KR101510423B1 - 슈도모나스 에어루지노사의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 슈도모나스 에어루지노사의 검출 방법 - Google Patents

슈도모나스 에어루지노사의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 슈도모나스 에어루지노사의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 슈도모나스 에어루지노사의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 슈도모나스 에어루지노사의 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 슈도모나스 에어루지노사의 O-항원 아세틸레이즈 유전자에 결합하는 프라이머쌍을 이용하여 시료에서 DNA를 추출하지 않고도 슈도모나스 에어루지노사 종을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

슈도모나스 에어루지노사의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 슈도모나스 에어루지노사의 검출 방법{Pseudomonas aeruginosa specific primers and method for detecting Pseudomonas aeruginosa using the same}
본 발명은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여, 시료에서 직접적으로 슈도모나스 에어루지노사를 검출하는 방법에 관한 것이다.
슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 토양, 수중 등 자연환경 중에 널리 일반적으로 분포되어 있는 그램 음성 간균으로, 중증의 화상, 췌낭포성 섬유종, 장기이식을 위한 면역억제제의 투여 또는 암치료 등에 의하여 면역체계가 저하된 환자에게 주로 감염되는 병원내 기회 감염균이다. 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 무병원성 세균으로 일반적으로 건강한 항체 역가를 갖고 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 충분한 건강한 면역기능을 갖는 개체에서는 발병하지 않는다. 그러나 일단 쇠약해진 환자가 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 감염되면, 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 심각한 증상을 일으킬 수 있고 이것은 환자의 사망을 가져올 수 있다. 특히 췌낭포성 섬유종 환자의 90% 이상이 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 상습적인 폐 감염에 기인하는 폐조직 손상으로 인하여 사망하는 것으로 밝혀졌다. 중증의 화상이나 면역억제제를 투여받은 환자의 경우 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 국소감염이 전신감염으로 이어져 결국 패혈증 쇼크를 야기하게 된다. 이러한 이유로 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 병원내 감염과 기회감염의 주요 원인이 되는 세균으로서 주목받고 있고, 따라서 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염의 예방 및 치료는 의료 분야에서 중요한 사안이 되어왔다.
슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염 치료시 대부분이 항생제에만 의존하므로 항생제의 남용에 의한 내성균주가 지속적으로 출현하고 있으므로 기존의 상용 항생제에 의한 치료는 점점 더 어려워지고 있는 실정이다. 또한, 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)가 병원의 중환자실에 장기입원하고 있는 환자의 세균 감염에 기인한 패혈증에 의한 사망률의 주요 원인균으로 지목되고 있다. 따라서 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)감염에 의한 패혈증을 효과적으로 예방하기 위한 백신 및 감염에 의한 패혈증 치료제를 개발하려는 노력이 계속되어 왔다. 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)백신 개발을 위한 항원으로서는 세포외막표면에 존재하는 성분인 리포폴리사카라이드(LPS), 캡슐 폴리사카라이드(CPS) 및 세포외막단백질 등이 사용되었다. 일반적으로 백신 후보항원들은 동물에서의 안전성 및 유효성 실험을 거쳐 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염예방을 위한 백신으로 개발되어 정상인에서의 안정성 및 면역원성이 확인되면 환자에게서 감염예방효능을 검증하게 된다. 종래 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 백신의 임상시험에서 백신의 감염예방효능의 지표로서는 환자의 사망률 감소를 측정하였다. 그러나, 이와 같은 경우 환자의 사망이 직접적으로 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염에 의한 것이라는 직접적인 증거가 없다. 또한 환자 혈액의 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염을 확인하기 위하여 환자의 혈액으로부터 미생물을 배양하는 방법이 사용되기도 하였으나 환자의 혈액에는 세균감염예방을 위하여 투여한 항생제가 고농도로 존재하므로 감염된 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 수가 적은 경우나 성장정지상태로 존재하는 경우에는 혈액배양법으로는 검출되지 않을 우려가 있었다. 이와 함께 미생물의 혈액배양법은 감염세균을 최종 동정하는데에 장시간이 소요되므로 환자를 적기에 치료하는 데에 장애가 되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 환자 또는 환경에서 슈도모나스 에어루지노사를 DNA 추출 과정 없이 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 개발하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 분석 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 분석 키트를 제공한다.
본 발명에서 제공되는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 특이적인 프라이머는 슈도모나스 에어루지노사와 동속 이종인 미생물은 검출하지 않는 특이성을 가지며, 시료에서 DNA를 추출하지 않고 직접 PCR로 검출이 가능하기 때문에, 기존의 검출법에 비해 특이적이고 간단하게 슈도모나스 에어루지노사를 검출 및 진단하기 위해 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머를 사용하여 표 1의 균주들의 DNA에 대하여 증폭한 뒤 증폭산물을 아가로스 젤에서 확인한 그림이다;
232 bp: 슈도모나스 에어루지노사의 O-항원 아세틸레이즈.
도 2는 본 발명의 프라이머 PA431CF 및 PA431CR을 사용하여 슈도모나스 에어루지노사에 대하여 real-time PCR을 수행한 도이다;
1 내지 3 곡선: 슈도모나스 에어루지노사를 접종한 토양시료; 및
4 곡선: 슈도모나스 에어루지노사가 존재하지 않는 토양시료.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머들은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-항원 아세틸레이즈(O-antigen acetylase)에 특이적인 프라이머들이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 시료는 혈액, 생검 조직, 객담 등의 생물학적 시료 또는 하천, 토양, 공기 등 환경학적 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 하천, 토양과 같은 환경 시료가 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 1) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법 (Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil (Mp Biomedicals)를 이용할 수 있다. 상기 시료는 임상 분야 또는 환경 분야의 시료를 말하고, 본 발명에서는 환경 시료일 수 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-항원 아세틸레이즈(O-antigen acetylase) 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.
상기 단계 2)의 PCR은 real-time PCR, qRT-PCR 또는 RT-PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있으며, 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 증폭 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 시료를 준비하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 시료에 대하여 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 시료는 혈액, 생검 조직, 객담 등의 생물학적 시료 또는 하천, 토양, 공기 등 환경학적 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 하천, 토양과 같은 환경 시료가 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 시료는 시료 자체 또는 시료가 포함되어 있던 현탁액의 상층액인 것이 바람직하며, 이는 DNA를 추출하지 않은 시료를 말한다. 예를 들어, 토양 시료인 경우에는 토양을 현탁액으로 만든 뒤 원심분리를 통한 상층액을 말하며, 하천 시료인 경우에는 하천 시료 자체 또는 이의 상층액을 말한다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출용 조성물을 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 분석 키트를 제공한다.
프라이머 PA431CF 및 PA431CR 프라이머쌍 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-antigen acetylase에 특이적인 프라이머 PA431CF 및 PA431CR는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 슈도모나스 에어루지노사 종만을 검출하였으며 (도 1 참조), 하천 시료에서 분리한 DNA에서 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-antigen acetylase 단편을 특이적으로 증폭하여 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하였고 (표 3 참조), 토양 시료에서 DNA의 추출 없이 직접적으로 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 단편을 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 2 참조). 따라서, 본 발명의 PA431CF 프라이머 및 PA431CR 프라이머를 포함하는 조성물은 슈도모나스 에어루지노사 종에 특이적이며, 이를 이용하여 기존의 DNA 추출 단계 없이 간단하게 시료 자체에서 직접 슈도모나스 에어루지노사를 특이적으로 검출할 수 있다.
< 실시예 1> 슈도모나스 에어루지노사 ( Pseudomonas aeruginosa ) 특이적 프라이머 제작
본 발명자들은 슈도모나스 에어루지노사에 특이적인 염기서열 정보 탐색을 위해 blastn 프로그램을 이용하였다.
구체적으로, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 Pseudomonas aeruginosa 유전체 정보 (등록번호 : GenBank Accession No. NP_253925, gi|110645304:5896806-5898794)에서 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 O-antigen acetylase 유전자의 슈도모나스 에어루지노사 특이성을 확인하고 232bp의 O-antigen acetylase 유전자를 증폭하는 하기 표 1의 PA431CF 프라이머 및 PA431CR 프라이머 세트를 제작하였다.
서열번호 프라이머 이름 서열(5' -> 3')
1 PA431CF CTGG GTCG AAAG GTGG TTGT TATC
2 PA431CR GCGG CTGG TGCG GCTG AGTC
< 실시예 2> 프라이머의 슈도모나스 에어루지노사 ( Pseudomonas aeruginosa ) 특이적 검출 확인
<2-1> 슈도모나스 에어루지노사( Pseudomonas aeruginosa )에 대한 특이성 확인
본 발명자들은 상기 표 1의 프라이머 쌍을 이용하여 다양한 미생물에 대한 특이성을 분석하였다.
구체적으로, 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC) 그리고 American Type culture collection (ATCC)에서 분양받은 슈도모나스 에어루지노사를 포함한 표 2의 기타 균주들을 NA배지(Peptone: 0.5%, NaCl: 0.5%, Yeast extract: 0.2%, Lab-Lemco beef extract: 0.1%, Agar: 1.5% :1L)에서 배양하였다. 배양된 균주의 총 DNA를 Qiagen(Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트(Genomic-tips)을 이용하여 추출한 뒤, 약 50 ng의 DNA를 사용하여 PCR 증폭 반응을 수행하였다. PCR 증폭은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여, ris-HCl 20 mM, KCl 100 mM, 50% Glycerol, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween20, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, dNTP는 각각 0.2mM, primer는 각각 20pM, Taq polymerase 2 unit(SolGent, Deajeon, Repulic of Korea)을 함유하는 PCR 혼합액 총 50 ㎕의 양으로 각 반응을 수행하였으며, 반응은 95 ℃에서 5분간 변성하고 95 ℃ 60초, 63 ℃ 30초, 72 ℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72 ℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 10 ㎕의 PCR 산물을 1.5%농도의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동한 뒤에 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 착색시켜 UV transilluminator에서 확인하였다.
그 결과, 슈도모나스 에어루지노사에서만 232bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다 (도 1).
번호 학명 출처a 지리적 기원
1 Pseudomonas aeruginosa LMG 1242T
2 Pseudomonas aeruginosa KACC 10232 Republic of Korea
3 Pseudomonas aeruginosa KACC 10185
4 Pseudomonas aeruginosa LMG 6395
5 Pseudomonas aeruginosa KACC 14021 Republic of Korea
6 Pseudomonas aeruginosa KACC 10258
7 Pseudomonas amygdali LMG 13184T Greece
8 Pseudomonas azotoformans LMG 21611T Japan
9 Pseudomonas cichorii LMG 2162T Germany
10 Pseudomonas citronellolis LMG 18378T United States
11 Pseudomonas coronafaciens LMG 5060 United Kingdom
12 Pseudomonas fluorescens LMG 1794T United Kingdom
13 Pseudomonas fuscovaginae LMG 2158T Japan
14 Pseudomonas graminis LMG 21661T Germany
15 Pseudomonas jessenii LMG 21605T France
16 Pseudomonas libanensis KACC 10809T Lebanon
17 Pseudomonas lundensis LMG 13517T Sweden
18 Pseudomonas mucidolens LMG 2223T United States
19 Pseudomonas oryzihabitans LMG 7040T Japan
20 Pseudomonas putida LMG 2257T United States
21 Pseudomonas stutzeri LMG 11199T
22 Pseudomonas syringae pv. tomato LMG 5093T United Kingdom
23 Pseudomonas taetrolens LMG 2336T
24 Pseudomonas viridiflqva LMG 2352T Switzerland
25 Burkholderia cenocepacia LMG 16656T United Kingdom
26 Burkholderia cepacia LMG 1222T United States
27 Burkholderia gladioli pv. gladioli LMG 2216T United States
28 Burkholderia multivorans LMG 13010T Belgium
29 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria LMG 905
30 Xanthomonas campestris pv. campestris LMG 568T United Kingdom
31 anthomonas pisi LMG 847T Japan
32 Xanthomonas theicola LMG 8684T Japan
33 Stenotrophomonas maltophilia LMG 958T United States
34 Escherichia coli LMG 2092T Denmark
35 Shigella sonnei ATCC 29930T
36 Shigella dysenteriae ATCC 13313T England
37 Shigella flexneri ATCC 29903T
38 Shigella boydii ATCC 8700T
39 Salmonella enterica subsp. arizonae ATCC 13314T
40 Salmonella enterica subsp. diarizonae ATCC 43973T
41 Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 43971T United States
42 Salmonella enterica subsp. indica ATCC 43976T
43 Salmonella bongori ATCC 43975T
44 Vibrio cholerae ATCC 39315T Bangladesh
45 Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969 United States
46 Vibrio vulnificus ATCC 27562T United States
47 Legionella pneumophila subsp. pneumophila ATCC 33152T United States
LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM), Belgium;
ATCC, American Type Culture Collection, USA;
KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea.
<2-2> 하천 시료에서의 슈도모나스 에어루지노사 ( Pseudomonas aeruginosa ) 검출 확인
본 발명자들은 발명의 프라이머 PA431CF 및 PA431CR을 사용하여 하천 시료에서 슈도모나스 에어루지노사의 검출을 Real-time PCR로 확인하였다.
구체적으로, 2010년 4월부터 2011년 7월까지 한강, 금강, 낙동강, 소양강에서 각각 상, 중, 하류에서 계절마다 하수를 취하여 MPbio(OH, USA)사의 Fast DNA spin kit for soil을 이용하여 총 DNA를 추출하였다. 추출한 하천 시료의 DNA 약 5 ng, 본 발명의 프라이머 각각 5 pM 및 SYBR®Premix Ex TaqTM 5 pM을 포함하는 SYBR green PCR 혼합액 총 20 ㎕을 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 real-time PCR을 실시하였다. real-time PCR 반응은 95 ℃에서 30초간 변성하고 95 ℃ 5초, 63 ℃ 30초로 45회 반복시킨 후 65 ℃에서부터 0.5씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95 ℃까지 반응시키면서 멜팅(melting) 커브와 멜팅 피크를 실시한 뒤, 특이 커브와 피크를 각각 확인하였다
그 결과, 한강은 37°5'25" N 및 127°9'52" E의 계절 1 및 2의 시료에서, 금강은 36°2'56.7" N 및 127°4'37.7" E의 계절 2의 시료와 36°8'9.6" N, 127°8'4.8" E의 계절 4 시료에서, 낙동강은 36°'34.5" N 및 128°2'34.7" E의 계절 4의 시료와 36°'0.3" N 및 128°7'1.6" E의 계절 1 시료에서, 소양강은 38°2'26" N 및 128°9'11" E의 계절 1 및 2의 시료에서 슈도모나스 에어루지노사가 검출되었다 (표 3).
하천 좌표 qPCR 결과
위도 경도 계절 1 계절 2 계절 3 계절 4
한강 37°5'25" N 127°9'52" E + + - -
37°2'57" N 127°6'37" E - - - -
38°1'30" N 127°7'13" E - - - -
금강 36°2'56.7" N 127°4'37.7" E - + - -
36°7'28.9" N 127°3'59.4" E - - - -
36°8'9.6" N 127°8'4.8" E - - - +
낙동강 36°34.5" N 128°2'34.7" E - - - +
36°29.8" N 128°4'5.1" E - - - -
36°0.3" N 128°7'1.6" E + - - -
소양강 38°2'26" N 128°9'11" E + + - -
38°3'01" N 128°9'56" E - - - -
38°4'39" N 128°1'17" E - - - -
<2-3> 토양 시료에서의 direct - PCR 검출 확인
본 발명자들은 real-time PCR 진단 감도를 측정하기 위하여 본 발명의 프라이머 PA431CF 및 PA431CR을 사용하여 토양 시료에서 DNA 추출 단계 없이 직접적으로 슈도모나스 에어루지노사 검출을 수행하였다.
구체적으로, 슈도모나스 에어루지노사가 존재하지 않는 토양시료 100 mg에 슈도모나스 에어루지노사 LMG 1242를 O.D 600에서 0.1이 되게 맞춘 후 균 현탁액을 10배씩 희석하여 2.7×106 내지 2.7×108 cells의 범위로 접종하였다. 토양시료에 균을 접종한 후 5분 동안 볼텍싱한 다음, 5분 동안 원심분리 (13,000 × g)하여 상층액을 취하였다. 본 발명의 프라이머 각각 5 pM 및 SYBR®Premix Ex TaqTM 2 pM을 포함하는 SYBR green PCR 혼합액 총 20 ㎕을 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 95 ℃에서 30초간 변성하고 95 ℃ 5초, 63 ℃ 30초로 45회 반복시킨 후 65 ℃에서부터 0.5 ℃씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95 ℃까지 반응시켜 real-time PCR을 실시하였다.
그 결과, 레인 1 (곡선 1) 내지 3 (곡선 3)에서는 각각의 슈도모나스 에어루지노사에 해당하는 증폭이 있으나, 레인 4 (곡선 4)에서는 증폭이 일어나지 않은 것을 확인할 수 있다. 레인 1 내지 3까지는 10배씩 희석하여 실험하였으므로, 토양에서 DNA 추출 없이, 2.7×108 cells 까지 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 2).
<110> REPUBLIC OF KOREA <120> Pseudomonas aeruginosa specific primers and method for detecting Pseudomonas aeruginosa using the same <130> P130220 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PA431CF primer <400> 1 ctgggtcgaa aggtggttgt tatc 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PA431CR primer <400> 2 gcggctggtg cggctgagtc 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출용 조성물로서, 상기 프라이머들은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-항원 아세틸레이즈(O-antigen acetylase)에 특이적인 것을 특징으로 하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 생검 조직, 객담 등의 생물학적 시료 또는 하천, 토양, 공기 등 환경학적 시료로부터 선택되는 시료인 것을 특징으로 하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 단계 2)의 PCR은 real-time PCR, qRT-PCR 또는 RT-PCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법.
  6. 1) 시료를 준비하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 시료에 대하여 제 1항의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료는 시료 자체 또는 시료가 포함되어 있던 현탁액의 상층액인 것을 특징으로 하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 검출하는 방법.
  8. 제 1항의 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출용 조성물을 포함하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 분석 키트.
KR20130033194A 2013-03-28 2013-03-28 슈도모나스 에어루지노사의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 슈도모나스 에어루지노사의 검출 방법 KR101510423B1 (ko)

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Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2009, Volume 63, Issue 2, Pages 127-131. *
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2009, Volume 63, Issue 2, Pages 127-131.*
GenBank: AE004091.2, Pseudomonas aeruginosa PAO1, complete genome. 2010.09.28. *
GenBank: AE004091.2, Pseudomonas aeruginosa PAO1, complete genome. 2010.09.28.*

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