KR101504879B1

KR101504879B1 - 아메리카동애등에(Hermetia illucens)의 장내에서 유래된 바실러스 속의 새로운 유용성 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101504879B1
Application number: KR1020140147769A
Authority: KR
Inventors: 이상훈; 김용균; 박지영; 김은성
Original assignee: 이상훈
Priority date: 2014-10-28
Filing date: 2014-10-28
Publication date: 2015-03-23

Abstract

본 발명은 아메리카동애등에(Hermetia illucens)의 장내에서 유래된 새로운 유용성 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는, 그람양성균 및 그람음성균에 대한 항균 활성, 항진균 활성, 항생제 내성, 아밀레이즈 활성, 및 섬유소 분해효소 활성을 나타내는 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii) ANU101 (수탁번호 KACC91846P)와; 그람양성균에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 아밀레이즈 활성 및 단백질분해효소 활성을 나타내는 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) ANU101 (수탁번호 KACC91845P); 및 항생제 내성 및 지질분해효소 활성을 나타내는 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) ANU101 (수탁번호 KACC91847P)이 제공된다. 또한, 본 발명에서는 상기 균주들을 이용한 항균제 조성물, 음식물 분해용 미생물 제제 및 사료첨가제 조성물이 제공된다.

Description

아메리카동애등에(Hermetia illucens)의 장내에서 유래된 바실러스 속의 새로운 유용성 균주 및 이의 용도 {New Bacillus bacteria Isolated from gut of Hermetia illucens and its use}

본 발명은 아메리카동애등에(Hermetia illucens)의 장내에서 유래된, 유용성이 높은 새로운 균주 및 이의 용도에 대한 것이다.

아메리카동애등에는 파리목 동애등에과에 속하는 곤충으로 원산지는 북아메리카이지만 전 세계로 퍼져나가 온대지역 전역에 분포하는 범존종으로 분류된다(Sheppard et al., 2002).

아메리카동애등에의 유충은 잡식성으로 주로 인축의 음식물 폐기물에서 발생하여 환경 정화 곤충으로 주목을 받아 왔다. 또한 이러한 유기 폐기물에서 다수의 유충이 함께 섭식하면서 50-60℃의 고온을 발생시키고 항생물질을 분비하여 타 생명체의 접근을 억제하는 것으로 알려져 있다(Landi, 1960; Erickson et al., 2004). 다양한 항생물질을 생산하는 아메리카동애등에는 의약용 물질을 생산하는 측면에서도 산업적 이용 가능성을 보이고 있다(Natori, 1995; Sherman et al., 2000). 다 자란 유충은 크기가 약 2cm이고, 단백질의 함량이 전체의 40% 이상이고 지질의 함량이 전체의 30% 이상으로 단백질과 지질의 함량이 높아 영양물질의 구성이 우수하므로 가축에 양질의 사료로 사용되고 있으며(Newton et al., 1997), 지질함량이 높아 바이오 연료로서의 가능성도 제기되고 있다. 또한 아메리카동애등에의 배설물은 양질의 유기질 비료로서 사용이 가능하다(Diener et al., 2009).

아메리카동애등에는 광식성(廣食性)을 가지고 있으며, 이러한 아메리카동애등에의 광식성을 음식물 쓰레기의 정화에 이용하기 위한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 연구의 일환으로 아메리카동애등에의 분해효소의 종류와 특성 및 장내 공생미생물 분석이 이뤄지고 있다.

아메리카동애등에의 소화관 즙액은 비교적 높은 단백질, 탄수화물 및 지질 분해 능력을 소유하고 있는 것으로 밝혀졌다(Kim et al., 2011a,b). 또한 탄수화물 가운데에서도 섬유소 분해 능력을 보유하고 있어, 이들을 소화하는데 있어서 공생 미생물에 대한 의존성이 높을 것으로 예상되고 있다.

아메리카동애등에의 장내 미생물을 메타게놈 방식으로 분석한 결과 6개 문의 세균류가 검출되었다(Jeon et al., 2011). 일반적으로 이러한 장내 미생물은 아메리카동애등에의 소화, 발육 및 면역에 중요한 역할을 담당할 뿐만 아니라 병원성 미생물의 정착을 억제하는데도 필요한 것으로 생각된다(Qin et al., 2010; Roh et al., 2008; Yu et al., 2008).

그러나 장내 서식하는 미생물 가운데 기주와 단순히 편리공생관계에 있는 미생물이 아니라 상호 상생공생 관계를 이루는 미생물을 결정하는 것은 쉽지 않다. 예를 들면, 아메리카동애등에의 경우도 장내 세균의 종류는 먹이 조건에 따라 상이하게 나타나며, 먹이의 다양성에 따라 세균의 종류도 다양하게 나타나는 경향을 보여서 공생관계를 이루는 미생물의 종류는 동적 변화를 이루고 있음을 보여주고 있다(Jeon et al., 2011; Zheng et al., 2013).

국내 산업용으로 응용되고 있는 아메리카동애등에에 대한 발현유전체의 분석도 이루어졌으며(Park et al., 2013), 면역, 스트레스 및 소화와 관련된 다수의 유전자를 동애등에 전사체에서 찾을 수 있었다. 특히 이들 유전자의 발현과 동애등에의 발육은 관련성이 높은 것으로 나타나고 있다.

Diener, S., Zurbrugg, C., Tockner, K., 2009. Conversion of organic material by black soldier fly larvae: establishing optimal feeding rates. Waste Manag. Res. 27, 603-610. Erickson, M.C., Islam, M., Sheppard, C., Liao, J., Doyle, M.P., 2004. Reduction of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella enterica serovar enteritidis in chicken manure by larvae of the black soldier fly. J. Food Protect. 67, 685-690. Jeon, H., Park, S., Choi, J., Jeong, G., Lee, S.B., Choi, Y., Lee, S.J., 2011. The intestinal bacterial community in the food waste-reducing larvae of Hermetia illucens. Curr. Microbiol. 62, 1390-1399. Kim, W., Bae, S., Kim, A., Park, K., Lee, S., Choi, Y., Han, S., Park, Y., Koh, Y., 2011a. Characterization of the molecular features and expression patterns of two serine proteases in Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) larvae. BMB reports 44, 387-392. Kim, W., Bae, S., Park, K., Lee, S., Choi, Y., Han, S., Koh, Y., 2011b. Biochemical characterization of digestive enzymes in the black solder fly, Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae). J. Asia Pac. Entomol. 14, 11-14. Landi, S., 1960. Bacteriostatic effect of hemolymph of larvae of various botflies. Can. J. Microbiol. 6, 115-119. Natori, S., 1995. Antimicrobial proteins of insects and their clinical application. Nippon Rinsho. 5, 1297-1304. Newton, G.L., Booram, C.V., Barker, R.W., Hale, O.M., 1997. Dried Hermetia illucens larvae meal as a supplement for swine. J. Anim. Sci. 44, 395-400. Park, J., Lee, S., Lee, H., Kim, Y., 2013. Effect of stress sound on the development of the black soldier fly, Hermetia illucens. Korean J. Appl. Entomol. In Press. Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K.S. 2010. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464, 59-65. Roh, S.W., Nam, Y.D., Chang, H.W., Kim, K.H., Kim, M.S., Ryu, J.H., Kim, S.H., Lee, W.J., Bae, J.W., 2008. Phylogenetic characterization of two novel commensal bacteria involved with innate immune homeostasis in Drosophila melanogaster. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6171-6177. Sheppard, D.C., Tomberlin, J.K., Joyce, J.A., Kiser, B.C., Sumner, S.M., 2002. Rearing methods for the black soldier fly (Diptera: Stratiomyidae). J. Med. Entomol. 39, 695-698. Sherman, R.A., Hall, M.J.R., Thomas, S., 2000. Medical maggots: an ancient remedy for some contemporary afflictions. Annu. Rev. Entomol. 45, 55-81. Yu, H., Wang, Z., Liu, L., Xia, Y., Cao, Y., Yin, Y., 2008. Analysis of the intestinal microflora in Hepialus gonggaensis larvae using 16S rRNA sequences. Curr. Microbiol. 56, 391-396. Zheng, L., Crippen, T.L., Singh, B., Tarone, A.M., Dowd, S., Yu, Z., Wood, T.K., Tomberlin, J.K., 2013. A survey of bacterial diversity from successive life stages of black solder fly (Diptera: Stratiomyidae) by using 16S rDNA pyrosequencing. J. Med. Entomol. 50, 647-658.

아메리카동애등에의 장내 미생물을 단순히 메타게놈 방식으로 분석한 연구결과가 있으나, 장내 서식하는 미생물 가운데 기주와 단순히 편리공생관계에 있는 미생물이 아니라 상호 상생공생 관계를 이루는 미생물을 결정하는 것은 쉽지 않다. 아메리카동애등에의 경우 장내 세균의 종류가 먹이 조건에 따라 상이하게 나타나고, 먹이의 다양성에 따라 세균의 종류도 다양하게 나타나는 경향을 보이고 있어 공생관계를 이루는 미생물의 종류가 동적으로 변화하고 있는 것으로 보고되었다.

본 발명은 아메리카동애등에의 장내에 서식하는 미생물 가운데 상호 공생 관계에 있다고 판단되는 유용성이 높은 미생물을 분리하여 그 균학적 특성을 밝히고 동정하여, 유용성이 높은 새로운 미생물과 그 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에서는 아메리카동애등에의 소화관을 적출하여 부위별로 세균을 분석하여 다양한 용도를 가질 수 있는 3종의 상이한 균총을 최종 분리하고, 이들의 생화학적 특성, 항균 능력 등을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는,

그람양성균 및 그람음성균에 대한 항균 활성, 항진균 활성, 항생제 내성, 아밀레이즈 활성, 및 섬유소 분해효소 활성을 나타내는 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii) ANU101 (수탁번호 KACC91846P)이 제공된다.

또한, 본 발명에서는

그람양성균에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 아밀레이즈 활성 및 단백질분해효소 활성을 나타내는 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) ANU101 (수탁번호 KACC91845P)이 제공된다.

본 발명에서는,

아메리카동애등에(Hermetia illucens)의 장내에서 분리되고, 항생제 내성 및 지질분해효소 활성을 나타내는 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) ANU101 (수탁번호 KACC91847P)이 제공된다.

또한, 본 발명에서는, 상기 균주들을 이용한 항균제 조성물이 제공된다. 본 발명의 항균제 조성물은, 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii) ANU101 (수탁번호 KACC91846P), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) ANU101 (수탁번호 KACC91845P) 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서 항균제 조성물은, 모르가넬라 모르가니 ANU101 (수탁번호 KACC91846P)을 포함하며, 그람양성균에 대한 항균 활성, 그람음성균에 대한 항균 활성, 항진균 활성 및 항생제 내성을 나타낸다. 본 발명의 다른 실시예에서 항균제 조성물은, 프로비덴시아 레트게리 ANU101 (수탁번호 KACC91845P)을 포함하며, 그람양성균에 대한 항균 활성 및 항생제 내성을 나타낸다. 본 발명에서 “항균제”(antimicrobials)는 특별히 한정하지 않는 한 세균에 대한 항균활성(antibacterial activity)과 진균에 대한 항진균 활성(antifungal activity)을 모두 포함하는 의미로 정의된다.

본 발명의 항균제 조성물은 기존의 다양한 항생제에 대해 강한 내성을 지니고 있어 병원성 미생물의 치료에 사용되는 기존 항생제에 영향을 받지 않으면서 항균작용을 나타낼 수 있으므로 기존의 항생제와 함께 사용하는 것도 가능하다.

또한 본 발명에서는, 상기 균주들을 포함하는 음식물 분해용 미생물 제제가 제공된다. 본 발명의 음식물 분해용 미생물 제제는, 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii) ANU101 (수탁번호 KACC91846P), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) ANU101 (수탁번호 KACC91845P), 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) ANU101 (수탁번호 KACC91847P) 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서 음식물 분해용 미생물 제제는, 모르가넬라 모르가니 ANU101 (수탁번호 KACC91846P)을 포함하며, 아밀레이즈 활성, 섬유소 분해효소 활성 및 항생제 내성을 나타낸다. 본 발명의 다른 실시예에서 음식물 분해용 미생물 제제는, 프로비덴시아 레트게리 ANU101 (수탁번호 KACC91845P)을 포함하며, 아밀레이즈 활성, 단백질분해효소 활성 및 항생제 내성을 나타낸다. 본 발명의 또 다른 실시예에서 음식물 분해용 미생물 제제는, 바실러스 할로두란스 ANU101 (수탁번호 KACC91847P)을 포함하며, 지질분해효소 활성 및 항생제 내성을 나타낸다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서 음식물 분해용 미생물 제제는, 모르가넬라 모르가니 ANU101 (수탁번호 KACC91846P), 프로비덴시아 레트게리 ANU101 (수탁번호 KACC91845P) 및 바실러스 할로두란스 ANU101 (수탁번호 KACC91847P)를 모두 포함하며, 아밀레이즈 활성, 섬유소 분해효소 활성, 단백질분해효소 활성, 지질분해효소 활성 및 항생제 내성을 나타낸다.

본 발명의 미생물 제제는 특히 음식물 찌꺼기를 분해시키는데 이용될 수 있다. 음식물 찌꺼기는 통상 다량의 수분과 10~20%의 유기물 및 약 1% 내외의 무기물로 이루어져 있다. 이중 유기물은 탄수화물(곡물류, 야채류, 과일류), 단백질(생선류, 육류) 및 지방(기름류, 유지류) 등으로 이루어져 있으며, 이들은 고분자 중합체로 구성되어 있으므로 미생물이 직접 분해 소멸시킬 수는 없다. 이러한 고분자 중합체는 미생물이 체외로 분비하는 각종 효소에 의해 모노머로 분해된 후 미생물이 이용할 수 있다. 따라서 음식물 쓰레기를 효율적으로 분해 소멸시키기 위해서는 이들 효소의 생산력 및 활성도가 높아야 한다.

아밀라아제는 탄수화물 분해효소로서 곡류의 주성분인 녹말을 분해하여 소멸시킨다. 같은 탄수화물 계통이지만 야채류에 많이 포함되어 있는 난분해성 탄수화물인 섬유소는 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌 등으로 구성되어 있으며, 그 중 셀룰로오즈의 함유량이 가장 높다. 셀룰라아제는 셀룰로오즈를 포도당과 같은 단당류오 분해하는 기능을 하며 섬유소 소멸에 절대적인 역할을 한다. 실제로 음식물 찌꺼기의 상당량이 섬유소로 구성되어 있으므로, 이 섬유소를 분해하는 효소인 셀룰라아제는 매우 중요한 분해효소이다. 프로테아제는 단백질 분해효소로서, 생선, 육류 등의 주성분인 단백질을 아미노산으로 분해하는 기능을 하며, 미생물은 이 아미노산을 이용하여 번식하므로 궁극적으로는 단백질 성분을 소멸시키게 된다. 리파아제는 지방분해효소로서 식물성 유지 등의 주성분인 지방성분을 지방산과 글리세롤로 분해하는 기능을 하며 이 분해된 성분들은 미생물에 의하여 직접 소멸되므로 궁극적으로 지방성분을 소멸시키게 된다. 지방성분은 난분해성 유기물의 일종으로 발효가 제대로 이루어지지 않으면 다량의 악취물질을 발생시킬 뿐 아니마 음식물에 공기공급을 차단하여 음식물 소멸성능을 악화시키는 특징을 가지고 있으므로, 이를 분해하는 지방분해효소인 리파아제의 활성이 중요하다.

본 발명의 모르가넬라 모르가니 ANU101은 아밀라아제 활성과 셀룰셀룰라아제 활성을 가지고, 프로비덴시아 레트게리 ANU101은 아밀라아제 활성과 프로테아제 활성을 가지며, 바실러스 할로두란스 ANU101은 리파아제 활성을 가진다. 이들 균주들을 포함하는 본 발명의 미생물 제제는 각각의 균주가 가진 효소활성의 복합작용으로 음식물 쓰레기 내의 탄수화물, 섬유소, 단백질 및 지방을 모두 분해시킬 수 있으므로 음식물 쓰레기를 효율적으로 분해소멸시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 음식물 분해용 미생물 제제는 병원성 미생물에 대한 항균작용도 가지고 있으므로 음식물 쓰레기 분해과정에서 병원성 미생물의 발생을 차단하면서 음식물 쓰레기를 위생적으로 처리할 수 있다.

본 발명의 균주들을 음식물 쓰레기 분해용 미생물 제제로 사용하는 경우, 바람직하게는 본 발명의 균주를 보존담체에 흡착시켜 사용할 수 있다. 적절한 보존담체로는 톱밥, 왕겨, 초벌구이, 탈지강, 셀카시(CellCaSi), 활성탄, 규조토, 화이트 카본 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 균주를 배양한 균배양액과 보존담체를 혼합함으로써 본 발명의 균주를 보존담체에 흡착시킬 수 있다.

또한 본 발명에서는, 상기 균주들을 포함하는 사료첨가제 조성물이 제공된다. 본 발명의 사료첨가제 조성물은, 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii) ANU101 (수탁번호 KACC91846P), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) ANU101 (수탁번호 KACC91845P), 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) ANU101 (수탁번호 KACC91847P) 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서 사료첨가제 조성물은, 모르가넬라 모르가니 ANU101 (수탁번호 KACC91846P)을 포함하며, 항균 활성, 항진균 활성, 항생제 내성, 아밀레이즈 활성 및 섬유소 분해효소 활성을 나타낸다. 본 발명의 다른 실시예에서 사료첨가제 조성물은, 프로비덴시아 레트게리 ANU101 (수탁번호 KACC91845P)을 포함하며, 항균 활성, 항생제 내성, 아밀레이즈 활성 및 단백질분해효소 활성을 나타낸다. 본 발명의 또 다른 실시예에서 사료첨가제 조성물은, 바실러스 할로두란스 ANU101 (수탁번호 KACC91847P)을 포함하며, 지질분해효소 활성 및 항생제 내성을 나타낸다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서 사료첨가제 조성물은, 모르가넬라 모르가니 ANU101 (수탁번호 KACC91846P), 프로비덴시아 레트게리 ANU101 (수탁번호 KACC91845P) 및 바실러스 할로두란스 ANU101 (수탁번호 KACC91847P)을 모두 포함하며, 항균 활성, 항진균 활성, 항생제 내성, 아밀레이즈 활성, 섬유소 분해효소 활성, 단백질분해효소 활성 및 지질분해효소 활성을 나타낸다.

본 발명에서 제공되는 모르가넬라 모르가니 ANU101, 프로비덴시아 레트게리 ANU101 및 바실러스 할로두란스 ANU101은 항생제 내성, 우수한 항균능력, 다양한 영양소에 대한 분해효소 활성 등을 나타내므로 의약용 물질의 제조, 음식물 쓰레기의 처리, 사료 첨가제를 포함하는 다양한 용도로 여러 산업분야에서 이용될 수 있다.

상기 균주들을 이용한 본 발명의 항균제 조성물은 우수한 항균 및 항진균 효과를 나타내면서 동시에 항생제에 대한 내성을 지니고 있어 병원성 미생물의 치료에 사용되는 기존 항생제에 영향을 받지 않으면서 항균작용을 나타낼 수 있으므로 기존의 항생제와 함께 사용될 수도 있다.

또한, 상기 균주를 이용한 본 발명의 음식물 분해용 미생물 제제는, 상기 3가지 균주의 소화효소분해 활성이 달라 복합 사용으로 각각의 균주가 상호작용하여 음식물에 포함된 영양소를 모두 분해할 수 있으며, 필요에 따라 선택적으로 사용하여 음식물에 포함되어 있는 탄수화물, 섬유소, 단백질 및 지방을 선택적으로 분해할 수도 있다. 본 발명의 음식물 분해용 미생물 제제는, 특히 다양한 영양소가 모두 포함되어 있는 음식물 쓰레기를 효과적으로 분해 처리할 수 있으며, 아울러 항균작용을 가지므로 음식물 쓰레기 내에 존재하는 병원성 미생물들을 사멸시키는 효과도 나타낼 수 있으며, 또한 항생제 내성이 있어 다른 항생제와 함께 사용하는 것도 가능하다.

상기 균주를 이용한 본 발명의 사료첨가제 조성물은, 항균 활성이 있어 가축 사육에서 기존 항생제의 사용을 대체할 수 있으며, 소화효소활성으로 가축의 소화를 도울 수 있으며, 또한 항생제 내성이 있으므로 다른 항생제와 함께 사용되는 것도 가능하다.

도 1은 아메리카동애등에 유충으로부터 적출된 소화관을 나타낸 것이다. 도 1의 (A)는 적출된 소화관의 사진으로, 소화관은 전장(FG), 중장(MG), 후장(HG)으로 이루어져 있고, 중장(MG)과 후장(HG)사이에는 말피기관(MT)이 위치하고 있다. 도 1의 (B)는 총장(WG)의 길이를 몸(Body)의 길이 및 후장(HG)의 길이와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 아메리카동애등에 유충의 소화관으로부터 분리된 본 발명의 3가지 균주들의 균총을 나타낸 것이다. I은 모르가넬라 모르가니 ANU101, Ⅱ는 프로비덴시아 레트게리 ANU101, Ⅲ는 바실러스 할로두란스 ANU101을 나타낸다.
도 3은 소화관의 각 영역에서의 총 세균밀도를 나타낸 것이다.
도 4는 소화관의 각 영역에서 각 균주들의 균총의 상대밀도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 미생물 균주들의 항생제 내성을 실험한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 미생물 균주들의 분해효소 활성을 실험한 결과를 나타낸 사진이다.

본 출원에서 "포함한다" 와 같은 용어는 명세서 상에 기재된 구성이나 단계 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 구성들이나 단계 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의하지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

균주의 분리 및 동정

1. 아메리카동애등에 유충의 사육

시험곤충으로는 공주시 정안면의 그린테코에서 아메리카동애등에 유충을 분양받아 돼지사료(Nonghyup Livestock Grains, Seoul)를 먹이로 유충 성장을 유지시켜 사용하였다.

2. 아메리카동애등에 유충의 소화관 분리

종령 유충의 동애등에 소화관을 적출하여 부위별로 크기와 세균을 분석하였다. 먼저, 아메리카동애등에 종령 유충을 선발하여 체 표면을 70% 에탄올로 표면 살균한 후 멸균된 인산완충용액(PBS: 100 mM phosphate, 0.7% NaCl, pH 7.4)에서 소화관을 분리하였다. 결과는 도 1과 같다. 도 1의 (A)는 적출된 소화관의 사진으로, 소화관은 전장(FG), 중장(MG), 후장(HG)으로 이루어져 있고, 중장(MG)과 후장(HG) 사이에는 말피기관(MT)이 위치하고 있다. 도 1의 (B)는 총장(WG)의 길이를 몸(Body)의 길이 및 후장(HG)의 길이와 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 아메리카동애등에 유충의 소화관은 체강에 여러 겹으로 접혀 있는 모습으로 존재하였으며, 적출된 소화관(whole intestine, WG)의 길이는 몸(Body)의 길이(10 ㎜)에 비해 약 7 배 (약 71 ㎜)에 달하는 것으로 나타났다. 일반적으로 음식물을 보관하는 전장(foregut, FG)은 중장(midgut, MG)에 비해 직경이 두꺼운 모습을 나타냈고, 중장과 후장(hindgut, HG) 사이에는 말피기관(Malpighian tubule, MT)이 연결되어 있었다. 전장, 중장, 후장(후장의 시작은 말피기관의 기부로 판정함)의 길이는 약 20-25mm로 거의 비슷하게 구성되어 있었다.

3. 아메리카동애등에 유충의 소화관에서 미생물의 분리

상기 분리된 각 부위의 소화관을 3 마리에서 분리된 것을 기준으로 200 ㎕의 멸균수에 넣고 마쇄하였다. 마쇄 후 약 200 x g에서 3 분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 얻어진 상등액에 멸균수를 넣어 10 배씩 희석하였다. 이 세균 추출액을 100 ㎕씩 NA(Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spain)에 도말하여 30℃ 조건의 혐기성 배양기(Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI, USA)에서 24시간 배양하였다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이 3종류의 서로 다른 균총을 얻을 수 있었다. I형 균총은 비교적 크고 노란색을 띠었고, Ⅱ형 균총은 I형에 비해 크기가 다소 작고 분홍색을 띠었으며, Ⅲ형 균총은 매우 작고 흰색을 띠었다. I은 모르가넬라 모르가니 ANU101, Ⅱ는 프로비덴시아 레트게리 ANU101, Ⅲ은 바실러스 할로두란스 ANU101 이었다.

전체 소화관에서의 세균밀도는 개체 당 5.0 x 10⁶ cfu였다. 전장(FG)과 중장(MG)에서의 세균밀도는 9.4 x 10⁴cfu로 전체 소화관 세균 중 1.9%를 차지하였으며, 후장(HG)에서의 세균밀도는 3.3 x 10⁶ cfu로 전체 소화관 세균 중 98.1%를 차지하였다. 도 3은 소화관의 각 영역에서의 총 세균밀도를 나타낸 것이다.

도 4는 소화관의 각 영역에서의 3가지 균주의 상대 밀도를 나타낸 것으로, I형 균주와 Ⅱ형 균주가 우점종을 이루며 소화관에 분포하지만 I형 균주가 후장에 더 많이 분포하는 것(X² = 147,587; df = 2; P < 0.0001)을 알 수 있다.

4. 분리된 미생물의 동정

상기 분리된 미생물을 Biolog 미생물동정장치를 이용하여 생화학적 특성에 근거하여 동정하였다.

NA 배지에서 자란 3종류의 균총을 대상으로 Bensen (1990)의 방법으로 그람테스트를 실시하였다. 이후 멸균된 면봉을 사용하여 단일 균총을 얻고 접종액에 넣어 수용액 상태로 준비했다. 접종액의 농도 측정은 탁도계(Biolog, Hayward, CA, USA)를 사용하였다. 탁도를 측정한 결과, 그람음성균인 Ⅰ, Ⅱ 균은 탁도의 범위가 50-60, 그람양성균인 Ⅲ 균은 탁도의 범위가 20-30 사이였다.

그 다음 그람양성균은 그람양성 마이크로플레이트에, 그람음성균은 그람음성 마이크로플레이트에 각각 접종하였다. 이후 30^oC에서 20시간 배양시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 얻어진 흡광도 자료를 Biolog 데이타베이스를 이용하여 종 동정하는데 사용하였다.

Biolog 동정 결과, 3종류 균주가 확인되었으며, 하기 표 1에 나타내었다. I형 균주는 모르가넬라 모르가니 ANU101, Ⅱ형 균주는 프로비덴시아 레트게리 ANU101, 그리고 Ⅲ형 균주는 바실러스 할로두란스 ANU101로 각각 동정되었다. 각 균주에 대한 특성은 표 1에 나타낸 바와 같다.

¹ 'Mn'은 모르가넬라 모르가니를, 'Bh'는 프로비덴시아 레트게리 'Pr'은 바실러스 할로두란스를 나타낸다.

² 'NA'는 Not assessed"를 나타낸다.

<실험예 1>

항생제 내성 확인

상기 실시예 1의 3가지 균주 모르가넬라 모르가니 ANU101, 프로비덴시아 레트게리 ANU101 및 바실러스 할로두란스 ANU101에 대한 항생제 내성 분석을 실시하였다. 항생제 내성 분석은 Ji and Kim (2004)의 방법을 변형한 방법으로 장내세균증식 억제유무에 따라 결정하였다.

우선 4종류의 항생제인 암피실린, 가나마이신, 테트라사이클린 및 스트렙토마이신 설페이트{모두 Sigma-Aldrich Korea (Seoul)에서 구입}를 멸균수로 희석하여 각각 1, 10, 10², 10³, 10⁵, 10⁷ppm의 농도로 조제하였다. 이 항생제를 직경 6㎜의 멸균한 원형 여과지에 20 ㎕씩 분주하였다. 처리된 여과지를 상기 3가지 균주가 각각 도말된 NA 배지에 올린 후 48 시간 동안 28℃에서 배양한 후 여과지 주변으로 세균 성장 억제 유무를 관찰하였다. 이때 항생제의 억제 능력을 판별하기 위한 대조군으로는 대장균을 사용하였고, 대조군인 대장균의 성장은 37^oC에서 동일한 방법으로 조사하였다.

상기 3가지 균주 모두 분석에 사용된 4가지 항생제에 대해서 내성을 나타내었으며, 그 결과를 표 2와 도 5에 나타내었다.

표 2와 도 5의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 대조구로서 사용된 대장균은 테트라사이클린을 제외한 나머지 항생제들에서 최소 농도인 1 ppm을 견디지 못한 반면, 본 발명의 균주들은 모두 최소한 10⁵ ppm 또는 심지어 10⁷ ppm 이상의 최소억제 농도를 나타냈다. 본 발명의 균주들 중 모르가넬라 모르가니 ANU101와 프로비덴시아 레트게리 ANU101가 바실러스 할로두란스 ANU101에 비해 더 높은 항생제 내성을 나타내었다.

<실험예 2>

항균 활성 확인

상기 실시예 1의 3가지 균주 모르가넬라 모르가니 ANU101, 프로비덴시아 레트게리 ANU101, 및 바실러스 할로두란스 ANU101의 동식물 병원미생물에 대한 항균 활성을 Ji et al. (2004)의 방법을 변형하여 분석하였다.

우선 상기 3가지 균주를 직경 6㎜의 멸균한 원형 여과지에 20㎕씩 분주하고 28^oC에서 48시간 동안 NA 배지 상에서 배양하였다. 여과지에 자란 세균을 클로로포름(chloroform)으로 1 시간 동안 훈증시켜 살균하였다.

억제 대상 세균으로는 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa), 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum), 세라티아 마르세센스(Serratia marscens), 및 대장균의 4종을 사용하였으며, 이들 세균현탁액 0.2㎖를 각각 45^oC의 0.7% 물한천 4㎖와 혼합하였다.

억제 대상 곰팡이로는 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici)와 콜레토트리춤 캡사이시(Colletotrichum capsici)의 2종을 사용하였으며, 이들 곰팡이의 포자 용액 0.2 ㎖를 0.7% 물한천 4 ㎖와 혼합하였다.

이후 세균 한천액과 곰팡이 한천액을 훈증처리된 상기 균주 여과지 위에 올리고 28^oC (대조구인 대장균은 37^oC)에서 48시간 동안 배양한 후 여과지 주변으로 세균 또는 곰팡이 균사 성장이 억제되는지 유무를 관찰하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 균주들 중 항균 활성을 갖는 것은 모르가넬라 모르가니 ANU101와 프로비덴시아 레트게리 ANU101였다.

프로비덴시아 레트게리 ANU101는 그람양성균인 패니바실러스 폴리믹사(Pp)에 대해서만 항균활성을 나타낸 반면, 모르가넬라 모르가니 ANU101는 그람양성균인 패니바실러스 폴리믹사(Pp), 그람음성균인 대장균(Ec), 및 파이토프토라 캡사이시(Pc)에 대해서 항균활성을 나타내었다.

<실험예 3>

주요 영양소 분해 효소 활성 확인

상기 실시예 1의 3가지 균주 모르가넬라 모르가니 ANU101, 프로비덴시아 레트게리 ANU101, 및 바실러스 할로두란스 ANU101의 영양소 분해 능력을 Jeon et al. (2011)의 방법에 의해 확인하였다.

(1) 아밀라아제 ( Amylase , 다당류 분해효소) 활성의 확인

아밀라아제 검정배지는 0.3% 비트추출물(beet extract) (BD Difco, Sparks, Maryland, USA), 2% 가용성 전분(soluble starch) (Katayama Chemical, Osaka, Japan), 0.5% 펩톤(peptone), 0.5% NaCl, 1.5% 한천(agar) (Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea)으로 구성하였다.

상기 3종류의 균주를 상기 아밀라아제 검정배지에 접종하고 28^oC에서 24시간 동안 배양한 다음, 2% 루골(Lugol) 용액을 뿌린 후 곧바로 균총 주변의 투명대를 형성하는지 여부로 아밀라아제 활성 유무를 확인하였다.

(2) 셀룰라아제( Cellulase , 섬유소 분해효소) 활성의 확인

셀룰라아제 검정배지는 1% 소디움 카복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose), 1% 트립톤(tryptone) (MBcell, Seoul, Korea), 0.5% 효모추출물(yeast extract) (MBcell), 1% NaCl, 1.5% 한천으로 구성하였다.

상기 3종류의 균주를 상기 셀룰라아제 검정배지에 접종하고 28^oC에서 24시간 동안 배양한 다음, 0.1% 콩고레드(Congo red)로 염색시킨 다음 1 M NaCl로 세척하고 균총 주변의 감귤색 무리(halo)를 나타내는지 여부로 셀룰라아제 활성 유무를 확인하였다.

(3) 리파아제( Lipase , 지질 분해효소) 활성의 확인

리파아제 검정배지는 1% Tween 80 (Daejung-Hwakeum, Siheung, Korea), 1% 펩톤, 0.5% NaCl, 0.01% CaCl₂(Junsei Chemical, Tokyo, Japan), 1% 한천으로 구성하였다.

상기 3종류의 균주를 상기 리파아제 검정배지에 접종하고 28^oC에서 24시간 동안 배양한 다음, 불용성 침전물이 생기는지 여부로 리파아제 활성 유무를 확인하였다.

(4) 프로테아제( Protease , 단백질 분해효소) 활성의 확인

프로테아제 검정배지는 0.5% 카제인(casein), 0.25% 효모추출물, 0.1% 글루코즈(glucose), 1% 탈지유(skim milk) (BD Difco), 1.5% 한천으로 구성하였다.

상기 3종류의 균주를 상기 프로테아제 검정배지에 접종하고 28^oC에서 24시간 동안 배양한 다음, 투명대를 나타내는지 여부로 프로테아제 활성 유무를 확인하였다.

상기 영양소 분해 활성을 확인한 결과를 나타낸 표 4와 도 6에 나타내었다.

상기 표 4와 도 6(화살표는 양성을 나타냄)에서 알 수 있듯이, 모르가넬라 모르가니 ANU101은 아밀라아제 및 셀룰라아제 활성을 나타내어 다당류와 섬유소를 분해할 수 있고, 프로비덴시아 레트게리 ANU101은 아밀라아제 및 프로테아제 활성을 나타내어 다당류와 단백질을 분해할 수 있다. 바실러스 할로두란스 ANU101은 다른 2가지 균주와 달리 아밀라아제 활성은 없었고 리파아제 활성만 나타내어 지질을 분해할 수 있다.

농업생명공학연구원

KACC91845P

20130719

농업생명공학연구원

KACC91846P

20130719

농업생명공학연구원

KACC91847P

20130719

Claims

암피실린, 가나마이신, 테트라사이클린 및 스트렙토마이신에 대한 항생제 내성; 및 리파아제 활성을 나타내는 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) ANU101 (수탁번호 KACC91847P).
바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) ANU101 (수탁번호 KACC91847P)을 유효성분으로 포함하는 음식물 분해용 미생물 제제.
바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) ANU101 (수탁번호 KACC91847P)을 포함하는 사료첨가제 조성물.