensor using the GO-MIP composite and method of fabrication of the same}
본 발명은 클로람페니콜(chloramphenicol, CAP) 검출용 센서에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 나노 사이즈의 분자 각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)의 복합체(GO-MIP composite) 및 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.
나노 구조 물질을 포함하는 전기화학적 바이오 센서는 우수한 감응 성능으로 인해 최근 각광 받고 있는 분야이다. 그 중에서도 탄소나노튜브 및 그래핀과 같은 탄소 기반의 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있다.
'분자각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)'는 적당한 주형물질(template; 본 발명에서는 클로람페니콜(chloramphenicol, CAP))과 단량체(또는 단위체)를 이용하여 (필요한 경우 가교제를 추가적으로 첨가하여) 중합체를 합성한 후 주형물질을 제거함으로써 주형물질과 동일한 공간이 존재하는 중합체를 말한다. 분자각인 중합체는 높은 선택성 및 안정성 때문에 특정 물질의 검출, 인식, 제거, 추출, 전달, 분석 등 다양한 분야에 응용되어 왔다(Gonzalez, G.P., Hernando, P.F., Alegria, J.S.D., Anal. Chim. Acta, 2009, 638, 209-212외 다수).
상기 분자각인 중합체를 얻는 기술 즉, 분자 각인 기술(molecular imprinting technique)은 어떠한 주형물질이라도 단량체 및 가교제가 혼합 용해되어 있는 용액에 투입하여 3차원의 고분자 구조를 형성할 수 있고, 이로부터 주형물질을 제거한 후에는 원래 주형물질에 대해 선택성 있게 결합할 수 있는 캐비티(cavities)가 형성된다. 또한 MIP는 가혹한 합성 및 분석 환경에서 높은 안정성 및 견고성을 나타낸다. 전기화학적 센서 분야에서도 특정 분자에 대한 우수한 인식 및 검출 기능이 기대되는 MIP는 다른 한편, 느린 물질 이동 속도 및 느린 흡착 능력이 문제시 되었으나, 그래핀과 같은 높은 표면적을 갖는 물질을 이용함으로써 이러한 장애를 제거하고자 하는 연구가 진행되었다(Li, Y., Li, X., Dong, C., Qi, J., Han, X. Carbon, 2010, 48, 3427-3433외 다수).
한편 식품에 대한 안정성 논란이 끊임없이 제기되는 가운데, 정확하고, 간단하며, 빠른 분석 결과를 제공하는 분석법에 대한 요구가 지속되고 있다. 식품은 각종 방해 물질이 존재하는 복잡한 분석 환경이다. 특히 항생제 물질인 클로람페니콜(chloramphenicol, CAP)은 재생 불량성 빈혈과 같은 부작용을 유발하는 것으로 미국, 유럽에서 사용이 엄격히 제한되어 있다. CAP를 검출하기 위하여 크로마토그래피법(Chen et al., Anal. Chim. Acta, 2009, 632, 80), 미생물학적 방법(Lynas et al., Analyst, 1998, 123, 2773), 면역에세이법(Lin et al., Anal. Bioanal. Chem., 2005, 382, 1250), 화학발광법(Taylor et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2006, 41, 347), 및 MIP 기반의 분석법(Shi, et al., Analyst, 2012, 137, 3381-3389)이 제시되어 왔다.
이러한 방법들은 정확한 검출 결과를 제공하기는 하나, 화학적으로 및 열역학적으로 불안정하며(예로서, 효소적 작용으로 인하여), 오랜 감응 시간, 높은 분석 비용 및 복잡한 샘플 준비 과정이 필요하다는 단점이 있다. 또한 상기 MIP 기반의 방법의 경우에도 높은 선택성을 보이는 반면, 값비싼 장비를 사용하고 힘든 샘플 준비 과정을 필요로 한다.
한편 CAP 검출을 위하여 전기화학적 수단을 사용하는 방법에 대한 연구도 지속적으로 진행되어 왔다(Kim et al., Biosens. Bioelectron. 2010, 25, 1781-1788외 다수). 그러나 상기 방법들도 면역센서의 기법을 이용한 매우 복잡한 과정을 필요로 하거나 CAP 센서로서의 선택성 및 감도면에서 만족할 만한 결과에 이르지 못하였다.
특히 CAP 검출을 위한 MIP 기반의 전기화학적 센서에서 선택성 문제를 해결하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 예로서 MIP 기반의 나노-복합체 탄소 페이스트 정전위법 센서(Ganjali, et al., Int. J. Electrochem. Sci., 2012, 7 4800 -4810), MIP-탄소나노튜브-금 나노입자로 변형된 전극(Zhao, et al., J. Electrochem. Soc., 2012, 159, J231-J236)이 제시되었다. 상기 제안된 방법들은 우수한 선택성을 보였으나, 반면 센서 제작과정의 수고로움, 검출 시간의 제한성 및 산소의 환원 반응으로 인한 부정확성 등의 단점을 가지고 있다.
본 발명은 검출 물질의 이동 속도가 빠르고 검출 물질에 대한 선택성이 우수하며 높은 전도성을 가짐으로써 센서 제작에 이용될 수 있는 GO-MIP 복합체 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 CAP 검출용 센서로서 간단한 방법으로 제조되는 반면 우수한 감응성 및 선택성을 나타내고 매우 우수한 검출 한계 및 신뢰성 있는 결과를 제공하는 전기화학적 센서 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)를 포함하는 분자 각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)의 복합체(GO-MIP composite)를 제공한다.
바람직하게, 상기 복합체는 주형물질 및 단량체로부터 개시되는 분자 각인 중합체의 중합 과정에서 GO를 투입하여 중합 반응시킴으로써 제조된다.
바람직하게, 상기 주형물질은 클로람페니콜(chloramphenicol, CAP)이다.
바람직하게, 상기 중합 반응에는 가교제(cross linker)가 포함될 수 있다.
바람직하게, 상기 복합체에 포함되는 그래핀 옥사이드는 10-90 중량% 범위의 양이다.
바람직하게, 상기 중합 반응 후 주형물질을 제거하는 과정을 추가로 포함한다.
본 발명은 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 분자 각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)의 복합체(GO-MIP composite)를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
바람직하게, 상기 바이오센서는 상기 복합체를 전극 표면에 드롭 캐스팅하여 제조한다.
바람직하게, 상기 전극은 바람직하게 금(Au), 백금(Pt) 또는 글래시 카본(GC)이다.
바람직하게, 상기 복합체는 클로람페니콜(chloramphenicol, CAP) 및 단량체로부터 개시되는 분자 각인 중합체의 중합 과정에서 그래핀 옥사이드를 투입하여 중합 반응시킴으로써 제조된다.
바람직하게, 상기 복합체는 중합 반응 후 클로람페니콜(chloramphenicol, CAP)이 제거된 것이다.
바람직하게, 상기 바이오센서는 pH 6.5 내지 7.5 범위의 시료 용액에 포함된 클로람페니콜의 농도 측정에 사용된다.
바람직하게, 상기 바이오센서는 바람직하게 작업전극, 카운터 전극 및 기준전극의 삼전극계이다.
바람직하게, 상기 적층 구조물의 두께는 0.1 μm - 1 mm의 범위이다.
본 발명에 따른 그래핀-분자 각인 중합체의 복합체(GO-MIP composite)는 표면적이 넓고, 전기전도도 성질이 우수하여 클로람페니콜 같은 생물 분자의 고정화 양을 높일 수 있으며, 이를 포함하는 센서에서 생물 분자에 대한 검출 민감도를 증대시키는 것이 가능하다. 따라서 본 발명의 센서에 의하면 표적 생물 분자(검출 물질)에 대한 선택성이 뛰어나고, 전기화학적 신호를 측정함으로써 바이오 물질을 정확히 한번에 대량으로 검출할 수 있다. 또한, 소량의 원료(source)만으로도 신뢰성 있고 정확한 측정값을 얻을 수 있는 검출법을 구현하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 GO-MIP composite 합성, 센서의 제작 및 그로부터 전기화학적 신호를 얻는 과정을 대략적으로 도시한 것이다.
도 2는 (a) 그래핀 옥사이드(GO), (b) GO-MIP composite(template 제거 전) 및 (c) GO-MIP composite(template 제거 후)의 SEM 사진이다.
도 3은 (a) GO-MIP composite(template 제거 전) 및 (b) GO-MIP composite(template 제거 후)의 등온 N2 흡탈착 커브이다.
도 4는 (a) 베어 금 전극, (b) MIP 센서, (c) GO-MIP 센서(template 제거 전) 및 (d) GO-MIP 센서(template 제거 후)의 electrochemical impedance spectroscopy(EIS) 분석 결과이다.
도 5는 (a) 베어 금 전극, (b) MIP 센서 및 (c) GO-MIP 센서의 CAP에 대한 cyclic voltammogram (CV) 커브이다.
도 6은 GO-MIP 센서의 CAP에 대한 cyclic voltammogram (CV)의 제1 및 제2 사이클 커브이다.
도 7은 GO-MIP 센서에 대해 (A) 시료 용액 내 센서의 dipping time 및 (B) 시료 용액의 pH을 달리하여 얻어진 결과를 도시한 것이다.
도 8은 GO-MIP 센서에 대해 (a) 0.1nM, (b) 1.5nM, (c) 8nM, (d) 20nM, (e) 30nM, (f) 50nM, (g) 60nM and (h) 90nM 농도의 CAP를 포함하는 시료 용액의 (A) differential pulse voltammetry (DPV) 커브와 이를 이용하여 얻어진 CAP 농도에 따른 (B) 검정곡선이다.
도 9은 GO-MIP 센서의 CAP 및 여러 방해물질들의 5 μM 동일 농도에서의 감응성 비교실험 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)를 포함하는 분자 각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)의 복합체(GO-MIP composite), 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 분자 각인 중합체(molecular imprinted polymer)의 복합체(GO-MIP composite)를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
상기 '그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)를 포함하는 분자 각인 중합체(molecular imprinted polymer)의 복합체(GO-MIP composite)', '그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 분자 각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)의 복합체(GO-MIP composite)', '그래핀-분자 각인 중합체의 복합체(GO-MIP composite)'는 이하 '복합체' 또는 'GO-MIP composite'과 동일한 것으로 이해되어야 한다.
GO-MIP composite을 합성하기 위하여 분자 각인 중합체를 합성하기 위한 분자 각인 중합 기술(molecular imprinting technique)에서 주형물질 및 단량체 이외에 전도성 그래핀을 포함시켜 중합반응을 진행시킨다. 이때 단량체로는 메타아크릴산(methacrylate acid(MAA)), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA)), 아크릴산(acrylic acid(ACA)), N-비닐 피롤리돈(N-vinyl pyrolidone(NVP)), 아크릴아미드(acrylamide(AAM)), 2-아크릴아미도-2-메틸-프로파노술폰산(2-acrylamido-2-methyl-propanosulfonic acid(AMPS))을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 두 가지 이상의 단량체를 동시에 사용하는 혼합 단량체가 이용될 수 있다. 주형물질은 합성되는 GO-MIP composite의 특성을 결정하는 물질로 본 발명에서는 일 실시예로서 항생제 물질 클로람페니콜(chloramphenicol, CAP)을 사용하여 이것에 대해 선택적으로 결합하는 복합체를 제조한다. 복합체의 중합에 투입 및 포함되는 그래핀은 구체적으로 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)이다. 일 실시예로 시트 형태로 제조된 그래핀 옥사이드를 분자 각인 중합체의 중합 반응에 포함시켜 함께 반응이 진행되도록 한다. 이때 반응에 포함되는 그래핀 옥사이드의 양은 10-90 중량% 범위로 한다. 상기 범위 미만으로 사용할 경우 제조되는 복합체의 전도성이 낮아 센서에 적용하였을 때 감응성이 떨어지게 되는 문제가 있고, 상기 범위를 초과하는 양으로 사용할 경우 복합체의 안정성 및 내구성에 문제가 있을 수 있다.
상기 중합 반응에는 가교제를 포함시켜 사용할 수 있다. 이러한 가교제로는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(ethyleneglycol dimethacrylate(EGMA)), 에틸렌 디메타크릴레이트(ethylene dimethacrylate(EDMA)), N,N-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-methylenebisacrylamide(MBAA)), 디비닐 벤젠(divinyl benzene(DVB))을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 두 가지 이상의 가교제를 동시에 사용하는 혼합 가교제가 이용될 수 있다. 또한 반응의 개시를 위하여 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile(AIBN)), 암모늄 퍼설레이트(ammonium persulfate(APS)), N,N,N ′,N ′-테트라메틸렌디아민(N,N,N ′,N ′-tetramethylenediamine(TEMED))과 같은 개시제를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법으로 제조된 복합체는 주형물질을 포함하고 있는 상태이다. 복합체로부터 주형물질을 제거함으로써 주형물질에 대해 선택적으로 결합하는 복합체의 제조를 완성한다. 이를 위해 일 실시예로 에탄올과 아세트산의 혼합용액을 이용하여 추출한다. 주형물질이 제거된 복합체는 기공의 직경 및 부피가 증가하여 다공성이 향상된다.
다음으로 본 발명은 도 1에 도시된 바와 같이 상기 제조된 복합체를 센서의 제조에 적용하는 방법 및 그로부터 제조되는 센서를 제공한다. 상기 센서를 제작하기 위하여 본 발명에서는 전극 표면에 복합체를 포함하는 용액을 드롭 캐스팅시켜 복합체의 적층 구조물을 형성하는 방법을 사용한다. 그러나 이에 제한되는 것이 아니라 용액의 점도 등에 따라 표적 물질의 검출을 위해 바람직한 두께의 적층 구조를 형성할 수 있는 방법이라면 사용 가능하다. 이때 상기 용액은 바람직하게 그래핀 옥사이드의 양은 10-90 중량% 범위의 농도이며 적층 구조물의 두께는 0.1 μm - 1 mm의 범위로 형성되도록 한다. 농도가 너무 낮거나 높은 경우 바람직한 두께 및 밀도의 적층 구조가 형성되지 않는다. 즉 용액의 농도가 너무 낮은 경우 용액이 전극 표면에서 지나치게 빠르게 퍼져 적당한 두께 및 밀도의 적층 구조가 형성되지 않고, 반대로 농도가 너무 높은 경우 용액이 전극 표면에서 퍼지지 않고 응집되어 응집물을 이루는 문제가 발생한다.
바람직하게 드롭 캐스팅으로 형성된 적층 구조물은 건조 과정을 거쳐 센서의 작업 전극으로 사용한다.
본 발명의 센서는 상기 제조된 전극을 작업 전극으로 사용하고, 센서의 구성을 위해 바람직하게 카운터 전극 및 기준 전극을 포함하는 삼전극계를 사용한다. 작업 전극으로는 금(Au), 백금(Pt) 또는 글래시 카본(GC)을 사용할 수 있고, 카운터 전극 및 기준 전극으로는 각각 백금 와이어를, Ag/AgCl를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 센서로부터 표적 물질의 검출을 위해 도 1에 도시된 바와 같이 순환 전압 전류(cyclic voltammetry, CV)법을 사용한다. 일 실시예로서 도 1의 클로람페니콜의 산화 및 환원 반응에 의해 얻어지는 곡선 'CV 커브' 상의 피크 전류값에 의해 그 농도를 측정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
1. 그래핀 옥사이드 시트의 제조
1 g의 그래파이트(graphite) 분말을 23 ml의 98% H2SO4 에 넣고 실온에서 24시간 교반하였다. 100 mg의 NaNO3을 상기 혼합물에 넣고 30분 간 교반한 후 아이스베스 내에서 5℃ 이하로 보관하였다. 3 g의 KMnO4를 천천히 투입한 후 혼합 용액을 40℃까지 가열 승온하고 30 분간 교반한 후에 46 mL의 물을 넣고 30 분간 반응시켰다. 최종적으로 140 mL의 물 및 10 mL의 30% H2O2를 투입하여 반응을 정지시켰다. 이용되지 않은 그래파이트를 원심분리로 제거한 후 합성된 그래핀 옥사이드를 증류수 내에서 시트 상으로 1 mg/mL의 농도로 분산시켰다. 회색빛의 검은 침전물을 에탄올 및 물로 수차례 세척하였으며, 건조하여 그래핀 옥사이드 시트를 획득하였다.
2. 그래핀 옥사이드 및 클로람페니콜 각인 고분자 복합체(graphene oxide-chloramphenicol(CAP) imprinted polymer composite(GO-MIP composite)) 및 MIP의 합성 및 주형물질의 제거
0.1 mmol의 CAP를 10mL의 tetrahydrofuran(THF, 기공 유도제(porogen))에 용해시킨 후 별도로 준비된 0.4 mmol의 methacrylic acid(MAA, 단위체) 및 2 mmol의 ethyleneglycol dimethacrylate(EGMA, 가교제) 혼합물을 투입하였다. 그런 다음, 8 mg의 azobisisobutyronitrile(AIBN, 폴리머 개시제)를 투입하였다. 55 mg의 그래핀 옥사이드를 상기 혼합물에 분산시키고 10 분간 초음파 처리하였다. 그런 다음 결과물을 물 배쓰 내에서 인큐베이션 한 후 60℃에서 20 시간 동안 천천히 교반하면서 중합 반응을 진행시켰다.
20 시간 후에 상기 제조된 GO-MIP composite으로부터 주형물질을 제거하기 위하여 에탄올로 잔여물을 세척하고, 에탄올: 아세트산(90:10 v/v %) 혼합물로 10 시간 동안 마그네틱 바로 교반하여 추출하였다. 결과물을 아세토니트릴 및 물로 다시 세척한 다음 건조시켰다.
한편 비교를 위하여 상기에서 혼합물에 GO를 투입하는 과정을 생략하는 것을 제외하고 동일한 방법으로 MIP를 합성하였다.
3. 센서의 제작
금 전극 위에 상기 제조된 GO-MIP composite(주형물질 제거 전 및 후) 및 MIP를 적층하여 센서를 제조하였다. 이를 위해 금 전극 표면을 알루미나-물 슬러리로 연마하고 증류수로 세척하였다. 여기에 상기 제조된 GO-MIP composite 및 MIP를 THF(4 mg/mL) 내에 분산시킨 것을 pneumatic dispenser (EFD model 1000XL) 을 이용하여 전극 상으로 드롭 캐스팅하였다. 40℃에서 2시간 건조시켜 균일하고 건조된 층 구조를 갖는 전극 표면을 획득하였다. 이것을 이하 센서의 구성에서 작업 전극으로 사용했다.
실험예
1. GO-MIP composite 표면 평가
상기 합성된 GO-MIP composite 의 표면 특성을 평가하기 위하여 S-4700 II(Hitachi (Tokyo, Japan)를 이용하여 주사전자현미경(Scanning electron micrographs (SEM)) 촬영(Hitachi (Tokyo, Japan) S-4700 II )을 하였다. 도 2a는 비교를 위하여 그래핀 옥사이드 시트를 촬영한 사진이다. 여기서는 산화에 의한 카본 네트워크의 오프닝으로 인하여 주름지고 느슨해진 표면이 확인된다. 다음으로 상기 제작된 센서에서 GO-MIP composite 표면을 촬영한 것을 도 2b 및 도 2c(주형물질 제거 전 및 후)에 나타내었다. 주형물질 제거 후 GO-MIP 복합체 표면에서는 평균 40-50 nm의 직경을 갖는 파티클들이 관찰되었으며 이는 그물 세공과 같은 핀홀을 갖는 다공성 표면을 나타낸 반면, 주형물질 제거 전에는 덜 다공성이며 따라서 좀 더 스무스한 표면을 보였다. 한편 본 발명의 GO-MIP composite 표면의 촬영 사진에서는 주름지고 접혀진 구조가 관찰되지 않았는데 이로부터 GO-MIP composite 은 폴리머 매트릭스 내부로 주형물질(CAP)의 통과가 용이하여 접근성이 용이할 것으로 예상된다. 따라서 본 발명에서 제조된 GO-MIP composite 은 주형물질에 대하여 높은 친화력 및 선택성을 나타낼 수 있다.
2. GO-MIP composite 의 다공성 평가
다음으로 주형물질 제거 전 및 제거 후의 GO-MIP composite 에서의 다공성을 평가하기 위하여 N2 흡착 및 탈착 실험(Brunauer-Emmett-Teller(BET) analysis), TriStar 3000 gas adsorption analyzer (Micromeritics, Norcross, GA, USA))을 하였다. 실험 결과를 도 3에 나타내었다. 또한 이로부터 계산되는 기공의 직경 및 부피를 하기 표 1에 나타내었다.
샘플 BET 표면적 (m2/g) 평균 기공 직경
(BJH 흡착)
(nm)		 기공 부피
(BJH 흡착)
(cm3/g)
GO-MIP
(주형물질 제거 전)

GO-MIP
(주형물질 제거 후) 		393.32



651.20		 4.1



8.6		 0.24



0.75
상기 표로부터 주형물질 제거 후에 GO-MIP composite의 기공들의 평균 직경 및 부피가 향상되어 표면적이 증가하였음을 확인할 수 있다.
3. 센서의 전도성 평가
상기 제작된 센서의 임피던스 및 전도성을 평가하기 위하여 도 4와 같이 bare 금 전극 (a), MIP 센서 (b), GO-MIP 센서(template 제거 전) (c) 및 GO-MIP 센서(template 제거 후) (d)의 electrochemical impedance spectroscopy(EIS) Nyquist plot(CH Instruments electrochemical analyzer 600B, 프리퀀시 범위; 100 mHz-100kHz, 포텐셜; 0.2V, AC 전압; 5 mV)을 얻었다. Bare 금 전극(도 4a)의 경우보다 주형물질 제거 전의 GO-MIP 센서(도 4c)에서 임피던스가 증가하였으나, 주형물질을 제거한 후(도 4d)에는 임피던스가 현저히 감소하였다. 즉 주형물질 제거로 인해 형성되는 기공으로 인해 전자 이동성이 급격히 향상되는 것이다. 반면 MIP 센서(도 4b)에서는 임피던스가 가장 크게 나타났는데 이는 전도성 있는 GO를 포함하지 않음으로 인한 당연한 결과이다.
4. 센서의 전기화학적 특성 평가
Bare 전극, MIP 센서, GO-MIP 센서를 각각 5 μM의 CAP 용액에 4 분간 담그어 두고 물로 세척한 후 0.1 M의 phosphate-buffered saline(PBS 버퍼, pH 7.0) 상에서 50 mV/s의 속도로 스캔하여 도 5와 같은 CV 커브(카운터 전극: Pt 와이어, 기준 전극: Ag/AgCl)를 얻었다. Bare 전극(도 5a)에서는 아무런 피크가 나타나지 않았고, MIP 센서(도 5b)에서는 작은 cathodic 피크(-0.65 V 근처)가 나타났으며, GO-MIP 센서(도 5c)에서는 상기 cathodic 피크가 더욱 크고 분명히 나타났다. 이로부터 MIP 내에 그래핀 옥사이드의 존재는 전자의 이동성을 향상시키고 CAP의 친화력 향상에도 기여함을 알 수 있다.
5. 센서의 최적화
(1) 검출 피크의 선정
한편 GO-MIP 센서에서 얻어진 CAP의 CV 커브(도 6)를 보면 -0.65 V에서의 cathodic 피크(제1 cathodic 피크)는 제1 사이클에서 크게 나타나고 다음 사이클에서는 확연히 줄어들며 이후 -0.06 V에서의 cathodic 피크(제2 cathodic 피크) 및 0.08 V에서의 anodic 피크가 안정적으로 나타나는 것을 발견할 수 있다. 이것은 도 1에 도시된 바와 같은 CAP의 산화 환원 반응의 결과로서 제1 cathodic 피크는 CAP의 니트로 그룹(-NO2)이 하이드록실아민 그룹(-NHOH)으로의 비가역적인 환원에 의한 것이고, 이후에는 하이드록실아민 그룹(-NHOH)과 니트로소 그룹(-NO) 간의 가역적인 산화 및 환원에 의하여 안정적인 제2 cathodic 피크 및 anodic 피크가 나타나는 것이다.
한편 제1 catodic 피크에서의 전류는 anodic 피크 및 제2 catodic 피크보다 크지만 제1 catodic 피크는 산소의 산화에 의해 영향을 받기 쉽다. 따라서 산소의 산화에 의해 영향을 받지 않고 또한 비교적 큰 전류의 흐름이 관찰되는 0.08 V에서의 산화 피크를 CAP의 검출에 사용하는 것이 바람직하다.
(2) 시료 용액 내 dipping time의 최적화
GO-MIP 센서에 대해 5 μM의 CAP를 포함하는 시료 용액에 담그어 두는 시간을 1 분부터 7 분 동안 달리하여 CV 커브를 얻고 anodic 피크에서의 전류를 측정하였다. 그 결과를 도 7A에 나타내었다. 4분 후로는 전류의 크기가 더 이상 증가하지 않는 것을 확인할 수 있다. 따라서 dipping 시간은 4분으로 하였다.
(3) 시료 용액의 pH 결정
GO-MIP 센서에 대해 NaH2PO4-Na2HPO4 의 혼합으로 pH가 5.0 내지 9.0의 범위로 달리 조정된 버퍼 용액 상에서의 CV 커브를 얻고 anodic 피크에서의 전류를 측정하였다. 그 결과 도 7B에서와 같이 pH 6.5 내지 7.5의 범위에서 전류가 크게 나타났다. 이것은 용액의 pH가 5.0 에서 7.0으로 증가할수록 CAP의 -NO2 그룹으로부터 -NHOH 그룹으로의 환원이 증가되고 반면 8.0 또는 9.0으로 상승하면 방해를 받기 때문이다. 따라서 CAP 검출을 위한 용액의 pH는 7.0으로 결정되었다.
6. 센서의 감응성 평가
본 발명의 GO-MIP 센서에 대해 CAP 용액의 농도를 90 nM 에서 0.1 nM으로 변화시키면서 CV 커브를 얻고 anodic 피크에서의 전류를 측정하였다. 각 전류는 제2 사이클에서 측정된 값이고, 각 농도의 측정에서 센서는 에탄올에 의한 elution(6 분)을 시행하여 주형물질 즉 CAP를 제거하였다. 결과를 도 8A 및 8B에 나타내었다. 이를 보면 CAP 농도에 따라 전류값이 선형적으로 증가하며(상관 계수 r2=0.9987), 검출 한계는 35±2pM (R.S.D. < 5%)으로 매우 낮게 나타났다.
7. 방해물질의 영향 평가
시료 용액 내 다른 방해물질에 의한 영향, 즉 본 발명의 GO-MIP 센서에서의 CAP에 대한 선택성을 평가하기 위하여 임상측정 시 주요 방해물질로 작용할 수 있는 티암페니콜(thiamphenicol, TAP), 암피실린(ampicillin, AMP) 테트라사이클린(tetracycline, TET) p-니트로페놀(p-nitrophenol, p-NP), 2,4-디니트로페놀(2,4-dinitrophenol, DNP), 설파디메톡신(sulfadimethoxine, SDM), 아스코브산(ascorbic acid, AA), 요산(uric acid, UA), 리보플라빈(riboflavin, Vit.B2) 및 피리독신(pyridoxine, Vit.B6)을 선택하였다. 도 9는 GO-MIP 센서의 CAP 및 여러 방해물질들의 5 μM 동일 농도에서의 감응성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 상기 모든 방해물질로부터의 신호는 CAP에 비해 현저히 낮게 나타났다. 이로부터 본 발명의 GO-MIP 센서는 방해물질의 존재 하에서도 CAP에 대해 높은 선택성을 가지고 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
8. 우유 샘플에 대한 센서의 성능 평가
0.5, 1.0, 5.0 및 10.0 nM 농도의 CAP 를 포함하는 우유 샘플에 대해 본 발명의 GO-MIP 센서의 성능을 평가하였다. 10 mL의 샘플을 원심 분리기용 튜브에 넣고 적당량의 산을 투입하여 단백질의 침전물을 얻었다. 1000 rpm으로 10 분간 원심분리하여 위층 및 아래층을 버리고 중간층을 여과하였다. 여과된 용액을 0.1 M PBS를 포함하는 셀로 이동하여 GO-MIP 센서로 농도를 측정하고 측정값으로부터 CAP 회수율을 계산하였다.
샘플 CAP ( nM)
첨가량 측정량		 회수율 (%) RSD (%)
1
2
3
4		 0.5 0.48±0.02
1.0 0.97±0.03
5.0 4.90±0.10
10.0 9.51±0.40		 96
97
97
95		 4.16
3.10
2.04
4.20
상기 표로부터 본 발명의 센서는 실제 샘플에 대해 신뢰성 있는 측정 결과를 제공한다는 것을 확인할 수 있다.
9. 센서의 안정성 평가
전해질 내(0.1 M PBS, pH 7.0, 실온)에 장시간 보관한 후 센서의 성능을 테스트함으로써 센서의 안정성을 평가하였다. 그 결과 1주 경과 후 감응성이 96% 보존되었고, 2주 및 3주 경과 후에는 각각 70% 및 50% 보존되었으며, 4주 경과 후 감응성이 손실되었다.
또한 반복 측정에서의 센서의 신뢰성을 평가하기 위하여 하나의 샘플에 대해 10번 반복 측정하였다. 그 결과 0.8%의 RSD를 보였다. 이로부터 본 발명의 센서는 분석 중 센서 전극 표면의 파울링이 일어나지 않으며 따라서 신뢰성 있는 결과를 제공할 수 있음이 확인되었다.
10. 다른 센서와의 감응성 비교
표 3은 CAP 측정에 사용되는 여러 다른 센서들의 검출 한계와 본 발명의 센서에서의 검출 한계를 비교한 것이다.
센서 종류 검출 한계 Reference
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Disposable
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Amperometric immunosensor based on Anti-CAP antibody on CdS modified-dendrimer bonded to the conducting polymer 45 pg/mL
(~ 140pM)		 Kim et al., Biosen. Bioelectron. 25, 2010, 1781
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Boron-doped Diamond Electrode with FIA 0.03 μM Suchada CHUANUWATANAKUL,* Orawon CHAILAPAKUL, Shoji MOTOMIZU, ANALYTICAL SCIENCES APRIL 2008, VOL. 24, 493-498
Ant-CAP immobilized on amino-silane modified beads immunoassay in PDMS channels 8 pM Zhang et al., J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 9862-9867
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LC-ESI-MS-MS		 100 pM Bogusz et al., J. Chromatogr. B, 807 (2004) 343-356
Composite of SWCNTs/AuNPS/Ionic Liquid 1 nM Xiao et al., Anal. Chim. Acta 596, 2007, 79
Graphene-MIP based composite 35pM (based on oxidation peak) 본 발명의 센서
MSA : 머캡토숙신산(mercaptosuccinic acid)
SATUM : 자기조립 티오우레아 모노레이어(Self-assembled thiourea monolayer)
상기 표로부터 본 발명의 센서는 다른 센서들에 비해 매우 낮은 검출한계를 가지는 것임이 확인된다.

Claims (16)

  1. 클로람페니콜(chloramphenicole, CAP) 및 단량체로부터 개시되는 분자 각인 중합체의 중합 과정에 그래핀 옥사이드(GO)를 투입하여 중합 반응시킴으로써 제조되는 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 분자 각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)의 복합체(GO-MIP composite)를 포함하는 용액을 전극 표면에 드롭 캐스팅하여 형성된 적층 구조물을 포함하는 작업전극, 카운터 전극 및 기준전극을 포함하며, 산화 피크로부터 클로람페니콜(chloramphenicole, CAP)을 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  2. 제 1 항에서,
    상기 복합체에 포함되는 그래핀 옥사이드는 10-90 중량% 범위인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에서,
    상기 단량체는 메타아크릴산(methacrylate acid(MAA)), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA)), 아크릴산(acrylic acid(ACA)), N-비닐 피롤리돈(N-vinyl pyrolidone(NVP)), 아크릴아미드(acrylamide(AAM)) 및 2-아크릴아미도-2-메틸-프로파노술폰산(2-acrylamido-2-methyl-propanosulfonic acid(AMPS))을 포함하는 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  6. 제 1 항에서,
    상기 중합 반응에는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(ethyleneglycol dimethacrylate(EGMA)), 에틸렌 디메타크릴레이트(ethylene dimethacrylate(EDMA)), N,N-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-methylenebisacrylamide(MBAA)) 및 디비닐 벤젠(divinyl benzene(DVB))을 포함하는 그룹에서 선택되는 1종 이상의 가교제가 포함되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  7. 제 1 항에서,
    상기 중합 반응에는 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile(AIBN)), 암모늄 퍼설레이트(ammonium persulfate(APS)) 또는 N,N,N′,N′-테트라메틸렌디아민(N,N,N′,N′-tetramethylenediamine(TEMED))의 개시제가 포함되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에서,
    상기 복합체(GO-MIP composite)는 중합 반응 후 클로람페니콜(chloramphenicole, CAP)이 제거된 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  12. 제 1 항에서,
    상기 바이오센서는 pH 6.5 내지 7.5 범위의 시료 용액에 포함된 클로람페니콜의 농도 측정에 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1 항에서,
    상기 작업전극은 바람직하게 금(Au), 백금(Pt) 또는 글래시 카본(GC)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  16. 제 1 항에서,
    상기 적층 구조물의 두께는 0.1 μm - 1 mm 의 범위인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
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