KR101508129B1 - Marker for diagnosing cell senescence and use thereof - Google Patents
Marker for diagnosing cell senescence and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR101508129B1 KR101508129B1 KR20130069703A KR20130069703A KR101508129B1 KR 101508129 B1 KR101508129 B1 KR 101508129B1 KR 20130069703 A KR20130069703 A KR 20130069703A KR 20130069703 A KR20130069703 A KR 20130069703A KR 101508129 B1 KR101508129 B1 KR 101508129B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- leu
- val
- glu
- gly
- lys
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, PAPSS2 유전자는 세포 노화 진단용 마커로서 역할을 할 수 있어 노화 세포를 진단하는 방법, 세포 노화 유도용 조성물 스크리닝 방법, 세포 노화 억제용 조성물 스크리닝 방법 등에 이용할 수 있다. 또한, 비종양 세포에서 PAPSS2 유전자를 억제할 경우 비종양 세포의 노화를 유도할 수 있다.The present invention relates to a marker for cytopathological diagnosis and a use thereof, and the PAPSS2 gene can serve as a marker for cell senescence diagnosis and can be used as a marker for diagnosing senescent cells, a method for screening a composition for inducing cell senescence, Can be used. In addition, inhibition of the PAPSS2 gene in non-tumor cells can induce aging of non-tumor cells.
Description
본 발명은 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a marker for cell aging diagnosis and its use.
세포복제의 노화(replicative cellular senescence)는 비가역적이며 영구적으로 세포주기를 지연 또는 정지시키는 과정이며, 외인성 또는 내인성 요인의 스트레스 및 손상에 대응하는 세포의 반응으로 인식되며, 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)와 같은 유전자 발현의 변형된 패턴을 나타낸다[J. Campisi, F. d'Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2007):729-740]. 이러한 과정은 텔로미어(telomere)-의존적 기작, 온코진(oncogene)-유도 기작 그리고 ROS 유도 기작에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다[H. Zhang, Molecular signaling and genetic pathway of senescence: its role in tumorigenesis and aging, J. Cell. Physiol. 210 (2007):567-574; M. Ozturk, A. Arslan-Ergul, S. Bagislar, S. Senturk, H. Yuzugullu, Senescence and immortality in hepatocellular carcinoma, Cancer Lett. 286 (2009):103-113]. 세포 노화는 조직의 재생 및 신생 등에 치명적이기 때문에 생명체에 해로운 효과{예를 들어, 조직 노화(tissue aging)}를 유발할 수도 있지만 세포분열이 왕성한 종양세포에서는 영구적인 세포 성장 억제(tumor suppressor)를 유발하기 때문에 이로울 수도 있다(anti- tumorigenesis). Replicative cellular senescence is a process that is irreversible and permanently delaying or stopping the cell cycle and is recognized as a cell response to stress or damage of an extrinsic or endogenous factor and is known as beta-galactosidase β-galactosidase) [J. Campisi, F. d'Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2007): 729-740. This process is known to be mediated by telomere-dependent mechanisms, oncogene-induced mechanisms, and ROS induction mechanisms [H. Zhang, Molecular signaling and genetic pathway of senescence: its role in tumorigenesis and aging, J. Cell. Physiol. 210 (2007): 567-574; M. Ozturk, A. Arslan-Ergul, S. Bagislar, S. Senturk, H. Yuzugullu, Senescence and immortality in hepatocellular carcinoma, Cancer Lett. 286 (2009): 103-113). Since cell senescence is lethal to tissue regeneration and neoplasia, it may cause a deleterious effect on living organisms (for example, tissue aging), but it may cause permanent tumor suppressor in vigorous tumor cells (Anti-tumorigenesis).
한편, 노화된 세포는 세포의 크기가 커지고 평평해지며, 특정 pH에서 베타-갈락토시다아제 활성을 나타낸다는 일반적인 특징이 있다.(Dimri et al., A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995; Chang et al., A Senescence-like Phenotype Distinguishes Tumor Cells That Undergo Terminal Proliferation Arrest after Exposure to Anticancer Agents, Cancer Res, 59:3761-3767, 1999) 상기의 특징을 이용하여 노화세포의 판별을 위해 가장 일반적으로 베타-갈락토시다아제 염색법을 사용하고 있으나, 이는 효소 활성이 유지되고 있는 살아있는 종양세포에만 적용해야 하며 종양조직의 경우 번거로운 동결절편 방법을 이용해 염색해야한다는 문제점이 있다.On the other hand, aged cells have the general characteristic of increasing cell size and flattening, and exhibiting beta-galactosidase activity at a specific pH (Dimri et al., Biomarker identifies senescent human cells in culture and in Aging skin in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 9363-9367, 1995; Chang et al., A Senescence-like Phenotype Distinguishes Tumor Cells That Undergo Terminal Proliferation Arrest after Exposure to Anticancer Agents, Cancer Res, 59: 3761-3767, 1999). Using the above characteristics, beta-galactosidase staining is most commonly used for the identification of senescent cells, but it should be applied only to living tumor cells in which the enzyme activity is maintained, There is a problem that the tissue must be dyed by a troublesome freezing section method.
따라서, 세포 노화를 쉽게 판별하기 위해 세포 노화의 일반적인 지표가 될 수 있는 바이오마커가 필요하며, 노화의 마커로 세포 주기 억제에 관여하는 단백질이 일반적으로 사용되고 있으나, 이는 일시적인 세포주기 억제와 세포 노화를 구분하는데 한계가 있다 (Igor B. Roninson, Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment, Cancer Res., 63:2705-2715, 2003). 따라서, 노화 세포의 명백한 판별을 위한 세포노화-특이적 바이오마커의 개발이 절실히 요구되고 있다(J. Campisi, F. d'Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2007):729-740).Therefore, a biomarker that can be a general indicator of cell senescence is needed to easily identify cell senescence. Proteins involved in cell cycle inhibition are generally used as markers of senescence, (Igor B. Roninson, Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment, Cancer Res., 63: 2705-2715, 2003). Therefore, there is a desperate need to develop a cell aging-specific biomarker for the clear discrimination of aging cells (J. Campisi, F. d'Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Cell. Biol. 8 (2007): 729-740).
한편, PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2)은 NCBI(미국 국립생물공학정보센터; National Center for Biotechnology Information) Access No. NM_004670 (서열번호 1) 또는 NM_001015880 (서열번호 2)인 유전자로 세포 노화와 관련하여 알려진 바가 없다. On the other hand, PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) can be obtained by NCBI (National Center for Biotechnology Information) Access. NM_004670 (SEQ ID NO: 1) or NM_001015880 (SEQ ID NO: 2).
이에 본 발명자들은 인간 섬유아 세포 (HDF)에서 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자를 억제하는 경우 인간 섬유아 세포 (HDF)의 노화가 유도됨을 확인하고, 세포가 노화됨에 따라 PAPSS2 유전자 발현이 감소됨을 확인함으로써, PAPSS2 유전자 발현 수준을 세포 노화 진단용 마커로 이용할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have confirmed that aging of human fibroblast (HDF) is induced when the PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) gene is inhibited in human fibroblast (HDF) By confirming that the expression of PAPSS2 gene is reduced, the present inventors have found that the expression level of PAPSS2 gene can be used as a marker for cell senescence diagnosis.
따라서 본 발명의 목적은 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도를 제공하는 데에 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a marker for cell aging diagnosis and its use.
본 발명은 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 세포 노화를 진단하는 마커로서의 용도를 제공한다.The present invention provides a use as a marker for diagnosing cellular senescence of PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) gene or a protein encoded by the gene.
본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자는 서열번호 1의 염기서열 (NCBI Access No. NM_004670) 또는 서열번호 2의 염기서열 (NCBI Access No. NM_001015880)을 포함한다. 또한 상기 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열에서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 포함한다.In the present invention, the PAPSS2 gene includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (NCBI Access No. NM_004670) or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (NCBI Access No. NM_001015880). Also, a base sequence of SEQ ID NO: 1 or a base sequence of deletion, substitution or insertion of one or more bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is included.
본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 폴리펩티드를 포함한다. 또한 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함한다. In the present invention, the protein encoded by the PAPSS2 gene comprises the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4. Or a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or a polypeptide of SEQ ID NO: 4, wherein the amino acid sequence is deleted, substituted or inserted.
본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.In the present invention, the sequence of the PAPSS2 gene is illustrative but not limited to those skilled in the art. Sequences having substantial sequence identity or substantial sequence homology to the sequences are also within the scope of the present invention. As used herein, the term "substantial sequence identity" or "substantial sequence identity" is used to denote that the sequence represents substantial structural or functional identity with another sequence. These differences are due, for example, to inherent variations in the codon usage between different species. If there is a significant amount of sequence redundancy or similarity between two or more different sequences, the structural differences will be negligible if they have similar physical properties even if the length or structure of these sequences is different.
본 발명은 세포 내 PAPSS2 유전자 발현 정도를 평가하는 단계를 포함하는 노화 세포를 진단하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for diagnosing senescent cells comprising the step of evaluating the degree of PAPSS2 gene expression in a cell.
상기 세포 내 PAPSS2 유전자 발현의 감소가 세포 노화 진단용 마커일 수 있다.The decrease in the intracellular PAPSS2 gene expression may be a cell aging diagnostic marker.
상기 세포는 개체로부터 분리된 세포일 수 있다. 상기 세포는 포유류로부터 유래한 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 인체로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 섬유아 세포 (HDF)일 수 있다.The cell may be a cell isolated from the individual. The cell may be derived from a mammal. The cells may also include those derived from the human body. For example, it may be human fibroblast (HDF).
본 발명은 또한 PAPSS2 유전자에 대한 항체를 포함하는 세포 노화 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a cell aging diagnostic kit comprising an antibody against the PAPSS2 gene.
상기 세포 노화 진단용 키트는 당업자에 알려진 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다.Such a cell aging diagnostic kit can be produced by a conventional method known to those skilled in the art.
또한 상기 세포 노화 진단용 키트는 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자에 대한 항체 외에도 상기 항체와 시료 간의 반응을 파악하는데 사용되는 예컨대 단백질 칩 등의 적용을 위한 재료를 포함할 수 있다.In addition to the antibody against the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 (PAPSS2) gene, the above-described cell aging diagnostic kit may include a material for application such as a protein chip used for determining the reaction between the antibody and the sample .
또한, 상기 세포 노화 진단용 키트는 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있으며, 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.The cytodiagnostic kit may include a lyophilized form of an antibody, a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like. The antibody may be radionuclides, fluorescors, enzymes, etc. ≪ / RTI >
본 발명은 또한 세포 내 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물을 스크리닝하는 단계를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for screening a composition for inducing cell senescence comprising the step of screening a drug that inhibits the expression of PAPSS2 gene in a cell.
상기 유전자는 mRNA(messenger Ribonucleic acid)일 수 있다.The gene may be mRNA (messenger ribonucleic acid).
또한, 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 상기 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다. 즉, 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 PAPSS2 유전자에 대한 mRNA의 발현을 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 서열번호 5의 센스서열(5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3') 및 이에 상보적인 서열번호 6의 안티센스 서열(5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3')인 이중가닥 siRNA 일 수 있다. 상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스서열의 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.In addition, the drug that inhibits the PAPSS2 gene expression may be siRNA (small interfering RNA) capable of inhibiting the mRNA. That is, the drug that inhibits the PAPSS2 gene expression may be an siRNA capable of inhibiting the expression of mRNA to the PAPSS2 gene. The siRNA comprises a sense sequence (5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3 ') of SEQ ID NO: 5 and an antisense sequence (5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3' Double stranded siRNA. The siRNA may have a thymine base (dTdT) bound to the 3 'end of the sense sequence and / or the antisense sequence.
본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 항체일 수 있다. 상기 항체는 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지의 방법에 의해 직접 제조할 수 있다.In the present invention, the drug that inhibits the PAPSS2 gene expression may be an antibody. The antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, and / or a recombinant antibody capable of specifically binding to a protein encoded by PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) gene, Or can be prepared directly by known methods.
본 발명은 세포 내 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 발현을 활성화하는 약물을 스크리닝하는 단계를 포함하는 세포 노화 억제용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention provides a method for screening a composition for inhibiting cell senescence comprising the step of screening a drug that activates the expression of PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) gene in a cell.
본 발명은 또한 PAPSS2 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for inducing cell senescence comprising an inhibitor against a PAPSS2 gene or a protein encoded by the gene.
상기 세포는 개체로부터 분리된 세포일 수 있다. 상기 세포는 포유류로부터 유래한 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 인체로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 섬유아 세포 (HDF)일 수 있다.The cell may be a cell isolated from the individual. The cell may be derived from a mammal. The cells may also include those derived from the human body. For example, it may be human fibroblast (HDF).
상기 유전자는 mRNA(messenger Ribonucleic acid)일 수 있다.The gene may be mRNA (messenger ribonucleic acid).
또한, 상기 억제제는 상기 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다. 즉, 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 PAPSS2 유전자에 대한 mRNA의 발현을 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 서열번호 5의 센스서열(5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3') 및 이에 상보적인 서열번호 6의 안티센스 서열(5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3')인 이중가닥 siRNA 일 수 있다. 상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스서열의 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.In addition, the inhibitor may be siRNA (small interfering RNA) capable of inhibiting the mRNA. That is, the drug that inhibits the PAPSS2 gene expression may be an siRNA capable of inhibiting the expression of mRNA to the PAPSS2 gene. The siRNA comprises a sense sequence (5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3 ') of SEQ ID NO: 5 and an antisense sequence (5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3' Double stranded siRNA. The siRNA may have a thymine base (dTdT) bound to the 3 'end of the sense sequence and / or the antisense sequence.
본 발명에서 상기 억제제는 항체일 수 있다. 상기 항체는 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지의 방법에 의해 직접 제조할 수 있다.In the present invention, the inhibitor may be an antibody. The antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, and / or a recombinant antibody capable of specifically binding to a protein encoded by PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) gene, Or can be prepared directly by known methods.
본 발명은 또한 비종양세포에 PAPSS2 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 비종양세포의 노화 유도 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for inducing senescence of non-tumor cells comprising treating a non-tumor cell with a PAPSS2 gene or a composition for inducing cell senescence comprising an inhibitor for a protein encoded by the gene.
상기 세포는 인간을 포함한 포유동물의 세포일 수 있다. 또한 상기 세포는 인간을 제외한 포유동물의 세포일 수 있다. 예를 들어, 인간 섬유아 세포 (HDF)일 수 있다.The cell may be a cell of a mammal, including a human. The cell may also be a mammalian cell other than a human. For example, it may be human fibroblast (HDF).
본 발명은 또한 비종양세포 노화 유도용 조성물의 제조를 위한 PAPSS2 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제의 용도를 제공한다.The present invention also provides the use of an inhibitor for PAPSS2 gene or a protein encoded by said gene for the production of a composition for inducing aging of a non-tumor cell.
PAPSS2 유전자는 세포 노화 진단용 마커로서 역할을 할 수 있어 노화 세포를 진단하는 방법, 세포 노화 유도용 조성물 스크리닝 방법, 세포 노화 억제용 조성물 스크리닝 방법 등에 이용할 수 있다. 또한, 비종양 세포에서 PAPSS2 유전자를 억제할 경우 비종양 세포의 노화를 유도할 수 있다.The PAPSS2 gene can serve as a marker for cell senescence diagnosis and can be used for diagnosis of aging cells, screening composition for inducing cell senescence, screening method for inhibiting cell senescence and the like. In addition, inhibition of the PAPSS2 gene in non-tumor cells can induce aging of non-tumor cells.
도 1은 인간 섬유아 세포주 HDF에 각각 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후 경과 일짜에 따른 상대적인 세포수 변화를 보여주는 도이다.
도 2는 위상차 현미경 관찰 결과를 보여주는 도이다. 도 2에서 위에서부터 아래로 0일, 2일 및 4일은 0일, 2일, 4일째의 노화-관련 베타-갈락토시다아제 염색법으로 염색하기 전 위상차 현미경의 관찰한 사진을 나타내고 맨 아래의 4일은 4일째의 노화-관련 베타-갈락토시다아제 염색법으로 염색 후의 위상차 현미경의 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 인간 섬유아 세포주 HDF에 각각 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후 날짜별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 인간 섬유아 세포주 HDF에 각각 PAPSS2 si 처리한 후 4일째까지 날짜별로 증가하는 p53 및 p21의 발현과 감소하는 PAPSS2의 발현을 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 5는 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 위상차 현미경으로 관찰한 사진을 보여주는 도이다.
도 6은 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별로 감소하는 PAPSS2 발현 및 Rb의 인산화를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.FIG. 1 is a graph showing relative cell numbers of human fibroblast cell line HDF after treatment with PAPSS2 si and Con si, respectively.
FIG. 2 is a view showing a result of observing a phase contrast microscope. In FIG. 2, from the top to bottom, 0 day, 2 day and 4 day are photographs of the phase contrast microscope before staining with aging-related beta-galactosidase staining on
FIG. 3 is a graph showing the effect of aging-related beta-galactosidase activity on the aging-related beta-galactosidase activity after staining with PAPSS2 si and ConSi in human fibroblast cell line HDF, Lt; / RTI > showing the percentage of cells showing positive cells.
FIG. 4 is a Western blotting result showing the expression of p53 and p21, which are increased by day, and the expression of PAPSS2, which is decreased by
FIG. 5 is a photograph showing a phase contrast microscope image of a human fibroblast HDF after staining using a staining specimen specific to activated aging-related beta-galactosidase by passage number.
FIG. 6 shows the ratio of cells showing aging-related beta-galactosidase-positive cells after staining using a staining sample specific for activated aging-related beta-galactosidase by the number of passages of human fibroblast cell line HDF Fig.
FIG. 7 shows Western blotting results confirming PAPSS2 expression and phosphorylation of Rb which decrease by the number of passages of human fibroblast cell line HDF.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples should not be construed as limiting the scope of the present invention, but should be construed to facilitate understanding of the present invention.
실시예Example 1. One. 트립판Trip plate 블루blue 분석법을 이용한 Analytical PAPSS2PAPSS2 sisi 에 의한 세포 Cells by 증식율Growth rate 감소 확인 Confirm reduction
인간 섬유아 세포 (HDF) (ATCC, USA)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제 (Gibco BRL 사)가 포함된 DMEM 배양 배지 안에서 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 9회 계대배양하였다. 작은 간섭 RNA의 주입 하루 전, 상기와 동일한 조건으로 인간 섬유아 세포 (HDF) (ATCC, USA)를 60 mm 배양접시로 계대배양하였다. 그 후, 2 ㎕의 RNAiMAX (invitrogen, Cat#13778-075)와 OptiMEM?I 배양배지 (Invitrogen, Cat#31985)를 섞고 PAPSS2 유전자에 대한 작은 간섭 RNA {PAPSS2 si; 5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3' (서열번호 5) 및 5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3'(서열번호 6)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임)}를 50 nM의 농도로 세포에 처리하였다(실험군). 6시간 후 배양배지를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ㎍/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM 배양 배지로 교환한 후, 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다.Human fibroblasts (HDF), (ATCC, USA) with 10% FBS (fetal bovine serum: FBS, ㈜ weljin) and antibiotics (Gibco BRL Co.) 37 ℃ in 5% CO 2 concentration in the DMEM culture medium containing the And
또한, 상기 인간 섬유아 세포에 비특이적 작은 간섭 RNA{Con si; 5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG U-3'(서열번호 7)과 5'-ACG AAA UUG GUG GCG UAG G-3'(서열번호 8)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 처리한 세포주를 대조군으로 하였다. 상기 실험군과 대조군의 상대적인 세포수를 트립판 블루 분석법을 이용하여 관찰하였고 도 1에 나타내었다. 인간 섬유아 세포주에 PAPSS2 유전자에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (PAPSS2 si) 또는 비특이적 작은 간섭 RNA (Con si)를 처리한 후 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1~4 일동안 배양한 후 도 1에 표기된 날짜별로 세포 상층액을 수확하고 트립신을 이용하여 세포를 떼어낸 후 PBS(phosphate buffered saline)로 2차례 세척 후 0.4 % 트립판 블루 (NUNK 사)와 1:1로 혼합한 후 상온에서 5분 동안 방치 후 혈구계수기(hemocytometer; MARIENFELD사) 상에서 트립판 블루에 염색되지 않은 세포의 개수를 세어 0일을 기준으로 하여 상대적인 세포수를 표시하였다. 도 1에서, x축은 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후의 경과시간(일)을 나타내며, y축은 PAPSS2 si 및 Con si 처리하기 직전의 세포수를 기준점(1)으로 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후의 경과시간(일)의 세포수를 계산하여 상대적인 세포수를 나타낸다.In addition, a non-specific small interference RNA {Con si; Stranded siRNA consisting of the nucleotide sequence of 5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG U-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-ACG AAA UUG GUG GCG UAG G-3' (SEQ ID NO: 8) (DTdT) was bound to the 3 'terminus} was treated as a control. The relative number of cells in the experimental and control groups was monitored using the Trypan Blue assay and is shown in FIG. Human fibroblast cells were treated with specific small interfering RNA (PAPSS2 si) or nonspecific small interfering RNA (Con si) for PAPSS2 gene and then cultured for 1 to 4 days in a constant temperature incubator at 37 ° C with 5% CO 2 The cell supernatants were harvested for each day indicated in FIG. 1 and the cells were removed using trypsin. The cells were washed twice with PBS (phosphate buffered saline), mixed with 0.4% trypan blue (NUNK) at a ratio of 1: For 5 minutes, and the number of unstained cells on the trypan blue on a hemocytometer (MARIENFELD Co.) was counted, and the relative number of cells was expressed on the basis of 0 day. In FIG. 1, the x-axis represents elapsed time (days) after PAPSS2 si and Con si treatment, and the y-axis represents the number of cells immediately before PAPSS2 si and Con si treatment, Calculate the number of cells per hour (days) to show the relative number of cells.
도 1에서 나타난 바와 같이, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군에서 기간경과에 따른 상대적인 세포수가 적은 것을 확인할 수 있다. 즉, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군은 세포증식율이 현저히 감소됨을 확인할 수 있다.As shown in Fig. 1, it can be confirmed that the relative number of cells in the PAPSS2 si treated group treated with PAPSS2 si and inhibiting the expression of PAPSS2 gene in comparison with the control group (Con si treated group) is small with the passage of time. In other words, the PAPSS2 si treated group, which inhibited PAPSS2 gene expression by treating PAPSS2 si compared with the control group (Con si treated group), can be confirmed that the cell proliferation rate is remarkably reduced.
실시예Example 2. 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 인간 2. Aging-related human beta-galactosidase activity staining 섬유아Fiber 세포 cell HDFHDF 의 of PAPSS2PAPSS2 sisi 에 의한 노화 유도 확인Induction of aging by
인간 섬유아 세포주 HDF의 PAPSS2 발현 저해가 초래하는 세포노화를 관찰하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 준비한 대조군(인간 섬유아 세포주 HDF에 비특이적 작은 간섭 RNA 처리군)과 실험군(인간 섬유아 세포주 HDF에 특이적 작은 간섭 RNA 처리군)에 대하여 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 위의 상기 실시예 1의 대조군(인간 섬유아 세포주 HDF에 비특이적 작은 간섭 RNA 처리군)과 실험군(인간 섬유아 세포주 HDF에 특이적 작은 간섭 RNA 처리군)의 세포를 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 도에 표기된 날짜별로 배양한 후 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.In order to observe the cell aging caused by inhibition of PAPSS2 expression of human fibroblast cell line HDF, a control group (a small non-specific RNA treatment group in human fibroblast HDF) prepared in the same manner as in Example 1 and an experimental group HDF-specific small interfering RNA treated group) were subjected to aging-related beta-galactosidase activity staining. The control group of Example 1 above (human fibroblast non-specific small interfering with the cell line HDF RNA treatment group) and group 37 ℃ in 5% CO 2 concentration in the cell of (human fibroblast-specific small interfering RNA-treated group to the cell line HDF) After incubation in the incubator on the dates indicated in the chart, aging-related beta-galactosidase activity was stained. The staining was performed according to the method of Dimri et al. (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 9363-9367, 1995) as follows.
세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트 (pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 1 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.The cells were washed twice with PBS and fixed with 3% formaldehyde at room temperature for 3-5 min. The immobilized cells were washed once more with PBS, and a solution of β-galactosidase active dye (1 mg / ml of X-Gal, 40 mM citric acid / sodium phosphate (pH 6.0), 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM chloride chloride, 2 mM magnesium chloride) was added thereto, followed by reaction at 37 ° C for 12-16 hours in a constant temperature incubator. During the reaction, the culture dish was wrapped with a thin foil foil to prevent light from entering.
베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 갯수를 측정하여 전체 세포에 대한 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율(백분율)에 관한 그래프를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 대조군(Con si 처리군)의 경우 검출할 수 있는 범위에 있지 않았다. The degree of beta-galactosidase activity was observed using a phase contrast microscope (ECLIPSE TE300, Nikon), and the results are shown in Fig. In addition, the number of stained cells was measured using a microscope (ECLIPSE TE300, Nikon) and a graph showing the percentage (percentage) of cells showing aging-related beta-galactosidase-positive cells to whole cells is shown in FIG. . In Fig. 3, it was not in the detectable range in the case of the control group (Con si treated group).
도 2에서 나타낸 바와 같이, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여 PAPSS2 si 처리군에서 넓고 편평한 모양의 세포가 노화된 세포의 비율이 높은 것을 확인하였다.As shown in Fig. 2, it was confirmed that the proportion of cells with a wide flattened shape in the PAPSS2 si treated group was higher than that in the control group (Con si treated group).
또한, 도 2 및 3에서 나타난 바와 같이, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여 PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군에서 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율이 증가함을 확인할 수 있다.In addition, as shown in Figs. 2 and 3, in the PAPSS2 si treated group in which PAPSS2 gene was inhibited by treating PAPSS2 si compared to the control group (Con si treated group), cells showing aging-related beta-galactosidase positive Of the total amount of water.
따라서, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여 PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군은 시간이 지남에 따라 세포 노화현상이 현저하게 일어남을 확인할 수 있다.Therefore, PAPSS2 si treated group treated with PAPSS2 si compared with the control group (Con si treated group) showed significant cell senescence over time.
실시예Example 3. 3. 웨스턴Western 분석을 이용한 인간 Human using analysis 섬유아Fiber 세포 cell HDFHDF 의 of PAPSS2PAPSS2 sisi 에 의한 노화 유도 확인Induction of aging by
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 준비한 대조군(인간 섬유아 세포주 HDF에 비특이적 작은 간섭 RNA 처리군)과 실험군(인간 섬유아 세포주 HDF에 특이적 작은 간섭 RNA 처리군)을 도 4에 표기된 날짜별로 PBS로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액 (50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 ㎍/ml 아프로티닌, 2 ㎍/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 13,200 rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법 {bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)}을 이용하여 정량하였다. 20㎍의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다.A control group (a small non-specific interference RNA treatment group for human fibroblast HDF) and an experimental group (a small interference RNA treatment group specific for human fibroblast HDF) prepared in the same manner as in Example 1 were cultured in PBS After washing, the cell samples were suspended in cell lysis buffer (50 mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na 3 VO 4 , 10 μg / ml aprotinin, Mu] g / ml lupeptin), and the extracted protein was centrifuged at 13,200 rpm for 20 minutes, and then only the supernatant was collected and analyzed by the Bradford method {bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)). 20 μg of
전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-p21 항체 (polyclonal anti-p21 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-PAPSS2 항 (polyclonal anti-PAPSS2 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-액틴(actin) 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-p53 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Leica 사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 혹은 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사)를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 세포노화여부를 확인하였다. After electrophoresis, the separated proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Whatman). Protein-transferred membranes were blocked in PBS solution containing 5% skimmed milk, incubated at room temperature for 1 hour, and primary antibodies diluted 1: 500 ~ 1: 1000 were added and incubated at 4 ° C for 16 hours Lt; / RTI > The primary antibodies were polyclonal anti-p21 Ab (Santa Cruz), polyclonal anti-PAPSS2 Ab (Santa Cruz), polyclonal anti-actin antibodies polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz), polyclonal anti-actin Ab (Leica) and secondary antibody was horseradish peroxidase complex anti-rabbit or anti-mouse antibody (HRP (Amersham) using agarose gels, conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP-conjugated goat anti-mouse IgG, and Santa Cruz).
도 4에서 액틴은 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(하우스키핑 유전자, housekeeping gene)로 동량의 단백질에 대해 분석되었는지를 보여주는 기준으로 사용되었다.In Fig. 4, actin was used as a standard to show that the same level of expression was detected in all cells (housekeeping gene).
도 4에서 나타난 바와 같이, PAPSS2 유전자의 발현이 억제될수록 세포 노화의 지표(marker)가 되는 p53, p21은 점진적으로 증가됨을 확인하였다. 따라서, 인간 섬유아 세포의 PAPSS2 유전자 발현을 억제시키면 세포 노화가 일어남을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 4, it was confirmed that as the expression of PAPSS2 gene is suppressed, p53 and p21, which are markers of cell senescence, are gradually increased. Therefore, inhibition of PAPSS2 gene expression in human fibroblasts leads to cell senescence.
실시예Example 4. 계대 횟수에 따른 4. Depending on the number of passages 복제성Replicability 노화 확인 Aging confirmation
복제성 노화를 연구하기 위하여, 인간 섬유아 세포주 HDF (ATCC, USA) 를 100 mm 배양접시 (SPL 사) 상에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진) 과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 3~4일 후 HDF 세포가 배양접시에 90 % 이상 가득차면 배양액을 걷어내고 PBS (phosphate buffered saline, PBS (주) 웰진) 10 ml 로 남아있는 배양액을 씻어낸 후 트립신((주) 웰진)을 처리하여 배양접시에 붙어있는 HDF를 걷어내고 그 중 4분의 1의 세포만을 새로운 배양접시에 옮겨 위의 배양배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 이러한 과정을 한번 거치면 계대횟수 1로 계산하여 10 번 계대배양하면 p10, 20번 계대배양하면 p20, 30번 계대배양하면 p30으로 하여 각각 젊은 세포, 중간-늙은 세포, 늙은 세포로 구분하여 세포노화가 제대로 일어났는지 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.Human fibroblast HDF (ATCC, USA) was cultured on a 100 mm culture dish (SPL) with 10% fetal bovine serum (FBS, Weljin) and 100 ug of streptomycin were cultured in / ml penicillin and 100 units / ml (Gibco BRL Co.) containing a DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's medium ) cell culture incubator where the CO 2 concentration and 37 ℃ temperature of 5% in the medium maintained at all times. After 3 to 4 days, if the HDF cells are over 90% in the culture dish, the culture medium is removed and the remaining culture is washed with 10 ml of PBS (phosphate buffered saline, PBS, Weljin) And the HDF attached to the culture dish was removed. Only a quarter of the cells were transferred to a new culture dish and cultured in the above culture medium in a cell incubator maintained at a constant CO 2 concentration of 5% and a temperature of 37 ° C. When this process is performed once, the number of passages is counted as 1, and when 10 passages are cultured, the cells are divided into p20, p20 and p30, respectively, into young cells, middle-aged cells and old cells. Aging-related beta-galactosidase active staining was performed. The staining was performed according to the method of Dimri et al. (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 9363-9367, 1995) as follows.
세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트 (pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 1 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.The cells were washed twice with PBS and fixed with 3% formaldehyde at room temperature for 3-5 min. The immobilized cells were washed once more with PBS, and a solution of β-galactosidase active dye (1 mg / ml of X-Gal, 40 mM citric acid / sodium phosphate (pH 6.0), 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM chloride chloride, 2 mM magnesium chloride) was added thereto, followed by reaction at 37 ° C for 12-16 hours in a constant temperature incubator. During the reaction, the culture dish was wrapped with a thin foil foil to prevent light from entering.
베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 또한, 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 갯수를 측정하여 전체 세포에 대한 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율에 관한 그래프를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 p10 및 p20의 경우 검출할 수 있는 범위에 있지 않았다. The degree of beta-galactosidase activity was observed using a phase contrast microscope (ECLIPSE TE300, Nikon) and the results are shown in FIG. FIG. 6 is a graph showing the ratio of cells showing aging-related beta-galactosidase-positive cells to total cells by measuring the number of stained cells using a microscope (ECLIPSE TE300, Nikon). In the case of p10 and p20 in Fig. 6, it was not within the detectable range.
도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 계대 횟수가 증가될수록 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율이 증가함을 확인할 수 있다.As shown in FIGS. 5 and 6, it can be seen that as the number of passages increases, the proportion of cells showing aging-related beta-galactosidase-positive increases.
따라서, 계대 횟수가 증가될수록 복제성 노화가 진행됨을 확인할 수 있다.Therefore, it can be confirmed that the replication aging progresses as the number of passages increases.
실시예Example 5. 5. PAPSS2PAPSS2 유전자의 Gene 발현정도의Degree of expression 복제성Replicability 노화의 지표( Aging Index ( markermarker )로서의 이용 가능성 확인) Availability as a
복제성 노화를 연구하기 위하여, 인간 섬유아 세포주 HDF (ATCC, USA) 를 100 mm 배양접시 (SPL 사) 상에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진) 과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 3~4일 후 HDF 세포가 배양접시에 90 % 이상 가득차면 배양액을 걷어내고 PBS (phosphate buffered saline, PBS (주) 웰진) 10 ml 로 남아있는 배양액을 씻어낸 후 트립신((주) 웰진)을 처리하여 배양접시에 붙어있는 HDF를 걷어내고 그 중 4분의 1의 세포만을 새로운 배양접시에 옮겨 위의 배양배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 이러한 과정을 한번 거치면 계대횟수 1로 계산하여 10 번 계대배양하면 p10, 20번 계대배양하면 p20, 30번 계대배양하면 p30 으로 하였다. 상기 인간 섬유아 세포주를 PBS로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액 (50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 13,200rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법 {bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)}을 이용하여 정량하였다. 20㎍의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다.Human fibroblast HDF (ATCC, USA) was cultured on a 100 mm culture dish (SPL) with 10% fetal bovine serum (FBS, Weljin) and 100 ug of streptomycin were cultured in / ml penicillin and 100 units / ml (Gibco BRL Co.) containing a DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's medium ) cell culture incubator where the CO 2 concentration and 37 ℃ temperature of 5% in the medium maintained at all times. After 3 to 4 days, if the HDF cells are over 90% in the culture dish, the culture medium is removed and the remaining culture is washed with 10 ml of PBS (phosphate buffered saline, PBS, Weljin) And the HDF attached to the culture dish was removed. Only a quarter of the cells were transferred to a new culture dish and cultured in the above culture medium in a cell incubator maintained at a constant CO 2 concentration of 5% and a temperature of 37 ° C. When this process is performed once, the number of passages is calculated as 1, and when 10 passages are cultured, p20 is cultured on
전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-PAPSS2 항체 (polyclonal anti-PAPSS2 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-액틴 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), pRb의 세린 잔기 중 인산화된 아미노산 807/811만을 특이적으로 인지하는 항 p-pRb 항체 (anti-phospho-pRb Ab, cell signaling 사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 또는 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사)를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 확인하고 PAPSS2 단백질, 액틴 단백질 및 p-pRb 단백질 발현에 대한 결과를 도 7에 나타냈다.After electrophoresis, the separated proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Whatman). Protein-transferred membranes were blocked in PBS solution containing 5% skimmed milk, incubated at room temperature for 1 hour, and primary antibodies diluted 1: 500 ~ 1: 1000 were added and incubated at 4 ° C for 16 hours Lt; / RTI > The primary antibodies were polyclonal anti-PAPSS2 Ab (Santa Cruz), polyclonal anti-actin Ab (Santa Cruz), phosphorylated amino acids 807 / (Anti-phospho-pRb Ab, cell signaling), which specifically recognizes 811-specific anti-pRb antibody, and a secondary antibody, horseradish peroxidase complex anti-rabbit or anti-mouse antibody (HRP conjugated goat anti (rabbit IgG, HRP-conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz) and the results for PAPSS2 protein, actin protein and p-pRb protein expression are shown in FIG. 7 .
도 7에서 Actin(액틴)은 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(하우스키핑 유전자, housekeeping gene)로 동량의 단백질에 대해 분석되었는지를 보여주는 기준으로 사용되었다.In FIG. 7, actin (actin) was used as a reference to show that the same level of expression (actin) was analyzed for the same amount of protein as a housekeeping gene (housekeeping gene) in all cells.
도 7에 나타난 바와 같이, 계대 횟수가 증가될수록 세포의 복제성 노화의 지표가 될 수 있는 pRb의 인산화가 감소됨을 확인할 수 있다. 또한, 계대 횟수가 증가될수록 PAPSS2 단백질 발현이 감소됨을 확인할 수 있다. 따라서, pRb과 마찬가지로 PAPSS2 단백질 발현 정도가 세포의 복제성 노화의 지표(marker)로 사용될 수 있음을 확인할 수 있다. As shown in FIG. 7, it can be confirmed that the phosphorylation of pRb, which is an index of the replication-aging of cells, decreases as the number of passages increases. In addition, it can be confirmed that the expression of PAPSS2 protein decreases as the number of passages increases. Thus, as with pRb, the degree of PAPSS2 protein expression can be used as an indicator of the replication-induced aging of cells.
<110> Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
<120> Marker for diagnosing cell senescence and use thereof
<130> P13-036-KNUL
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 3859
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mRNA
<222> (1)..(3859)
<223> Homo sapiens 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2
(PAPSS2), transcript variant 1, mRNA, Access No. NM_004670
<400> 1
ctaggcggcg gcggccgggt ccccaaggct gggcgctgct tgcggaaccg acggggcgga 60
gaggagcgtg gcgggaggag gagtaggaga agggggctgg tcaagggaag tgcgacgtgt 120
ctgcggagcc tttttatacc tccttcccgg gagtccggca gccgctgctg ctgctgctgc 180
tgctgctgcc gccgccgccg ccgccgtccc tgcgtccttc ggtctctgct cccgggaccc 240
gggctccgcc gcagccagcc agcatgtcgg ggatcaagaa gcaaaagacg gagaaccagc 300
agaaatccac caatgtagtc tatcaggccc accatgtgag caggaataag agagggcaag 360
tggttggaac aaggggtggg ttccgaggat gtaccgtgtg gctaacaggt ctctctggtg 420
ctggaaaaac aacgataagt tttgccctgg aggagtacct tgtctcccat gccatccctt 480
gttactccct ggatggggac aatgtccgtc atggccttaa cagaaatctc ggattctctc 540
ctggggacag agaggaaaat atccgccgga ttgctgaggt ggctaagctg tttgctgatg 600
ctggtctggt ctgcattacc agctttattt ctccattcgc aaaggatcgt gagaatgccc 660
gcaaaataca tgaatcagca gggctgccat tctttgaaat atttgtagat gcacctctaa 720
atatttgtga aagcagagac gtaaaaggcc tctataaaag ggccagagct ggggagatta 780
aaggatttac aggtattgat tctgattatg agaaacctga aactcctgag cgtgtgctta 840
aaaccaattt gtccacagtg agtgactgtg tccaccaggt agtggaactt ctgcaagagc 900
agaacattgt accctatact ataatcaaag atatccacga actctttgtg ccggaaaaca 960
aacttgacca cgtccgagct gaggctgaaa ctctcccttc attatcaatt actaagctgg 1020
atctccagtg ggtccaggtt ttgagcgaag gctgggccac tcccctcaaa ggtttcatgc 1080
gggagaagga gtacttacag gttatgcact ttgacaccct gctagatgat ggcgtgatca 1140
acatgagcat ccccattgta ctgcccgtct ctgcagagga taagacacgg ctggaagggt 1200
gcagcaagtt tgtcctggca catggtggac ggagggtagc tatcttacga gacgctgaat 1260
tctatgaaca cagaaaagag gaacgctgtt cccgtgtttg ggggacaaca tgtacaaaac 1320
acccccatat caaaatggtg atggaaagtg gggactggct ggttggtgga gaccttcagg 1380
tgctggagaa aataagatgg aatgatgggc tggaccaata ccgtctgaca cctctggagc 1440
tcaaacagaa atgtaaagaa atgaatgctg atgcggtgtt tgcattccag ttgcgcaatc 1500
ctgtccacaa tggccatgcc ctgttgatgc aggacactcg ccgcaggctc ctagagaggg 1560
gctacaagca cccggtcctc ctactacacc ctctgggcgg ctggaccaag gatgacgatg 1620
tgcctctaga ctggcggatg aagcagcacg cggctgtgct cgaggaaggg gtcctggatc 1680
ccaagtcaac cattgttgcc atctttccgt ctcccatgtt atatgctggc cccacagagg 1740
tccagtggca ctgcaggtcc cggatgattg cgggtgccaa tttctacatt gtggggaggg 1800
accctgcagg aatgccccat cctgaaacca agaaggatct gtatgaaccc actcatgggg 1860
gcaaggtctt gagcatggcc cctggcctca cctctgtgga aatcattcca ttccgagtgg 1920
ctgcctacaa caaagccaaa aaagccatgg acttctatga tccagcaagg cacaatgagt 1980
ttgacttcat ctcaggaact cgaatgagga agctcgcccg ggaaggagag aatcccccag 2040
atggcttcat ggcccccaaa gcatggaagg tcctgacaga ttattacagg tccctggaga 2100
agaactaagc ctttggctcc agagtttctt tctgaagtgc tctttgatta ccttttctat 2160
ttttatgatt agatgctttg tattaaattg cttctcaatg atgcatttta atcttttata 2220
atgaagtaaa agttgtgtct ataattaaaa aaaaatatat atatatacac acacacatat 2280
acatacaaag tcaaactgaa gaccaaatct tagcaggtaa aagcaatatt cttatacatt 2340
tcataataaa attagctcta tgtattttct actgcacctg agcaggcagg tcccagattt 2400
cttaaggctt tgtttgacca tgtgtctagt tacttgctga aaagtgaata tattttccag 2460
catgtcttga caacctgtac tcttccaatg tcatttatca gttgtaaaat atatcagatt 2520
gtgtcctctt ctgtacaatt gacaaaaaaa aaaatttttt tttctcactc taaaagaggt 2580
gtggctcaca tcaagattct tcctgatatt ttacctcatg ctgtacaaag ccttaatgtt 2640
gtaatcatat cttacgtgtt gaagacctga ctggagaaac aaaatgtgca ataacgtgaa 2700
ttttatctta gagatctgtg cagcctattt ctgtcacaaa agttatattg tctaataaga 2760
gaagtcttaa tggcctctgt gaataatgta actccagtta cacggtgact tttaatagca 2820
tacagtgatt tgatgaaagg acgtcaaaca atgtggcgat gtcgtggaaa gttatctttc 2880
ccgctctttg ctgtggtcat tgtgtcttgc agaaaggatg gccctgatgc agcagcagcg 2940
ccagctgtaa taaaaaataa ttcacactat cagactagca aggcactaga actggaaaag 3000
accacagaaa acaaagaatc caaccctttc atcttacagg tgaacaaact gtgatgatgc 3060
acatgtatgt gttttgtaag ctgtgagcac cgtaacaaaa tgtaaatttg ccattattag 3120
gaagtgctgg tggcagtgaa gaagcaccca ggccacttga ctcccagtct ggtgccctgt 3180
ctacaccaga caacacagga gctgggtcag attcccctca gctgcttaac aaagttcctc 3240
gaacagaaag tgcttacaaa gctgccttct cggatactga aaggtcgagt tttctgaact 3300
gcactgattt tattgcagtt gaaaaaaaaa aaaagctatt ccaaagattt caagctgttc 3360
tgagacatct tctgatggct ttacttcctg agaggcaatg tttttacttt atgcataatt 3420
cattgttgcc aaggaataaa gtgaagaaac agcacctttt aatatatagg tctctctgga 3480
agagacctaa attagaaaga gaaaactgtg acaattttca tattctcatt cttaaaaaac 3540
actaatctta actaacaaaa gttcttttga gaataagtta cacacaatgg ccacagcagt 3600
ttgtctttaa tagtatagtg cctatactca tgtaatcggt tactcactac tgcctttaaa 3660
aaaaaaaacc agcatattta ttgaaaacat gagacaggat tatagtgcct taaccgatat 3720
attttgtgac ttaaaaaata catttaaaac tgctcttctg ctctagtacc atgcttagtg 3780
caaatgatta tttctatgta caactgatgc ttgttcttat tttaataaat ttatcagagt 3840
gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3859
<210> 2
<211> 3874
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mRNA
<222> (1)..(3874)
<223> Homo sapiens 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2
(PAPSS2), transcript variant 2, mRNA, NM_001015880
<400> 2
ctaggcggcg gcggccgggt ccccaaggct gggcgctgct tgcggaaccg acggggcgga 60
gaggagcgtg gcgggaggag gagtaggaga agggggctgg tcaagggaag tgcgacgtgt 120
ctgcggagcc tttttatacc tccttcccgg gagtccggca gccgctgctg ctgctgctgc 180
tgctgctgcc gccgccgccg ccgccgtccc tgcgtccttc ggtctctgct cccgggaccc 240
gggctccgcc gcagccagcc agcatgtcgg ggatcaagaa gcaaaagacg gagaaccagc 300
agaaatccac caatgtagtc tatcaggccc accatgtgag caggaataag agagggcaag 360
tggttggaac aaggggtggg ttccgaggat gtaccgtgtg gctaacaggt ctctctggtg 420
ctggaaaaac aacgataagt tttgccctgg aggagtacct tgtctcccat gccatccctt 480
gttactccct ggatggggac aatgtccgtc atggccttaa cagaaatctc ggattctctc 540
ctggggacag agaggaaaat atccgccgga ttgctgaggt ggctaagctg tttgctgatg 600
ctggtctggt ctgcattacc agctttattt ctccattcgc aaaggatcgt gagaatgccc 660
gcaaaataca tgaatcagca gggctgccat tctttgaaat atttgtagat gcacctctaa 720
atatttgtga aagcagagac gtaaaaggcc tctataaaag ggccagagct ggggagatta 780
aaggatttac aggtattgat tctgattatg agaaacctga aactcctgag cgtgtgctta 840
aaaccaattt gtccacagtg agtgactgtg tccaccaggt agtggaactt ctgcaagagc 900
agaacattgt accctatact ataatcaaag atatccacga actctttgtg ccggaaaaca 960
aacttgacca cgtccgagct gaggctgaaa ctctcccttc attatcaatt actaagctgg 1020
atctccagtg ggtccaggtt ttgagcgaag gctgggccac tcccctcaaa ggtttcatgc 1080
gggagaagga gtacttacag gttatgcact ttgacaccct gctagatggc atggcccttc 1140
ctgatggcgt gatcaacatg agcatcccca ttgtactgcc cgtctctgca gaggataaga 1200
cacggctgga agggtgcagc aagtttgtcc tggcacatgg tggacggagg gtagctatct 1260
tacgagacgc tgaattctat gaacacagaa aagaggaacg ctgttcccgt gtttggggga 1320
caacatgtac aaaacacccc catatcaaaa tggtgatgga aagtggggac tggctggttg 1380
gtggagacct tcaggtgctg gagaaaataa gatggaatga tgggctggac caataccgtc 1440
tgacacctct ggagctcaaa cagaaatgta aagaaatgaa tgctgatgcg gtgtttgcat 1500
tccagttgcg caatcctgtc cacaatggcc atgccctgtt gatgcaggac actcgccgca 1560
ggctcctaga gaggggctac aagcacccgg tcctcctact acaccctctg ggcggctgga 1620
ccaaggatga cgatgtgcct ctagactggc ggatgaagca gcacgcggct gtgctcgagg 1680
aaggggtcct ggatcccaag tcaaccattg ttgccatctt tccgtctccc atgttatatg 1740
ctggccccac agaggtccag tggcactgca ggtcccggat gattgcgggt gccaatttct 1800
acattgtggg gagggaccct gcaggaatgc cccatcctga aaccaagaag gatctgtatg 1860
aacccactca tgggggcaag gtcttgagca tggcccctgg cctcacctct gtggaaatca 1920
ttccattccg agtggctgcc tacaacaaag ccaaaaaagc catggacttc tatgatccag 1980
caaggcacaa tgagtttgac ttcatctcag gaactcgaat gaggaagctc gcccgggaag 2040
gagagaatcc cccagatggc ttcatggccc ccaaagcatg gaaggtcctg acagattatt 2100
acaggtccct ggagaagaac taagcctttg gctccagagt ttctttctga agtgctcttt 2160
gattaccttt tctattttta tgattagatg ctttgtatta aattgcttct caatgatgca 2220
ttttaatctt ttataatgaa gtaaaagttg tgtctataat taaaaaaaaa tatatatata 2280
tacacacaca catatacata caaagtcaaa ctgaagacca aatcttagca ggtaaaagca 2340
atattcttat acatttcata ataaaattag ctctatgtat tttctactgc acctgagcag 2400
gcaggtccca gatttcttaa ggctttgttt gaccatgtgt ctagttactt gctgaaaagt 2460
gaatatattt tccagcatgt cttgacaacc tgtactcttc caatgtcatt tatcagttgt 2520
aaaatatatc agattgtgtc ctcttctgta caattgacaa aaaaaaaaat ttttttttct 2580
cactctaaaa gaggtgtggc tcacatcaag attcttcctg atattttacc tcatgctgta 2640
caaagcctta atgttgtaat catatcttac gtgttgaaga cctgactgga gaaacaaaat 2700
gtgcaataac gtgaatttta tcttagagat ctgtgcagcc tatttctgtc acaaaagtta 2760
tattgtctaa taagagaagt cttaatggcc tctgtgaata atgtaactcc agttacacgg 2820
tgacttttaa tagcatacag tgatttgatg aaaggacgtc aaacaatgtg gcgatgtcgt 2880
ggaaagttat ctttcccgct ctttgctgtg gtcattgtgt cttgcagaaa ggatggccct 2940
gatgcagcag cagcgccagc tgtaataaaa aataattcac actatcagac tagcaaggca 3000
ctagaactgg aaaagaccac agaaaacaaa gaatccaacc ctttcatctt acaggtgaac 3060
aaactgtgat gatgcacatg tatgtgtttt gtaagctgtg agcaccgtaa caaaatgtaa 3120
atttgccatt attaggaagt gctggtggca gtgaagaagc acccaggcca cttgactccc 3180
agtctggtgc cctgtctaca ccagacaaca caggagctgg gtcagattcc cctcagctgc 3240
ttaacaaagt tcctcgaaca gaaagtgctt acaaagctgc cttctcggat actgaaaggt 3300
cgagttttct gaactgcact gattttattg cagttgaaaa aaaaaaaaag ctattccaaa 3360
gatttcaagc tgttctgaga catcttctga tggctttact tcctgagagg caatgttttt 3420
actttatgca taattcattg ttgccaagga ataaagtgaa gaaacagcac cttttaatat 3480
ataggtctct ctggaagaga cctaaattag aaagagaaaa ctgtgacaat tttcatattc 3540
tcattcttaa aaaacactaa tcttaactaa caaaagttct tttgagaata agttacacac 3600
aatggccaca gcagtttgtc tttaatagta tagtgcctat actcatgtaa tcggttactc 3660
actactgcct ttaaaaaaaa aaaccagcat atttattgaa aacatgagac aggattatag 3720
tgccttaacc gatatatttt gtgacttaaa aaatacattt aaaactgctc ttctgctcta 3780
gtaccatgct tagtgcaaat gattatttct atgtacaact gatgcttgtt cttattttaa 3840
taaatttatc agagtgaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3874
<210> 3
<211> 614
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(614)
<223> Homo sapiens bifunctional 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate
synthase 2 isoform a protein
<400> 3
Met Ser Gly Ile Lys Lys Gln Lys Thr Glu Asn Gln Gln Lys Ser Thr
1 5 10 15
Asn Val Val Tyr Gln Ala His His Val Ser Arg Asn Lys Arg Gly Gln
20 25 30
Val Val Gly Thr Arg Gly Gly Phe Arg Gly Cys Thr Val Trp Leu Thr
35 40 45
Gly Leu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Thr Ile Ser Phe Ala Leu Glu Glu
50 55 60
Tyr Leu Val Ser His Ala Ile Pro Cys Tyr Ser Leu Asp Gly Asp Asn
65 70 75 80
Val Arg His Gly Leu Asn Arg Asn Leu Gly Phe Ser Pro Gly Asp Arg
85 90 95
Glu Glu Asn Ile Arg Arg Ile Ala Glu Val Ala Lys Leu Phe Ala Asp
100 105 110
Ala Gly Leu Val Cys Ile Thr Ser Phe Ile Ser Pro Phe Ala Lys Asp
115 120 125
Arg Glu Asn Ala Arg Lys Ile His Glu Ser Ala Gly Leu Pro Phe Phe
130 135 140
Glu Ile Phe Val Asp Ala Pro Leu Asn Ile Cys Glu Ser Arg Asp Val
145 150 155 160
Lys Gly Leu Tyr Lys Arg Ala Arg Ala Gly Glu Ile Lys Gly Phe Thr
165 170 175
Gly Ile Asp Ser Asp Tyr Glu Lys Pro Glu Thr Pro Glu Arg Val Leu
180 185 190
Lys Thr Asn Leu Ser Thr Val Ser Asp Cys Val His Gln Val Val Glu
195 200 205
Leu Leu Gln Glu Gln Asn Ile Val Pro Tyr Thr Ile Ile Lys Asp Ile
210 215 220
His Glu Leu Phe Val Pro Glu Asn Lys Leu Asp His Val Arg Ala Glu
225 230 235 240
Ala Glu Thr Leu Pro Ser Leu Ser Ile Thr Lys Leu Asp Leu Gln Trp
245 250 255
Val Gln Val Leu Ser Glu Gly Trp Ala Thr Pro Leu Lys Gly Phe Met
260 265 270
Arg Glu Lys Glu Tyr Leu Gln Val Met His Phe Asp Thr Leu Leu Asp
275 280 285
Asp Gly Val Ile Asn Met Ser Ile Pro Ile Val Leu Pro Val Ser Ala
290 295 300
Glu Asp Lys Thr Arg Leu Glu Gly Cys Ser Lys Phe Val Leu Ala His
305 310 315 320
Gly Gly Arg Arg Val Ala Ile Leu Arg Asp Ala Glu Phe Tyr Glu His
325 330 335
Arg Lys Glu Glu Arg Cys Ser Arg Val Trp Gly Thr Thr Cys Thr Lys
340 345 350
His Pro His Ile Lys Met Val Met Glu Ser Gly Asp Trp Leu Val Gly
355 360 365
Gly Asp Leu Gln Val Leu Glu Lys Ile Arg Trp Asn Asp Gly Leu Asp
370 375 380
Gln Tyr Arg Leu Thr Pro Leu Glu Leu Lys Gln Lys Cys Lys Glu Met
385 390 395 400
Asn Ala Asp Ala Val Phe Ala Phe Gln Leu Arg Asn Pro Val His Asn
405 410 415
Gly His Ala Leu Leu Met Gln Asp Thr Arg Arg Arg Leu Leu Glu Arg
420 425 430
Gly Tyr Lys His Pro Val Leu Leu Leu His Pro Leu Gly Gly Trp Thr
435 440 445
Lys Asp Asp Asp Val Pro Leu Asp Trp Arg Met Lys Gln His Ala Ala
450 455 460
Val Leu Glu Glu Gly Val Leu Asp Pro Lys Ser Thr Ile Val Ala Ile
465 470 475 480
Phe Pro Ser Pro Met Leu Tyr Ala Gly Pro Thr Glu Val Gln Trp His
485 490 495
Cys Arg Ser Arg Met Ile Ala Gly Ala Asn Phe Tyr Ile Val Gly Arg
500 505 510
Asp Pro Ala Gly Met Pro His Pro Glu Thr Lys Lys Asp Leu Tyr Glu
515 520 525
Pro Thr His Gly Gly Lys Val Leu Ser Met Ala Pro Gly Leu Thr Ser
530 535 540
Val Glu Ile Ile Pro Phe Arg Val Ala Ala Tyr Asn Lys Ala Lys Lys
545 550 555 560
Ala Met Asp Phe Tyr Asp Pro Ala Arg His Asn Glu Phe Asp Phe Ile
565 570 575
Ser Gly Thr Arg Met Arg Lys Leu Ala Arg Glu Gly Glu Asn Pro Pro
580 585 590
Asp Gly Phe Met Ala Pro Lys Ala Trp Lys Val Leu Thr Asp Tyr Tyr
595 600 605
Arg Ser Leu Glu Lys Asn
610
<210> 4
<211> 619
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(619)
<223> Homo sapiens bifunctional 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate
synthase 2 isoform b protein
<400> 4
Met Ser Gly Ile Lys Lys Gln Lys Thr Glu Asn Gln Gln Lys Ser Thr
1 5 10 15
Asn Val Val Tyr Gln Ala His His Val Ser Arg Asn Lys Arg Gly Gln
20 25 30
Val Val Gly Thr Arg Gly Gly Phe Arg Gly Cys Thr Val Trp Leu Thr
35 40 45
Gly Leu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Thr Ile Ser Phe Ala Leu Glu Glu
50 55 60
Tyr Leu Val Ser His Ala Ile Pro Cys Tyr Ser Leu Asp Gly Asp Asn
65 70 75 80
Val Arg His Gly Leu Asn Arg Asn Leu Gly Phe Ser Pro Gly Asp Arg
85 90 95
Glu Glu Asn Ile Arg Arg Ile Ala Glu Val Ala Lys Leu Phe Ala Asp
100 105 110
Ala Gly Leu Val Cys Ile Thr Ser Phe Ile Ser Pro Phe Ala Lys Asp
115 120 125
Arg Glu Asn Ala Arg Lys Ile His Glu Ser Ala Gly Leu Pro Phe Phe
130 135 140
Glu Ile Phe Val Asp Ala Pro Leu Asn Ile Cys Glu Ser Arg Asp Val
145 150 155 160
Lys Gly Leu Tyr Lys Arg Ala Arg Ala Gly Glu Ile Lys Gly Phe Thr
165 170 175
Gly Ile Asp Ser Asp Tyr Glu Lys Pro Glu Thr Pro Glu Arg Val Leu
180 185 190
Lys Thr Asn Leu Ser Thr Val Ser Asp Cys Val His Gln Val Val Glu
195 200 205
Leu Leu Gln Glu Gln Asn Ile Val Pro Tyr Thr Ile Ile Lys Asp Ile
210 215 220
His Glu Leu Phe Val Pro Glu Asn Lys Leu Asp His Val Arg Ala Glu
225 230 235 240
Ala Glu Thr Leu Pro Ser Leu Ser Ile Thr Lys Leu Asp Leu Gln Trp
245 250 255
Val Gln Val Leu Ser Glu Gly Trp Ala Thr Pro Leu Lys Gly Phe Met
260 265 270
Arg Glu Lys Glu Tyr Leu Gln Val Met His Phe Asp Thr Leu Leu Asp
275 280 285
Gly Met Ala Leu Pro Asp Gly Val Ile Asn Met Ser Ile Pro Ile Val
290 295 300
Leu Pro Val Ser Ala Glu Asp Lys Thr Arg Leu Glu Gly Cys Ser Lys
305 310 315 320
Phe Val Leu Ala His Gly Gly Arg Arg Val Ala Ile Leu Arg Asp Ala
325 330 335
Glu Phe Tyr Glu His Arg Lys Glu Glu Arg Cys Ser Arg Val Trp Gly
340 345 350
Thr Thr Cys Thr Lys His Pro His Ile Lys Met Val Met Glu Ser Gly
355 360 365
Asp Trp Leu Val Gly Gly Asp Leu Gln Val Leu Glu Lys Ile Arg Trp
370 375 380
Asn Asp Gly Leu Asp Gln Tyr Arg Leu Thr Pro Leu Glu Leu Lys Gln
385 390 395 400
Lys Cys Lys Glu Met Asn Ala Asp Ala Val Phe Ala Phe Gln Leu Arg
405 410 415
Asn Pro Val His Asn Gly His Ala Leu Leu Met Gln Asp Thr Arg Arg
420 425 430
Arg Leu Leu Glu Arg Gly Tyr Lys His Pro Val Leu Leu Leu His Pro
435 440 445
Leu Gly Gly Trp Thr Lys Asp Asp Asp Val Pro Leu Asp Trp Arg Met
450 455 460
Lys Gln His Ala Ala Val Leu Glu Glu Gly Val Leu Asp Pro Lys Ser
465 470 475 480
Thr Ile Val Ala Ile Phe Pro Ser Pro Met Leu Tyr Ala Gly Pro Thr
485 490 495
Glu Val Gln Trp His Cys Arg Ser Arg Met Ile Ala Gly Ala Asn Phe
500 505 510
Tyr Ile Val Gly Arg Asp Pro Ala Gly Met Pro His Pro Glu Thr Lys
515 520 525
Lys Asp Leu Tyr Glu Pro Thr His Gly Gly Lys Val Leu Ser Met Ala
530 535 540
Pro Gly Leu Thr Ser Val Glu Ile Ile Pro Phe Arg Val Ala Ala Tyr
545 550 555 560
Asn Lys Ala Lys Lys Ala Met Asp Phe Tyr Asp Pro Ala Arg His Asn
565 570 575
Glu Phe Asp Phe Ile Ser Gly Thr Arg Met Arg Lys Leu Ala Arg Glu
580 585 590
Gly Glu Asn Pro Pro Asp Gly Phe Met Ala Pro Lys Ala Trp Lys Val
595 600 605
Leu Thr Asp Tyr Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Asn
610 615
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense sequence of siRNA for Homo sapiens 3'-phosphoadenosine
5'-phosphosulfate synthase 2 (PAPSS2)
<400> 5
acaaccugua cucuuccaa 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense sequence of siRNA for Homo sapiens 3'-phosphoadenosine
5'-phosphosulfate synthase 2 (PAPSS2)
<400> 6
uuggaagagu acagguugu 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense sequence of non-specific siRNA
<400> 7
ccuacgccac caauuucgu 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense sequence of non-specific siRNA
<400> 8
acgaaauugg uggcguagg 19
<110> Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
<120> Marker for diagnosing cell senescence and use thereof
<130> P13-036-KNUL
<160> 8
<170> Kopatentin 2.0
<210> 1
<211> 3859
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mRNA
≪ 222 > (1) .. (3859)
<223> Homo sapiens 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2
(PAPSS2),
Claims (6)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20130069703A KR101508129B1 (en) | 2013-06-18 | 2013-06-18 | Marker for diagnosing cell senescence and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20130069703A KR101508129B1 (en) | 2013-06-18 | 2013-06-18 | Marker for diagnosing cell senescence and use thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20140146859A KR20140146859A (en) | 2014-12-29 |
KR101508129B1 true KR101508129B1 (en) | 2015-04-06 |
Family
ID=52675899
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR20130069703A KR101508129B1 (en) | 2013-06-18 | 2013-06-18 | Marker for diagnosing cell senescence and use thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101508129B1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9994849B2 (en) | 2015-12-24 | 2018-06-12 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of separating senescent cells using overexpression of protocadherin |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111727374B (en) | 2017-10-13 | 2024-02-20 | 纳米智能生物医学工程有限公司 | GRP78 derived peptides for identification of high efficiency stem cells |
KR102129380B1 (en) * | 2017-10-13 | 2020-07-02 | 주식회사 나이벡 | Method of Screening Highly Efficient Stem Cell Using GRP78 Protein Biomarker |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005534324A (en) * | 2002-08-06 | 2005-11-17 | エクセリクシス, インク. | PAPSSs as AXIN pathway modifiers and methods of use |
-
2013
- 2013-06-18 KR KR20130069703A patent/KR101508129B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005534324A (en) * | 2002-08-06 | 2005-11-17 | エクセリクシス, インク. | PAPSSs as AXIN pathway modifiers and methods of use |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9994849B2 (en) | 2015-12-24 | 2018-06-12 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of separating senescent cells using overexpression of protocadherin |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20140146859A (en) | 2014-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Azimzadeh et al. | hPOC5 is a centrin-binding protein required for assembly of full-length centrioles | |
Xu et al. | Human Rif1 protein binds aberrant telomeres and aligns along anaphase midzone microtubules | |
Li et al. | Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2 | |
Kurschat et al. | Neuron restrictive silencer factor NRSF/REST is a transcriptional repressor of neuropilin-1 and diminishes the ability of semaphorin 3A to inhibit keratinocyte migration | |
Dugina et al. | Interaction of microtubules with the actin cytoskeleton via cross-talk of EB1-containing+ TIPs and γ-actin in epithelial cells | |
Kannan et al. | Mutation in senataxin alters the mechanism of R-loop resolution in amyotrophic lateral sclerosis 4 | |
Hsu et al. | 58-kDa microspherule protein (MSP58) is novel Brahma-related gene 1 (BRG1)-associated protein that modulates p53/p21 senescence pathway | |
Gorsler et al. | DNA damage-induced translocation of S100A11 into the nucleus regulates cell proliferation | |
Wang et al. | FERM-containing protein FRMD5 is a p120-catenin interacting protein that regulates tumor progression | |
Chuang et al. | The homeobox transcription factor Irxl1 negatively regulates MyoD expression and myoblast differentiation | |
KR101508129B1 (en) | Marker for diagnosing cell senescence and use thereof | |
Mouton et al. | Ascribing novel functions to the sarcomeric protein, myosin binding protein H (MyBPH) in cardiac sarcomere contraction | |
WO2016152352A1 (en) | Melanoma-specific biomarker and use thereof | |
EP1315970B1 (en) | Nucleic acid sequence and protein involved in cellular senescence | |
Zhou et al. | Decorin promotes proliferation and migration of ORS keratinocytes and maintains hair anagen in mice | |
Basak et al. | Sequestration of eIF4A by angiomotin: A novel mechanism to restrict global protein synthesis in trophoblast cells | |
Hägele et al. | TSGA10 prevents nuclear localization of the hypoxia-inducible factor (HIF)-1α | |
Priami et al. | Aberrant activation of p53/p66Shc-mInsc axis increases asymmetric divisions and attenuates proliferation of aged mammary stem cells | |
Noguchi et al. | Hic‐5 affects proliferation, migration and invasion of B16 murine melanoma cells | |
KR101642264B1 (en) | Method for screening of interaction inhibitors between YAP or TAZ protein and MAML1 or MAML2 protein | |
Sitterlin | Characterization of the Drosophila Rae1 protein as a G1 phase regulator of the cell cycle | |
Cano-Rodriguez et al. | TCTN2: a novel tumor marker with oncogenic properties | |
AU2001295457B2 (en) | Use of CARP inhibitors for the treatment of heart diseases | |
WO2005111213A1 (en) | Target gene mimitin of myc | |
TW201204393A (en) | Diagnostic agent and therapeutic agent of cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180323 Year of fee payment: 4 |