KR101510970B1 - Electrochemical immunosensing biosensor using enzymic action and method and kit for detecting microoraganism using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 펩티도글리칸 층 분해효소를 이용하여 분절시킨 미생물의 펩티도글리칸 조각과 전극의 표면에 고정시킨 항체의 면역반응에 의한 전기화학적 신호증폭을 유도하는 바이오센서와 이를 이용한 미생물 검출방법 및 미생물 검출키트에 관한 것이다.The present invention relates to a biosensor for inducing an electrochemical signal amplification by an immune reaction between a piece of peptidoglycan of a microorganism segmented by using a peptidoglycan layer degrading enzyme and an antibody immobilized on the surface of an electrode, and a microorganism detection method using the biosensor And a microorganism detection kit.
전통적으로 병원성 미생물의 정량분석에 있어서 가장 표준화된 방법은 확산평판법(spread-plate method)과 같이 미생물이 포함된 시료를 배양한 후 평판배지에 도말하여 콜로니의 수를 계수하는 검정방법이다. 그러나 상기 검정방법은 오랜 배양시간이 요구되며 복잡한 배양과정이 필요하기 때문에 신속한 미생물 검출에는 적합하지 않다. Traditionally, the most standardized method for the quantitative analysis of pathogenic microorganisms is a method of counting the number of colonies by culturing a microbial-containing sample such as a spread-plate method, and then plated on a plate medium. However, the above assay method is not suitable for rapid microbial detection because a long incubation time is required and a complicated culture process is required.
상기 문제점을 해결하기 위한 방법으로 신속한 병원성 미생물의 검출을 위해서 측방유동 면역분석 키트가 사용되고 있으나, 측정하고자 하는 미생물의 존재 유무 또는 대략적인 농도 범위만을 제공하며 정량분석에 있어서 낮은 정확도가 문제가 되고 있다. 또한 보다 정확하고 빠른 검사를 위하여 효소면역결합 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)이나, 중합효소 연쇄 반응기법(Polymerase Chain Reaction; PCR)등이 사용되고 있으나 상기 방법은 높은 검사 단가와 휴대가 불리한 장비 구조의 문제를 가지고 있다.As a method for solving the above problem, a lateral flow immunoassay kit is used for the rapid detection of pathogenic microorganisms. However, the present invention provides only a concentration range or approximate concentration range of microorganisms to be measured and low accuracy in quantitative analysis is a problem . In addition, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and polymerase chain reactions (PCR) have been used for more accurate and rapid inspections. However, It has a problem of structure.
때문에 보다 저렴한 비용과 현장 진단에 적합하도록 신속하고 정확한 병원성 미생물 정량분석기술의 개발이 요구되어짐에 따라, 최근 전기화학적인 방법을 이용한 병원성 미생물 면역검출기술의 개발이 주목받고 있다.Therefore, development of a pathogenic microorganism immunoassay technology using an electrochemical method has been attracting attention as it is required to develop a rapid and accurate pathogenic microorganism quantitative analysis technique to be more suitable for inexpensive cost and on-site diagnosis.
상기 전기화학적 방법으로 표적 미생물에 특이적인 항체가 고정된 전극에 분석대상시료를 처리하여 선택적으로 표적 미생물을 전극 표면에 결합시킴으로써 발생하는 전류, 저항 및 전하량과 같은 전기화학적 신호들을 분석하여 미생물의 농도를 정량하는 방법으로 상대적으로 매우 신속하고 정확한 미생물 검사가 가능하게 되었다.By electrochemically analyzing the electrochemical signals such as current, resistance and charge generated by selectively immobilizing the target microorganism on the electrode surface by treating the sample to be analyzed with an electrode having a specific antibody specific to the target microorganism, , Which allows relatively fast and accurate microbial testing.
그러나 일반적으로 미생물을 전기화학적인 방법으로 검출할 때에는 파쇄되지 않은 온전한 형태의 미생물을 검출하게 되는데, 미생물의 경우 보통 1 μm 정도의 크기이며, 항체는 10 내지 15 nm의 크기로 미생물과 항체의 크기 차이 및 미생물의 모양에 인한 면역센싱 표면의 반응에 참여하지 못하는 항체 또는 미생물이 존재할 수 있다.However, when the microorganisms are generally detected by electrochemical methods, the microorganisms which are not broken down are detected as the whole microorganisms. The size of the microorganisms is usually about 1 μm, the size of the antibody is 10 to 15 nm, There may be antibodies or microorganisms that do not participate in the response of the immune sensing surface due to differences and the shape of the microorganism.
따라서 전극 표면의 계면 저항의 변화를 관찰하는 임피던스 측정 방식을 통한 전기화학적인 미생물 측정 방법의 경우 면역센싱 표면의 미생물 검출 민감도가 낮아지며 이러한 문제점을 해결하기 위해 민감도 증가를 위한 개선이 필요한 실정이다. Therefore, in the case of an electrochemical microorganism measurement method using an impedance measurement method for observing the change of the interface resistance of the electrode surface, the sensitivity of detecting the microorganism on the surface of the immune sensing surface is lowered. In order to solve such a problem, improvement is required for increasing the sensitivity.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 미생물에 효소를 처리하여 분절시킨 미생물의 펩티도글리칸 조각과, 검출하고자 하는 미생물과 면역결합을 하는 항체를 이용하여 전극의 표면에 면역센싱을 형성함으로써, 전기화학적 임피던스 신호를 증폭시킬 수 있는 미생물 검출용 바이오센서와 이를 이용한 미생물 검출방법 및 미생물 검출키트를 제공하고자 한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for detecting a microorganism, comprising the steps of: forming an immunosensitivity on the surface of an electrode using a peptidoglycan fragment of a microorganism obtained by treating the microorganism with an enzyme and an antibody that immunoreacts with the microorganism to be detected; A biosensor for detecting a microorganism capable of amplifying an electrochemical impedance signal, a microorganism detection method using the same, and a microorganism detection kit.
본 발명은 전극; 상기 전극 상에 형성된 자가 조립 단분자막; 상기 단분자막 상에 형성되며 항체를 포함하는 포획자층; 및 상기 포획자층 상에 형성되며, 미생물에 효소를 처리하여 형성된 분절한 펩티도글리칸 분절층을 포함하는 전기화학적 미생물 면역센싱 바이오센서를 제공한다.The present invention relates to an electrode; A self-assembled monolayer formed on the electrode; A trapping layer formed on the monomolecular film and including an antibody; And a segmented peptidoglycan segmented layer formed on the trapping layer and formed by treating the microbe with an enzyme. The present invention also provides an electrochemical microbial immunosensing biosensor.
다른 구체예로 전극 표면상에 검출할 미생물과 결합할 수 있는 항체를 고정시키는 단계; 검출할 미생물에 효소를 처리하여 펩티도글리칸층을 분절하여 펩티도글리칸 조각을 얻는 단계; 및 상기 항체와 상기 펩티도글리칸 조각 간의 면역학적 결합을 통해 전기화학적 임피던스 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는, 전기화학적 미생물 면역센싱을 이용한 검출방법을 제공한다.Fixing the antibody capable of binding to the microorganism to be detected on the surface of the electrode; Treating the microorganism to be detected with an enzyme to segment the peptidoglycan layer to obtain a peptidoglycan fragment; And amplifying an electrochemical impedance signal through immunological association between the antibody and the peptidoglycan fragment. The present invention also provides a detection method using electrochemical microbial immunosensing.
보다 상세하게는 상기 펩티도글리칸층 분절은 미생물 102 내지 107 CFU/mL 농도의 세균 용액과 1 내지 20㎍/mL의 효소를 10:1(v/v)로 10 내지 20분간 반응시켜 분절할 수 있다. More specifically, the peptidoglycan layer segment is prepared by reacting a bacterial solution having a concentration of 10 2 to 10 7 CFU / mL with 1 to 20 μg / mL of an enzyme at a ratio of 10: 1 (v / v) can do.
상기 효소는 라이소스타핀 및 라이소자임으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The enzyme may be selected from the group consisting of lysostaphin and lysozyme.
상기 미생물은 그램 양성 미생물일 수 있다.The microorganism may be a gram-positive microorganism.
상기 그램 양성 미생물은 디프테리아균, 나병균, 방선균, 파상풍균, 폐렴균, 포도상구균 및 탄저균으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The gram-positive microorganism may be selected from the group consisting of Diphtheria, Leprosy, Actinomycetes, Tetanus, Pneumococcus, Staphylococcus, and Anthrax.
상기 항체는 단일클론 항체일 수 있다.The antibody may be a monoclonal antibody.
또 다른 구체예로 상기 바이오센서 또는 상기 검출방법을 이용한 미생물 검출키트를 제공할 수 있다.As another embodiment, the microorganism detection kit using the biosensor or the detection method can be provided.
본 발명에 의하면, 효소에 의해 분절된 미생물의 펩티도글리칸 조각과 검출하고자 하는 미생물에 특이적으로 반응하는 항체를 고정시켜 형성한 면역센싱 바이오센서 또는 이를 이용한 검출방법을 이용하면, 미생물과 항체의 모양 및 크기 차이로 인하여 낮게 나타났던 면역결합을 증가시킬 수 있으며, 그에 따른 전극표면의 계면저항 변화를 증가시켜 전기화학적 임피던스 신호를 증폭을 유도할 수 있음으로, 신속하고 정확한 미생물 검출용 바이오센서 또는 이를 이용한 미생물 검출방법 및 검출키트를 제공할 수 있다. According to the present invention, by using an immunosensing biosensor formed by immobilizing an antibody specifically reacting with a piece of peptidoglycan of a microorganism separated by an enzyme and a microorganism to be detected or a detection method using the biosensor, Which is lowered due to the difference in shape and size of the electrode, thereby increasing the change in the interface resistance of the electrode surface, thereby inducing the amplification of the electrochemical impedance signal. Therefore, the biosensor for rapid and accurate detection of microorganisms Or a microorganism detection method and a detection kit using the same.
도 1은 그램 양성균인 포도상구균의 펩티도글리칸 구조와 라이소스타핀 활성 부위를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 면역센싱 표면 제작 과정을 나타낸 모식도로 ①은 금, 카본, 및 전도성 고분자와 같은 전도성 지지체를 이용한 전극이며, ②는 자가 조립 단분자막이며, ③은 단일클론 항체를 이용한 포획자 층이고, ④는 에탄올아민과 같은 차단제이며, ⑤는 검출하고자 하는 온전한 형태의 미생물이고, ⑥은 라이소스타핀 또는 라이소자임과 같은 펩티도글리칸 분해 효소를 처리하는 과정이고, ⑦은 분절된 펩티도글리칸 조각이며, ⑧은 펩티도글리칸 분해 효소에 의해 파쇄된 미생물을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 면역센싱 표면의 포도상구균 농도에 따른 계면저항 변화를 확인하기 위해 수행한 임피던스 측정 결과이다.
도 4는 혼합된 이종미생물 균주 시료에서 포도상구균의 선택적인 검출효과를 확인하기 위해 수행한 임피던스 측정 결과이다.Fig. 1 is a diagram showing a peptidoglycan structure and a lysostatin active site of Staphylococcus aureus, which are Gram-positive bacteria.
FIG. 2 is a schematic view illustrating a process of preparing the immunosensing surface of the present invention. FIG. 2 (a) is an electrode using a conductive support such as gold, carbon, and a conductive polymer, 2 is a self-assembled monolayer, , ④ is a blocker such as ethanolamine, ⑤ is a complete microorganism to be detected, ⑥ is a process for treating a peptidoglycan degrading enzyme such as lysostaphin or lysozyme, ⑦ is a process for treating a fragmented peptido Glycan fragment, and (8) represents a microorganism disrupted by a peptidoglycan degrading enzyme.
FIG. 3 is a graph showing impedance measurements performed to confirm the change in interface resistance according to the concentration of Staphylococcus aureus on the immunosensing surface of the present invention.
FIG. 4 shows the results of impedance measurements carried out in order to confirm the selective detection effect of Staphylococci in mixed microbial strains.
본 발명은 전극; 상기 전극 상에 형성된 자가 조립 단분자막; 상기 단분자막 상에 형성되며 항체를 포함하는 포획자층; 및 상기 포획자층 상에 형성되며, 미생물에 효소를 처리하여 형성된 분절한 펩티도글리칸 분절층을 포함하는 전기화학적 미생물 면역센싱 바이오센서를 제공한다.The present invention relates to an electrode; A self-assembled monolayer formed on the electrode; A trapping layer formed on the monomolecular film and including an antibody; And a segmented peptidoglycan segmented layer formed on the trapping layer and formed by treating the microbe with an enzyme. The present invention also provides an electrochemical microbial immunosensing biosensor.
다른 구체예로 전극 표면상에 검출할 미생물과 결합할 수 있는 항체를 고정시키는 단계; 검출할 미생물에 효소를 처리하여 펩티도글리칸층을 분절하여 펩티도글리칸 조각을 얻는 단계; 및 상기 항체와 상기 펩티도글리칸 조각 간의 면역학적 결합을 통해 전기화학적 임피던스 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는, 전기화학적 미생물 면역센싱을 이용한 검출방법을 제공한다.Fixing the antibody capable of binding to the microorganism to be detected on the surface of the electrode; Treating the microorganism to be detected with an enzyme to segment the peptidoglycan layer to obtain a peptidoglycan fragment; And amplifying an electrochemical impedance signal through immunological association between the antibody and the peptidoglycan fragment. The present invention also provides a detection method using electrochemical microbial immunosensing.
보다 상세하게는 상기 펩티도글리칸층 분절은 미생물 102 내지 107 CFU/mL 농도의 세균 용액과 1 내지 20㎍/mL의 효소를 10:1(v/v)로 10 내지 20분간 반응시켜 분절할 수 있다. More specifically, the peptidoglycan layer segment is prepared by reacting a bacterial solution having a concentration of 10 2 to 10 7 CFU / mL with 1 to 20 μg / mL of an enzyme at a ratio of 10: 1 (v / v) can do.
상기 효소는 라이소스타핀 및 라이소자임으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The enzyme may be selected from the group consisting of lysostaphin and lysozyme.
보다 상세하게는 라이소스타핀은 그램 양성 미생물인 포도상구균과, 포도상구균의 펩티도글리칸에 특이적으로 활성을 갖는 분해효소로 도 1과 같이 포도상구균 펩티도글리칸 내의 펜타글리신 가교다리의 세 번째와 네 번째 글리신 사이의 활성부위를 통하여 펩티도글리칸을 분절하지만, 인간 세포 독성은 유발하지 않는다.In more detail, lysostaphin is a gram-positive microorganism, staphylococcus, and a protease which is specifically active in peptidoglycan of Staphylococcus. As shown in Fig. 1, pentaglycine bridge of staphylococcal peptidoglycan Separates the peptidoglycan through the active site between the third and fourth glycine, but does not induce human cytotoxicity.
또한 라이소자임은 미생물의 세포벽 펩티도글리칸의 N-아세틸글루코사민과 N-아세틸무람산 사이의 β-1,4 무라미드 결합을 가수분해하여 그램 양성 미생물을 비롯하여 대장균, 살모넬라 등의 그램 음성 미생물의 세포벽을 분해하는 기능을 가진 효소이다. The lysozyme also hydrolyzes the? -1,4-muramide bond between N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid in the cell wall peptidoglycan of the microorganism, thereby forming gram-positive microorganisms as well as the cell walls of Gram negative microorganisms such as Escherichia coli and Salmonella It is an enzyme that has the function of decomposing.
상기 미생물은 그램 양성 미생물일 수 있다.The microorganism may be a gram-positive microorganism.
상기 그램 양성 미생물은 디프테리아균, 나병균, 방선균, 파상풍균, 폐렴균, 포도상구균 및 탄저균으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The gram-positive microorganism may be selected from the group consisting of Diphtheria, Leprosy, Actinomycetes, Tetanus, Pneumococcus, Staphylococcus, and Anthrax.
상기 항체는 단일클론 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. The antibody may be a monoclonal antibody.
보다 상세하게는 본 발명의 바이오센서의 면역센싱 표면은 도 2와 같이 구성될 수 있다.More specifically, the immunosensing surface of the biosensor of the present invention can be configured as shown in FIG.
먼저 전극(①)에 자가 조립 단분자막(②)을 형성하고 미생물의 펩티도글리칸 구조를 특이적으로 인식하여 포획하는 단일클론 항체(③)를 고정시켰다. 항체 고정 후 포획자와 반응하지 않은 자가 조립 단분자막의 잔기들을 에탄올아민과 같은 차단제(④)를 이용하여 차단시킨 후 바이오센서의 면역센싱 표면을 형성하였다.First, a monoclonal antibody (③) that specifically recognizes and captures the peptidoglycan structure of a microorganism is immobilized on the electrode (1) by forming a self - assembled monolayer (②). The immobilized surface of the biosensor was formed by blocking the residues of the self - assembled monolayer that did not react with the captor after immobilization of the antibody using a blocking agent (④) such as ethanolamine.
상기 과정으로 제작된 면역센싱 표면에 펩티도글리칸 분해효소(⑥)에 의해 분절된 펩티도글리칸 조각들(⑦)을 면역센싱 표면에 고정된 포획자들인 단일클론 항체와 반응시켜 특이적으로 결합시켰다.The peptidoglycan fragments (⑦) separated by the peptidoglycan degrading enzyme (⑥) on the immunosensing surface prepared in the above process are reacted with monoclonal antibodies which are captors immobilized on the immune sensing surface, Lt; / RTI >
이후 전극의 계면저항을 이용한 전기화학적 측정방식인 임피던스 측정을 통하여 면역센싱 표면의 포도상구균 농도에 따른 계면저항 변화를 관찰한 결과 도 3과 같이 포도상구균의 농도가 증가할수록 면역센싱 표면의 계면저항성이 증가하였으며 라이소스타핀을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 라이소스타핀에 의해 분절된 펩티도글리칸 시료의 계면저항성이 90%까지 증가하였다.As a result of observing the change of interfacial resistance according to the concentration of staphylococci on the surface of the immunosensor through the impedance measurement, which is an electrochemical measurement method using the interfacial resistance of the electrode, the interfacial resistance of the immune sensing surface And increased the interfacial resistance of the peptidoglycan sample fractionated by lysostaphin up to 90% compared to the lysostaphin-treated control.
또한 본 발명의 면역센싱 표면의 검출하고자 하는 미생물에 대한 민감성을 확인하기 위하여 이종미생물을 혼합한 시료의 임피던스 측정결과, 도 4와 같이 대조군인 포도상구균만 들어있는 시료와 모든 세트의 혼합시료의 계면저항성이 동일한 양상을 나타내는 것을 확인하였으며, 상기 결과로부터 검출하고자 하는 미생물에 대한 높은 민감성을 확인하였으며, 본 발명을 통하여 구현된 바이오센싱 시스템은 검출할 미생물에 대한 높은 선택성을 나타낼 수 있음이 확인되었다.In order to confirm the sensitivity of the immune sensing surface of the present invention to the microorganism to be detected, the impedance of the sample mixed with the heterologous microorganism was measured as follows. As shown in FIG. 4, The results show that the biosensing system of the present invention can exhibit a high selectivity for the microorganisms to be detected.
또 다른 구체예로 상기 바이오센서 또는 상기 검출방법을 이용한 미생물 검출키트를 제공할 수 있다.
As another embodiment, the microorganism detection kit using the biosensor or the detection method can be provided.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
<< 실시예Example 1> 1> 펩티도글리칸Peptidoglycan 층 layer 분절화Segmentation
그람 양성세균인 포도상구균과 포도상구균의 펩티도글리칸에 특이적으로 활성을 갖는 분해효소인 라이소스타핀을 시그마(Sigma-Aldrich)에서 구입하여 사용하였다.Lysostaphin, a degrading enzyme that is specifically active for gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus and Staphylococcus aureus peptidoglycan, was purchased from Sigma-Aldrich.
먼저, 102 내지 107 CFU/mL 농도의 포도상구균 용액과 10㎍/mL 농도의 라이소스타핀을 10:1(v/v)의 비율로 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜 포도상구균의 펩티도글리칸 층을 분절하였다. First, a solution of Staphylococcus aureus at a concentration of 10 2 to 10 7 CFU / mL and lysostaphin at a concentration of 10 μg / mL was mixed at a ratio of 10: 1 (v / v) Of the peptidoglycan layer.
<< 실시예Example 2> 2> 면역센싱Immune Sensing 표면 제작 Surface preparation
도 2와 같은 과정으로 면역센싱 표면을 제작하였다.The immune sensing surface was prepared as shown in FIG.
금 전극을 황산(H2SO4)과 과산화수소(H2O2)를 4:1의 비율로 혼합한 용액에 5분간 담그고 3차 증류수로 세척하여 금 전극 표면의 불순물을 제거하였다.The gold electrode was immersed in a solution of sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in a ratio of 4: 1 for 5 minutes, and washed with third distilled water to remove impurities on the surface of the gold electrode.
상기 금 전극에 포획자를 고정하기 위하여 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시킨 5 mM 3,3'-디티오디프로피오닉 액시드 디(N-하이드록시석신이미드 에스테르)(DTSP)를 사용하여 2 시간 동안 자가 조립 단분자막을 형성하였다. 상기 반응이 끝난 후에 DMSO, 에탄올, 3차 증류수의 순서로 전극을 세정하고 포도상구균의 펩티도글리칸 구조를 인식하는 20㎍/mL 농도의 단일클론 항체를 1시간 동안 반응시켜 전극 표면에 포획자 층을 형성하였다.5
상기 포획자를 고정시킨 후 포획자와 반응하지 않는 자가조립 단분자막의 미반응 잔기는 10 mM 에탄올아민을 30분 동안 반응시켜 차단시키고 면역센싱 표면을 형성하였다.The unreacted residues of the self-assembled monolayer, which did not react with the captor after immobilization of the captor, were blocked by blocking with 10 mM ethanolamine for 30 minutes to form an immune sensing surface.
<< 실시예Example 3> 임피던스 측정 및 계면저항 변화 확인 3> Measurement of impedance and change of interfacial resistance
1. 세균 농도에 따른 계면저항 변화 확인1. Identification of interfacial resistance change according to bacterial concentration
상기 실시예 1의 방법으로 분절된 농도별 포도상구균의 펩티도글리칸 조각을 실시예 2와 같이 제작된 면역센싱 표면에 10분간 반응시켜 펩티도글리칸 조각과 포획자 사이에 특이적 결합이 일어나도록 하였다. 면역반응 후 세척을 통하여 반응하지 않은 펩티도글리칸 조각을 제거한 후 전기화학적 측정 방식인 임피던스 측정을 통하여 면역센싱 표면에서 포도상구균 농도에 따른 계면저항의 변화를 살펴보았다.Peptidoglycan fragments of Staphylococcus aureus at different concentrations separated by the method of Example 1 were reacted for 10 minutes on the prepared immunosensing surface as in Example 2, resulting in specific binding between peptidoglycan fragments and captors Respectively. After removing the unreacted peptidoglycan fragments by washing after the immune reaction, the change of the interface resistance according to the staphylococcal concentration on the immune sensing surface was examined by measuring the impedance which is an electrochemical measurement method.
임피던스 측정은 50000 내지 1 Hz 의 주파수 범위(frequency range), 0.17 V의 초기 전압(initial potential)과 0.01 V의 진폭(amplitude)에서 수행하였으며, 전해질 용액으로는 0.1M의 염화칼륨 용액에 5 mM의 페리시아나이드를 녹여 사용하였다.Impedance measurements were carried out at a frequency range of 50000 to 1 Hz with an initial potential of 0.17 V and an amplitude of 0.01 V and a solution of 0.1 M potassium chloride in a solution of 5 mM ferric chloride The cyanide was dissolved and used.
그 결과 도 3을 참고하면, 상기 실시예와 같이 효소에 의해 펩티도글리칸을 분절시킨 시료의 임피던스 신호 민감도가 대조군인 세포벽을 분절하지 않은 포도상구균 시료의 전기화학적 임피던스 신호보다 90% 증가 된 것을 확인할 수 있었다. As a result, referring to FIG. 3, it was found that the impedance signal sensitivity of a sample in which peptidoglycan was segmented by an enzyme was 90% higher than the electrochemical impedance signal of a non-segmented staphylococcal sample as a control group I could confirm.
또한 초음파를 이용하여 물리적으로 세포벽을 파쇄한 포도상구균 시료의 신호 민감도와 라이소스타핀을 이용하여 세포벽을 분절시킨 포도상구균 시료의 신호 민감도에서는 큰 차이를 나타내지는 않았으나, 초음파 처리과정이 약 2시간 이상 소요되며 추가적인 전문 장비가 필요함을 고려할 때, 효소 반응을 이용한 펩티도글리칸 분절화 기술이 미생물검출 신호의 민감도 증진에 더욱 효과적임을 확인할 수 있었다.In addition, the signal sensitivity of staphylococcal samples with physically disrupted cell walls using ultrasound and the signal sensitivity of staphylococcal isolates using lysostaphin were not significantly different, but the ultrasonication process took about 2 hours And the need for additional specialized equipment, it was confirmed that the peptidoglycan segmentation technique using the enzyme reaction is more effective in increasing the sensitivity of the microbe detection signal.
2. 다른 종의 세균 시료에 따른 신호간섭 확인2. Identification of signal interference according to bacterial samples of other species
상기 효소를 이용한 펩티도글리칸 분절화 기술을 이용한 미생물 검출방법에서 다른 종의 미생물시료에 의한 신호간섭의 여부를 확인하기 위하여 4종류의 혼합 미생물시료를 이용하여 전기화학적 임피던스 분석을 수행하였다.In order to confirm the signal interference by microbial samples of other species in the microorganism detection method using the peptidoglycan segmentation technique using the enzyme, electrochemical impedance analysis was performed using four kinds of mixed microbial samples.
이종 미생물로 그램 음성 미생물인 Escherichia coli (E. coli)와 그램 양성미생물인 Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum)을 사용하였으며, 도 4의 표와 같이 포도상구균 단독 시료, 포도상구균과 E. coli 혼합시료, 포도상구균과 C. glutamicum 혼합시료 및 포도상구균, E. coli , C. glutamicum 가 모두 들어 있는 혼합시료를 사용한 4세트의 시료를 이용하였으며 첨가된 이종 미생물의 농도는 106 CFU/mL로 고정하였다. 또한 이종미생물의 세포벽 와해를 위하여 라이소스타핀과 동일한 조건으로 20㎍/mL의 라이소자임 효소를 20분간 처리하였으며, 각각의 미생물 혼합조건에서 포도상구균(S. aureus)의 농도를 0, 102, 104, 106 CFU/mL로 변화시켜 (amplitude) 상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 임피던스 분석을 수행하였다.As a heterologous microorganism,Escherichia coli (E. coli) And gram-positive microorganismsCorynebacterium glutamicum (C. glutamicum), And as shown in the table of Fig. 4, a single sample of staphylococci,E. coli Mixed samples, Staphylococcus aureusC. glutamicumMixed samples and staphylococci,E. coli , C.I. glutamicum Were used. The concentration of the added microorganism was 106 CFU / mL. In addition, for the cell wall breakage of heterologous microorganisms, 20 μg / mL of lysozyme was treated for 20 minutes under the same conditions as lysostaphin.S. aureus) Was changed to 0, 102, 104, 106 CFU / mL, and impedance analysis was performed in the same manner as in Example 3-1.
그 결과 도 4의 그래프와 같이 모든 시료의 계면저항 변화양상이 포도상구균만 존재하는 시료의 농도에 따른 계면저항의 변화 양상과 동일하게 나타났으며, 그 신호의 수준 역시 거의 차이가 없음을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in the graph of FIG. 4, the change in the interfacial resistance of all the samples was the same as that of the interfacial resistance according to the concentrations of only the staphylococcal sample, and the levels of the signals were almost the same there was.
상기 결과로부터 세포벽 가수분해효소를 이용하여 분절된 미생물의 펩티도글리칸 시료들에서 면역검출 반응에 어떠한 신호간섭도 나타나지 않음을 확인할 수 있었으며 이를 통하여 검출하고자 하는 미생물에 대한 높은 민감성을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that no signal interference was observed in the immunodetection reaction in the peptidoglycan samples of the microorganisms separated using the cell wall hydrolase, thereby confirming the high sensitivity to the microorganisms to be detected.
Claims (12)
검출할 미생물에 효소를 처리하여 펩티도글리칸층을 분절하여 펩티도글리칸 조각을 얻는 단계; 및
상기 항체와 상기 펩티도글리칸 조각 간의 면역학적 결합을 통해 전기화학적 임피던스 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는, 전기화학적 미생물 면역센싱을 이용한 검출방법.Immobilizing an antibody capable of binding to the microorganism to be detected on the electrode surface;
Treating the microorganism to be detected with an enzyme to segment the peptidoglycan layer to obtain a peptidoglycan fragment; And
And amplifying an electrochemical impedance signal through immunological association between said antibody and said peptidoglycan fragment.
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| KR20090075132A (en) * | 2008-01-03 | 2009-07-08 | 한양대학교 산학협력단 | Biosensor for detecting bacteria using impedence measuring method |
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