RU2594063C1 - Diagnostic technique for mycobacterium tuberculosis - Google Patents
Diagnostic technique for mycobacterium tuberculosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2594063C1 RU2594063C1 RU2015115617/15A RU2015115617A RU2594063C1 RU 2594063 C1 RU2594063 C1 RU 2594063C1 RU 2015115617/15 A RU2015115617/15 A RU 2015115617/15A RU 2015115617 A RU2015115617 A RU 2015115617A RU 2594063 C1 RU2594063 C1 RU 2594063C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- complex
- kda
- mpt64
- mycobacterium tuberculosis
- antibodies
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления возбудителя туберкулеза в микробиологических культурах.The invention relates to medicine and can be used to identify the causative agent of tuberculosis in microbiological cultures.
Известен микробиологический способ диагностики туберкулеза, при котором проводятся микроскопические исследования мазков мокроты и другого клинического материала больных с предварительным окрашиванием по Цилю-Нильсену на наличие кислотоустойчивых микобактерий и с последующим культуральным исследованием материала.There is a known microbiological method for the diagnosis of tuberculosis, in which microscopic studies of smears of sputum and other clinical material of patients are carried out with preliminary Ziehl-Nielsen staining for the presence of acid-resistant mycobacteria and followed by cultural examination of the material.
Бактериоскопическая идентификация недостаточно чувствительна, чревата ошибками и зависит от квалификации персонала (при использовании теста в лабораториях развивающихся стран выявляется только 20-40% больных туберкулезом, в развитых странах ~ 40-60%) [Kent, В.D., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory, 207 p. U. S. Department of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta].Bacterioscopic identification is not sensitive enough, is fraught with errors and depends on staff qualifications (when using the test in laboratories in developing countries, only 20-40% of patients with tuberculosis are detected, in developed countries ~ 40-60%) [Kent, B.D., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory, 207 p. U. S. Department of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta].
Известен также способ, основанный на биохимическом тестировании выращенных на питательных плотной и жидкой среде Миддлбрук 7Н9 микроорганизмов, с целью быстрой идентификации вида обнаруженных микобактерий.There is also a method based on biochemical testing grown on nutrient dense and liquid medium Middlebrook 7H9 microorganisms in order to quickly identify the type of detected mycobacteria.
Этот способ требует значительного времени (4-6 недель от момента сбора материала) из-за медленного роста микобактерий.This method requires a considerable time (4-6 weeks from the moment of collecting the material) due to the slow growth of mycobacteria.
Более совершенный способ диагностики туберкулеза основан на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР).A more advanced method for the diagnosis of tuberculosis is based on polymerase chain reaction (PCR).
Это высокоспецифичный и чрезвычайно чувствительный тест, с помощью которого возможно идентифицировать в анализируемой пробе наличие даже одной-единственной молекулы ДНК возбудителя (чувствительность составляет порядка 10-15 М) [Reischl U., Naumann L./ [Molecular biology methods in detection of mycobacteria. Improved and newly developed test systems for the diagnosis of mycobacteria] / Fortschr. Med. - 1996. - Vol. 114. - P. 237-241].This is a highly specific and extremely sensitive test, with which it is possible to identify in the analyzed sample the presence of even one single DNA molecule of the pathogen (sensitivity is about 10 -15 M) [Reischl U., Naumann L. / [Molecular biology methods in detection of mycobacteria. Improved and newly developed test systems for the diagnosis of mycobacteria] / Fortschr. Med. - 1996. - Vol. 114. - P. 237-241].
Недостатком этого способа являются его относительно высокая сложность и относительно низкая экономичность, поскольку при его проведении используется дорогое инструментальное и приборное обеспечение. Кроме того, из-за сверхвысокой чувствительности этот тест требует необычайной чистоты и очень зависим от уровня квалификации персонала и соблюдения особых требований к лабораторным помещениям, в которых проводится анализ. Минимальное загрязнение анализируемых образцов, инструментария и воздуха в помещении нуклеиновой кислотой микобактерий может дать ложноположительный результат.The disadvantage of this method is its relatively high complexity and relatively low profitability, since its implementation uses expensive tooling and instrumentation. In addition, due to its ultra-high sensitivity, this test requires extraordinary cleanliness and is very dependent on the level of staff qualification and compliance with the special requirements for the laboratory rooms in which the analysis is carried out. Minimal contamination of the analyzed samples, instruments and air in the room with nucleic acid of mycobacteria can give a false positive result.
Кроме указанных выше, известен способ, основанный на использовании иммунохроматографических тестов для выявления микобактериального белка МРТ64 в микробиологических культурах, полученных на жидкой питательной среде Миддлбрук 7Н9 в автоматизированной системе учета роста микобактерий ВАСТЕС MGIT320-960.In addition to the above, a method is known based on the use of immunochromatographic tests to detect mycobacterial MPT64 protein in microbiological cultures obtained on Middlebrook 7H9 liquid nutrient medium in the automated system for measuring the growth of mycobacteria WASTES MGIT320-960.
Известно, что, МРТ64 присутствует только в микобактериях M.tuberculosis complex, которые вызывают туберкулез. Поэтому тесты позволяют быстро идентифицировать рост микобактерий M.tuberculosis complex в жидкой среде при посеве материала от больных туберкулезом. Наиболее известны из них Capilia TBNeoassay (TAUNS, Izunokuni, Япония) [Chikamatsu et al., 2014], SD BIOLINE TBAg (Standard Diagnostics Inc., Корея), MPT64 Rapid [Fabre M. et al., 2011] и TBc ID (Becton Dickinson and Company, США).MRT64 is known to be present only in the M. tuberculosis complex mycobacteria that cause tuberculosis. Therefore, tests allow you to quickly identify the growth of M. tuberculosis complex mycobacteria in a liquid medium when sowing material from tuberculosis patients. The most famous of them are Capilia TBNeoassay (TAUNS, Izunokuni, Japan) [Chikamatsu et al., 2014], SD BIOLINE TBAg (Standard Diagnostics Inc., Korea), MPT64 Rapid [Fabre M. et al., 2011] and TBc ID ( Becton Dickinson and Company, USA).
Исследование специфичности выявления микобактерий M.tuberculosis complex в этих тестах было проведено Chikamatsu с коллегами в 2014 году на 96-ти референсных штаммах. Тесты дают минимум перекрестных реакций, подтверждая высокую специфичность диагностики по антигену МРТ64.A study of the specificity of the detection of M. tuberculosis complex mycobacteria in these tests was carried out by Chikamatsu and colleagues in 2014 on 96 reference strains. Tests give a minimum of cross-reactions, confirming the high specificity of diagnostics for the MPT64 antigen.
Недостатком способа является относительно низкая чувствительность способа и как результат этого относительно низкая диагностическая точность.The disadvantage of this method is the relatively low sensitivity of the method and as a result of this relatively low diagnostic accuracy.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающий иммуноанализ с использованием антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, в котором указанное антитело включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4 [RU 2473095 C2, G01N 33/569, G01N 33/533, G01N 33/543, 20.01.2013].Closest to the technical nature of the proposed is a method for detecting the complex Mycobacterium tuberculosis, comprising immunoassay using an antibody against a specific Mycobacterium tuberculosis complex secretory protein MPB64, wherein said antibody comprises an antibody against the MPB64 epitope located in any of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 -4 [RU 2473095 C2, G01N 33/569, G01N 33/533, G01N 33/543, 01.20.2013].
К особенностям известного способа относится то, что указанное антитело представляет собой моноклональное антитело. Способ включает сэндвич-иммуноанализ с использованием первого и второго антител против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, в котором, по меньшей мере, одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4. По меньшей мере, одно из указанных антител, первое или второе, представляет собой моноклональное антитело, а любое, первое или второе, антитело иммобилизовано на носителе. В этом способе биологический образец подвергают указанному иммуноанализу без культивирования или после культивирования в течение времени перед тем, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis в образце проявляют значительный рост. Биологический образец подвергают обработке для инактивации Mycobacterium tuberculosis или предварительной обработке диспергированием или солюбилизацией перед тем, как подвергать иммуноанализу. Обработку солюбилизацией или диспергированием проводят посредством операции перемешивания или посредством добавления к биологическому образцу по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из щелочного вещества, восстанавливающего вещества, протеазы и поверхностно-активного вещества. Указанный биологический образец представляет собой мокроту.The features of the known method include the fact that the specified antibody is a monoclonal antibody. The method includes a sandwich immunoassay using the first and second antibodies against the MPC64 specific secretory protein Mycobacterium tuberculosis complex, in which at least one of the first and second antibodies comprises an anti-MPB64 epitope antibody localized in any of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2-4. At least one of these antibodies, the first or second, is a monoclonal antibody, and any, the first or second, antibody is immobilized on a carrier. In this method, a biological sample is subjected to the indicated immunoassay without cultivation or after culturing for a time before the bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex in the sample show significant growth. The biological sample is treated to inactivate Mycobacterium tuberculosis or pretreated by dispersion or solubilization before being immunoassayed. The solubilization or dispersion treatment is carried out by means of a stirring operation or by adding at least one selected from the group consisting of an alkaline substance, a reducing agent, a protease and a surfactant to a biological sample. The specified biological sample is sputum.
В известном способе иммунохроматографический анализ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis включает наличие мембранного носителя, обладающего зоной связывания, сформированной в его заранее определенном положении посредством иммобилизации первого антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, хроматографическое проявление смешанного раствора, содержащего второе антитело против МРВ64 и заранее определенное количество тестируемого образца на мембранном носителе в зоне связывания, в результате чего комплекс антигена, содержащегося в тестируемом образце, и второго антитела связываются в зоне связывания, где, по меньшей мере, одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.In the known method, an immunochromatographic analysis of the detection of the Mycobacterium tuberculosis complex includes the presence of a membrane carrier having a binding zone formed at its predetermined position by immobilizing the first antibody against the Mycobacterium tuberculosis complex-specific secretory protein MPB64, the chromatographic manifestation of a mixed solution containing the second anti-MP antibody in advance a certain amount of the test sample on a membrane carrier in the binding zone, resulting in The antigen complex contained in the test sample and the second antibody bind in the binding zone, where at least one of the first and second antibodies includes an anti-MPB64 epitope antibody localized in any of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2-4.
При иммунохроматографическом анализе, по меньшей мере, одно из указанных антител, первое или второе, представляет собой моноклональное антитело, тестируемый образец содержит биологический образец, который не культивировали или культивировали в течение времени перед тем, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis проявляют значительный рост, биологический образец подвергают предварительной обработке посредством обработки для инактивации Mycobacterium tuberculosis или обработки диспергированием или солюбилизацией, диспергирование или солюбилизацию биологического образца проводят посредством операции перемешивания или посредством добавления к биологическому образцу по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из щелочного вещества, восстанавливающего вещества, протеазы и поверхностно-активного вещества, биологический образец представляет собой мокроту, второе антитело является меченным коллоидными частицами металлов или частицами латекса, мембранный носитель представляет собой нитроцеллюлозную мембрану.In an immunochromatographic analysis, at least one of the indicated antibodies, the first or second, is a monoclonal antibody, the test sample contains a biological sample that has not been cultured or cultured for a time before the bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex show significant growth, a biological sample pretreated by treatment to inactivate Mycobacterium tuberculosis or by treatment with dispersion or solubilization, dispersion or solubilization the biological sample is carried out by a stirring operation or by adding at least one selected from the group consisting of an alkaline substance, a reducing agent, a protease and a surfactant to the biological sample, the biological sample is sputum, the second antibody is labeled with colloidal metal particles or particles of latex, the membrane carrier is a nitrocellulose membrane.
Иммунохроматографическая тест-полоска для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, которая, по меньшей мере, содержит первое и второе антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64 и мембранный носитель, где первое антитело предварительно иммобилизовано в заранее определенном положении на мембранном носителе так, чтобы сформировать зону связывания, второе антитело мечено подходящим средством для мечения и подготовлено в положении, удаленном от зоны связывания, для хроматографического проявления на мембранном носителе, где, по меньшей мере, одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4. В иммунохроматографической тест-полоске, по меньшей мере, одно из первого и второго антител представляет собой моноклональное антитело, второе антитело мечено коллоидными частицами металлов или частицами латекса, мембранный носитель представляет собой нитроцеллюлозную мембрану.An immunochromatographic test strip for detecting the Mycobacterium tuberculosis complex, which at least contains the first and second antibodies against the Mycobacterium tuberculosis complex specific MPB64 secretory protein and a membrane carrier, where the first antibody is pre-immobilized in a predetermined position on the membrane carrier so as to form binding zone, the second antibody is labeled with a suitable labeling agent and prepared at a position remote from the binding zone for chromatographic development on a meme rannom carrier, wherein at least one of the first and second antibodies comprises an antibody against an epitope of MPB64 located in any one of amino acid sequences SEQ ID NO: 2-4. In an immunochromatographic test strip, at least one of the first and second antibodies is a monoclonal antibody, the second antibody is labeled with colloidal metal particles or latex particles, the membrane carrier is a nitrocellulose membrane.
Моноклональное антитело, распознающее эпитоп МРВ64, локализовано в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.A monoclonal antibody recognizing the MPB64 epitope is located in any of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2-4.
Недостатком способа является относительно низкая чувствительность способа и как результат этого относительно низкая диагностическая точность.The disadvantage of this method is the relatively low sensitivity of the method and as a result of this relatively low diagnostic accuracy.
Задача, которая решается в изобретении, заключается в повышении чувствительности способа и как результат этого диагностической точности исследования.The problem that is solved in the invention is to increase the sensitivity of the method and as a result of this diagnostic accuracy of the study.
Требуемый технический результат заключается в повышении чувствительности и диагностической точности способа.The required technical result is to increase the sensitivity and diagnostic accuracy of the method.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что в способе, включающему сэндвич-иммуноанализ с использованием первого и второго антител против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64(24kDa), согласно изобретению используют два моноклональных антитела, направленные против двух разных антигенных детерминант микобактериального белка MPT64(24kDa), обладающие специфичностью и высокой аффинностью по отношению к исследуемому антигену и имеющие различную изотипическую принадлежность, при этом одно моноклональное антитело фиксируют на твердой фазе, после отмывки неадсорбировавшихся антител добавляют исследуемый материал и инкубируют, а при образовании комплекса антиген MPT64(24kDa) - моноклональное антитело после очередной отмывки добавляют другое моноклональное антитело и связывают с этим комплексом, после чего распознают его меченными пероксидазой изотип-специфическими антителами для детектирования комплекса в количественной манере на основе стандартов с известной концентрацией белка МРТ64(24kDa).The problem is solved, and the required technical result is achieved by the fact that in the method comprising a sandwich immunoassay using the first and second antibodies against the MPB64 specific secretory protein MPB64 (24kDa) specific for the Mycobacterium tuberculosis complex, two monoclonal antibodies directed against two different antigenic antibodies are used according to the invention determinant of mycobacterial protein MPT64 (24kDa), which have specificity and high affinity for the antigen under study and have different isotypic affiliations, in this case, one monoclonal antibody is fixed on the solid phase, after washing the non-adsorbed antibodies, the studied material is added and incubated, and when the MPT64 antigen complex is formed (24kDa), the monoclonal antibody is added another monoclonal antibody after the next washing and is bound to this complex, after which it is labeled peroxidase isotype-specific antibodies for detecting the complex in a quantitative manner based on standards with a known concentration of MPT64 protein (24kDa).
На графических материалах представлены:The graphic materials presented:
в таблице 1 - противотуберкулезные МАТ против МРТ64, их изотип и специфичность по отношению к микобактериальным и бактериальным ультразвуковым дезинтегратам (УЗД) и исходному иммуногену;table 1 - anti-tuberculosis MAT against MRI64, their isotype and specificity for mycobacterial and bacterial ultrasonic disintegrates (SPL) and the original immunogen;
на фиг. 1 - иммуноблоттинг анти-МРТ64 МАТ с культуральным фильтратом M.tuberculosis H37Rv;in FIG. 1 - immunoblotting anti-MRT64 MAT with culture filtrate M.tuberculosis H37Rv;
на фиг. 2 - двусайтовый ИФА с MAT 2Н3С6 и 1Н10 с рекомбинантным белком МРТ64;in FIG. 2 - two-site ELISA with MAT 2H3C6 and 1H10 with the recombinant protein MPT64;
на фиг. 3 - двусайтовый ИФА с МАТ против МРТ64 с цельными живыми клетками M.tuberculosis H37Rv, измерения в колониеобразующих единицах (КОЕ);in FIG. 3 - two-site ELISA with MAT against MRT64 with whole living cells of M. tuberculosis H37Rv, measurements in colony forming units (CFU);
на фиг. 4 - двусайтовый ИФА с МАТ против МРТ64 с антигенами различных микобактерий;in FIG. 4 - two-site ELISA with MAT against MRT64 with antigens of various mycobacteria;
в таблице 2 - определение МРТ64 в культурах с ВАСТЕС MGIT960;table 2 - definition of MRI in cultures with WASTES MGIT960;
в таблице 3 - статистические данные обработки результатов наличия МРТ64 в 546 микробиологических образцах, выделенных при культивировании диагностического материала от больных туберкулезом и другими заболеваниями.table 3 - statistical data processing the results of the presence of MRI in 546 microbiological samples isolated during the cultivation of diagnostic material from patients with tuberculosis and other diseases.
Реализуется предложенный способ диагностики микобактерий туберкулеза следующим образом.Implemented the proposed method for the diagnosis of mycobacterium tuberculosis as follows.
Способ основан на стандартном двусайтовом методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), который позволяет регистрировать комплекс антитело-антиген-антитело, зафиксированный на твердой фазе, с помощью изотип-специфических «вторых» антител с ковалентно связанной ферментной меткой. Взаимодействие фермента с субстратом цветной реакции позволяет в зависимости от величины регистрируемого комплекса получить большую или меньшую засветку реакции, которая считывается спектрофотометрически. Основными компонентами теста являются два моноклональных антитела, направленные против двух разных антигенных детерминант микобактериального белка МРТ64 (24kDa), обладающие специфичностью и высокой аффинностью по отношению к исследуемому антигену и имеющие различную изотипическую принадлежность. Одни из этих моноклональных антител фиксируется на твердой фазе (лунка планшета для ИФА). После отмывки неадсорбировавшихся антител добавляется исследуемый материал и инкубируется. Если образуется комплекс антиген МРТ64 - моноклональные антитела, то после очередной отмывки добавленные «вторые» моноклональные антитела связываются с этим комплексом, образуя 3-этажную структуру типа «сэндвич». Эти вторые моноклональные антитела распознаются меченными пероксидазой изотип-специфическими антителами, что позволяет детектировать комплекс в количественной манере, при наличии стандартов с известной концентрацией белка МРТ64.The method is based on the standard two-site method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which allows you to register a complex of antibody-antigen-antibody, fixed on the solid phase, using isotype-specific "second" antibodies with a covalently linked enzyme label. The interaction of the enzyme with the substrate of the color reaction allows, depending on the magnitude of the detected complex, to obtain greater or lesser illumination of the reaction, which is read spectrophotometrically. The main components of the test are two monoclonal antibodies directed against two different antigenic determinants of the mycobacterial protein MPT64 (24kDa), which have specificity and high affinity for the test antigen and have different isotypic affiliations. One of these monoclonal antibodies is fixed on the solid phase (well of an ELISA plate). After washing the non-adsorbed antibodies, the test material is added and incubated. If the MPT64 antigen complex, a monoclonal antibody, is formed, then after the next washing, the added “second” monoclonal antibodies bind to this complex, forming a 3-story sandwich-type structure. These second monoclonal antibodies are recognized by peroxidase-labeled isotype-specific antibodies, which allows the complex to be detected in a quantitative manner, with standards with a known concentration of MPT64 protein.
Пример реализации способа.An example implementation of the method.
При проведении двусайтового ИФА для определения МРТ64 использовали моноклональные антитела 2Н3С6 и 1Н10. Специфичность реакции этих МАТ в ИФА и распознаваемый ими антиген приведены в таблице 1 и на фиг. 1. МАТ реагируют только с антигенами микобактерий M.tuberculosis и распознают эпитоп на микобактериальном антигене массой 24кДа.When conducting a two-site ELISA, monoclonal antibodies 2H3C6 and 1H10 were used to determine MRI. The specificity of the reaction of these MATs in ELISA and the antigen recognized by them are shown in Table 1 and in FIG. 1. MATs only react with M. tuberculosis mycobacterial antigens and recognize an epitope on mycobacterial antigen weighing 24 kDa.
Прежде всего, для проведения ИФА иммуноглобулины MAT 2Н3С6 и 1Н10 были очищены из культуральной среды методом иммуноаффинной хроматографии на сорбенте, содержащем белок L, отдиализованы против забуференного фосфатами физраствора (PBS) и спектрофотометрически определена концентрация глобулинов.First of all, for ELISA, immunoglobulins MAT 2Н3С6 and 1Н10 were purified from the culture medium by immunoaffinity chromatography on a sorbent containing protein L, dialyzed against phosphate buffered saline (PBS), and the concentration of globulins was determined spectrophotometrically.
Далее иммуноглобулины 1Н10 адсорбировали на дно лунок 96-луночных планшетов для ИФА в PBS в концентрации 1 мкг/мл. После инкубации в течение 18 часов при 4°C планшеты трехкратно отмывали PBS с 0,1% Tween 20 (PBS-Tw) и «блокировали» 1% BSA в PBS-Tw. После получасовой инкубации планшеты отмывали PBS-Tw и вносили исследуемые образцы культуральной жидкости, полученной при культивировании клинического материала в ВАСТЕС MGIT960; препараты цельных клеток, ультразвукового дезинтеграта (УЗД), культурального фильтрата M.tuberculosis H37Rv; и микобактерий других видов и/или в качестве калибраторов - рекомбинантный белок МРТ64 в разных концентрациях. После 30-минутной инкубации планшеты трижды отмывали PBS-Tw и добавляли «вторые» MAT 2Н3С6 в концентрации 1 мкг/мл в 1% BSA в PBS-Tw. После получасовой инкубации и отмывки несвязавшегося материала в лунки планшета вносили изотипический иммунопероксидазный антимышиный конъюгат против IgG1 мыши («вторые» MAT 2Н3С6 - IgG1 изотипа). После 30 мин инкубации и пятикратной отмывки PBS-Tw цветную реакцию в течение 15 минут проявляли с помощью 0,05 мМ ТМБ (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин) в качестве хромогена в 0,1 М цитратном буфере pH 5,3 в присутствии пербората натрия. Реакцию останавливали 10% серной кислотой и считывали на автоматическом спектрофотометре с вертикальным лучом для определения оптической плотности реакции в ИФА-планшетах ELx800 (Biolline, США).Next, 1H10 immunoglobulins were adsorbed to the bottom of the wells of 96-well ELISA plates in PBS at a concentration of 1 μg / ml. After an incubation of 18 hours at 4 ° C, the plates were washed three times with PBS with 0.1% Tween 20 (PBS-Tw) and “blocked” with 1% BSA in PBS-Tw. After a half-hour incubation, the plates were washed with PBS-Tw and the test samples of the culture fluid obtained by culturing the clinical material in WASTES MGIT960 were added; whole cell preparations, ultrasonic disintegrate (SPL), culture filtrate M.tuberculosis H37Rv; and mycobacteria of other species and / or as calibrators, recombinant protein MPT64 in different concentrations. After a 30-minute incubation, the plates were washed three times with PBS-Tw and the “second” MAT 2H3C6 was added at a concentration of 1 μg / ml in 1% BSA in PBS-Tw. After half an hour incubation and washing of unbound material, isotypic immunoperoxidase anti-mouse anti-mouse IgG1 conjugate was introduced into the wells of the plate (“second” MAT 2H3C6 — IgG1 isotype). After 30 min of incubation and five-fold washing with PBS-Tw, a color reaction was observed for 15 minutes using 0.05 mM TMB (3.3 ′, 5.5′-tetramethylbenzidine) as a chromogen in 0.1 M
На фиг. 2 представлена кривая определения рекомбинантного белка МРТ64. Как видно из рисунка, минимальная чувствительность метода лежит в области ниже чем 10-15 М. Физическая чувствительность метода составляет 10-15 М, что сопоставимо с проведением ПНР-анализа для выявления ДНК возбудителя.In FIG. 2 shows a curve for determining the recombinant protein MPT64. As can be seen from the figure, the minimum sensitivity of the method lies in the region lower than 10 -15 M. The physical sensitivity of the method is 10 -15 M, which is comparable with the PPR analysis to detect the DNA of the pathogen.
Высокая физическая чувствительность метода достигается путем использования «пары» моноклональных антител, реагирующих с двумя различными антигенными детерминантами на поверхности белка МРТ64, что позволяет выявлять комплекс с аффинностью, превышающей аффинность каждого из используемых моноклональных антител, тем самым многократно повышая физическую чувствительность метода.High physical sensitivity of the method is achieved by using a "pair" of monoclonal antibodies that react with two different antigenic determinants on the surface of the MPT64 protein, which allows you to identify a complex with an affinity greater than the affinity of each of the monoclonal antibodies used, thereby greatly increasing the physical sensitivity of the method.
Аналогичная кривая, полученная в ИФА на цельных клетках M.tuberculosis H37Rv, позволяет говорить о чувствительности метода для определения цельных клеток микобактерий в пределах нескольких клеток на мкл (фиг. 3).A similar curve obtained in ELISA on whole M. tuberculosis H37Rv cells suggests the sensitivity of the method for determining whole mycobacterial cells within a few cells per μl (Fig. 3).
На фиг. 4 приведены кривые титрования, полученные для антигенов туберкулезных микобактерий и нетуберкулезных микобактерий. Из рисунка видно, что МРТ64 определяется только в растворимых микобактериальных антигенах микобактерий M.tuberculosis.In FIG. Figure 4 shows the titration curves obtained for antigens of tuberculous mycobacteria and non-tuberculous mycobacteria. It can be seen from the figure that MR64 is determined only in the soluble mycobacterial antigens of M. tuberculosis mycobacteria.
Для изучения диагностической специфичности и чувствительности в тесте были исследованы образцы ВАСТЕС MGIT960, выращенные из мокроты больных туберкулезом и неспецифическими заболеваниями легких.To study the diagnostic specificity and sensitivity in the test, WASTES MGIT960 samples were grown from the sputum of patients with tuberculosis and non-specific lung diseases.
В таблице 2 приведены данные по исследованию микробиологических культур с официально подтвержденным ростом: туберкулезных микобактерий «+» - образцы, НТМБ - образцы с ростом нетуберкулезных микобактерий и «-» - образцы с ростом бактерий немикобактериальной природы.Table 2 shows the data on the study of microbiological cultures with officially confirmed growth: tuberculous mycobacteria “+” - samples, NTMB - samples with the growth of non-tuberculous mycobacteria and “-” - samples with the growth of non-mycobacterial bacteria.
Результаты статистической обработки данных приведены в таблице 3.The results of statistical data processing are shown in table 3.
Как видно из приведенных статистических выкладок, диагностическая специфичность описываемого метода составляет 100%, а диагностическая чувствительность - 98,5%, при эффективности диагностики 99,06%. Эти значения указывают на уникальность белка МРТ64 и специфичность моноклональных антител против МРТ64, используемых в тесте. А также подтверждает достижение требуемого технического результата - повышение чувствительности и точности диагностики.As can be seen from the above statistical calculations, the diagnostic specificity of the described method is 100%, and the diagnostic sensitivity is 98.5%, with a diagnostic efficiency of 99.06%. These values indicate the uniqueness of the MPT64 protein and the specificity of the monoclonal antibodies against MRT64 used in the test. And also confirms the achievement of the required technical result - increasing the sensitivity and accuracy of diagnosis.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015115617/15A RU2594063C1 (en) | 2015-04-27 | 2015-04-27 | Diagnostic technique for mycobacterium tuberculosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015115617/15A RU2594063C1 (en) | 2015-04-27 | 2015-04-27 | Diagnostic technique for mycobacterium tuberculosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2594063C1 true RU2594063C1 (en) | 2016-08-10 |
Family
ID=56612978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015115617/15A RU2594063C1 (en) | 2015-04-27 | 2015-04-27 | Diagnostic technique for mycobacterium tuberculosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2594063C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111474357A (en) * | 2020-04-15 | 2020-07-31 | 杭州恒奥科技有限公司 | Test strip for rapidly detecting African swine fever virus, and preparation method and application thereof |
| RU2794855C1 (en) * | 2022-01-24 | 2023-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" | Method for diagnosing tuberculosis |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2473095C2 (en) * | 2007-12-28 | 2013-01-20 | БиЭл КО., ЛТД | Analysis of mycobacterium tuberculosis complex immunodetection |
| WO2013151122A1 (en) * | 2012-04-05 | 2013-10-10 | 株式会社ビーエル | Method and kit for immunological detection of mycobacterium tuberculosis complex |
-
2015
- 2015-04-27 RU RU2015115617/15A patent/RU2594063C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2473095C2 (en) * | 2007-12-28 | 2013-01-20 | БиЭл КО., ЛТД | Analysis of mycobacterium tuberculosis complex immunodetection |
| WO2013151122A1 (en) * | 2012-04-05 | 2013-10-10 | 株式会社ビーエル | Method and kit for immunological detection of mycobacterium tuberculosis complex |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111474357A (en) * | 2020-04-15 | 2020-07-31 | 杭州恒奥科技有限公司 | Test strip for rapidly detecting African swine fever virus, and preparation method and application thereof |
| CN111474357B (en) * | 2020-04-15 | 2023-07-25 | 杭州恒奥科技有限公司 | African swine fever virus rapid detection test strip and preparation method and application thereof |
| RU2794855C1 (en) * | 2022-01-24 | 2023-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" | Method for diagnosing tuberculosis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bekmurzayeva et al. | Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis | |
| US8541179B2 (en) | Immunodetection assay for Mycobacterium tuberculosis complex | |
| US10550175B2 (en) | Mycoplasma pneumoniae immunological detection method and kit | |
| Nour-Neamatollahi et al. | A new diagnostic tool for rapid and accurate detection of Mycobacterium tuberculosis | |
| US20050272104A1 (en) | Method for detection of Mycobacterium tuberculosis antigens in biological fluids | |
| Sumi et al. | Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by a dot immunobinding assay to detect mycobacterial antigen in cerebrospinal fluid specimens | |
| El-Masry et al. | Rapid and simple detection of a mycobacterium circulating antigen in serum of pulmonary tuberculosis patients by using a monoclonal antibody and Fast-Dot-ELISA | |
| CN101329342A (en) | Method and reagent kit for detecting tubercle bacillus and anti-tuberculosis medicaments sensibility | |
| RU2594063C1 (en) | Diagnostic technique for mycobacterium tuberculosis | |
| Turner et al. | Serological speciation of human schistosome infections by ELISA with a panel of three antigens | |
| EP1329718B1 (en) | Devices for collecting and preparing specimens for detection of mycobacteria and their antigens | |
| US20040132211A1 (en) | Isolation and confirmation of analytes from test devices | |
| Verstijnen et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies for identification of mycobacteria from early cultures | |
| Broger et al. | Novel high sensitivity tuberculosis point-of-care test for people living with HIV | |
| Neumann et al. | Innovative and Highly Sensitive Detection of Clostridium perfringens Enterotoxin Based on Receptor Interaction and Monoclonal Antibodies | |
| US20090011442A1 (en) | TB diagnostics based on mycobacterium tuberculosis excretory secretory antigens and their specific immunoglobulins | |
| EP1751190B1 (en) | Spore specific antibodies | |
| RU2794855C1 (en) | Method for diagnosing tuberculosis | |
| EP1674868A1 (en) | Method and device for detection of mycobacterium tuberculosis antigens in biological fluids | |
| Byzova et al. | Development of immunochromatographic test system for rapid detection of the lipopolysaccharide antigen and cells of the causative agent of bovine brucellosis | |
| Pechenkin et al. | Development of enzyme-immunoassay for Bacillus anthracis detection | |
| RU2695525C1 (en) | Method for immunoenzymometric detection of agent of pseudotuberculosis 1 serotype on basis of monoclonal antibodies to o-side chains of lipopolysaccharide | |
| Anindita et al. | Potential of mycobacterial excretory secretory protein antigens (sevatb ES-31, ES-43, EST-6 and ES-20) as biomarkers to detect Mycobacterium tuberculosis bacilli | |
| Eddyani et al. | Laboratory Investigations in Buruli Ulcer | |
| KR20130135590A (en) | Lawsonia intracellularis-specific monoclonal antibody and hybridoma cell producing the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170428 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20200219 |