KR101519200B1 - Novel carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 퍼셉포넬라 마리나 EX-H1 유래의 신규한 탄산무수화효소 및 이의 용도에 관한 것으로, 해양 미세조류에서 분리한 신규한 탄산무수화효소는 이산화탄소 수화 활성 및 열적 안정성이 우수하여 이산화탄소 포집 및 고정화에 사용할 수 있고, 바이카보네이트 화합물 제조에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 유용 대사 산물 합성 시 촉매로 사용되어 합성 수율을 높을 수 있다. 또한, 상기 탄산무수화효소의 N-말단의 시그널 펩타이드를 제거함으로써 수용성 발현율과 효소 활성을 증가시킬 수 있다. The present invention relates to a novel carbonic anhydrase derived from Persephonella marina EX-H1 and its use. The novel carbonic anhydrase isolated from marine microalgae has excellent carbon dioxide hydration activity and thermal stability, Can be used for immobilization, can be used not only for the production of bicarbonate compounds but also as a catalyst for the synthesis of useful metabolites, thereby increasing the synthesis yield. In addition, by removing the N-terminal signal peptide of the carbonic anhydrase, the water-soluble expression rate and enzyme activity can be increased.
Description
본 발명은 퍼셉포넬라 마리나 EX-H1 유래의 신규한 탄산무수화효소 및 이의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel carbonic anhydrase derived from Persephonella marina EX-H1 and its use.
탄산무수화효소(carbonic anhydrase, CA)는 하기 반응식과 같은 반응을 촉매하는 효소로 척추동물의 적혈구를 비롯하여 많은 동물의 여러 조직, 식물의 잎 등에서 관찰되고 실물에서는 광합성에 관계한다고 알려져 있으며, 현재 알려져 있는 효소 가운데 분자 활성이 가장 커서 효소 1분자당 3.6×107개의 기질을 변화시킬 수 있는 능력이 있다.Carbonic anhydrase (CA) is an enzyme that catalyzes the reaction as shown in the following reaction formula. It is known that it is involved in photosynthesis in a variety of tissues, plant leaves, and the like of many animals including red blood cells of vertebrate animals. The enzyme has the greatest molecular activity and is capable of changing 3.6 × 10 7 substrates per enzyme molecule.
CO2 + H2O ↔ HCO3 - + H+ CO 2 + H 2 O ↔ HCO 3 - + H +
해양 미세조류를 이용한 CO2 고정에는 CO2의 농도가 높을 경우 CA의 발현이 이루어지지 않기 때문에 CO2 농도와는 무관하게 CA를 대량 생산할 수 있는 시스템을 구성한다면, CO2와의 반응 친화도 및 반응성을 향상시켜 대기 중 CO2 농도를 낮추는데 더욱 효과적으로 작용할 것으로 기대된다. CA를 활용한 CO2 고정화 공정 개발의 경우, 주로 추출 생산한 CA를 이용하여 고정화 반응기를 설계, 활용하는 소수의 연구가 시작 단계에 있다. 하지만, 효소 추출로서는 단가가 비싸고 효소 고정화에 드는 비용을 감안할 때, 고기능성의 CA를 발굴하고 재조합 미생물 기반의 CA를 대량 생산하는 연구가 중요하다. 최근 미국 연구 결과에 의하면 기존의 CO2 포획 기술에 생촉매 CA를 활용할 경우 그 효율성이 크게 높아지는 것으로 보고되어 있다. Marine microalgae of CO 2 fixed by there if you configure a system capable of producing large quantities irrespective of the CA and the CO 2 concentration because no expression when the concentration of CO 2 CA made, even and reactive responses affinity with CO 2 And to lower the CO 2 concentration in the atmosphere. In the case of developing a CO 2 immobilization process using CA, a small number of studies are in the initial stages of designing and utilizing immobilized reactors mainly using extracted CAs. However, considering the cost of enzyme digestion and the cost of enzyme immobilization, it is important to search for highly functional CAs and mass-produce CAs based on recombinant microorganisms. Recent US studies have shown that the efficiency of using biocatalyst CAs for existing CO 2 capture techniques is greatly increased.
따라서, 향후 CA에 대한 수요는 더욱 높아질 것으로 예상되며, 고기능의 CA 발굴과 CA 대량생산 관련 기술들은 미래 CO2 고정화, 저감 제거 및 전환 활용 기술들을 현실화하는데 중요한 기반 기술로 기대된다.
Therefore, the demand for CA is expected to be higher in the future, and technologies for high-performance CA discovery and CA mass production are expected to be important technologies for realizing future CO 2 immobilization, abatement and conversion technologies.
본 발명의 목적은 해양 열수 환경에서 생존하는 미세조류 유래의 신규한 탄산무수화효소, 이의 용도 및 상기 탄산무수화 효소의 수용성 발현 또는 효소 활성을 증가하는 방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a novel carbonic anhydrase derived from microalgae which survive in an ocean hydrothermal environment, its use and a method for increasing the aqueous expression or enzyme activity of said carbonic anhydrase.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 4에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)를 포함하는 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for capturing or fixing carbon dioxide, which comprises a carbonic anhydrase represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 do.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 포함하는 이산화탄소의 포집 및 고정 장치를 제공한다.The present invention also provides an apparatus for collecting and fixing carbon dioxide which comprises a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물이 고정화(immobilization) 된 이산화탄소의 포집 및 고정용 센서를 제공한다.The present invention also provides a sensor for capturing and fixing carbon dioxide in which a composition for trapping or fixing carbon dioxide according to the present invention is immobilized.
본 발명은 또한 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 반응시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 포집 또는 고정 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for trapping or fixing carbon dioxide comprising the step of reacting a carbon dioxide saturated solution with a composition for trapping or fixing carbon dioxide according to the present invention.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물 제조용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for producing a bicarbonate or a carbonate compound comprising a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention.
본 발명은 또한 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 반응시키는 단계; 및 상기에서 얻은 반응물과 알칼리 양이온염을 반응시켜 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a process for the production of carbon dioxide, comprising the steps of: reacting a carbon dioxide saturated solution with a composition for trapping or fixing carbon dioxide according to the present invention; And reacting the reactant obtained above with an alkali cationic salt to produce an amorphous bicarbonate or carbonate compound. The present invention also provides a method for producing a bicarbonate or a carbonate compound.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 대사 산물 생산용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for producing metabolites using bicarbonate or carbon dioxide, which comprises a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention.
본 발명은 또한 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 C4 대사 또는 지질 대사에서 촉매로 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 사용하여 대사 산물을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a metabolite using a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention as a catalyst in C4 metabolism using bicarbonate or carbon dioxide or as a catalyst in lipid metabolism.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2에 기재된 염기 서열로 표시되는 탄산무수화효소의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 대량 생산 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for mass production of carbonic anhydrase, comprising the step of preparing a recombinant vector comprising a coding sequence of a carbonic anhydrase represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
본 발명은 또한 탄산무수화효소의 코딩 서열에서 N-말단의 시그널 펩타이드가 결실되어 있는 SEQ ID NO: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 수용성 발현 또는 효소 활성을 증가하는 방법을 제공한다.
The present invention also relates to a method for producing a soluble expression of a carbonic anhydrase, comprising the step of producing a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 wherein the N-terminal signal peptide is deleted in the coding sequence of the carbonic anhydrase Or < / RTI > increased enzyme activity.
본 발명은 해양 열수 환경에서 생존하는 미세조류 유래의 신규한 탄산무수화효소를 제공한다. 상기 탄산무수화효소는 이산화탄소 고정화 활성 및 열적 안정성이 우수하여 이산화탄소 포집 또는 고정화함으로써 이산화탄소를 감축 또는 제거할 수 있다. The present invention provides a novel carbonic anhydrase derived from microalgae that survive in a marine hydrothermal environment. The carbonic anhydrase has excellent carbon dioxide immobilization activity and thermal stability, so that carbon dioxide can be reduced or removed by capturing or fixing the carbon dioxide.
또한, 이산화탄소는 상기 탄산무수화효소에 의해 바이카보네이트로 전환되어 알칼리 양이온 처리 시 바이카보네이트 화합물로 회수되어 건자재 또는 제지용 재료 등 다양한 산업용 원료로 활용될 수 있다. In addition, carbon dioxide can be converted to bicarbonate by the carbonic anhydrase and recovered as a bicarbonate compound upon alkali cation treatment, and thus it can be utilized as various industrial raw materials such as building materials or papermaking materials.
또한, 상기 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 C4 대사 또는 Malonyl CoA로의 지질 대사에서 효소 활성이 우수한 상기 탄산무수화효소를 촉매로 사용하여 유용 대사 산물을 생산할 수 있다.
In addition, useful metabolites can be produced by using the carbonic anhydrase having excellent enzyme activity in the lipid metabolism of C4 metabolism using bicarbonate or carbon dioxide or malonyl CoA as a catalyst.
도 1은 본 발명에 따른 PM-aCA 유전자 서열(A), 대장균 발현생산을 위한 코돈 최적화 유전자 서열(B) 및 PM-aCA의 아미노산 서열(C)을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 PM-aCA의 유전자 서열에서 N-말단에 존재하는 시그널 펩타이드를 제거한 성숙형 PM-aCA 유전자 서열(mPM-aCA)(A, B) 및 상기 mPM-aCA의 아미노산 서열(C)을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 PM-aCA 단백질의 최적 대장균 발현을 위해 구성한 유전자 벡터 및 벡터 유전자 확인 결과(A), PM-aCA 과발현 확인 결과(B), 20℃에서 배양된 PM-aCA 균체로부터 가용성 발현 회수 후 단백질의 발현(C) 및 정제 결과(D)를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 성숙형 mPM-aCA 단백질의 대장균 발현을 위해 구성한 유전자 벡터(A), 벡터에 유전자 존재 확인 결과(B), mPM-aCA 단백질의 가용성 분획에서의 과발현 확인 및 정제 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 PM-aCA와 mPM-aCA의 CO2 수화 활성 비교 결과이다.
도 6 및 7은 본 발명에 따른 mPM-aCA의 열적 안정성을 확인한 결과이다.Fig. 1 shows the PM-aCA gene sequence (A) according to the present invention, the codon-optimized gene sequence (B) for producing E. coli expression, and the amino acid sequence (C) of PM-aCA according to the present invention.
FIG. 2 shows the mature PM-aCA gene sequence (mPM-aCA) (A, B) in which the signal peptide existing at the N-terminus is removed from the gene sequence of PM-aCA according to the present invention and the amino acid sequence of mPM- C).
FIG. 3 is a graph showing the results of (A) confirming the gene vector and the vector gene constructed for the optimal E. coli expression of PM-aCA protein according to the present invention, (B) confirming overexpression of PM-aCA, (C) and purification results (D) of the protein after expression recovery.
FIG. 4 is a graph showing the results of gene expression confirmation (B) for the expression of the mature mPM-aCA protein according to the present invention in E. coli, the overexpression of the mPM-aCA protein in the soluble fraction, C).
Figure 5 shows the results of comparing the CO 2 hydration activity of PM-aCA and mPM-aCA according to the present invention.
6 and 7 are the results of confirming the thermal stability of mPM-aCA according to the present invention.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.
본 발명자들은 구조가 알려진 네이세리아 고노로에세(Neisseria gonorrhoeae) 유래의 알파형 탄산무수화효소(alpha-type CA, PDB ID: 1KOP)를 기준으로 단백질 데이터베이스로부터 신규 CA 기능의 후보 단백질을 탐색하였다. 탐색 결과 해양 열수 환경에 존재하는 그람 음성, 호열성 진정세균인 산수균류에 속하는 퍼셉포넬라 마리나(Persephonella marina) EX-H1에서 기능이 알려져 있지 않지만 알파형 CA와 구조적으로 유사한 신규 단백질 유전자를 확보하고 PM-aCA이라 명명하였다. 위의 유전자서열을 대장균(E. coli)에서 최적 발현될 수 있도록 유전자를 최적화한 후 대장균(E. coli)에서 발현시킨 결과 과발현이 유도되었고 알파 타입의 CA 활성을 나타내었다. 또한 PM-aCA 유전자 서열 중에 N-말단에 존재하는 시그널 펩타이드를 제거함으로써 대장균(E.coli)에서 단백질의 수용성 발현율을 높일 수 있었다. 활성측면에서 시그널 펩타이드를 제거한 성숙형의 mPM-aCA가 활성이 제거하지 않은 전구체형 PM-aCA에 비해 13배 이상 높았다. 또한, 성숙형의 mPM-aCA는 높은 온도에서도 활성을 유지하는 뛰어난 열적 안정성 특징을 나타냈다. 따라서, 본 발명은 아직 결정되지 않은 가설 단백질(hypothetical protein)을 코돈 최적 발현을 통해 생산하고 특성화를 통해 CA의 기능성이 있음을 확인하였다. 특히, 발현된 단백질은 열적 안정성이 뛰어난 CA임을 확인하였으며 이의 생산을 통해 CO2 포획 기술 공정 개발 등에 활용이 기대된다.The present inventors have searched for a novel CA function candidate protein from the protein database based on alpha-type CA (PDB ID: 1 KOP) derived from Neisseria gonorrhoeae whose structure is known . As a result of the research, Persephonella spp. Belonging to the acidic fungi, Gram-negative, marina ) A novel protein gene whose structure is similar to that of alpha-type CA was isolated and named PM-aCA in EX-H1. E. coli the gene sequence of the above and then optimize the gene to be expressed in the best (E. coli) Escherichia coli (E. coli) was the result of over-expression was induced expression in CA exhibited activity of the alpha type. Also, by removing the signal peptide present at the N-terminus in the PM-aCA gene sequence, the water-soluble expression rate of the protein in E. coli could be increased. The mature form of mPM-aCA, from which the signal peptide was removed from the active side, was 13-fold more potent than the precursor PM-aCA without activity. In addition, mature forms of mPM-aCA exhibit excellent thermal stability characteristics that maintain activity at elevated temperatures. Therefore, the present invention produces hypothetical proteins that have not yet been determined through optimal codon expression, and it has been confirmed that the CA functions through the characterization. In particular, the expressed protein was confirmed to be a CA with excellent thermal stability, and its production is expected to be utilized in the development of CO 2 capture technology.
따라서 본 발명은 CO2 수화 활성 및 열적 안정성을 나타내는 신규 알파형 탄산무수화효소, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a novel alpha-type carbonic anhydrase exhibiting CO 2 hydration activity and thermal stability, a method for its production, and its use.
본 발명에 따른 탄산무수화효소는 SEQ ID NO: 1 또는 4에 기재된 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한 상기 탄산무수화효소는 SEQ ID NO: 1 또는 4에 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 서열 상동성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 탄산무수화효소가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교 시 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다.The carbonic anhydrase according to the present invention may be represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4. The above-mentioned carbonic anhydrase has not only the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 4, but also a homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more , 96% or more, 97% or more, 98% or more, and 99% or more of the amino acid sequence. In the present invention, the fact that the carbonic anhydrase has a specific ratio (for example, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%) to another sequence means that when the two sequences are aligned Quot; means that the amino acid residues in the ratio are the same in the comparison of the sequences.
또한, 상기 탄산무수화효소는 SEQ ID NO: 2 또는 5에 기재된 염기 서열로부터 코딩된 것일 수 있다. In addition, the carbonic anhydrase may be the one encoded from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 5.
상기 탄산무수화효소는 에스터라아제 활성과 CO2 수화 활성을 가지는 특징이 있다. 또한, 상기 탄산무수화효소는 고안정성과 열적 안정성이 뛰어난 효소일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 통상 30 내지 40℃에서 효소 활성을 측정하는데, 50℃ 이상에서 활성을 보이고 유지할 경우 열적 안정성이 높다고 말하며, 일반적으로 알려진 탄산무수화효소가 60℃에서 50% 이상의 활성을 잃어버리는 것을 고려할 때 상기 탄산무수화효소는 60 내지 100 ℃에서 5분 내지 100분의 조건에서 효소 활성이 50% 이상 유지되므로 열적 안정성이 뛰어난 효소임을 알 수 있다.The carbonic anhydrase has an esterase activity and a CO 2 hydration activity. In addition, the carbonic anhydrase may be an enzyme having high stability and excellent thermal stability. According to one embodiment, the enzymatic activity is measured at 30 to 40 ° C, and when the activity is shown and maintained at 50 ° C or more, the thermal stability is high. In general, the known carbonic anhydrase has lost more than 50% It can be understood that the carbonic anhydrase is an enzyme having excellent thermal stability because the enzyme activity is maintained at 50% or more at 60 to 100 ° C for 5 minutes to 100 minutes.
본 발명의 일 구현예는, SEQ ID NO: 2에 기재된 염기 서열로 표시되는 탄산무수화효소의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 대량 생산 방법에 관한 것이다.One embodiment of the present invention relates to a method for mass production of carbonic anhydrase, comprising the step of preparing a recombinant vector comprising the coding sequence of a carbonic anhydrase represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 .
본 발명의 탄산무수화효소의 대량 생산 방법은 숙주세포에서 최적 발현을 위해 코돈 최적화된 상기 탄산무수화효소 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시키고, 상기로부터 얻은 형질전환체의 배양물로부터 알파형 탄산무수화효소 활성을 갖는 단백질을 수득함으로써 대량 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.The method for mass production of the carbonic anhydrase of the present invention comprises the steps of: transforming a host cell with a recombinant vector comprising the carbonic anhydrase coding sequence whose codon is optimized for optimal expression in a host cell, culturing the transformant And is capable of mass production by obtaining a protein having alpha-type carbonic anhydrase activity from water.
상기 탄산무수화효소는 숙주세포에서의 최적 발현을 위해 유전자 코돈으로 최적화될 수 있는데, SEQ ID NO: 2에 기재된 염기 서열에 대해 유전자 코돈으로 최적화할 수 있다. 상기 유전자 코돈은 숙주세포의 종류에 따라 당업자 수준에서 적절히 채택될 수 있다. The carbonic anhydrase may be optimized as a gene codon for optimal expression in a host cell, and may be optimized to a gene codon for the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The gene codon can be suitably adopted at the level of the skilled person depending on the kind of the host cell.
상기 탄산무수화효소는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다. 즉, 탄산무수화효소의 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 재조합 벡터를 사용할 수 있다. The above-mentioned carbonic anhydrase can be produced by a method of synthesis in vitro through gene recombination and protein expression system. That is, a recombinant vector containing an essential regulatory element operably linked to the expression of the gene insert of the carbonic anhydrase can be used.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.Such vectors include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors. Suitable expression vectors include signal sequence or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, operator, initiation codon, termination codon, polyadenylation signal and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. Further, the expression vector includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and includes a replication origin in the case of a replicable expression vector.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터, pGEM-T Easy vector에 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 대장균 발현용 벡터로 pGEM-T Easy vector를 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다. The recombinant vector of the present invention can be preferably prepared by inserting a nucleic acid encoding the above-mentioned carbonic anhydrase into a vector for expressing Escherichia coli strain, pGEM-T Easy vector. In one embodiment of the present invention, pGEM-T Easy vector is used as a vector for expressing Escherichia coli. However, the present invention is not limited thereto, and all commonly used Escherichia coli vectors for expression can be used without limitation.
본 발명의 일 구체예에서는 대장균 균주 발현용 벡터인 pGEM-T Easy vector를 사용하여 본 발명의 탄산무수화효소의 PCR 증폭 산물을 pET42b vector에 서브클로닝한 후 제한 효소 처리된 pET42b vector에 라이게이션 시켜 재조합 벡터, pET42b-PM-aCA 또는 pET22b-mPM-aCA을 제조할 수 있다. 상기 재조합 벡터를 형질전환시켜 재조합 PM-aCA 또는 mPM-aCA을 생산하는 형질전환체를 확보할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the PCR amplification product of the carbonic anhydrase of the present invention is subcloned into a pET42b vector using pGEM-T Easy vector for expression of Escherichia coli strain, followed by ligation to a restriction enzyme-treated pET42b vector A recombinant vector, pET42b-PM-aCA or pET22b-mPM-aCA, can be prepared. The recombinant vector can be transformed to obtain a transformant for producing recombinant PM-aCA or mPM-aCA.
상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.Such transformation includes any method of introducing the nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and can be carried out by selecting a suitable standard technique depending on the host cell, as is known in the art. Such methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, Agrobacterium mediated transformation, PEG, dextran sulfate, ≪ / RTI > lipofectamine, and the like.
또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.In addition, since the expression amount of the protein and the expression are different depending on the host cell, the host cell most suitable for the purpose may be selected and used.
숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. Examples of host cells include Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus but are not limited to, prokaryotic host cells such as mirabilis or Staphylococcus . In addition, fungi (e.g., Aspergillus ), yeast (e. G., Pichia < pastoris), Saccharomyces access to my kids Vichy Auxerre (Saccharomyces cerevisiae), investigating car break in Rome Seth (Schizosaccharomyces), Castello La Neuro Chrysler Corporation (Neurospora can be used lower eukaryotic cells, insect cells, plant cells, mammalian cells, such as in higher eukaryotic origin, including such as crassa)) as a host cell. The transformant can be easily prepared by introducing the recombinant vector into any host cell.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 알파형 탄산무수화효소를 발현하는 재조합 벡터 pET42b-PM-aCA 또는 pET22b-mPM-aCA를 대장균 균주 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, a transformant can be prepared by introducing recombinant vector pET42b-PM-aCA or pET22b-mPM-aCA expressing alpha-type carbonic anhydrase into E. coli strain BL21 (DE3).
상기 탄산무수화효소를 발현하는 형질전환체는 통상의 배양방법에 따라 배양하여 분리 정제함으로써 대량 생산이 가능하다. 특별히 제한하지는 않으나, 통상의 TB(terrific broth)에서 배양하고, 배양물로부터 가용성 분획만을 회수하여 크로마토그래피법을 통해 정제할 수 있다. The transformant expressing the above-mentioned carbonic anhydrase can be mass-produced by culturing and isolating and purifying the transformant according to a conventional culture method. Although it is not particularly limited, it can be purified by chromatographic method by culturing it in ordinary TB (terrific broth) and recovering only the soluble fraction from the culture.
일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체에서 분리 정제된 탄산무수화효소는 SDS-PAGE 결과, 성숙형 PM-aCA는 약 27 kDa, 시그널 펩타이드가 결실된 성숙형 mPM-aCA는 25 kDa일 수 있다.According to one embodiment, as a result of SDS-PAGE, the carbonic anhydrase isolated and purified from the transformant may have a mature form of PM-aCA of about 27 kDa and a mature mPM-aCA of 25 kDa of a signal peptide deleted .
상기 탄산무수화효소는 성숙형 PM-aCA 대비 시그널 펩타이드가 결실된 성숙형 mPM-aCA의 효소 활성이 13배 증가하며, 수용성 발현율이 높아지는 것을 특징으로 한다. The above-mentioned carbonic anhydrase is characterized in that the enzyme activity of mature mPM-aCA in which a signal peptide compared to mature PM-aCA is deleted is increased 13-fold and the water-soluble expression ratio is increased.
따라서, 본 발명은 탄산무수화효소의 코딩 서열에서 N-말단의 시그널 펩타이드가 결실되어 있는 SEQ ID NO: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 수용성 발현 또는 효소 활성을 증가하는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a method for preparing a recombinant vector comprising the step of preparing a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 wherein the N-terminal signal peptide is deleted in the coding sequence of the carbonic anhydrase, Lt; / RTI > expression or enzymatic activity.
본 발명의 탄산무수화효소의 수용성 발현 또는 효소 활성을 증가하는 방법에 있어서, 상기 탄산무수화효소의 전장에서 N-말단의 시그널 펩타이드가 결실되어 있는 코딩 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO: 5에 기재된 염기 서열로 표시되는 것을 형질전환체 제조에 사용할 경우 본 발명에 따른 탄산무수화효소의 수용성 발현 또는 효소 활성을 증가시킬 수 있다.
In a method for enhancing the water-soluble expression or enzymatic activity of the carbonic anhydrase of the present invention, the coding sequence in which the N-terminal signal peptide is deleted in the full length of the carbonic anhydrase, preferably SEQ ID NO: 5 When the expressed nucleotide sequence is used in the production of a transformant, the water-soluble expression or enzyme activity of the carbonic anhydrase according to the present invention can be increased.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 또는 4에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for capturing or fixing carbon dioxide comprising a carbonic anhydrase represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 4.
전술한 바와 같이, 본 발명의 탄산무수화효소는 에스터라아제 활성과 이산화탄소 수화 활성을 가지고 있어, 이산화탄소의 포집 및 고정화에 효과적일 수 있다. As described above, the carbonic anhydrase of the present invention has an esterase activity and a carbon dioxide hydration activity, and thus can be effective for capturing and immobilizing carbon dioxide.
본 발명의 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조된 본 발명에 따른 탄산무수화효소를 포함할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다. The composition for trapping or fixing carbon dioxide of the present invention may include a carbonic anhydrase according to the present invention prepared by a known method in the art for synthesizing peptides. For example, by a method of synthesizing in vitro through gene recombination and protein expression system or peptide synthesizer.
또한, 본 발명의 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물은 탄산무수화효소를 발현하는 형질전환체의 배양물 형태로 포함할 수 있다.
In addition, the composition for capturing or fixing carbon dioxide of the present invention may be contained in the form of a culture of a transformant expressing a carbonic anhydrase.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 포함하는 이산화탄소의 포집 및 고정 장치에 관한 것이다.The present invention also relates to an apparatus for collecting and fixing carbon dioxide which comprises a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention.
본 발명의 이산화탄소의 포집 및 고정 장치는 공기로부터 이산화탄소를 추출하여 바이카보네이트로 전환시켜 고정하는 통상의 장치일 수 있다. 예컨대, 이산화탄소의 포집 및 고정 장치는 업라이트 타워(upright towers), 챔버(chamber) 및 물 공급부(source of water)를 포함하고, 상기 업라이트 타워는 하부에 적어도 하나의 공기 투입부(air inlet)를 포함하고 타워의 상부에 적어도 하나의 공기 배출부(air outlet)를 포함하고, 상기 챔버는 적어도 하나의 공기 투입구(air inlet)와 적어도 하나의 공기 배출구(air outlet) 사이에 위치하고 이산화탄소를 포집하기 위한 수집기를 포함하며, 상기 물 공급부에서 수지를 습윤하여 이산화탄소를 방출시키는 구조를 가질 수 있고, 상기 이산화탄소를 포집하기 위한 수집기에 본 발명에 따른 탄산무수화효소를 포함할 수 있다. The apparatus for trapping and fixing carbon dioxide of the present invention may be a conventional apparatus for extracting carbon dioxide from air and converting it into bicarbonate and fixing it. For example, the capture and fixation device of carbon dioxide may include upright towers, a chamber and a source of water, wherein the upright tower includes at least one air inlet at the bottom And at least one air outlet at the top of the tower, the chamber being located between at least one air inlet and at least one air outlet, The water supply unit may have a structure for wetting the resin to release carbon dioxide, and the collector for capturing the carbon dioxide may include the carbonic anhydrase according to the present invention.
다른 구체예에서, 본 발명의 이산화탄소의 포집 및 고정 장치는 실내 공기정화 장치일 수 있다. 상기 실내 공기정화 장치는 기존 분수장치 내에 효소가 포함된 담체를 고정한 것으로, 이산화탄소 저감기능 및 가습기능을 겸비하고, 효소가 지속적으로 그 기능을 할 수 있도록 수용액 저장소의 수용액에 잠기도록 구성할 수 있다. 따라서, 상기 효소가 포함된 담체에 포함된 효소는 용해된 이산화탄소를 바이카보네이트로 빠르게 전환하도록 하는 촉매기능을 가져 지속적으로 공기 중 이산화탄소를 저감할 수 있다. 상기 효소로 본 발명에 따른 탄산무수화효소를 포함할 수 있다.
In another embodiment, the trapping and anchoring device for carbon dioxide of the present invention may be an indoor air purifier. The indoor air cleaning apparatus may be configured such that a carrier containing an enzyme is fixed in an existing fractional apparatus and has a carbon dioxide abatement function and a humidifying function and is submerged in an aqueous solution of an aqueous solution reservoir so that the enzyme can continuously perform its function . Therefore, the enzyme contained in the carrier containing the enzyme has a catalytic function for rapidly converting dissolved carbon dioxide into bicarbonate, so that the carbon dioxide in the air can be continuously reduced. The enzyme may include a carbonic anhydrase according to the present invention.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물이 고정화(immobilization) 된 이산화탄소의 포집 및 고정용 센서에 관한 것이다.The present invention also relates to a sensor for capturing and fixing carbon dioxide in which a composition for trapping or fixing carbon dioxide according to the present invention is immobilized.
본 발명의 이산화탄소의 포집 및 고정용 센서에 있어서, 효소 고정 방법은 흡착법, 이온결합법, 가교법, 포획법 또는 공유결합법으로 고정할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
In the sensor for trapping and fixing carbon dioxide in the present invention, the enzyme fixing method can be fixed by an adsorption method, an ion-binding method, a crosslinking method, a capturing method, or a covalent bonding method, but the method is not particularly limited thereto.
본 발명은 또한 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 반응시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 포집 또는 고정 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for trapping or fixing carbon dioxide comprising the step of reacting a carbon dioxide saturated solution with a composition for trapping or fixing carbon dioxide according to the present invention.
상기 이산화탄소 포화 용액은 이산화탄소 가스를 녹여 탄산수용액에 녹여 제조한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The carbon dioxide saturation solution may be prepared by dissolving carbon dioxide gas in an aqueous carbonate solution, but is not particularly limited thereto.
본 발명에 따른 알파형 탄산무수화효소는 이산화탄소를 빠른 속도로 탈수시켜 바이카보네이트로 전환시킬 수 있다.
The alpha-type carbonic anhydrase according to the present invention can rapidly convert carbon dioxide to bicarbonate by dehydration.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물 제조용 키트에 관한 것이다.The present invention also relates to a kit for producing a bicarbonate or a carbonate compound comprising a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention.
또한, 본 발명은 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 반응시키는 단계; 및 상기에서 얻은 반응물과 알칼리 양이온염을 반응시켜 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing carbon dioxide, comprising the steps of: reacting a carbon dioxide saturated solution with a composition for trapping or fixing carbon dioxide according to the present invention; And reacting the reactant obtained above with an alkali cationic salt to produce an amorphous bicarbonate or carbonate compound. The present invention also provides a method for producing a bicarbonate or a carbonate compound.
상기 탄산무수화효소는 가역반응성이 있어 기질로 이산화탄소뿐만 아니라 바이카보네이트를 사용할 수 있다. 따라서, 이산화탄소 고정 과정에서 이산화탄소에서 전환된 바이카보네이트는 알칼리 양이온의 처리 시 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물로 전환될 수 있다.The carbonic anhydrase has reversible reactivity, and bicarbonate as well as carbon dioxide can be used as a substrate. Thus, the bicarbonate converted from carbon dioxide in the carbon dioxide fixation process can be converted to an amorphous bicarbonate or carbonate compound upon treatment of the alkali cation.
상기 바이카보네이트 화합물은 소듐 바이카보네이트(Na2HCO3), 포타슘 바이카보네이트(KHCO3), 마그네슘 바이카보네이트(Mg(HCO3)2), 칼슘 바이카보네이트(Ca(HCO3)2) 또는 암모늄 바이카보네이트((NH4)HCO3) 등일 수 있다.The bicarbonate compound may be selected from the group consisting of sodium bicarbonate (Na 2 HCO 3 ), potassium bicarbonate (KHCO 3 ), magnesium bicarbonate (Mg (HCO 3 ) 2 ), calcium bicarbonate (Ca (HCO 3 ) 2 ) ((NH 4) HCO 3), and the like.
상기 카보네이트 화합물은 카본산(H2CO3), 리튬 카보네이트(Li2CO3), 소듐 카보네이트(Na2CO3), 포타슘 카보네이트(K2CO3), 루비듐 카보네이트(Rb2CO3), 세슘 카보네이트(Cs2CO3), 베릴륨 카보네이트(BeCO3), 마그네슘 카보네이트(MgCO3), 칼슘 카보네이트(CaCO3), 스트론튬 카보네이트(SrCO3), 바륨 카보네이트(BaCO3), 망간 카보네이트(MnCO3), 철 카보네이트(FeCO3), 코발트 카보네이트(CoCO3), 니켈 카보네이트(NiCO3), 구리 카보네이트(CuCO3), 실버 카보네이트(Ag2CO3), 징크 카보네이트(ZnCO3), 카드뮴 카보네이트(CdCO3), 알루미늄 카보네이트(Al2(CO3)3), 탈륨 카보네이트(Tl2CO3), 리드 카보네이트(PbCO3) 또는 란타늄 카보네이트(La2(CO3)3) 등일 수 있다.The carbonate compound may be at least one selected from the group consisting of carbonic acid (H 2 CO 3 ), lithium carbonate (Li 2 CO 3 ), sodium carbonate (Na 2 CO 3 ), potassium carbonate (K 2 CO 3 ), rubidium carbonate (Rb 2 CO 3 ) carbonate (Cs 2 CO 3), beryllium carbonate (BeCO 3), magnesium carbonate (MgCO 3), calcium carbonate (CaCO 3), strontium carbonate (SrCO 3), barium carbonate (BaCO 3), manganese carbonate (MnCO 3), ferrous carbonate (FeCO 3), cobalt carbonate (CoCO 3), nickel carbonate (NiCO 3), copper carbonate (CuCO 3), silver carbonate (Ag 2 CO 3), zinc carbonate (ZnCO 3), cadmium carbonate (CdCO 3) , Aluminum carbonate (Al 2 (CO 3 ) 3 ), thallium carbonate (Tl 2 CO 3 ), lead carbonate (PbCO 3 ), or lanthanum carbonate (La 2 (CO 3 ) 3 ).
상기 알칼리 양이온염은 Mg, K, Na, NH4, Ca, Li, Rb, Cs, Be, Sr, Ba, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Ag, Al, Tl, Pb 또는 La의 염 등일 수 있다. 예컨대, 염화칼슘(CaCl2), 황산칼슘(CaSO4), 중탄산칼슘(Ca(HCO3)2), 산화칼슘(CaO), 수산화칼슘(Ca(OH)2) 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The alkali cation salt may be at least one selected from the group consisting of Mg, K, Na, NH 4 , Ca, Li, Rb, Cs, Be, Sr, Ba, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Ag, La salt and the like. For example, calcium chloride (CaCl 2 ), calcium sulfate (CaSO 4 ), calcium bicarbonate (Ca (HCO 3 ) 2 ), calcium oxide (CaO) and calcium hydroxide (Ca (OH) 2 ) It is not.
상기 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물은 침전 반응을 통해 상전이를 거쳐 결정상의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물로 전환될 수 있다.The amorphous bicarbonate or carbonate compound may be converted to a crystal phase bicarbonate or carbonate compound through phase transformation through a precipitation reaction.
상기 침전은 pH 8 내지 10 에서 0 내지 50 ℃의 온도 조건에서 실시할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The precipitation can be carried out at a pH of 8 to 10 at a temperature of 0 to 50 ° C, but is not particularly limited thereto.
상기 결정상의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물은 칼사이트(calcite), 아라고나이트(aragonite) 또는 베터라이트(veterite)일 수 있다.
The crystal phase bicarbonate or carbonate compound may be calcite, aragonite or veterite.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 대사 산물 생산용 키트에 관한 것이다. The present invention also relates to a kit for the production of metabolites using bicarbonate or carbon dioxide comprising a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention.
또한, 본 발명은 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 C4 대사 또는 지질 대사에서 촉매로 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물을 사용하여 대사 산물을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a metabolite using a composition for capturing or fixing carbon dioxide according to the present invention as a catalyst in C4 metabolism using bicarbonate or carbon dioxide or lipid metabolism.
상기 대사 산물은 C4 대사 또는 지질 대사 산물로서, C4 대사에서, PEP(phosphoenol pyruvate)에 CO2를 붙여서 옥살로아세테이트(Oxaloacetate)로 진행하는 PEP carboxylase 반응에서 탄산무수화효소가 촉매(또는 보조 효소)로 연동하여 C4 화합물을 효과적으로 합성할 수 있는 특징이 있다.The metabolites are C4 metabolites or lipid metabolites. In the C4 metabolism, the carbonic anhydrase catalyzes (or co-enzymes) in the PEP carboxylase reaction proceeding to oxaloacetate by attaching CO 2 to PEP (phosphoenol pyruvate) The C4 compound can be synthesized effectively.
또한, 지질 대사에서, Acetyl CoA에서 bicabonate(HCO3 -)를 붙여서 Malonyl CoA로 진행하는 Acetyl CoA carboxylase 반응에서 탄산무수화효소가 촉매(또는 보조 효소)로 연동하여 Malonyl CoA를 효과적으로 합성할 수 있는 특징이 있다.In addition, in lipid metabolism, bicarbonate (HCO 3 - ) was attached to Acetyl CoA, and thus, an acetyl CoA carboxylase reaction proceeded to Malonyl CoA, and the carbonic anhydrase was linked to a catalyst (or coenzyme) to effectively synthesize Malonyl CoA .
따라서, 본 발명은 유용 대사 산물 합성에 유용한 시스템을 제공한다.
Thus, the present invention provides a system useful for the synthesis of useful metabolites.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> PM-aCA 유전자 확보≪ Example 1 > PM-aCA gene securing
구조가 알려진 네이세리아 고노로에세(Neisseria gonorrhoeae) 유래의 알파형 CA (PDB ID: 1KOP)를 기준으로 단백질 데이터베이스로부터 신규 CA 기능의 후보 단백질을 탐색하였다. 탐색 결과 해양 열수 환경에 존재하는 그람 음성, 호열성 진정세균인 산수균류에 속하는 퍼셉포넬라 마리나(Persephonella marina) EX-H1 유래의 기능이 알려져 있지 않지만 1KOP와 구조적으로 50% 유사성을 나타내는 신규 단백질 유전자를 확보하고 PM-aCA이라 명명하였다. 탐색된 신규 단백질인 PM-aCA의 유전자 서열(도 1A)을 대장균에서 발현되도록 유전자 서열을 대장균에서 사용 빈도가 높은 유전자 코돈으로 최적화한 후(도 1B) 코스모진텍 (Cosmogen Tech. Seoul, Korea)에 유전자 합성을 의뢰하였다. 유전자 서열의 번역 아미노산 서열은 도 1C와 같다.
Neisseria , known for its structure, Neisseria gonorrhoeae ) Based on the derived alpha type CA (PDB ID: 1 KOP), candidate proteins of novel CA function were searched from the protein database. As a result of the research, Persephonella spp. Belonging to the acidic fungi, Gram-negative, marina ) Although a function derived from EX-H1 was not known, a novel protein gene showing structural similarity to 1 KOP was obtained and named PM-aCA. The gene sequence of the novel protein PM-aCA (FIG. 1A) was optimized so that the gene sequence was expressed in Escherichia coli (FIG. 1B) and then used in Escherichia coli (FIG. 1B). Cosmogen Tech. Seoul, . The translated amino acid sequence of the gene sequence is shown in Figure 1C.
<실시예 2> 성숙형 PM-aCA 아미노산 서열≪ Example 2 > Mature PM-aCA amino acid sequence
PM-aCA가 과발현되었으나 불용성 분획에서 주로 발현되었기에 PM-aCA의 가용성 발현 및 활성을 높이는 전략으로 PM-aCA의 아미노산 서열을 Signal P 4.1 서버 분석 프로그램을 이용하여 시그널 펩타이드 존재 유무를 조사한 결과 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 시그널 펩타이드가 존재하는 전구체형의 단백질임을 확인하였다(도 2A). N-말단의 시그널 펩타이드 서열을 제거한 성숙형 PM-aCA(즉, mPM-aCA)의 염기서열과 아미노산 서열은 도 2에 나타내었다.
As a strategy to increase the solubility and activity of PM-aCA, PM-aCA was over expressed and mainly expressed in the insoluble fraction. As a strategy to increase the solubility and activity of PM-aCA, the presence of signal peptides was examined using Signal P 4.1 server analysis program ( http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ) signal peptide (FIG. 2A). The nucleotide sequence and amino acid sequence of mature PM-aCA (i.e., mPM-aCA) from which the N-terminal signal peptide sequence has been deleted is shown in Fig.
<실시예 3> 성숙형 PM-aCA의 발현≪ Example 3 > Expression of mature PM-aCA
PM-aCA 단백질을 NdeI 제한 효소 자리가 5‘ 말단에 첨가된 정방향 프라이머(5’-ATACATATGAAAAAATTTGTAGTC -3’)와 5’말단에 HindIII 제한 효소 자리가 첨가된 역방향 프라이머(5’-AAGCTT TTTTTCCATAATCATTCT-3’)를 이용하여 증폭시킨 후(PCR 조건; 94℃, 3분, ×1 사이클; 94℃, 30s, 50℃, 1분, 72℃, 1분, ×30 사이클; 72℃, 6분, ×1 사이클), pGEM-T Easy vector(Promega co., Madison, WI)에 PCR 단편을 서브클로닝한 후 상기 각 제한 효소를 처리하여 잘린 PCR 단편을 같은 제한 효소로 처리된 pETDuet 벡터에 라이게이션 시켜 E. coli XL1-Blue에 형질전환 시키고, PM-aCA 생산 유전자가 클로닝 된 벡터인 pET Duet-PM-aCA를 제조하였다(도 3A). 구축한 발현 벡터를 대장균 BL21-DE3에 형질전환 시켜 PM-aCA 단백질을 생산할 수 있는 균주를 확보하였다. (5'-ATA CATATG AAAAAATTTGTAGTC -3 ') in which the Nde I restriction enzyme site was added at the 5' end and a reverse primer (5'-AAGCTT 3 ') in which the Hind III restriction enzyme site was added at the 5 ' (PCR conditions: 94 ° C., 3 minutes, × 1 cycle; 94 ° C., 30 s, 50 ° C., 1 minute, 72 ° C., 1 minute, × 30 cycles; 72 ° C. and 6 ° C.) using TTTTTCCATAATCATTCT-3 ' Min, 1 cycle), and the PCR fragment was subcloned into pGEM-T Easy vector (Promega co., Madison, WI). The PCR fragment thus obtained was treated with the restriction enzymes and ligated to the pETDuet vector treated with the same restriction enzyme And transformed into E. coli XL1-Blue to prepare pET Duet-PM-aCA, a vector in which the PM-aCA producing gene was cloned (FIG. 3A). The constructed expression vector was transformed into E. coli BL21-DE3 to obtain a strain capable of producing PM-aCA protein.
1mM IPTG 처리와 20℃ 배양 조건에서 단백질이 불용성 분획과 가용성 분획에서 약 27kDa의 크기로 발현됨을 SDS-PAGE를 실시하여 확인하였다(도 3C). The protein was expressed at about 27 kDa in the insoluble and soluble fractions under the conditions of 1 mM IPTG treatment and 20 ° C culture (FIG. 3C).
가용성 분획을 회수하여 발현된 단백질을 정제하여(도 3D) 알파형 CA의 에스터라아제 활성을 측정하는 방법인 파라-니트로 아세테이트(para-nitro acetate)를 기질로 하여 측정한 결과 활성을 띠는 것을 확인하였다(미도시됨).
The soluble fraction was recovered to purify the expressed protein (FIG. 3D) and was found to be active as a result of measuring para-nitro acetate as a substrate for measuring the activity of alpha-type CA. (Not shown).
<실시예 4> 성숙형 mPM-aCA 발현Example 4 Expression of mature mPM-aCA
PCR을 통해 mPM-aCA의 코돈 최적화된 유전자를 증폭시킨 후 제한효소 NdeI과 HindIlI으로 처리한 산물을 같은 제한효소로 처리한 pET22b 벡터에 넣어 발현 벡터인 pET22b-mPM-aCA를 제조하였다(도 4A 및 B). 또한 시그널 펩타이드를 제거한 성숙형의 mPM-aCA의 경우 C-말단의 His-tag이 있는 벡터 사용시 발현이 어려우므로 N-말단에 His-tag을 붙일 수 있는 벡터를 사용해야 발현을 확인할 수 있었다(미도시됨). 구축한 발현 벡터를 대장균 BL21-DE3에 형질전환시켜 mPM-aCA 단백질을 생산할 수 있는 균주를 확보하였다. The codon-optimized gene of mPM-aCA was amplified by PCR, and the product treated with restriction enzymes Nde I and Hind II was inserted into pET22b vector treated with the same restriction enzyme to prepare pET22b-mPM-aCA as an expression vector 4A and B). In addition, in the mature form of mPM-aCA from which the signal peptide had been removed, it was difficult to express the vector with the His-tag at the C-terminus, so that the expression could be confirmed using a vector capable of attaching His-tag at the N-terminus being). The constructed expression vector was transformed into E. coli BL21-DE3 to obtain a strain capable of producing mPM-aCA protein.
1mM IPTG 처리와 20℃ 배양 조건에서 단백질이 가용성 분획에서 약 25kDa의 크기로 과발현됨을 SDS-PAGE를 실시하여 확인하였다. It was confirmed by SDS-PAGE that the protein was overexpressed to a soluble fraction of about 25 kDa at 1 mM IPTG treatment and at 20 ° C culture condition.
발현된 단백질을 정제하여(도 4C) 알파형 CA의 에스터라아제 활성을 측정하는 방법인 파라-니트로 아세테이트를 기질로 하여 측정한 결과 활성을 띠는 것을 확인하였다(미도시됨).
The expressed protein was purified (Fig. 4C) and assayed for activity of para-nitroacetate, which is a method for measuring the activity of alpha-type CA, as a substrate (not shown).
<실시예 5> CO2 수화 활성 실험Example 5 CO 2 Hydration Activity Experiment
상기 실시예 4 및 5에서 정제된 PM-aCA와 mPM-aCA의 CO2 수화 활성을 pH8.3 완충용액에 녹아있는 CO2가 이들 단백질에 의한 촉매 작용으로 수화되어 바이카보네이트로 전환되면서 pH8에서 pH7로 감소하는 데 소요되는 시간 t로 계산하고 촉매 반응 없이 자연적으로 탈수되는 데 필요한 시간을 t0로 계산하여 다음의 공식 (1)에 따라 활성을 U(Wilbur-Andersion unit)로 표현하고 이 값을 사용된 단백질 양으로 나눈 값으로 활성도(2)를 계산하였다:Example 4, and the PM-aCA and mPM-aCA the CO 2 hydration activity purified from the 5 CO 2 dissolved in a buffer solution pH8.3 is hydration catalyzed by these proteins as converted to bicarbonate in pH7 pH8 And the time required for natural dehydration without catalyst reaction is calculated as t 0 , and the activity is expressed as U (Wilbur-Andersion unit) according to the following formula (1) Activity (2) was calculated by dividing by the amount of protein used:
[식][expression]
U = (t0-t)/t ......................(1) U = (t 0 -t) / t ...................... (1)
활성도 = U/mg protein .............(2)Activity = U / mg protein (2)
활성도는 PM-aCA가 376 unit/mg과 mPM-aCA가 4957 unit/mg으로 활성이 약 13배 증가하였다. 양성 대조구로는 bovine CA(BCAII)를 사용하였으며 pH 지시약으로 페놀 레드를 사용하였다.
The activity of PM-aCA was 376 unit / mg and mPM-aCA was 4957 unit / mg, which was about 13 times more active. Bovine CA (BCAII) was used as a positive control and phenol red was used as a pH indicator.
<실시예 6> mPM-aCA의 열적 안정성 조사<Example 6> Investigation of thermal stability of mPM-aCA
정제된 mPM-aCA 단백질을 30℃에서 100℃까지 10분간 전 처리를 하고 에스터라아제 활성을 측정해본 결과 60℃ 이상 100℃에서도 50% 이상의 활성을 띠는 것을 확인하였다(도 6). 상기 결과로부터 mPM-aCA는 고온에서도 활성을 나타내며 열적 안정성이 높은 CA임을 확인할 수 있었다. The purified mPM-aCA protein was pretreated from 30 ° C. to 100 ° C. for 10 minutes, and the activity of the purified mPM-aCA protein was measured. As a result, it was confirmed that the activity of the purified mPM-aCA protein was more than 50% at 60 ° C. to 100 ° C. (FIG. From the above results, it was confirmed that mPM-aCA exhibits activity even at a high temperature and is a CA with high thermal stability.
또한, 정제된 mPM-aCA 단백질을 100℃ 조건에서 130분 동안 활성을 측정해본 결과 130분까지도 활성이 유지되며 130분의 활성은 대략 40% 정도까지 유지되었다. 또한, 100분 정도까지는 약 50% 이상 활성이 유지되었다(도 7).In addition, the activity of the purified mPM-aCA protein was measured at 100 ° C for 130 minutes, and the activity was maintained up to 130 minutes, and the activity of 130 minutes was maintained at about 40%. In addition, about 50% or more activity was maintained up to about 100 minutes (FIG. 7).
통상적인 CA가 60℃에서 50% 이상의 활성을 잃어버리는 것을 고려할 때 상기 CA는 고안정성 및 열적 안정성이 뛰어난 CA임을 알 수 있었다.
Considering that a conventional CA lost more than 50% of activity at 60 캜, it was found that the CA was a CA having excellent stability and thermal stability.
<110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation <120> Novel carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 and use thereof <130> P130542 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 (PM-aCA) <400> 1 Met Lys Lys Phe Val Val Gly Leu Ser Ser Leu Val Leu Ala Thr Ser 1 5 10 15 Ser Phe Ala Gly Gly Gly Trp Ser Tyr His Gly Glu His Gly Pro Glu 20 25 30 His Trp Gly Asp Leu Lys Asp Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys 35 40 45 Asn Gln Ser Pro Val Asp Ile Asn Arg Ile Val Asp Ala Lys Leu Lys 50 55 60 Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Arg Ala Gly Ala Thr Lys Val Leu Asn Asn 65 70 75 80 Gly His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Val Val 85 90 95 Asp Gly Ile Lys Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser 100 105 110 Glu His Lys Leu Lys Gly Gln His Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val 115 120 125 His Ala Asp Lys His Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Phe Phe Lys 130 135 140 Glu Gly Arg Glu Asn Pro Ile Leu Glu Lys Ile Trp Lys Val Met Pro 145 150 155 160 Glu Asn Ala Gly Glu Glu Val Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Glu 165 170 175 Asp Leu Leu Pro Lys Asp Arg Asp Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu 180 185 190 Thr Thr Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu 195 200 205 Glu Met Glu Met Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Ile Met 210 215 220 Gly Gly Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile 225 230 235 240 Met Glu Lys <210> 2 <211> 732 <212> DNA <213> Carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 (PM-aCA) <400> 2 atgaaaaaat ttgtagtcgg gctttcatct cttgtacttg caacatcttc atttgcaggt 60 ggtggctgga gttatcacgg ggaacacgga ccggaacatt ggggcgatct aaaagatgaa 120 tacataatgt gtaagatcgg taaaaatcag tctccggtag atataaacag aatagttgat 180 gcgaaattaa aacctataaa gatagaatac agagcaggtg caacaaaggt attaaataat 240 ggacacacaa taaaagtttc ttacgaaccg ggaagttata tagttgttga tgggataaaa 300 tttgagctga agcagtttca tttccacgca ccaagtgagc ataaattaaa aggacagcat 360 tacccgtttg aggctcattt tgttcatgca gataagcatg gtaaccttgc tgttataggt 420 gttttcttta aagaaggaag agaaaatcct atcttagaaa agatatggaa agttatgcct 480 gaaaatgcag gcgaagaggt taaacttgca cacaagataa atgctgaaga tttactgcca 540 aaggatagag attactacag atacagcggt tctttaacta ctccaccatg ttctgaaggt 600 gtaagatgga tagttatgga agaggagatg gagatgtcaa aggagcagat tgagaagttc 660 agaaagatta tgggtggaga tacaaacaga ccggttcagc ctttaaatgc aagaatgatt 720 atggaaaaat ag 732 <210> 3 <211> 732 <212> DNA <213> Carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 (PM-aCA) <400> 3 atgaaaaaat ttgtagtcgg gctttcatct cttgtacttg caacatcttc atttgcaggt 60 ggtggctgga gttatcacgg ggaacacgga ccggaacatt ggggcgatct aaaagatgaa 120 tacataatgt gtaagatcgg taaaaatcag tctccggtag atataaacag aatagttgat 180 gcgaaattaa aacctataaa gatagaatac agagcaggtg caacaaaggt attaaataat 240 ggacacacaa taaaagtttc ttacgaaccg ggaagttata tagttgttga tgggataaaa 300 tttgagctga agcagtttca tttccacgca ccaagtgagc ataaattaaa aggacagcat 360 tacccgtttg aggctcattt tgttcatgca gataagcatg gtaaccttgc tgttataggt 420 gttttcttta aagaaggaag agaaaatcct atcttagaaa agatatggaa agttatgcct 480 gaaaatgcag gcgaagaggt taaacttgca cacaagataa atgctgaaga tttactgcca 540 aaggatagag attactacag atacagcggt tctttaacta ctccaccatg ttctgaaggt 600 gtaagatgga tagttatgga agaggagatg gagatgtcaa aggagcagat tgagaagttc 660 agaaagatta tgggtggaga tacaaacaga ccggttcagc ctttaaatgc aagaatgatt 720 atggaaaaat ag 732 <210> 4 <211> 225 <212> PRT <213> Carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 (mPM-aCA) <400> 4 Met Gly Gly Gly Trp Ser Tyr His Gly Glu His Gly Pro Glu His Trp 1 5 10 15 Gly Asp Leu Lys Asp Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn Gln 20 25 30 Ser Pro Val Asp Ile Asn Arg Ile Val Asp Ala Lys Leu Lys Pro Ile 35 40 45 Lys Ile Glu Tyr Arg Ala Gly Ala Thr Lys Val Leu Asn Asn Gly His 50 55 60 Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Val Val Asp Gly 65 70 75 80 Ile Lys Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu His 85 90 95 Lys Leu Lys Gly Gln His Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His Ala 100 105 110 Asp Lys His 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cgtttgaggc tcattttgtt catgcagata agcatggtaa ccttgctgtt 360 ataggtgttt tctttaaaga aggaagagaa aatcctatct tagaaaagat atggaaagtt 420 atgcctgaaa atgcaggcga agaggttaaa cttgcacaca agataaatgc tgaagattta 480 ctgccaaagg atagagatta ctacagatac agcggttctt taactactcc accatgttct 540 gaaggtgtaa gatggatagt tatggaagag gagatggaga tgtcaaagga gcagattgag 600 aagttcagaa agattatggg tggagataca aacagaccgg ttcagccttt aaatgcaaga 660 atgattatgg aaaaatag 678 <110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation <120> Novel carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 and use the <130> P130542 <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Carbonic anhydrase from Persephonella marina EX-H1 (PM-aCA) <400> 1 Met Lys Lys Phe Val Val Gly Leu Ser Ser Leu Val Leu Ala Thr Ser 1 5 10 15 Ser Phe Ala Gly Gly Gly Trp Ser Tyr His Gly Glu His Gly Pro Glu 20 25 30 His Trp Gly Asp Leu Lys Asp Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys 35 40 45 Asn Gln Ser Pro Val Asp Ile Asn Arg Ile Val Asp Ala Lys 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Comprising the step of preparing a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in which the N-terminal signal peptide is deleted from the coding sequence of the carbonic anhydrase, How to increase.
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