CN106226369B - 一种妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法。本发明所述方法包括以下步骤：以妥曲珠利为模板分子，羧基化β‑环糊精为功能单体，正硅酸四乙酯为交联剂，在酸性条件下反应得到妥曲珠利溶胶印迹聚合物；将还原石墨烯分散液滴涂于铂电极(Φ2mm)上，并于红外灯下晾干；继续将氨基化二氧化钛分散液滴涂于铂电极上，于红外灯下晾干；再将妥曲珠利溶胶印迹聚合物滴涂于铂电极上，于室温晾干；将铂电极置于HCl溶液中，恒温水浴洗脱模板分子，得到妥曲珠利分子印迹电化学传感器。本发明操作简单，涂层牢固，模板分子易于洗脱；制备的分子印迹电化学传感器稳定、重现性好，灵敏度高，选择性好，可应用于食品和饲料中妥曲珠利的检测。

Description

一种妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法
技术领域
本发明属于材料技术领域，涉及一种分子印迹电化学传感器的制备方法，具体涉及妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，可应用于食品、饲料样品中妥曲珠利的检测。
背景技术
妥曲珠利(Toltrazuril)又名甲基三嗪酮，是三嗪酮类抗球虫药物，它能够有效治疗家禽、兔子、猪仔等动物爆发的球虫病，因此应用广泛。妥曲珠利主要的代谢物为妥曲珠利亚矾和妥曲珠利矾，毒理学试验表明妥曲珠利可能有致畸毒性，欧盟规定肉制品中最大残留限量为100-600μg·kg-1，产卵(供消费)的动物不允许用(Jong-Hwan LIM,etal.J.Vet.Med.Sci.,2010,72(8):1085-1087； Committee for medicinal products forveterinary use toltrazuril.EMEA/MRL/907/04 -FINAL,June 2004.)。为此，开发一种简便快速、灵敏、准确的方法用于日常监控食品和饲料中妥曲珠利残留量，具有重要意义。
目前，对于妥曲珠利的快速检测方法有超高效液相色谱-紫外法(UPLC-UV)(Jiang Zhaoling,et al.Chromatographia,2014,77:1705–1712.),高效液相色谱-- 串联质谱法(宫小明等.色谱,2011,29(3):217-222.)，LC-MS/MS法(Wenli Zheng, etal.Journal of Chromatography B,2014,972:89–94；Lianfeng Aia,et al.Journal ofChromatography B,2011,879:1757–1763.)，高效毛细管电泳法(施祖灏等，中国兽药杂志,2008,42(9):13-16.)。这些方法灵敏度和选择性虽然较高，但仪器昂贵、操作需经专门训练，不适合基层实验室推广应用。
电化学检测技术的仪器设备价格便宜，分析速度快，灵敏度高，与分子印迹技术相结合，能大大提高分析方法选择性，因此受到极大关注。分子印迹传感器的制备方法主要有四种：原位引发聚合法(Huiping Bai,et al.Biosensors and Bioelectronics,2015,64:352–358.)、电聚合法(Behzad Rezaein,et al,Biosensors and Bioelectronics,2015,66:490–496；M.L.Yola,Sensors and Actuators B: Chemical,2015,210,149-157.)、溶胶-凝胶法(Guilin Xu,et al.Food Chemistry, 2014,12(097):1-32；S.Güney,et al,Sensors and Actuators B:Chemical,2015, 208:307-314.)、自组装(Zhifeng Zhang,etal,Biosensors and Bioelectronics,2015,68: 556–562.)，其中应用广泛的是电聚合法和溶胶-凝胶法。电聚合法制备的分子印迹传感器具有制备方法简单、膜厚度容易控制等优点，但由于它对模板分子的特异性吸附是基于分子尺寸和电荷排斥效应，功能单体与模板分子以共价键结合导致模板分子非常难洗脱，印迹膜易溶胀，应用受到限制。溶胶—凝胶法制备的分子印迹传感器特异性识别较强、孔径较大、电子传送较快，灵敏度较高，但传感器涂层易脱落、干裂，稳定性差，模板分子洗脱较困难，可逆性和再生性差等问题，缺乏应用前景。
发明内容
为了解决溶胶—凝胶法制备的分子印迹传感器存在的涂层易脱落、干裂，模板分子不易洗脱，稳定性差等问题，本发明的目的在于提供一种妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，所制备的妥曲珠利分子印迹电化学传感器方法简便，模板分子易于洗脱，涂层牢固，结果稳定，重现性好，选择性高，灵敏，能应用于食品和饲料中妥曲珠利残留量的检测。
本发明所述的一种妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其包括以下步骤：A.将β-环糊精(β-CD)置于25mL的圆底烧瓶中，加入3mL NaOH溶液，搅拌使其完全溶解，水浴碱化1h。将1mL氯乙酸溶液缓慢逐滴滴入圆底烧瓶中，水浴反应4h。调节溶液pH值，加入甲醇提取，过滤，烘干，得到羧基化的环糊精。B.将羧基化的β-CD和妥曲珠利溶于水和无水乙醇混合溶剂，超声分散0.5h后密封，于30℃搅拌1h进行预聚合。然后加入正硅酸乙酯，通氮气15min，加入冰醋酸，密封，水浴反应12h，得到妥曲珠利溶胶印迹聚合物。 C.将纳米二氧化钛粉末置于50mL的圆底烧瓶中，加入25mL乙醇和1mL去离子水，超声分散0.5h。加入3.0mL三氨丙基三乙氧基硅烷和1mL去离子水，搅拌混合均匀，调节pH值，通氮气5min，密封，恒温水浴中快速搅拌反应4h，然后在高速离心机上离心30min。沉淀用乙醇洗涤3次，真空干燥，得到氨基化二氧化钛(NH2-TiO2)。D.将还原石墨烯(RGO)溶于N,N-二甲基甲酰胺和壳聚糖醋酸混合溶液，超声分散1h，得到还原石墨烯分散液。用微量移液枪将分散液滴涂于处理好的铂电极(Φ2mm)上，于红外灯下晾干，得到RGO/Pt电极。 E.将氨基化二氧化钛溶于壳聚糖醋酸溶液，超声分散1h，得到氨基化二氧化钛分散液。将分散液滴涂于已晾干的RGO/Pt电极上，于红外灯下晾干，得到 NH2-TiO2/RGO/Pt电极。F.将妥曲珠利溶胶印迹聚合物溶于壳聚糖醋酸溶液，滴涂于NH2-TiO2/RGO/Pt电极上，室温晾干，得到妥曲珠利印迹聚合物电极。G.将妥曲珠利印迹聚合物电极置于HCl溶液中，水浴恒温洗脱模板分子，得到妥曲珠利分子印迹电化学传感器(MIP)。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤A中，β-环糊精(β-CD)的用量为0.5～0.8g，NaOH溶液的浓度为4～6mol·L-1，水浴碱化的温度为35～45℃，氯乙酸水溶液的浓度为0.5～0.7 g·mL-1，水浴反应温度60～70℃，调pH值是用冰醋酸调至中性，烘干是在70～80℃真空干燥箱中进行，干燥时间为24小时。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤B中，羧基化β-CD，妥曲珠利，正硅酸乙酯的摩尔比为1:2:30，无水乙醇加入量为水的三分之一，冰醋酸加入量为无水乙醇的十分之一，水浴温度为55～65℃。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤C中，纳米二氧化钛的用量为0.2～0.3g，调pH值是用冰醋酸调至 pH 3，水浴温度为70～80℃，离心机的转速为10000r·min-1，干燥温度为70～80℃，干燥时间为12-14小时。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤D中，铂电极处理方法为：用0.05μm Al2O3悬浊液在麂皮上将铂电极抛光，然后依次用双蒸水、0.1mol·L-1硫酸、双蒸水各超声清洗3min，室温晾干。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤D中，还原石墨烯(RGO)的质量浓度为1mg·mL-1，溶剂N,N- 二甲基甲酰胺和壳聚糖醋酸溶液的体积比为1:1，壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖溶于 1％醋酸溶液中的浓度为2×10-4g·mL-1，RGO分散液的滴涂量为4～6μL。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤E中，氨基化二氧化钛溶于壳聚糖醋酸溶液中的质量浓度为1 mg·mL-1，壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖溶于1％醋酸溶液中的浓度为2×10-4g·mL-1，分散液的滴涂量为4～6μL。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤F中，妥曲珠利溶胶印迹聚合物溶于壳聚糖醋酸溶液中的质量浓度为0.25g·mL-1，壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖溶于1％醋酸溶液中的浓度为2×10-4 g·mL-1，滴涂量为6～8μL。
根据本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤G中，HCl溶液浓度为0.5mol·L-1，水浴温度为40℃，洗脱时间为20～25min。
与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：
(1)利用壳聚糖粘度高、与各种材料的相容性好，在制备电化学传感器涂层时，将极少量壳聚糖掺杂于涂层材料中，研发出的传感器涂层牢固，稳定性高，结果的重现性好。
(2)基于环糊精独特的内疏水空腔，可与疏水性模板分子妥曲珠利形成包合物，而环糊精外空腔表面具有亲水的羟基基团，与模板分子妥曲珠利存在氢键作用且可逆性好，使制备出的传感器模板分子易于洗脱，分子识别选择性高。
(3)以硅酸四乙酯为交联剂，选择羧基化环糊精为功能单体，进行溶胶- 凝胶缩合反应合成的聚合物，稳定性高；通过醋酸调节体系的pH，控制反应温度等关键措合成的溶胶印迹聚合物，粘度大，以此溶胶印迹聚合物为涂层制备的传感器涂层结合牢固，结果的重现性好。
(4)以还原石墨烯和氨基化二氧化钛修饰铂电极，达到放大信号和提高灵敏度的效果；环糊精独特的筒状空腔结构，使电子通道不易被非导电聚合物层堵塞，电子传送快，本发明制备方法易于控制，可操作性强，制备的传感器灵敏度高。
(5)在合成妥曲珠利溶胶印迹聚合物时，创新性研发出一个新配方，即羧甲基-β-CD、妥曲珠利、正硅酸乙酯的摩尔配比，无水乙醇、水、冰醋酸的加入量，水浴温度控制。按最佳的羧甲基-β-CD、妥曲珠利、正硅酸乙酯的摩尔配比制备的分子印迹传感器，选择性高。
(6)采用本发明所述方法制备的妥曲珠利分子印迹电化学传感器具有模板分子易于洗脱，吸附可逆性好(以0.5mol·L-1HCl作为洗脱液，洗脱时间20～25 min，16～20min吸附达平衡)，电子转移速度快，灵敏度高(检出限(S/N＝3)为0.1 μg·L-1)，选择性高(结构类似物盐酸氨丙啉，磺胺喹噁啉钠，磺胺二甲基嘧啶和地克珠利与空白液的电流响应值的相对误差小于7.5％，500倍K+、Na+、Ca2+、 Mg2+、Cu2+、Fe3+、PO4 2-、Cl-、SO4 2-离子和50倍葡萄糖不干扰测定，相对误差小于5％，)，重现性和稳定性好(同一传感器重复使用6次，测定结果的相对标准偏差为4.4％；将传感器每天用于测定一次，连续十天，传感器的响应值与第一次相比下降11.3％)等优点，因此可广泛应用于食品和饲料等样品的快速检测分析。
附图说明
图1是本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备示意图。
图2是本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的差分脉冲曲线。曲线中a.还原石墨烯/氨基化二氧化钛修饰的电极；b.未洗脱模板分子的印迹电极； c.还原石墨烯修饰的电极；d.裸电极；e.洗脱模板分子后的印迹电极；f.在212.7 μg·L-1妥曲珠利标准溶液中孵化15min后的印迹电极。
图3是本发明所述的不同洗脱时间下的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的差分脉冲曲线。曲线a～i分别表示不同的洗脱时间：a.0min；b.3min；c.6min； d.9min；e.12min；f.15min；g.18min；h.20min；i.25min。
图4是本发明所述的不同吸附时间下的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的差分脉冲曲线。曲线(a～f)表示：a.0min；b.4mim；c.8min；d.12min；e.16min； f.20mim。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不限制于这些实施例。
实施例1：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备
本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备示意图如图1所示，制备方法包括以下步骤：
(1)将0.5gβ-环糊精(β-CD)置于25mL的圆底烧瓶中，加入3mL 4mol·L-1 NaOH溶液，搅拌使其完全溶解，35℃水浴碱化1h。将1mL0.50g·mL-1氯乙酸水溶液缓慢逐滴滴入圆底烧瓶中，于60℃的水浴中反应4h。用冰乙酸将pH 值调至中性，加入甲醇提取，过滤，70℃烘干，得到羧基化环糊精。
(2)将0.30g羧甲基-β-CD和0.054g妥曲珠利溶于6mL水和2mL无水乙醇混合溶剂，超声分散0.5h，密封，于30℃搅拌1h进行预聚合。加入846μL 正硅酸乙酯，通氮气15min后加入200μL冰醋酸，密封，60℃水浴反应12h，得到妥曲珠利溶胶印迹聚合物。
(3)将0.2g纳米二氧化钛粉末置于50mL的圆底烧瓶中，加入25mL乙醇和1mL去离子水，超声分散0.5h。加入3.0mL三氨丙基三乙氧基硅烷和1mL 去离子水，搅拌混合均匀，调节pH＝3，通氮气5min，密封，70℃恒温水浴中快速搅拌反应4h,然后在10000r·min-1高速离心机上离心30min。沉淀用乙醇溶液洗涤3次，70℃真空干燥12h，得到氨基化二氧化钛(NH2-TiO2)。
(4)将10mg还原石墨烯(RGO)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺和5mL 壳聚糖醋酸混合溶液，超声1h使其分散，得到还原石墨烯分散液。用微量移液枪将5μL分散液滴涂于处理好的铂电极(Φ2mm)上，于红外灯下晾干，得到 RGO/Pt电极。将10mg氨基化二氧化钛溶于10mL壳聚糖醋酸溶液，超声1h，得到氨基化二氧化钛分散液。将5μL分散液滴涂于已晾干的RGO/Pt电极上，于红外灯下晾干，得到NH2-TiO2/RGO/Pt电极。将0.25g妥曲珠利溶胶印迹聚合物溶于1mL壳聚糖醋酸溶液，用玻璃棒搅拌均匀后，取6μL滴涂于 NH2-TiO2/RGO/Pt电极上，室温晾干，得到妥曲珠利印迹聚合物电极。
(5)将妥曲珠利印迹聚合物电极置于0.5mol·L-1HCl溶液中，在40℃水浴中搅拌20min洗脱模板分子，得到妥曲珠利分子印迹电化学传感器(MIP)。
实施例2：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备
(1)将0.65gβ-环糊精(β-CD)置于25mL的圆底烧瓶中，加入3mL 5 mol·L-1NaOH溶液，搅拌使其完全溶解，40℃水浴碱化1h。将1mL 0.60g·mL-1氯乙酸水溶液缓慢逐滴滴入圆底烧瓶中，于65℃的水浴中反应4h，然后用冰乙酸将pH值调至7，加入甲醇提取，过滤，75℃烘干，得到羧基化的环糊精。
(2)将0.15g羧甲基-β-CD和0.027g妥曲珠利溶于3mL水和1mL无水乙醇混合溶剂，超声分散0.5h，密封，于30℃搅拌1h进行预聚合。再加入423 μL正硅酸乙酯，通氮气15min后加入100μL冰醋酸，密封，55℃水浴反应12h，得到妥曲珠利溶胶印迹聚合物。
(3)将0.25g纳米二氧化钛粉末置于50mL的圆底烧瓶中，加入25mL乙醇和1mL去离子水，超声分散0.5h。加入3.0mL三氨丙基三乙氧基硅烷和1mL 去离子水，搅拌混合均匀，调节pH＝3，通氮气5min，密封，75℃恒温水浴中快速搅拌4h,然后在10000r·min-1高速离心机上离心30min。沉淀用乙醇溶液洗涤3次，75℃真空干燥14h，得到氨基化二氧化钛(NH2-TiO2)。
(4)将6mg还原石墨烯(RGO)溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺和3mL壳聚糖醋酸混合溶液，超声1h使其分散，得到还原石墨烯分散液。用微量移液枪将4μL分散液滴涂于处理好的铂电极(Φ2mm)上，于红外灯下晾干，得到RGO/Pt 电极。将5mg氨基化二氧化钛溶于5mL壳聚糖醋酸溶液，超声1h，得到氨基化二氧化钛分散液。将4μL分散液滴涂于已晾干的RGO/Pt电极上，于红外灯下晾干，得到NH2-TiO2/RGO/Pt电极。将0.25g妥曲珠利溶胶印迹聚合物溶于1mL壳聚糖醋酸溶液，用玻璃棒搅拌均匀后，取6μL滴涂于NH2-TiO2/RGO/Pt 电极上，室温晾干，得到妥曲珠利印迹聚合物电极。
(5)将妥曲珠利印迹聚合物电极置于0.5mol·L-1HCl溶液中，在40℃水浴中搅拌23min洗脱模板分子，得到妥曲珠利分子印迹电化学传感器(MIP)。
实施例3：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备
(1)将0.8gβ-环糊精(β-CD)置于25mL的圆底烧瓶中，加入3mL 6mol·L-1 NaOH溶液，搅拌使其完全溶解，45℃水浴碱化1h。将1mL0.70g·mL-1氯乙酸水溶液缓慢逐滴滴入圆底烧瓶中，于70℃的水浴中反应4h，然后用冰乙酸将 pH值调至中性，加入甲醇提取，过滤，80℃烘干，得到羧基化的环糊精。
(2)将0.60g羧甲基-β-CD和0.107g妥曲珠利溶于12mL水和4mL无水乙醇混合溶剂，超声分散0.5h，密封，于30℃搅拌1h进行预聚合。再加入1.7 mL正硅酸乙酯，通氮气15min后加入400μL冰醋酸，密封，水浴反应12h，得到妥曲珠利溶胶印迹聚合物。
(3)将0.3g纳米二氧化钛粉末置于50mL的圆底烧瓶中，加入25mL乙醇和1mL去离子水，超声分散0.5h。加入3.0mL三氨丙基三乙氧基硅烷和1mL 去离子水，搅拌混合均匀，调节pH＝3，通氮气5min，密封，80℃恒温水浴中快速搅拌4h，然后在10 000r·min-1高速离心机上离心30min。沉淀用乙醇溶液洗涤3次，80℃真空干燥12h，得到氨基化二氧化钛(NH2-TiO2)。
(4)将12mg还原石墨烯(RGO)溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺和6mL 壳聚糖醋酸混合溶液，超声1h使其分散，得到还原石墨烯分散液。用微量移液枪将6μL分散液滴涂于处理好的铂电极(Φ2mm)上，于红外灯下晾干，得到 RGO/Pt电极。将10mg氨基化二氧化钛溶于10mL壳聚糖醋酸溶液，超声1h，得到氨基化二氧化钛分散液。将6μL分散液滴涂于已晾干的RGO/Pt电极上，于红外灯下晾干，得到NH2-TiO2/RGO/Pt电极。将0.25g妥曲珠利溶胶印迹聚合物溶于1mL壳聚糖醋酸溶液，用玻璃棒搅拌均匀后，取8μL滴涂于 NH2-TiO2/RGO/Pt电极上，室温晾干，得到妥曲珠利印迹聚合物膜电极。
(5)将妥曲珠利印迹聚合物膜电极置于0.5mol·L-1HCl溶液中，在40℃水浴中搅拌25min洗脱模板分子，得到妥曲珠利分子印迹电化学传感器(MIP)。
实施例4：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的电子传递、灵敏度和选择性识别
差分脉冲法表征：将实施例2制备妥曲珠利分子印迹电化学传感器的每一涂层进行差分脉冲曲线表征，如图2所示。以含0.5mol·L KCl的5mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]溶液为电子传递媒介，经还原石墨烯和氨基化二氧化钛修饰的电极 (曲线a)的氧化峰电流＞经还原石墨烯修饰的电极(曲线c)的氧化峰电流＞裸电极(e)的氧化峰电流，说明还原石墨烯具备优良的导电性能和大的比表面积，能促进了Fe(CN)6 3-/4-的反应，提高灵敏度，而氨基化二氧化钛能催化 Fe(CN)6 3-/4-的反应，从而进一步增大峰电流信号；经妥曲珠利印迹聚合物修饰的电极在未洗脱模板分子前的差分脉冲曲线中没有出现氧化峰(曲线f)，说明在电极表面修饰一层聚合物薄膜后阻碍了K3[Fe(CN)6]向电极表面的扩散；经妥曲珠利印迹聚合物修饰的电极在洗脱模板分子后的差分脉冲曲线出现了氧化峰(曲线 b)，其氧化峰电流＞经修饰还原石墨烯的电极(曲线c)的氧化峰电流，说明洗脱模板分子后的印迹膜表面形成了大量“空穴”，使大量K3[Fe(CN)6]可以通过“空穴”到达电极的表面发生氧化还原反应，提高了检测灵敏度；将洗脱模板分子后的电极在浓度为212.7μg·L-1的妥曲珠利标准溶液中孵化15min后(曲线d)，峰电流下降，说明电极表面的“空穴”不同程度被模板分子占据，峰电流降低，也说明电极表面的“空穴”对模板分子具有选择性识别能力。
实施例5：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的模板分子洗脱、吸附性能
采用实施例2所制备的妥曲珠利分子印迹聚合物膜电极进行以下实验。
(1)以0.5mol·L-1HCl作为洗脱液，将未洗脱模板的妥曲珠利分子印迹聚合物膜电极在40℃的洗脱液中洗脱不同时间后，取出电极用超纯水冲洗，然后在5mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶液中进行DPV扫描，结果见图2。随着洗脱时间的增加，越来越多的模板分子被洗脱下来，使电极表面有更多的孔穴产生，为 K3[Fe(CN)6]到达电极表面打通了通道，从而形成了越来越大的峰电流信号，在 20～25min峰电流信号达最大(曲线i)，再增加洗脱时间峰电流变化不明显，说明此时电极表面的模板分子已经洗脱完全，形成的孔穴也较稳定。
(2)将制备好的分子印迹膜电极在浓度为212.7μg·L-1的妥曲珠利标准溶液中进行孵化，孵化后在5mmol·L-1K3[Fe(CN)6溶液中进行DPV扫描，每隔5min 测量一次,结果见3。随着孵化时间的增加，峰电流值不断减小，在0～16min内峰电流变化明显，经过16min后峰电流减小的趋势变缓，20min的峰电流大小与16min的相差不大，说明此时吸附已达平衡。
以上结果说明制备的妥曲珠利分子印迹电化学传感器具有模板分子易于洗脱，吸附可逆性好。
实施例6：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的稳定性和重现性
采用实施例2所制备的妥曲珠利分子印迹电化学传感器进行以下实验。
将MIP分子印迹传感器用于212.7μg·L-1的妥曲珠利溶液中平行测定6次，测定的峰电流值与空白溶液的峰电流值之差Δi分别为19.62、22.32、22.16、20.93、 21.86、20.15μA，其相对标准偏差为4.4％，结果表明该传感器具有良好的重现性。将MIP分子印迹传感器浸泡在水中保存于4℃的冰箱中，每天用于测定浓度为212.7μg·L-1妥曲珠利溶液1次，起始电流响应值Δi为21.17μA。连续测定五天后，该传感器所测得的Δi为19.54μA，相对误差7.7％；连续测定十天后，该传感器所测得的相对电流值Δi为18.78μA，相对误差为11.3％，表明该传感器具有较好的稳定性。
实施例7：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的选择性
采用实施例2所制备的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的进行以下实验。
探究妥曲珠利的结构类似物盐酸氨丙啉，磺胺喹噁啉钠，磺胺二甲基嘧啶和地克珠利以及食品、饲料中常见离子K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、PO4 2-、Cl-、SO4 2-和葡萄糖等对浓度为212.7μg·L-1妥曲珠利溶液测定的影响(表1和表 2)。由表1可见，盐酸氨丙啉、磺胺喹噁啉钠、地克珠利的选择因子分别为0.21、 0.24、0.23，与空白溶液的电流响应值的相对误差小于7.5％，说明妥曲珠利分子印迹电化学传感器的选择性高。由表2可见，在食品、饲料中常见离子和葡萄糖等物质共存条件下，测定结果的相对误差均≤±5％，表明这些共存组分均不干扰测定，说明传感器对妥曲珠利的测定具有高的选择性。
表1：妥曲珠利分子印迹电化学传感器的选择性(n＝3)
表2：共存离子对检测的干扰结果(n＝3)
实施例8：本发明所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器应用于测定鸡蛋和饲料中妥曲珠利残留量。
采用实施例2所制备的妥曲珠利分子印迹电化学传感器进行以下实验。
实验材料：鸡蛋(购自肇庆学院市场)，饲料购自广东肇庆联合饲料公司。
(1)称取10.00g鸡蛋样品于50mL的烧杯中，加入10mL水，20mL乙腈混匀后超声提取20min，然后以5000r·min-1离心10min，收集上清液。沉淀用水5mL、10mL乙腈重复提取一次。合并上清液于分液漏斗中，加入30mL 正己烷，振荡摇匀3min，静置后收集水层，进行电化学分析。同时进行加标回收试验。
(2)称取10.00g饲料样品于50mL烧杯中，加入40mL乙腈溶液，搅拌均匀后超声提取10min，静置1min，取上层提取液约30mL转入离心管，以5 000 r·min-1离心10min，上清液进行电化学分析。同时进行加标回收试验。
(3)测定结果见表3。在鸡蛋和饲料中均未检出妥曲珠利，鸡蛋的平均加标回收率为94.5％-97.9％，饲料的平均加标回收率为98.5％-104％，相对标准偏差2.4～4.2％，表明该印迹传感器具有高的精确性和准确性，能应用于实际复杂样品中的检测。
表3：样品中妥曲珠利的测定结果(n＝3)
“–”表示未检测出。

Claims (9)

1.一种妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A．将β-环糊精即β-CD置于25 mL的圆底烧瓶中，加入3 mL NaOH溶液，搅拌使其完全溶解，水浴碱化1 h；将1 mL氯乙酸溶液缓慢逐滴滴入圆底烧瓶中，水浴反应4 h；调节溶液pH值，加入甲醇提取，过滤，烘干，得到羧基化的环糊精；
B．将羧基化的β-CD和妥曲珠利溶于水和无水乙醇混合溶剂，超声分散0.5 h后密封，于30℃搅拌1 h进行预聚合；然后加入正硅酸乙酯，通氮气15 min，加入冰醋酸，密封，水浴反应12 h，得到妥曲珠利溶胶印迹聚合物；
C．将纳米二氧化钛粉末置于50 mL的圆底烧瓶中，加入25 mL乙醇和1 mL去离子水，超声分散0.5 h；加入3.0 mL三氨丙基三乙氧基硅烷和1 mL去离子水，搅拌混合均匀，调节pH值，通氮气5 min，密封，恒温水浴中快速搅拌反应4 h，然后在高速离心机上离心 30 min；沉淀用乙醇洗涤3次，真空干燥，得到氨基化二氧化钛即NH2-TiO2；
D．将还原石墨烯即RGO溶于N,N-二甲基甲酰胺和壳聚糖醋酸混合溶液，超声分散1 h，得到还原石墨烯分散液；用微量移液枪将分散液滴涂于处理好的铂电极上，于红外灯下晾干，得到RGO/Pt电极；
E．将氨基化二氧化钛溶于壳聚糖醋酸溶液，超声分散1 h，得到氨基化二氧化钛分散液；将分散液滴涂于已晾干的RGO/Pt电极上，于红外灯下晾干，得到NH2-TiO2/RGO/Pt电极；
F．将妥曲珠利溶胶印迹聚合物溶于壳聚糖醋酸溶液，滴涂于NH2-TiO2/RGO/Pt电极上，室温晾干，得到妥曲珠利印迹聚合物膜电极；
G．将妥曲珠利印迹聚合物膜电极置于HCl溶液中，水浴恒温洗脱模板分子，得到妥曲珠利分子印迹电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，β-环糊精即β-CD的用量为0.5~0.8 g，NaOH溶液的浓度为4~6 mol·L-1，水浴碱化的温度为35~45℃，氯乙酸水溶液的浓度为0.5~0.7 g·mL-1，水浴反应的温度60~70℃，调pH值是用冰醋酸调至中性，烘干是在70~80℃真空干燥箱中进行，干燥时间为24小时。
3.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤B中，羧基化β-CD、妥曲珠利、正硅酸乙酯的摩尔比为1:2:30，无水乙醇加入量为水的三分之一，冰醋酸加入量为无水乙醇的十分之一，水浴温度为55~65℃。
4.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤C中，纳米二氧化钛的用量为0.2~0.3 g，调pH值是用冰醋酸调至pH 3，水浴温度为70~80℃，离心机的转速为10000 r·min-1，干燥温度为70~80℃，干燥时间为12-14小时。
5.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤D中，铂电极处理方法为：用0.05 μm Al2O3悬浊液在麂皮上将铂电极抛光，然后依次用双蒸水、0.1 mol·L-1硫酸、双蒸水各超声清洗3 min，室温晾干。
6.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤D中，还原石墨烯即RGO的质量浓度为1 mg·mL-1，溶剂N,N-二甲基甲酰胺和壳聚糖醋酸溶液的体积比为1:1，壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖溶于1%醋酸溶液中的浓度为2×10-4 g·mL-1，RGO分散液的滴涂量为4~6 μL。
7.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤E中，氨基化二氧化钛溶于壳聚糖醋酸溶液中的质量浓度为1 mg·mL-1，壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖溶于1%醋酸溶液中的浓度为2×10-4 g · mL-1，分散液的滴涂量为4~6 μL。
8.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤F中，妥曲珠利溶胶印迹聚合物溶于壳聚糖醋酸溶液中的质量浓度为0.25 g·mL-1，壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖溶于1%醋酸溶液中的浓度为2×10-4 g·mL-1，滴涂量为6~8 μL。
9.根据权利要求1所述的妥曲珠利分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤G中，HCl溶液浓度为0.5 mol·L-1，水浴温度为40 ℃，洗脱时间为20~25 min。
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