KR101516386B1

KR101516386B1 - 스트렙토그라민 ａ 유도체 및 이를 포함하는 항생제

Info

Publication number: KR101516386B1
Application number: KR1020130054110A
Authority: KR
Inventors: 박제원
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2015-05-04
Also published as: KR20140134381A

Abstract

본 발명은 항생 활성을 갖는 스트렙토그라민 A 유도체, 상기 스트렙토그라민 A 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 항생 조성물, 상기 스트렙토그라민 A 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

스트렙토그라민 Ａ 유도체 및 이를 포함하는 항생제{STREPTOGRAMIN A ANALOG AND ANTIBACTERIAL AGENT INCLUDING THE SAME}

본 발명은 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 스트렙토그라민 A 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이의 제조방법, 및 이를 유효 성분으로 하는 항생 조성물에 관한 것이다.

스트렙토그라민(streptogramin) 항생제들은 다양한 토양 박테리아 속인 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에서 생산되는 것으로 알려져 있으며, 이들은 헥사뎁시펩타이드(hexadepsipeptide) 구조의 스트렙토그라민 B 그룹과 탄소수 23개의 마크로락톤(macrolactone) 구조의 스트렙토그라민 A 그룹으로 대별된다. 스트렙토그라민 A 그룹은 그람 양성 병원균에 유효한 활성을 보이며, 특히 메티실린내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)에 높은 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 여러 종의 스트렙토마이세스에서 생산이 확인되는 버지니아마이신(virginiamycin) 역시 스트렙토그라민 B 그룹의 버지니아마이신S1과 스트렙토그라민 A 그룹의 버지니아마이신M1으로 나누어질 수 있다(비특허문헌 2 참조).

화학식 1은 버지니아마이신M1의 구조를 나타낸다.

버지니아마이신S1/M1은 그람 양성 세균의 50S 라이보솜(ribosome)에 개별적으로 부착되어 세균 내 단백질 합성을 저해하는 항세균 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 각각은 정균(bacteriostatic) 활성을 보이나 혼합 사용 시에는 살균(bactericidal) 활성을 나타내는 시너지 효과가 보고되어 있다(비특허문헌 3 참조). 한편, 이들 스트렙토그라민 항생제에 대한 병원균들의 항생제 내성 기작은 다음과 같다. 우선, 균체 내 버지니아마이신을 능동적으로 체외로 배출하는 방출 펌프 시스템(efflux pump system), 자체 23S 라이보솜 RNA의 메틸화 혹은 라이보솜 단백질 돌연변이화를 통한 구조적 변형으로 항생제 작용 기전을 방어하는 기작, 균체 내 버지니아마이신의 14번 탄소 부착 수산기능기(hydroxyl function)를 임의적으로 아세틸화(acetylation) 시키는 기작들이 보고되어 왔다(비특허문헌 4 참조). 버지니아마이신 항생제는 발견 후 오랫동안 축산 산업에서 성장 촉진제(growth promoting agent)로 이용되고 있으나, 이에 대한 오남용 및 그에 따른 내성 병원성균의 출현이 근래 문제가 되고 있다. 하지만, 1999년도 FDA의 신약 승인을 득한 버지니아마이신S1과 버지니아마이신M1의 반합성(semi-synthetic) 유도체인 퀴누프리스틴/다플로프리스틴(quinupristin/daflopristin, 3:7)의 임상 이용(브랜드명 Synercid)은 스트렙토그라민 항생제의 시너지 기작에 대한 차세대 항생제 개발의 관심을 보여주는 좋은 예이다(비특허문헌 5 참조). 현재 전술한 Synercid의 경우엔 주사제로서 메티실린내성 황색포도상구균 처치에 이용되고 있다. 또한, 최근에 프랑스 제약 회사인 Novexel 역시 스트렙토그라민 항생제의 반합성 유도체인 리노프리스틴/플로프리스틴(linopristin/flopristin)으로 제제화된 일명 NXL103을 현재 임상 2단계에 진입시켰으며, 이 후보 의약품의 경우 경구 투여가 가능하다는 장점을 가지고 있다(비특허문헌 6 참조). 플로프리스틴은, 버지니아마이신M2(버지니아마이신M1에서 탄소 26번과 27번 위치의 이중 결합이 제거된 유사체)를 시작 물질로 하여 유기 화학적 반합성법을 통하여 탄소 16번 위치의 카노닐기(carbonyl group)을 환원시켜 불소(fluoro)를 부착한 16-desoxy-16-fluorovirginiamycinM2이다. 따라서, 전술한 반합성법이나 미생물을 생체-촉매(bio-catalyst)로 활용한 생전환(bioconversion) 기법을 통하여 구조적으로 다양화시킨 버지니아마이신 유도체의 개발은 기존 제한된 항생제 화학 골격(chemical scaffold)에 다양성을 제시함으로써 차세대 항생제 및 개량 신약으로서의 개발 가능성을 제시할 수 있다. 또한, 1993년도에는 기존 버니니아마이신M1을 시작 물질로 하여 탄소위치 14번과 16번의 수산기와 카노닐기를 각각 에스터(ester), 카바닐(carbanilation)화 혹은 수산화(hydroxylation)시킨 유도체를 합성하고, 그람 양성균인 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)를 대상으로 이들 유도체의 항생제 활성을 조사한 보고가 있다(비특허문헌 7 참조). 한편, 버지니아마이신M1을 희귀 방선균인 엑티노플래인 유타헨시스(Actinoplanes utahensis)와 같이 배양하여 12번 탄소에 수산기를 추가적으로 부가하거나 15번 탄소 부착 수산기를 아세틸기로 치환 또는 탈수산화(deoxygenation)시킨 세 종류의 버니지아마이신M1 유도체를 생물학적으로 생산한 적이 있다(비특허문헌 8 참조). 반면, 1996년도에는 버지니아마이신 야생 균주인 스트렙토마이세스 버지니아(Streptomyces virginiae) 세포 추출물(cell extract)을 이용하여 버지니아마이신M1을 활성이 없는 16-디하이드로버지니아마이신M1(16-dihydrovirginiamycinM1)으로 생전환한 바가 있다(비특허문헌 9 참조). 하지만, 전술한 Synercid 혹은 후보 의약품인 NXL103을 제외하고는 기존 보고된 반합성 혹은 생전환 기법을 통해 생산된 버지니아마이신M1 유도체들은 원래 항생제인 버지니아마이신M1보다 높은 항세균 활성을 보인 적이 없었다.

1) Canu, A.; Leclercq, R. Curr.Drug Targets Infect. Disord. 2001,1,215225. 2) De Somer, P.; Van Dijck, P. Antibiot. Chemother.(Basel)1955,5,632639. 3) Bonfiglio, G.; Furneri, P. M. Expert Opin. Ther. Pat. 2003,13,651659. 4) Chancey, S. T.; Z, D.; Stephens, D. S. Future Microbiol. 2012,7,959978. 5) Delgado, G., Jr.; Neuhauser, M. M.; Bearden, D. T.; Danziger, L. H. Pharmocotherapy 2000,20,14691485. 6) Politano, A. D.; Sawyer, R. G. Curr. Opin. Investig. Drugs 2010,11,225236. 7) Lam, Y.K.; Dai, P.; Zink, D. L.; Smith, A. J.; Lee, N. W.; Freedman, S.; Salvatore, M. J. J. Antibiot. 1993,46,623630. 8) Di Giambattista, M.; Vannuffel, P.; Cocito, C.; Friebe, T. L.; Gangloff, A. R.; Helquist, P. J. Antibiot. 1994,47,119122. 9) Lee, C. K.; Minami, M.; Sakuda, S.; Nihira, T.; Yamada, Y. Antimicrob. Agents Chemother. 1996,40,595601. 10) Park, J. W.; Oh, H. S.; Jung, W. S.; Park, S. R.; Han, A. R.; Ban, Y. H.; Kim, E. J.; Kang, H. Y.; Yoon, Y. J. Chem. Commun. 2008,44,57825784. 11) Park, J. W.; Park, S. R.; Han, A. R.; Ban, Y. H.; Yoo, Y. J.; Kim, E. J.; Kim, E.; Yoon, Y. J. J. Antibiot. 2011,64,155157. 12) Park, J. W.; Park, S. R.; Han, A. R.; Ban, Y. H.; Yoo, Y. J.; Kim, E. J.; Kim, E.; Yoon, Y. J. J. Nat. Prod.2011,74,12721274.

본 발명의 목적은 신규한 스트렙토그라민 A 유도체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 스트렙토그라민 A 유도체의 제조 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 스트렙토그라민 A 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 항생 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제들은 상기 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

최근, 본 발명자들은 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae (S. venezuelae))가 불포화된 고리형 마크로라이드 및 히드록사메이트(hydroxamates)에 대해 독특하고 부위-특이적인 수소화 활성을 나타내는 것을 보고하였다. 구체적으로, 스트렙토마이세스 베네주엘래를 이용한 바이오-수소화 시스템(bio-hydrogenation system)은 표적 이중 결합의 특이적 구조적 꾸밈(즉, 이중 결합을 중심으로 한쪽 탄소는 카르보닐 작용기를 갖고, 다른 탄소는 메틸기를 갖는 특이적 구조적 꾸밈)을 인지할 수 있다(비특허문헌 10-12 참조).

이에, 본 발명자들은 전술한 화합물 내 구조적 꾸밈을 보유하고 있는 버지니아마이신M1을 대상으로 스트렙토마이세스 베네주엘래의 생체 촉매(biocatalyst) 응용성을 시도하고자 연구한 결과, 버지니아마이신M1을 첨가한 배지에서 배양한 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezuelae) 배양액으로부터, 이전에 특정되지 않은 5,6-디하이드로버지니아마이신M1(5,6-dihydrovirginiamycinM1) 유도체를 분리하였다. 이에 따라, 본 발명자들은 5,6-디하이드로버지니아마이신M1의 구조를 분석하고, 기존의 버지니아마이신M1에 비해 향상된 항균 잠재성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 양상으로, 하기 화학식의 스트렙토그라민 A 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:

[화학식]

.

바람직하게, 상기 스트렙토그라민 A 유도체는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주에 의해 버지니아마이신M1으로부터 생전환된다.

본 발명의 다른 양상으로, 스트렙토그라민 A 유도체를 버지니아마이신M1으로부터 제조하는 방법에 있어서, 상기 버지니아마이신M1을 포함하는 배지에서 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배지로부터 하기 화학식의 스트렙토그라민 A 유도체를 추출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다:

[화학식]

.

바람직하게, 상기 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상으로, 하기 화학식의 스트렙토그라민 A 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 항생 조성물이 제공된다:

[화학식]

.

바람직하게, 상기 항생 조성물은 항생제 내성 균주에 대해 활성을 갖는다.

바람직하게, 상기 항생제 내성 균주는 메티실린-내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant Stahphylococcus aureus; MRSA)을 포함한다.

바람직하게, 상기 스트렙토그라민 A 유도체는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주에 의해 버지니아마이신M1으로부터 생전환 된다.

본 발명은 기존의 버지니아마이신M1에 비해 유의하게 높은 항생 활성(예, 항-MRSA활성)을 나타내는 스트렙토그라민 A(즉, 15,6-디하이드로버지니아마이신M1), 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 5,6-디하이드로버지니아마이신M1의 제조 방법, 바람직하게는 미생물 생전환을 이용한 제조 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 얻은 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에 관한 이해를 돕기 위해 상세한 설명의 일부로 포함되는, 첨부 도면은 본 발명에 대한 실시예를 제공하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술적 사상을 설명한다.
도 1은 버지니아마이신M1이 첨가된 배지에서 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezuelae)가 배양된 배양액으로부터 획득된 유기 용매 추출물의 HPLC-ESI-MS(High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry) 크로마토그램을 나타낸다. (A)는 스트렙토마이세스 베네주엘래 배양없이 배지 내 버지니아마이신M1을 첨가한 배지로부터 만들어진 유기 용매 추출액의 크로마토그램을 나타낸다. (B)는 버지니아마이신M1 첨가 배지에 스트렙토마이세스 베네주엘래를 배양한 후 만들어진 유기 용매 추출액의 크로마토그램을 나타낸다. 여기서, 버지니아마이신M1 및 그의 생전환 유도체인 5,6-디하이드로버지니아마이신M1은 각각 분자[M+H]+ 이온 526.3 및 528.3에서 선별되었다.
도 2는 버지니아마이신M1(A) 및 그의 생전환 유도체인 5,6-디하이드로버지니아마이신M1(B)의 ESI-MS/MS 스펙트럼을 각각 나타낸다.
도 3은 d₆-DMSO(dimethyl sulfoxide)에서 버지니아마이신M1 및 그의 생전환 유도체인 5,6-디하이드로버지니아마이신M1의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 버지니아마이신M1 및 그의 생전환 유도체인 5,6-디하이드로버지니아마이신M1의 MSSA 1종 및 MRSA 2종의 황색포도상구균 종에 대한 항세균 활성을 나타낸다.

이하의 설명에서 사용되는 특정(特定) 용어들은 본 발명의 이해를 돕기 위해서 제공된 것이며, 이러한 특정 용어는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 다른 형태로 변경될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 설명되는 동작들의 순서는 변경될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 신규한 스트렙토그라민 A 유도체를 제공한다.

화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체는 버지니아마이신M1으로부터 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 의해 생전환 되어 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 화학적 합성 등에 의해 제조된 것을 모두 포함한다.

화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체는 항생제-내성 균주, 바람직하게 항생제-내성 황색포도상구균 종, 보다 바람직하게 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA) 종에 대해 우수한 항생 활성을 갖는다. 또한, 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체는 황색포도상구균 종, 바람직하게 항생제-내성 황색포도상구균 종, 보다 바람직하게 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA) 종에 대해 우수한 항균 활성을 갖는다.

화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체는 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용할 수 있다. 염으로는 약제학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하고, 유리산으로 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산, 인산, 바람직하게는 염산을 사용할 수 있다. 유기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산, 바람직하게는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체는 약제학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 2의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴 등에 녹이고, 과량의 유기산 또는 무기산의 산 수용액을 가한 후, 침전시키거나 결정화시켜 제조할 수 있다. 이 후, 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나, 석출된 염을 흡인 여과시켜 부가염을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체는,

1) 버지니아마이신M1을 포함하는 배지에서 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주를 배양하는 단계; 및

2) 상기 배지로부터 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체를 추출하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

보다 구체적으로, 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체는,

1) 버지니아마이신M1을 첨가한 배지에서 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하는 단계

2) 단계 1)에서 배양된 배양액을 유기 용매로 추출하는 단계

3) 단계 2)의 유기 용매 추출물을 진공 하에 농축시키는 단계 및

4) 단계 3)의 잔여물을 유기 용매로 용해시킨 후 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

상기 방법에서, 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezuelae)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에서, 단계 2)의 유기 용매는 에틸아세테이트(EtOAc)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에서, 단계 4)의 유기 용매는 메탄올(MeOH)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에서, 단계 4)의 분리는 크로마토그래피를 이용할 수 있으며, HPLC을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 일 예로, preparative HPLC를 이용하여 유지시간(Retention time) 25 내지 27분에서 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체를 분리할 수 있었다.

상술한 제조 방법은 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) 토양 미생물을 이용한 바이오 생전환 기술을 활용하는 경우를 예시하고 있으나, 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체를 제조하는 방법은 이로 제한되지 않으며 화학적 합성법에 의해서도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식2의 스트렙토그라민 A 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 항생 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항생 조성물은 항세균용 조성물인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항생 조성물은 항생제-내성 균주, 바람직하게 항생제-내성 황색포도상구균 종, 보다 바람직하게 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA) 종에 대해 우수한 항생 활성을 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 항생 조성물은 황색포도상구균 종, 바람직하게 항생제-내성 황색포도상구균 종, 보다 바람직하게 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA) 종에 대해 우수한 항균 활성을 갖는다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 항생 조성물은 임상 투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화 되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등을 포함하고, 이들 제형은 유효 성분 이외에 희석제(예, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있고, 필요에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함유할 수 있다.

화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체를 유효 성분으로 하는 항생 조성물은 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

비경구 투여용 제형으로 제제화 하기 위하여 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항생 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화 될 수 있다.

또한, 화학식 2의 스트렙토그라민 A 유도체의 인체 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 /일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 /일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 실시예를 제시한다.

그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 스트렙토그라민 A 유도체의 제조

<1-1> 스트렙토그라민 A의 생물전환

피크로마이신 폴리케타이드 합성효소(pikromycin polyketide synthase)를 암호화하는 유전자 및 데소사민(desosamine) 생합성 유전자가 모든 제거된, S. venezuelae YJ028의 재조합 돌연변이 종[비특허문헌 10에 기재된 종을 사용]을 우선, SPA(sorbitol pyroglutamic acid) 아가 플레이트[0.1% 효모 추출물, 0.1% 쇠고기 추출물, 0.2% 트립토즈(tryptose), 1.0% 글루코즈(glucose), 1.5% 아가, 및 미량의 FeSO₄]에서 분리를 위해 획선화(streak)한 다음, 2일 동안 30에서 배양하였다. 그 후, 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 30에서 2일 동안 50 ml의 SCM 배지[1.5% 수용성 전분(soluble starch), 2.0% 소이톤(soytone), 0.01% CaCl₂, 0.15% 효모 추출물(yeast extract), 및 1.0% MOPS]에서 배양된 배양액에 버지니아마이신M1(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가(250 ; 최종 농도 5 /mL; 100 uL의 MeOH로 용해된)한 다음, 3일 동안 더 배양하였다. 모든 실험은 적어도 세 번 독립적으로 수행하였다.

<1-2> 스트렙토그라민 A 유도체의 추출 및 분리

실시예 <1-1>의 전체 배양액을 250 mL의 분별 깔때기에서 두 번 평균 부피의 EtOAc(Ethyl acetate)를 이용하여 추출 및 분리한 다음, 상기 유기체 추출물을 진공 하에 농축시켰다. 건조된 잔여물을 즉시 200 uL의 MeOH(Methanol)로 용해시켰으며, 상기 용매의 일부를 분석에 이용하였다. 우선, Micromass Quattro micro MS에 직접 연결된 분석 역상 Nova-Pak C₁₈ 컬럼(Waters, Milford, MA; 150×3.9 mm, 4.0 m)으로 구성된 Waters/Micromass Quattro micro/MS 접속기를 이용하여 분석을 수행하였다.

그 결과, YJ028 종의 여러 배치 배양액으로 버지니아마이신M1을 첨가함으로써, 버지니아마이신M1에 대응하는 환원된 스트렙토그라민 A 유도체가 약 20%의 변환율로 발생하는 것을 확인하였다(도 1 참조).

스트렙토그라민 A 유도체는, 분취 역상 HPLC로부터 수집된 각 분획(5 mL/분획)의 연속적 ESI-MS 분석을 이용한 크로마토그래피 분리에 의해 정제되었다. 스트렙토그라민 A 유도체의 화학적 구조는 ¹H- 및 ¹³C-NMR 분광 분석법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 크로마토그래피 분리는 Watchers 120 ODS-BP 컬럼(250×10.0 mm, 5.0 m)으로 구성된 preparative HPLC를 이용하여 수행하였다. 또한, ¹H- 및 ¹³C-NMR 분광 분석법은 다음과 같이 수행하였다. NMR 시료들은 200 uL의 d₆-DMSO에서 스트렙토그라민 A 유도체를 용해시킨 후, 상기 용매에 적절한 5 mm Shigemi advanced NMR 마이크로튜브(Sigma, St. Louis, MO)에 상기 용매를 방치시킴으로써 제조하였다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 Varian INOVA 500 분광광도계를 이용하여 298 K에서 획득하였고, 화학적 이동은 내부 준거로서 TMS(Trimethyl Silane)를 이용하여 ppm(parts per milion)으로 기록되었다. 모든 NMR 데이타 산출은 Mnova Suite 5.3.2 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

양성자 분자 이온을 나타내는 m/z 526.3에서 버지니아마이신M1의 MS/MS 스텍트럼은 m/z 508.8 및 355.2에서 두개의 주요 절편 이온들을 보여주었다. 반면, 생전환 유도체의 MS/MS 스텍트럼은 버지니아마이신M1의 전형적인 m/z 355.2 절편 이온을 보여줄 뿐만 아니라, 버지니아마이신M1으로부터 생성된 m/z 508.8 생성 이온과 2 Da이 차이가 나는 m/z 510.8에서 특이적인 생성 이온을 보여주었다(도 2 참조). 이런 결과는 버지니아마이신M1 유도체에서 C-5,6에 존재하는 이중 결합이 없어진 것을 제시한다.

버지니아마이신M1 및 그의 환원된 유도체의 ¹H-NMR 분광 데이타의 비교를 통해, 스트렙토그라민 A 유도체에서 관찰되는 가장 명백한 변화는, 버지니아마이신M1 내 올레핀 프로톤(olefinic proton)(H-5,6)에 대한 전형적인 6.08 및 6.59 ppm의 신호의 결핍이었다. 모 화합물(parent compound) 버지니아마이신M1의 C-5 및 C-6 신호(각각 123.5 및 149.3 ppm에서 39.4 및 27.2 ppm)의 업필드 이동(upfield shift)은 ¹H-NMR 데이타를 통해 확인된 차이를 지지하는 것이며, 이는 버지니아마이신M1의 생전환 유도체에서 C-5,6 이중 결합이 없어졌음을 입증한다(도 3 참조). 이런 결과는 5,6-디하이드로버지니아마이신M1(5,6-dihydrovirginiamycin M1)에 대한 버지니아마이신M1 위한 부위 선택인 활성(regio-selective activity)을 포함하는 S. venezuelae에 의해 스트렙토그라민 A 유도체가 버지니아마이신M1으로부터 생전환이 되는 것을 보여준다.

< 실시예 2> 스트렙토그라민 A 유도체의 항세균 활성 확인

스트렙토그라민 A 유도체의 항MRSA 활성을 알아보기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, USA)로부터 메티실린감수성 황색포도상구균(Methicillin-susceptable Staphylococcus aureus; MSSA) 1종 (ATCC 6538)과 메티실린내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant Stahphylococcus aureus; MRSA) 2종(ATCC 33592와 ATCC 43300)을 확보하여 항세균 활성을 확인하였다.

구체적으로, 2종의 MRSA를 28에서 Mueller-Hinton broth(Difco, BD Biosciences, San Jose, CA)에서 배양 및 유지시켰다. 그런 다음, 버지니아마이신M1(VM) 및 5,6-디하이드로버지니아마이신M1(5,6-dihydroVM)을 배지에 처리하였다. 임상 및 실험 표준화 기관(Clinical and Laboratory Standard Institute; CLSI)에 의해 권장되는 미량 희석법(microdilution method)을 이용하여, MRSA에 대한 항세균 활성을 측정하였다. 각 처리구의 최종 농도가 0.125-128 /mL가 되도록 DMSO를 이용하여 연속 2배 희석하였고, DMSO의 부분 표본(최종 0.1%)은 음성 대조군으로 사용하였다. MSSA와 MRSA의 성장은 Labsystems Bioscreen C 리더기를 이용하여 600 nm에서 모니터하였으며, 시험 미생물의 성장을 억제하는 broth 배지에서 희석된 버지니아마이신M1 및 5,6-디하이드로버지니아마이신M1의 최저 농도를 MIC(Minimum Inhibitory Concentration)로 결정하였다. 모든 분석은 적어도 세 번 이상 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 5,6-디하이드로버지니아마이신M1은 항세균 활성, 특히 메티실린내성 황색포도상구균에 대하여 버지니아마이신M1과 비교하여 2배로 향상된 항세균 활성을 나타내었다. 이는 버지니아마이신M1에서 C5,6-이중 결합의 결핍이 항세균 활성에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있으며(도 4 참조), 본 발명의 5,6-디하이드로버지니아마이신M1을 항생제 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 5,6-디하이드로버지니아마이신M1은 버지니아마이신M1에 비하여 향상된 항세균 활성, 특히 항내성 항세균 활성을 나타내므로, 슈퍼박테리아 대응용 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.

결론적으로, 본 발명은 신규 스트렙토그라민 A 유도체 및/또는 동족체를 생산하기 위해 일반적으로 사용되는 전- 또는 반-합성법 대신에, 미생물에 의한 바이오 생전환 기술을 이용하여 스트렙토그라민 유도체를 제공할 수 있다.

결론적으로, 본 발명은 신규 스트렙토그라민 A 유도체 및/또는 동족체를 생산하기 위해 일반적으로 사용되는 전- 또는 반-합성법 대신에, 미생물에 의한 생전환 기술을 이용하여 스트렙토그라민 A 유도체를 제공할 수 있다. 또한, 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezueale)의 부위 특이적 바이오-수소화 활성이 다양한 마크로라이드계 화합물에 적용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 5,6-디하이드로버지니아마이신M1은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 5,6-디하이드로버지니아마이신M1을 활성 성분으로 함유시킨 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 정제(직접 가압)

활성 성분 5.0 을 체로 친 후, 락토스 14.1 , 크로스포비돈 USNF 0.8 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

< 제제예 2> 정제(습식 조립)

활성 성분 5.0 을 체로 친 후, 락토스 16.0 과 녹말 4.0 을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

< 제제예 3> 분말과 캡슐제

활성 성분 5.0 을 체로 친 후, 락토스 14.8 , 폴리비닐 피롤리돈 10.0 , 마그네슘 스테아레이트 0.2 와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

< 제제예 4> 주사제

활성 성분 100 mg을 함유시키고, 그 밖에 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

Claims

하기 화학식의 스트렙토그라민 A 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
[화학식]

.
제1항에 있어서, 버지니아마이신M1으로부터 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주에 의해 생전환된 스트렙토그라민 A 유도체.
스트렙토그라민 A 유도체를 버지니아마이신M1으로부터 제조하는 방법에 있어서,
상기 버지니아마이신M1을 포함하는 배지에서 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주를 배양하는 단계; 및
상기 배지로부터 하기 화학식의 스트렙토그라민 A 유도체를 추출하는 단계를 포함하는 방법:
[화학식]

.
제3항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)를 포함하는 방법.
하기 화학식의 스트렙토그라민 A 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 항생 조성물:
[화학식]

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제5항에 있어서, 메티실린-내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant Stahphylococcus aureus; MRSA)에 대해 활성을 갖는 항생 조성물.
삭제
제5항에 있어서, 상기 스트렙토그라민 A 유도체는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주에 의해 버지니아마이신M1으로부터 생전환된 스트렙토그라민 A 유도체인 항생 조성물.