KR101498012B1 - HpGAS1 gene deleted yeasts and methods of producing recombinant proteins using them - Google Patents

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KR101498012B1 KR1020130045467A KR20130045467A KR101498012B1 KR 101498012 B1 KR101498012 B1 KR 101498012B1 KR 1020130045467 A KR1020130045467 A KR 1020130045467A KR 20130045467 A KR20130045467 A KR 20130045467A KR 101498012 B1 KR101498012 B1 KR 101498012B1
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Abstract

본 발명은 신규 유전자를 파손시켜 단백질 분비능을 향상시킨 변이 균주를 외래 재조합 단백질 생산에 이용하기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 한세눌라 폴리모르파 유전체 염기서열을 탐색하여 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈 활성을 가지는 Gas1 단백질을 암호화하는 HpGAS 유전자 후보군을 확보하였으며, 그 중 신규한 유전자(HpGAS1)를 확인하고 해당 유전자를 결실시켜 그 기능을 검증한 결과 세포 형태 변화, 세포벽 합성 저해제 감수성 증대, 및 총 단백질 분비량이 증대되며, 재조합 단백질 분비량이 현격히 증대됨을 확인하였으므로, 외래 재조합 단백질의 분비생산, 정제 및 수확을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a method for using a mutant strain in which a novel gene is broken to improve protein secretion ability in the production of a foreign recombinant protein. More specifically, A candidate gene for the HpGAS gene encoding the Gas1 protein having the glucanosyltransglycosylase activity was obtained. Among them, a novel gene ( HpGAS1 ) was identified and the gene was deleted and its function was verified. As a result, It is possible to increase the sensitivity of the synthetic inhibitor, increase the total protein secretion amount, and significantly increase the amount of recombinant protein secreted. Therefore, it can be usefully used as a resource for the secretory production, purification and harvesting of the recombinant protein.

Description

ＨｐＧＡＳ1 유전자 파쇄 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법{HpGAS1 gene deleted yeasts and methods of producing recombinant proteins using them}HpGAS1 gene disruption yeast strain and production method of recombinant protein using the same HpGAS1 gene deletion yeast and methods of producing recombinant proteins using them

본 발명은 신규 유전자를 파손시켜 단백질 분비능을 향상시킨 변이 균주 및 상기 변이 균주를 이용한 외래 재조합 단백질 생산 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a mutant strain in which a novel gene is broken to improve protein secretion ability and a method for producing a foreign recombinant protein using the mutant strain.

단백질 의약품 개발은 1970년대에 유전자 재조합 기술이 보편화됨에 따라 시작되었다. 특히, 생산량이 한정된 호르몬, 항체, 백신 및 생체기능성 단백질과 같은 유용 단백질을 미생물 숙주세포에서 대량 생산하여 의약품으로 개발하는 재조합 단백질 의약품 생산기술은 미생물을 세포공장(Cell factory)으로 활용하는 대표적인 미생물 이용기술로 부상하고 있으며, 인류의 보건 복지가 향상됨에 따라 난치성 질환의 치료를 위한 고순도의 단백질성 의약품에 대한 수요가 기하급수적으로 증가되고 있어, 저렴한 비용으로 대량생산이 가능한 미생물 발현시스템을 이용한 재조합 의약품 생산기술 개발은 미래 의약산업의 성장에 크게 기여할 것으로 예측되고 있다. 초기 단백질 의약품은 인체 조직 또는 혈액에서 분리하는 경우가 있었으나, HIV와 간염바이러스를 비롯한 바이러스 감염 문제, 잠재적인 암 유발 인자의 잔류 가능성 등과 같은 심각한 문제들 때문에 현재 이들은 재조합 의약품으로 바뀌고 있으며, 고비용 기술인 동물세포에서 생산하는 경우에도 여전히 바이러스와 광우병의 원인이 되는 프라이온 등의 오염 가능성 문제가 남기 때문에 안전하다고 여겨지는 GRAS(generally recognized as safe) 미생물을 이용한 경제성 높은 재조합 단백질의 대량생산 기술개발의 중요성이 부각되고 있다. 미생물 활용 재조합 의약용 단백질 개발 분야의 경우 생산기술의 근간이 되는 신규 고발현 시스템 개발, 유전체 정보 기반의 고기능 숙주세포 재설계, 고성능 생산 균주의 대량 배양에 관한 분자생물공정 기술 개발 등이 국제시장 개방과 함께 국가 경쟁력 강화를 위한 중요한 분야로 대두되고 있다.
Protein drug development began in the 1970s as genetic recombination technology became popular. Particularly, recombinant protein pharmaceutical production technology which mass-produced useful protein such as hormone, antibody, vaccine and bio functional protein with limited production amount in microbial host cells and develops it as medicine is a typical microorganism utilizing microorganism as a cell factory As the health and welfare of mankind has been improved, the demand for high-purity protein drugs for the treatment of intractable diseases has increased exponentially, and recombinant drugs using a microbial expression system capable of mass production at low cost Production technology development is expected to contribute greatly to the growth of the future pharmaceutical industry. Early protein medicines have been isolated from human tissues or blood, but due to serious problems such as HIV infection and virus infections including hepatitis viruses, and the potential for residual potential for cancer, they are now being converted into recombinant drugs, It is still important to develop mass-production technology for recombinant proteins with high economic efficiency using GRAS (generally recognized as safe) microorganisms, which are believed to be safe, because the possibility of contaminating the plasmin, which is still causing viruses and mad cow disease, Has been highlighted. In the field of recombinant medicinal protein development, development of new high-expression system that is the basis of production technology, high-performance host cell re-design based on genome information, and development of molecular bioprocess technology for mass culture of high-performance production strains And is becoming an important field for strengthening national competitiveness.

재조합 단백질 생산 기술은 비교적 최근에 발달한 유전자 재조합 기술을 통하여 고등생물 유래의 유전자를 다양한 미생물로부터 대량 발현 생산하여 자연적으로 생산량이 한정된 고부가가치 의료용 단백질을 비교적 저렴한 비용으로 생산하는 기술로서 앞으로 난치성 질환의 증가와 국민 의료 수준의 제고에 따라 고 순도의 단백질성 의약품의 수요가 급증할 것으로 예상되고 있다. 따라서 인체에 무해한 다양한 미생물을 이용하여 신 기능성 재조합 단백질을 비교적 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있는 기술개발 연구가 필요한 실정이다. 효모를 숙주세포로 이용한 재조합 단백질생산 연구는 주로 전통효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하였으나 효율적인 외래단백질 발현을 위한 강력한 프로모터의 부재 또는 장시간 발효시에 야기되는 플라스미드의 불안정성 등의 이유로 재조합 단백질의 생산효율이 떨어지며, 고농도 배양시 fed-batch 발효(fermentation)가 필요하고, 발현된 이종 단백질들이 하이퍼글라이코실레이션(hyperglycosylation) 된다는 점에서 비적절한 숙주로 간주되고 있다(Romanos, et al., Yeast, 8, 423, 1992). 이와 같은 단점을 보완하는 외래단백질 발현 시스템이 메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 개발되었으며(Sudbery et al., Yeast, 10, 1707, 1994 ; Cregg et al., Bio/Technol. 5, 479, 1987), 최근에는 또다른 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 이용한 이종 단백질 발현 시스템의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다(Oh et al., Biotechnol. J. 3, 1, 2008; Gellissen et al., Bio/Technol. 9, 291, 1991; Janowicz et al., Yeast 7, 431, 1991). 새로운 대체숙주효모 중의 하나인 메탄올 자화 효모 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 값싼 원료물질인 메탄올을 탄소원으로 이용하여 비교적 쉽게 고농도 배양이 가능하며, 메탄올 대사에 관련된 몇 가지 유전자 유래의 강력한 프로모터가 존재한다. 또한, 외래 유전자를 숙주세포의 염색체 DNA에 다중도입(multicopy integration)할 수 있어 고농도 배양 중에도 안정하게 유지되는 장점이 있다.
Recombinant protein production technology is a technology to produce high-value-added medical proteins with limited production capacity naturally produced at a relatively low cost by mass-expressing genes derived from higher organisms from various microorganisms through relatively recently developed recombinant technology. The demand for high-purity protein drugs is expected to increase sharply. Therefore, there is a need to develop a technology for mass production of a novel functional recombinant protein at a relatively low cost by using various microorganisms harmless to human body. The study on the production of recombinant proteins using yeast as a host cell mainly used the yeast Saccharomyces cerevisiae , but the lack of a strong promoter for efficient expression of foreign proteins or the instability of plasmids caused by prolonged fermentation The production efficiency of recombinant proteins is lowered because of the reason that fed-batch fermentation is required in high concentration culture and hyperglycosylation of expressed heterologous proteins is regarded as an inappropriate host (Romanos, et al., Yeast, 8, 423, 1992). An exogenous protein expression system that complements these disadvantages has been developed in the methanol magnetizing yeast Pichia pastoris (Sudbery et al., Yeast, 10, 1707, 1994; Cregg et al., Bio / Technol. , 479, 1987). Recently, a heterologous protein expression system using Hansenula polymorpha , another methanol magnetization yeast, has been actively studied (Oh et al., Biotechnol. Gellissen et al., Bio / Technol 9, 291, 1991; Janowicz et al., Yeast 7, 431, 1991). Hansenula polymorpha , one of the novel alternative yeast strains, is a relatively high-concentration culture using methanol, which is an inexpensive raw material, as a carbon source, and a strong promoter derived from several genes related to methanol metabolism exist. In addition, since the foreign gene can be multicopy integrated into the chromosomal DNA of the host cell, it can be stably maintained even during high concentration culture.

이에, 본 발명자들은 외래 재조합 단백질의 생산에 유리한 기존의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 균주의 단백질 분비 생산을 더욱 증가시키기 위하여 세포벽 구성 및 투과성 결정에 중요한 신규한 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈(beta-1,3-glucanosyltransglycosylase) 활성을 가지는 HpGAS1 유전자를 확보하였으며, 상기 유전자 결손시 외래 재조합 단백질 분비능이 증가함을 확인하였으므로, 이를 통해 본 발명의 HpGAS1 유전자가 단일 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이 균주가 의약용 재조합 단백질의 분비 생산을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.Therefore, the inventors of the present invention found that, in order to further increase the secretory production of the Hansenula polymorpha strain, which is advantageous for the production of foreign recombinant protein, a novel beta-1,3-glucan HpGAS1 gene having the activity of beta-1,3-glucanosyltransglycosylase was obtained and it was confirmed that the secretory protein of the foreign recombinant protein was increased in the case of the gene deletion, so that the HpGAS1 gene of the present invention was single- The inventors of the present invention have completed the present invention by disclosing that the Hansenulla polymorpha mutant strain can be usefully used as a resource for the secretory production of a medicament recombinant protein.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자가 결손된 단백질 분비능이 향상된 기탁번호 KCTC12220BP의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주를 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a Hansenula polymorpha mutant strain of Accession No. KCTC12220BP having improved HpGAS1 gene-deficient protein secretion ability described in SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a method for producing a yeast strain having improved protein secretion ability.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 외래 재조합 단백질 생산 방법을 제공하는 것이다.
In addition, another object of the present invention is to provide a method for producing a foreign recombinant protein.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자가 결손된 단백질 분비능이 향상된 기탁번호 KCTC12220BP의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a Hansenula polymorpha mutant strain of Accession No. KCTC12220BP having improved HpGAS1 gene-deficient protein-releasing ability as described in SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a yeast strain having improved protein secretion ability.

아울러, 본 발명은 외래 재조합 단백질 생산 방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a method for producing a foreign recombinant protein.

본 발명의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈(beta-1,3-glucanosyltransglycosylase)를 코딩하는 신규한 유전자 HpGAS1을 단일 결손시킨 한세눌라 폴리모르파 균주는 세포의 형태가 변화했으며, 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성이 증대되었고, 총 단백질 분비량이 증대됨을 확인하였으며, 특히, 재조합 단백질의 분비량 및 활성이 현격히 향상됨을 확인하였으므로, 외래 재조합 단백질의 분비생산, 정제 및 수확에 유리하여 재조합 단백질의 생산을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있다.
The novel gene HpGAS1 coding for beta-1,3-glucanosyltransglycosylase of Hansenula polymorpha of the present invention is a single-deleted Hansenula poly Morpha strains showed changes in cell morphology, increased susceptibility to cell wall synthesis inhibitors, increased total protein secretion, and, in particular, increased secretory protein secretion and activity, confirming the secretion of foreign recombinant proteins Can be advantageously used as a resource for the production of recombinant protein, advantageous for production, purification and harvesting.

도 1은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자의 서열을 NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성을 검색한 결과이다.
도 2는 서열번호 2로 기재되는 HpGAS2 유전자의 서열을 NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성을 검색한 결과이다.
도 3은 ScGas1 도메인을 통해 HpGas1 도메인을 비교 분석한 도이다:
*: Potential N-glycosylation 위치;
△: GPI 부착 위치(GPI attachment sites);
▲: Strictly conserved residues in the catalytic domain;
1-22: Signal sequence;
23-332: β-(1,3)-glucan transferase domain (GluTD);
370-462: 8 Cys-region;
485-525: Ser-rich region; 및
537-559: 소수성 부위(Hydrophobic region).
도 4는 HpURA3 유전자 파쇄 카세트의 제작 과정을 나타내는 도이다.
도 5는 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트의 제작 과정을 나타내는 도이다.
도 6은 HpGAS2 유전자 파쇄 카세트의 제작 과정을 나타내는 도이다.
도 7은 HpGAS1, HpGAS2 및 ScGAS1 유전자를 클로닝한 한세눌라 폴리모르파용 벡터와 사카로마이세스 세레비지애용 벡터이다:
1: 한세눌라 폴리모르파용 벡터(pDLGUK):
2: 사카로마이세스 세레비지애용 벡터(YEp352ScGAPDHpt).
도 8은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이주의 세포 형태적 특징을 보여주는 사진이다:
A: 2% 포도당 최소 배지에서 48 시간 동안 배양한 후 2000 배율의 공초점현미경으로 확인한 사진;
B: 2% 포도당 복합 배지에서 48 시간 동안 배양한 후 2000 배율의 공초점현미경으로 확인한 사진;
C: 2% 포도당 복합 배지에서 48 시간 동안 배양한 후 1000 배율의 광학현미경으로 확인한 사진;
1: 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주(H. polymorpha DL1);
2: HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1); 및
3: HpGAS2 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2).
도 9는 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주, 및 유전자 회복 균주의 생리적 특징을 확인한 사진이다:
A: 2% 포도당 복합 배지(37℃);
B: 2% 포도당 복합 배지(42℃);
C: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) - 2% 포도당 복합 배지;
D: Congo Red (CR) - 2% 포도당 복합 배지;
E: Calcofluor White (CFW) - 2% 포도당 복합 배지;
1: 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주(H. polymorpha DL1);
2: HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1);
3: HpGAS2 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2);
4: HpGAS1 발현벡터(pDLGUK-HpGAS1)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS1);
5: HpGAS2 발현벡터(pDLGUK-HpGAS2)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS2);
6: ScGAS1 발현벡터(pDLGUK-ScGAS1)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-ScGAS1); 및
7: 대조군인 공벡터(pDLGUK)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK).
도 10은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주에서의 총 단백질 분비량을 비교한 그래프이다:
A: 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주(H. polymorpha DL1);
B: HpGAS1을 결손시킨 DL1 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1); 및
C: HpGAS2를 결손시킨 DL1 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2).
도 11은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주에서 Glucose oxidase (GOD) 분비량을 비교한 사진이다:
M: 단백질 크기 표지
1: 야생형 GOD 생산균주[H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)];
2: HpGAS1을 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS1/pDLMOX-GOD(H)]; 및
3: HpGAS2를 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS2/pDLMOX-GOD(H)].
도 12는 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이주에서 분비된 Glucose oxidase (GOD) 활성을 비교한 그래프이다:
1: 야생형 GOD 생산균주 [H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)];
2: HpGAS1을 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS1/pDLMOX-GOD(H)]; 및
3: HpGAS2를 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS2/pDLMOX-GOD(H)].
도 13은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주에서 Human serum albumin (HSA) 분비량을 비교한 사진이다:
M: 단백질 크기 표지
1: 야생형 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8);
2: HpGAS1을 결손시킨 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS1); 및
3: HpGAS2를 결손시킨 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS2).
도 14는 HpGAS1 유전자 파쇄된 균주의 HpURA3을 결손시키는 과정을 나타내는 도이다.
도 15는 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)에서 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자 발현벡터를 형질전환한 균주의 생리적 특징을 확인한 사진이다:
A: 2% 포도당 복합배지;
B: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) - 2% 갈락토오즈 및 1% 라피노오즈 복합 배지;
C: Congo Red (CR) - 2% 갈락토오즈 및 1% 라피노오즈 최소 배지;
1: 사카로마이세스 세레비지애 야생형균주(S. cerevisiae BY4741);
2: ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1);
3: HpGAS1 발현 벡터 (YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1) 로 형질전환된 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1);
4: HpGAS2 발현벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2)로 형질전환된 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2); 및
5: 대조군인 공벡터(YEp352ScGAPDHpt)로 형질전환된 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt). 1 shows the result of searching for the homology of the HpGAS1 gene of SEQ ID NO: 1 using BLAST of NCBI.
2 shows the result of searching for the homology of the HpGAS2 gene of SEQ ID NO: 2 using BLAST of NCBI.
3 is a comparative analysis of the HpGas1 domain through the ScGas1 domain:
*: Potential N-glycosylation position;
△: GPI attachment sites;
▲: Strictly conserved residues in the catalytic domain;
1-22: Signal sequence;
23-332:? - (1,3) -glucan transferase domain (GluTD);
370-462: 8 Cys-region;
485-525: Ser-rich region; And
537-559: Hydrophobic region.
4 is a diagram showing a process for producing a HpURA3 gene disruption cassette.
FIG. 5 is a diagram showing a process for producing a HpGAS1 gene disruption cassette.
6 is a diagram showing a process for producing a HpGAS2 gene disruption cassette.
Fig. 7 is a vector for Hansenula polypharmacology and Saccharomyces cerevisiae cloning HpGAS1, HpGAS2 and ScGASl genes.
1: Hansenulla polyphage vector (pDLGUK):
2: Saccharomyces cerevisiae vector (YEp352ScGAPDHpt).
Figure 8 is a photograph showing cell morphology of HpGASl and HpGAS2 single deletion mutants:
A: photographs obtained by confocal microscopy at 2,000 magnification after culturing in 2% glucose minimal medium for 48 hours;
B: photographs obtained by incubation in a 2% glucose complex medium for 48 hours, followed by confocal microscopy at a magnification of 2000;
C: photographs obtained by culturing in a 2% glucose complex medium for 48 hours and then observing with a 1000 magnification optical microscope;
1: Hansenula polymorpha wild-type strain ( H. polymorpha DL1);
2: Hansenula polymorpha strains deficient in HpGAS1 gene ( H. polymorpha DL1? HpGAS1 ); And
3: H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2 with HpGAS2 gene deficient.
FIG. 9 is a photograph showing the physiological characteristics of HpGAS 1 and HpGAS 2 single deletion mutant strains and gene-recovering strains:
A: 2% glucose complex medium (37 DEG C);
B: 2% glucose complex medium (42 캜);
C: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) - 2% glucose complex medium;
D: Congo Red (CR) - 2% glucose complex medium;
E: Calcofluor White (CFW) - 2% glucose complex medium;
1: Hansenulla polymorpha DL1 wild type strain ( H. polymorpha DL1);
2: Hansenula polymorpha strains deficient in HpGAS1 gene ( H. polymorpha DL1? HpGAS1 );
3: is a gene defect HpGAS2 century Cronulla poly Maurepas strain (H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2);
4: Hansenula polymorpha strain ( H. polymorpha DL1 ? HpGAS1? URA3 / pDLGUK-HpGAS1) lacking the HpGAS1 gene transformed with the HpGAS1 expression vector (pDLGUK-HpGAS1);
5: Hansenula polymorpha strain ( H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3 / pDLGUK-HpGAS2) lacking the HpGAS1 gene transformed with the HpGAS2 expression vector (pDLGUK-HpGAS2);
6: Hansenula polymorpha strain ( H. polymorpha DL1 ? HpGAS1? URA3 / pDLGUK-ScGAS1) lacking the HpGAS1 gene transformed with the ScGAS1 expression vector (pDLGUK-ScGAS1); And
7: H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3 / pDLGUK, in which the HpGAS1 gene transformed with the control vector pDLGUK was deleted.
10 is a graph comparing the total amount of protein secretion in HpGAS 1 and HpGAS 2 single deletion mutants:
A: Hansenulla polymorpha DL1 wild type strain ( H. polymorpha DL1);
B: DL1 strain deficient in HpGAS1 ( H. polymorpha DL1? HpGAS1 ); And
C: DL1 strain deficient in HpGAS2 ( H. polymorpha DL1? HpGAS2 ).
FIG. 11 is a photograph comparing the secretion amount of glucose oxidase (GOD) in the HpGAS 1 and HpGAS 2 single deletion mutants.
M: Protein size marker
1: wild type GOD producing strain [ H. polymorpha / pDLMOX-GOD (H)];
2: GOD producing strain deficient in HpGAS1 [ H. polymorpha? HpGAS1 / pDLMOX-GOD (H)]; And
3: GOD-producing strain in which a defect HpGAS2 [H. polymorpha ΔHpGAS2 / pDLMOX- GOD (H)].
FIG. 12 is a graph comparing the activity of secreted glucose oxidase (GOD) in HpGAS 1 and HpGAS 2 single deletion mutants;
1: wild type GOD producing strain [ H. polymorpha / pDLMOX-GOD (H)];
2: GOD producing strain deficient in HpGAS1 [ H. polymorpha? HpGAS1 / pDLMOX-GOD (H)]; And
3: GOD-producing strain in which a defect HpGAS2 [H. polymorpha ΔHpGAS2 / pDLMOX- GOD (H)].
FIG. 13 is a photograph comparing human serum albumin (HSA) secretion levels in HpGAS 1 and HpGAS 2 single deletion mutants;
M: Protein size marker
1: wild type HSA producing strain ( H. polymorpha G3T8);
2: HSA-producing strain in which a defect HpGAS1 (H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS1); And
3: HSA-producing strain in which a defect HpGAS2 (H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS2).
14 is a diagram showing a process of cleaving HpURA3 of the HpGAS1 gene-disrupted strain.
15 is a photograph showing the physiological characteristics of strains transformed with HpGAS 1 and HpGAS 2 gene expression vectors in Saccharomyces cerevisiae strain ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 ) deficient in ScGAS1 gene:
A: 2% glucose complex medium;
B: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) - 2% galactose and 1% raffinose complex medium;
C: Congo Red (CR) - 2% galactose and 1% raffinose minimal medium;
1: Saccharomyces cerevisiae wild-type strain ( S. cerevisiae BY4741);
2: Saccharomyces cerevisiae strain deficient in ScGAS1 gene ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 );
3: Saccharomyces cerevisiae strain ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 / YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1) lacking the ScGAS1 gene transformed with the HpGAS1 expression vector (YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1);
4: Saccharomyces cerevisiae strain ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 / YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2) lacking the ScGAS1 gene transformed with the HpGAS2 expression vector (YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2); And
5: Saccharomyces cerevisiae strain ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 / YEp352ScGAPDHpt) lacking the ScGAS1 gene transformed with the control vector (YEp352ScGAPDHpt) .

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자가 결손된 단백질 분비능이 향상된 기탁번호 KCTC12220BP의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주를 제공한다.
The present invention provides a mutant strain of Hansenula polymorpha of Accession No. KCTC12220BP having improved HpGAS1 gene-deficient protein-releasing ability as described in SEQ ID NO: 1.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파 DL1 유전체 정보 데이터베이스에서 다른 효모의 Gas1 단백질과 아미노산 서열이 유사한 단백질을 번역하는 HpGAS 유전자 후보들을 확보하였다. 그 결과 2 종의 한세눌라 폴리모파 유전자들(HpGAS1, HpGAS2)이 타 효모의 Gas1 단백질과 아미노산 서열 상동성이 높은 단백질을 번역하는 것으로 분석되었다 (도 1과 2 참조). 그 중 사카로마이세스 세레비지애의 ScGas1 단백질의 아미노산 서열과 더 높은 상동성을 갖는 단백질을 번역하는 신규한 서열의 HpGAS1 유전자 번역하는 단백질의 아미노산 서열에 여러 Gas1 단백질에 보존적인 아미노산 서열 및 활성 도메인이 존재함을 확인하였다(도 3 참조). HpGAS1 및 HpGAS2 유전자가 파쇄된 균주를 선별하기 위하여 우선, URA3 파쇄 카세트로 한세눌라 폴리모르파의 URA3 유전자를 파쇄한 뒤, HpGAS1 및 HpGAS2 유전자 파쇄 카세트를 이용한 상동재조합을 통해 한세눌라 폴리모르파 균주의 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자를 각각 파쇄하였다. HpGAS1 및 HpGAS2 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 돌연변이 균주들의 특성을 비교 분석한 결과 HpGAS1 파쇄 균주만이 GAS1 유전자 파쇄 균주의 특성을 보였다. HpGAS1 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 균주에서 총 단백질 분비량이 증가함을 확인하였으며(도 10 참조), 외래 재조합 단백질인glucose oxidase (GOD) (Kim et al., Glycobiology. 14, 243, 2004)및 human serum albumin (HSA) (Kang et al., Biotechnol Bioeng. 76, 175, 2001)를 분비생산하는 균주의 HpGAS1 유전자를 파쇄한 결과 해당 재조합 단백질의 분비량이 현격하게 증가함을 확인할 수 있었다(도 11, 도 12 및 도 13 참조). 아울러, 상기 HpGAS1 유전자 발현 벡터를 형질전환하여 HpGAS1 결손 돌연변이를 회복시킨 경우, 유전자 파쇄시 관찰된 감수성 배지에서의 생장 저하가 복원되는 것을 알 수 있었다(도 9 및 도 15 참조). 따라서, HpGAS1 유전자를 파쇄한 한세눌라 폴리모르파 균주의 단백질 분비능의 향상은 HpGAS1 유전자의 단일 결실에 의한 것임을 재차 확인할 수 있었다.
In a specific embodiment of the present invention, we have obtained HpGAS gene candidates that translate amino acid sequence similar proteins to other yeast Gas1 proteins in the Hansenul polyMorpha DL1 genomic information database. As a result, two Hansenuli polymorphic genes ( HpGAS1 , HpGAS2 ) were analyzed to translate proteins having high amino acid sequence homology with Gas1 protein of other yeast (see FIGS. 1 and 2). Among them, the HpGAS1 gene of a novel sequence that translates a protein having higher homology with the amino acid sequence of the ScGas1 protein of Saccharomyces cerevisiae. The amino acid sequence of the protein to be translated includes the conserved amino acid sequence and the active domain (See FIG. 3). First, in order to screen the HpGAS1 and HpGAS2 strain the gene is disrupted, URA3 crushing cassette in the century Cronulla poly know century Cronulla poly know through homologous recombination using the after crushing the URA3 gene of the wave, HpGAS1 and HpGAS2 gene disrupted cassette wave strain HpGAS1 and HpGAS2 genes, respectively. The HpGAS1 and HpGAS2 gene is disrupted only century Cronulla poly know analysis comparing the characteristics of mutant strain wave HpGAS1 disrupted strain showed the characteristics of a GAS1 gene disrupted strain. (GOD) (Kim et al., Glycobiology. 14, 243, 2004), which is a foreign recombinant protein, was found to increase the total protein secretion level in the Hansenula poly- morpha strain in which the HpGAS1 gene was disrupted and it was confirmed that the human serum albumin (HSA) (Kang et al., Biotechnol Bioeng. 76, 175, 2001) the result is increased remarkably secretion of the recombinant protein secreted disrupted HpGAS1 gene of strains producing (Fig. 11, 12 and 13). In addition, when the HpGAS1 gene expression vector was transformed and the HpGAS1 deletion mutant was restored, it was found that the growth degradation in the susceptible medium observed upon gene disruption was restored (see FIGS. 9 and 15). Therefore, it was confirmed again that the enhancement of the protein secretion ability of the HspGAS1 gene disrupted Hansenula polymorpha strain was due to the single deletion of the HpGAS1 gene.

본 발명은 The present invention

1) URA3 유전자 파쇄 카세트를 상동재조합을 통해 효모 균주에 도입하는 단계; 및1) introducing the URA3 gene disruption cassette into the yeast strain through homologous recombination; And

2) 상기 균주에 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트를 상동재조합을 통해 도입하는 단계를 포함하는 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법을 제공한다.2) introducing the HpGAS1 gene disruption cassette into the strain through homologous recombination, thereby producing a yeast strain having improved protein secretion ability.

상기 URA3 유전자 파쇄 카세트는 HpURA3 유전자의 N 말단 절편, HpURA3 유전자의 C 말단 절편 및 Zeocin 저항성 유전자 (ZeoR) 카세트를 이용하여 제작한 파쇄카세트인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The URA3 gene disrupted cassette is the N-terminal fragment of the gene HpURA3, C-terminal fragments and Zeocin resistance gene of HpURA3 gene (Zeo R) One preferred that the broken cassette manufactured using the cassette is not limited to this.

상기 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 HpGAS1 유전자의 N 말단 절편, HpGAS1 유전자의 C 말단 절편 및 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편 를 이용하여 제작한 파쇄 카세트인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
The HpGAS1 gene disrupted cassette of HpGAS1 gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 N-terminal fragment, C-terminal fragment and the lacZ gene HpGAS1-HpURA3-lacZ cassette in-lacZ cassette in the N- terminal fragment, lacZ-HpURA3 But is not limited to, a crushing cassette produced using a C-terminal fragment.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 유전자 파쇄를 구별할 수 있도록 URA3 유전자를 파쇄하기 위하여, HpURA3 유전자의 N 말단 절편, HpURA3 유전자의 C 말단 절편 및 Zeocin 저항성 유전자 (ZeoR) 카세트를 이용하여 URA3 파쇄 카세트를 제작하여 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환한 후 상동재조합 방법으로 염색체상의 해당 유전자를 파쇄하였다(도 4 참조). URA3 유전자가 파쇄된 균주에 HpGAS1 유전자의 N 말단 절편, HpGAS1 유전자의 C 말단 절편 및 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편을 이용하여 제작한 파쇄카세트를 형질전환하여 HpGAS1 유전자가 파쇄된 균주를 제작하였으며(도 5 참조), HpGAS1 유전자가 파쇄된 균주의 단백질 분비능이 향상됨을 확인하였다. 이를 통해, 기존의 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주 및 특정 재조합 단백질을 분비하는 야생형의 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주의 HpGAS1 유전자를 파쇄함으로써 단백질 분비가 월등히 증가한 한세눌라 폴리모르파 균주를 제작할 수 있었다.
In a particular embodiment of the present invention, the inventors have found that by using a, N-terminal fragment of HpURA3 genes, C-terminal fragment and the Zeocin resistance gene (Zeo R) of HpURA3 gene cassette in order to disrupt the URA3 gene to identify the gene disrupted The URA3 disruption cassette was prepared and transformed into Hansenulla polyMorpha strain, and the corresponding gene on the chromosome was disrupted by homologous recombination method (see FIG. 4). N-terminal fragment of the gene HpGAS1 URA3 gene disrupted strain, C-terminal fragment and the lacZ gene HpGAS1 - HpURA3 - N- terminal fragment of lacZ cassette, lacZ - HpURA3 - C- terminal fragments broken produced by the use of the lacZ cassette The cassette was transformed to produce a strain in which the HpGAS1 gene was disrupted (see FIG. 5), and the protein secretion ability of the strain in which the HpGAS1 gene was disrupted was improved. Thus, Hansen 's polyomorpha strains were obtained, in which the HpGAS1 gene of the wild - type recombinant Hansenella polymorpha isolate, which secretes the wild type Hansenula polymorpha strain and the specific recombinant protein, was greatly increased.

본 발명은The present invention

1) HpGAS1 유전자가 파쇄된 상기 변이 균주에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜 재조합 효모 균주를 제조하는 단계; 및1) preparing a recombinant yeast strain by introducing a vector comprising a gene encoding a target protein into the mutant strain in which the HpGAS1 gene is disrupted; And

2) 상기 재조합 효모 균주를 배양하는 단계를 포함하는 외래 재조합 단백질 생산 방법을 제공한다.2) culturing the recombinant yeast strain.

상기 재조합 효모 균주는 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 또는 캔디다(Candida)속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 한세눌라 폴리모르파 균주인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. The recombinant yeast strain is preferably any one selected from a saccharide in my process (Saccharomyces), inclusive Vero My process (Kluyveromyces), Pichia (Pichia), Hanse Cronulla (Hansenula) or Candida group consisting of genus (Candida), and , Hansenulla polyomorpha strain is more preferable, but is not limited thereto.

상기 외래 재조합 생산 방법은 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 상기 변이주를 대량 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
Preferably, the foreign recombinant production method further comprises a step of culturing the mutant strain using a bioreactor, but not limited thereto.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 glucose oxidase(GOD) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입되어 외래 재조합 단백질을 생산하는 GOD 생산균주 및 HSA 생산균주의 HpGAS1 또는 HpGAS2 유전자를 파쇄시킨 뒤 배양한 결과, 특히 HpGAS1 유전자 파쇄의 경우 상기 외래 재조합 단백질의 분비능이 월등히 증가하였으며, 생산된 단백질의 활성 또한 증가함을 확인하였다(도 11, 도 12 및 도 13). 따라서, 본 발명의 HpGAS1 유전자를 단일 파쇄시킨 한세눌라 폴리모르파 균주를 외래 재조합 단백질의 생산을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있다.
In a specific embodiment of the present invention, the inventors of the present invention have found that a GOD producing strain in which a vector containing a gene encoding glucose oxidase (GOD) or human serum albumin (HSA) is introduced to produce a foreign recombinant protein and HpGAS1 As a result of disrupting the HpGAS2 gene, it was confirmed that secretion of the foreign recombinant protein was markedly increased in the case of HpGAS1 gene disruption, and the activity of the produced protein was also increased (FIGS. 11, 12 and 13). Therefore, the Hansenula polyhomoras strain having the single- stranded HpGAS1 gene of the present invention can be usefully used as a resource for the production of foreign recombinant proteins.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
It should be noted, however, that the following examples and experimental examples are illustrative of the present invention only, and the content of the present invention is not limited by the examples and the experimental examples.

<실시예 1> &Lt; Example 1 > HpGAS1HpGAS1 및  And HpGAS2HpGAS2 유전자 발굴 및 분석 Gene discovery and analysis

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 유전체 정보 해독 및 검색을 통하여 HpGAS1 유전자를 발굴하였다.The present inventors have uncovered the HpGAS1 gene through decoding and searching of genomic information of Hansenula polymorpha .

구체적으로, 미국 국립생물정보센터(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 다른 효모의 Gas1 단백질의 아미노산 서열정보(PpGas1, ZbGas1, ScGas1 단백질)를 확보한 뒤, 본 발명자들이 구축한 한세눌라 폴리모르파 DL1 유전체 정보 데이터베이스에서 tblastn 프로그램을 통해 Gas1 단백질과 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 번역하는 5가지의 HpGAS 유전자 후보를 확보하였다. 그 중 상동성이 높은 두 유전자를 다른 효모 Gas1 단백질과 아미노산 서열의 상동성을 비교 및 선별하여 HpGAS1 유전자(서열번호 1) 및 HpGAS2 유전자(서열번호 2)라고 명명하였다(표 1). 그 후, 상기 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자의 염기 서열을 BLAST로 확인한 결과, 신규한 유전자임을 알 수 있었다(도 1 및 2). 또한, 상기 HpGAS1 유전자의 아미노산 서열을 웹에서 이용 가능한 소프트웨어(ClustalW-XXL , http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW-XXL.html)을 이용하여 이미 도메인 구조가 알려진 ScGas1의 아미노산 서열과 상동성을 분석하여 HpGas1 단백질에도 보존적인 아미노산 서열 및 활성 도메인이 존재함을 확인하였다(도 3).
Specifically, the amino acid sequence information (PpGas1, ZbGas1, ScGas1 protein) of the Gas1 protein of another yeast was obtained from the National Bioinformatics Center (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) The inventors constructed five HpGAS gene candidates that translate proteins having amino acid sequence similar to Gas1 protein through the tblastn program in the Hanseul Nulla polymorpha DL1 genome information database. The two homologous genes were named HpGAS1 gene (SEQ ID NO: 1) and HpGAS2 gene (SEQ ID NO: 2) (Table 1) by comparing and selecting the homology between amino acid sequence and other yeast Gas1 protein. Thereafter, the nucleotide sequences of the HpGAS1 and HpGAS2 genes were confirmed by BLAST, and it was found that these genes were novel genes (FIGS. 1 and 2). Further, the amino acid sequence of the HpGAS1 gene was amplified using the software (ClustalW-XXL, http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW-XXL.html ) available on the web, and the amino acid sequence of ScGas1 Sequence and homology were analyzed to confirm that conservative amino acid sequences and active domains were present in the HpGas1 protein (FIG. 3).

Figure 112013036088946-pat00001
Figure 112013036088946-pat00001

<< 실시예Example 2>  2> HpGAS1HpGAS1 및  And HpGAS2HpGAS2 단일 유전자 파쇄 균주 제작 Production of single gene disruption strain

<2-1> <2-1> URA3URA3 파쇄 균주 제작 Fabrication of disrupted strains

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파 균주의 URA3 유전자를 파쇄하여 영양요구주로 만들기 위하여 URA3 파쇄 카세트로 URA3 유전자 절편 사이에 Zeocin 저항성 유전자(ZeoR) 를 클로닝하였다.The present inventors cloned the Zeocin resistance gene (Zeo R ) between the URA3 gene fragments with the URA3 disruption cassette to disrupt the URA3 gene of the Hansenulla polyMorpha strain and to make it an essential nutrient source .

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 HpURA3_N_Forward(서열번호 3) 및 HpURA3_N_Reverse_ZRF (서열번호 4)를 이용하여 HpURA3의 N-말단 절편(499 bp)을 얻었으며, HpURA3_C_Forward_ZRR (서열번호 5) 및 HpURA3_C_Reverse(서열번호 6)를 이용하여 HpURA3의 C-말단 절편(441 bp)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. 또한, pPICZalphaA 벡터를 주형으로 하여 Zeo resistance_Forward (서열번호 7) 및 Zeo resistance_Reverse (서열번호 8)를 이용하여 Zeocin 저항성 유전자 (ZeoR) 카세트(1192 bp)를 중합효소 연쇄 반응을 통해 얻었다. Fusion PCR 방법을 통해 상기 제작한 HpURA3의 N-말단 절편, Zeocin 저항성 유전자 (ZeoR) 카세트 및 HpURA3의 C-말단 절편을 이용하여 URA3 파쇄 카세트를 제작하였다. URA3 파쇄 카세트를 야생형 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1), Glucose oxidase (GOD) 생산 재조합 균주[H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)] 및 Human serum albumin (HSA)생산 재조합 균주(H. polymorpha G3T8)에 각각 상동재조합을 통해 도입하여 Zeocin 배지에서 생존가능한 URA3 유전자가 파쇄된 돌연변이 균주를 얻었다(도 4).
Specifically, a century Cronulla poly Maurepas to a chromosome DNA isolated from the strain as a template primer DL1 HpURA3 _N_Forward (SEQ ID NO: 3) and HpURA3 _N_Reverse_ZRF scored (SEQ ID NO: 4), N- terminal fragment (499 bp) of HpURA3 using , And the C-terminal fragment (441 bp) of HpURA3 was obtained by polymerase chain reaction (PCR) using HpURA3_C_Forward_ZRR (SEQ ID NO: 5) and HpURA3_C_Reverse (SEQ ID NO: 6). In addition, the pPICZalphaA vector as a template resistance_Forward Zeo (SEQ ID NO: 7) and resistance_Reverse Zeo (SEQ ID NO: 8), Zeocin resistance gene (Zeo R) cassette (1192 bp) was obtained via polymerase chain reaction using a. A URA3 disruption cassette was constructed using the N-terminal fragment, Zeocin resistance gene (Zeo R ) cassette and HpURA3 C-terminal fragment of HpURA3 prepared above by Fusion PCR method. A wild-type URA3 cassette disrupted century Cronulla poly Maurepas strain (H. polymorpha DL1), Glucose oxidase (GOD) produces recombinant strain [H. polymorpha / pDLMOX-GOD ( H)] and Human serum albumin (HSA) produced recombinant strain (H . polymorpha G3T8) respectively introduced through homologous recombination to obtain a viable URA 3 gene is a mutant strain disrupted in a medium to Zeocin (Fig. 4).

<2-2> <2-2> HpGAS1HpGAS1 파쇄 균주 제작 Fabrication of disrupted strains

본 발명자들은 HpGAS1 유전자가 결손된 파쇄 균주를 제작하기 위하여 GAS1 파쇄 카세트를 제작하여 URA3 유전자가 파쇄된 실시예 <2-1>의 돌연변이 균주에 도입하였다.The present inventors prepared a GAS1 disruption cassette for introducing a mutant strain of Example < 2-1 > in which the URA3 gene was disrupted in order to prepare a crushing strain lacking the HpGAS1 gene.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하여 HpGAS1_N_Forward (서열번호 9) 및 HpGAS1_N_Reverse_LUF(서열번호 10)를 이용하여 HpGAS1의 N-말단 절편(537 bp)을 얻었으며, HpGAS1_C_Forward_LUR(서열번호 11) 및 HpGAS1_C_Reverse (서열번호 12)를 이용하여 HpGAS1의 C-말단절편(524 bp)을 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 얻었다. pLacUR3를 주형 (Kim et al., J Biol Chem. 281, 6261, 2006)으로 프라이머 쌍 HplacZ_URA3_N_Forward (서열번호 24)와 HplacZ_URA3_N_Reverse (서열번호 25)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을, HplacZ_URA3_C_Forward (서열번호 26)와 HplacZ_URA3_C_Reverse (서열번호 27)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편을 중합효소 연쇄반응을 통해 얻었다. HpGAS1의 N-말단절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을 fusion PCR을 통해 GAS1 파쇄 카세트_N-말단 절편을 얻고, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편, HpGAS1의 C-말단절편을 fusion PCR을 통해 GAS1 파쇄 카세트_C-말단 절편을 얻었다(도 5). 제작한 GAS1 파쇄 카세트_N-말단 절편과 GAS1 파쇄 카세트_C-말단 절편을 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 URA3 유전자가 파쇄된 균주 각각에 상동재조합을 통해 도입하여 SC-URA 최소 배지에서 생존할 수 있는 HpGAS1 유전자가 파쇄된 돌연변이주를 얻었다.
Was scored Specifically, a century Cronulla poly Maurepas to a chromosome DNA isolated from the strain as a template DL1 HpGAS1 _N_Forward (SEQ ID NO: 9) and HpGAS1 _N_Reverse_LUF (SEQ ID NO: 10), N- terminal fragment (537 bp) of HpGAS1 using , HpGAS1 _C_Forward_LUR (SEQ ID NO: 11) and HpGAS1 _C_Reverse (SEQ ID NO: 12) to obtain the C- terminal fragment of HpGAS1 (524 bp) by the polymerase chain reaction (PCR) using a. terminal fragment of the lacZ-HpURA3-lacZ cassette using the primer pair HplacZ_URA3_N_Forward (SEQ ID NO: 24) and HplacZ_URA3_N_Reverse (SEQ ID NO: 25) as template (Kim et al. , HplacZ_URA3_C_Forward (SEQ ID NO: 26) and HplacZ_URA3_C_Reverse (SEQ ID NO: 27) were obtained by polymerase chain reaction of the C-terminal fragment of lacZ-HpURA3-lacZ cassette. N- terminal fragment of HpGAS1, lacZ-HpURA3-lacZ cassette in the N- terminal fragment to obtain a GAS1 crushing cassette _N- terminal fragment through the PCR fusion, C- terminal fragment of lacZ-HpURA3 lacZ-cassette, the HpGAS1 C- Terminal fragment was subjected to fusion PCR to obtain a GAS1 disrupted cassette_C-terminal fragment (FIG. 5). The GAS1 disrupted cassette_N-terminal fragment and the GAS1 disrupted cassette_C-terminal fragment were introduced into each of the disrupted URA3 gene prepared in Example <2-1> through homologous recombination to prepare SC-URA minimal medium The mutant strains of the HpGAS1 gene, which can survive, were obtained.

<2-3> <2-3> HpGAS2HpGAS2 파쇄 균주 제작 Fabrication of disrupted strains

본 발명자들은 HpGAS2 유전자가 결손된 파쇄 균주를 제작하기 위하여 GAS2 파쇄 카세트를 제작하여 실시예 <2-1>의 URA3 유전자가 파쇄된 돌연변이주에 도입하였다.The present inventors prepared a GAS2 disruption cassette in order to prepare a crushing strain lacking the HpGAS2 gene, and introduced the URA3 gene of Example <2-1> into the disrupted mutant strain.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하여 HpGAS2_N_Forward (서열번호 13) 및 HpGAS2_N_Reverse_LUF(서열번호 14)를 이용하여 HpGAS2의 N-말단 절편(537 bp)을 얻었으며, HpGAS2_C_Forward_LUR (서열번호 15) 및 HpGAS2_C_Reverse (서열번호 16)를 이용하여 HpGAS2의 C-말단절편(524 bp)을 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 얻었다. pLacUR3를 주형으로 프라이머 쌍 HplacZ_URA3_N_Forward (서열번호 24)와 HplacZ_URA3_N_Reverse (서열번호 25)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을, HplacZ_URA3_C_Forward (서열번호 26)와 HplacZ_URA3_C_Reverse (서열번호 27)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편을 중합효소 연쇄반응을 통해 얻었다. HpGAS2의 N-말단절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을 fusion PCR을 통해 GAS2 파쇄 카세트_N-말단 절편을 얻고, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편, HpGAS2의 C-말단절편을 fusion PCR을 통해 GAS2 파쇄 카세트_C-말단 절편을 얻었다(도 6). 제작한 GAS2 파쇄 카세트_N-말단 절편과 GAS2 파쇄 카세트_C-말단 절편을 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 URA3 유전자가 파쇄된 균주 각각에 상동재조합을 통해 도입하여 SC-URA 최소 배지에서 생존할 수 있는 HpGAS2 유전자가 파쇄된 돌연변이주를 얻었다.
Was scored Specifically, a century Cronulla poly Maurepas to a chromosome DNA isolated from the strain as a template DL1 HpGAS2 _N_Forward (SEQ ID NO: 13) and HpGAS2 _N_Reverse_LUF (SEQ ID NO: 14), N- terminal fragment (537 bp) of HpGAS2 using , HpGAS2 _C_Forward_LUR Terminal fragment (524 bp) of HpGAS2 was obtained by polymerase chain reaction (PCR) using HpGAS2 (SEQ ID NO: 15) and HpGAS2_C_Reverse (SEQ ID NO: 16). The N-terminal fragment of lacZ-HpURA3-lacZ cassette was amplified using HplacZ_URA3_C_Forward (SEQ ID NO: 26) and HplacZ_URA3_C_Reverse (SEQ ID NO: 27) using primer pair HplacZ_URA3_N_Forward (SEQ ID NO: 24) and HplacZ_URA3_N_Reverse And the C-terminal fragment of lacZ-HpURA3-lacZ cassette was obtained by polymerase chain reaction. N- terminal fragment of HpGAS2, lacZ-HpURA3-lacZ cassette in the N- terminal fragment to obtain a crushed GAS2 cassette _N- terminal fragment through the PCR fusion, C- terminal fragment of lacZ-HpURA3 lacZ-cassette, the HpGAS2 C- Terminal fragment was subjected to fusion PCR to obtain a GAS2 disrupted cassette_C-terminal fragment (FIG. 6). The prepared GAS2 disrupted cassette_N-terminal fragment and the GAS2 disrupted cassette_C-terminal fragment were introduced into each of the disrupted URA3 gene prepared in Example <2-1> through homologous recombination to obtain SC-URA minimal medium The mutant strain, in which the HpGAS2 gene, which can survive in the wild, was disrupted.

<실험예 1> 유전자 파쇄 변이주의 특성 확인&Lt; Experimental Example 1 > Characterization of gene mutation strain

<1-1> <1-1> HpGAS1HpGAS1 또는  or HpGAS2HpGAS2 파쇄 균주의 형태학적 특징 확인 Identification of Morphological Characteristics of Fragmented Strain

본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 제작한 HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주의 형태적 특징을 확인하기 위하여 공초점 현미경과 광학 현미경으로 한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1 균주와 비교하였다. In order to confirm the morphological characteristics of the HpGAS1 gene disruption strain and the HpGAS2 gene disruption strain produced in Example 2, the present inventors compared the wild type DL1 strain with the Hansenulla polypharmacia using a confocal microscope and an optical microscope.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1 균주, HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주들을 각각 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후 초기 OD600 값이 0.3이 되도록 50 ml 포도당 2% 복합 배지와 포도당 2% 최소 배지에 접종한 후 같은 조건으로 본 배양하였다. 48시간 뒤 정체기의 세포 배양액을 OD600 값이 10이 되도록 취한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 제거하고 세포를 얻었다. 상기 세포를 1xPBS로 두 번 세척한 후 칼코플로어 화이트(Calcofluor White, CFW) 용액(1 mg/ml) 100 ㎕로 15분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 1xPBS로 두 번 세척하고 1xPBS 100 ㎕로 세포를 푼 뒤 슬라이드에 10 ㎕을 올려 Excitation 405 nm, Emission 420-480 nm에서 2000 배율의 공초점 현미경 및 1000 배율의 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다(도 8). 그 결과, HpGAS1 유전자 파쇄 균주는 세포의 형태가 원형이 되었고 야생형보다 그 크기가 두 배정도 커진 것이 관찰되었으며, 세포들이 다소 덜 분리되고 서로 뭉쳐있는 것을 확인할 수 있었다. 반면, HpGAS2 유전자 파쇄 균주는 야생형과 비슷한 모양을 보였다.
Specifically, Hansenulla polymorpha wild type DL1 strain, HpGAS1 gene disruption strain and HpGAS2 Gene-disruptant strains were preincubated in 3 ml of glucose 2% complex medium at 200 rpm at 37 ° C for 16 hours, and then seeded in a 50 ml glucose 2% complex medium and glucose 2% minimal medium to an initial OD 600 of 0.3 And then cultured under the same conditions. After 48 hours, the cell culture medium of the stagnant phase was taken to have an OD 600 value of 10, centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the supernatant was removed to obtain cells. The cells were washed twice with 1 × PBS and reacted with 100 μl of Calcofluor White (CFW) solution (1 mg / ml) at room temperature for 15 minutes. After the reaction, the cells were washed twice with 1 × PBS, and the cells were extracted with 100 μl of 1 × PBS. Then, 10 μl of the supernatant was loaded onto the slides and observed with a confocal microscope at a magnification of 2000 to 4,000 nm at an excitation wavelength of 405 nm and an optical microscope at a magnification of 1000 8). As a result, it was observed that the HpGAS1 gene fragment was round in shape and twice as large as the wild type, and the cells were somewhat less separated and clustered together. On the other hand, the strain of HpGAS2 gene was similar to the wild type.

<1-2> <1-2> HpGAS1HpGAS1 또는 or HpGAS2 HpGAS2 파쇄 균주의 생리적 특성 확인 Identification of the physiological characteristics of the crushed strain

본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 제작한 HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주의 생리적 특징을 세포벽 저해 물질에 대한 감수성을 통해 확인하였다. The inventors of the present invention confirmed the physiological characteristics of the HpGAS1 gene disruption strain and the HpGAS2 gene disruption strain prepared in Example 2 through sensitivity to cell wall inhibitors.

구체적으로, HpGAS1 유전자 파쇄 또는 HpGAS2 유전자 파쇄에 의해 변화된 세포벽의 구조에 따른 세포벽 합성저해제 및 삼투교란제에 대한 감수성을 확인하기 위하여, 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주, HpGAS1 파쇄 균주 및 HpGAS2 파쇄 균주들을 각각 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양하였다. 상기 배양한 균주들을 멸균수 1 ml에 처음 OD600 값을 1로 시작하여 연속적으로 1/10씩 희석하여 포도당 2% 복합 한천배지, 세포벽 합성 저해제인 3% 칼코플로어 화이트(Calcofluor White, CFW), 1% 콩고레드(Congo Red, CR) 및 삼투교란제인 0.01% 도데실 황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)이 각각 포함된 포도당 2% 복합 한천 배지에 1 ㎕씩 집적하여 37℃에서 이틀 또는 삼일 동안 배양하였고, 아울러, 열 스트레스에 대한 감수성을 확인하기 위해 포도당 2% 복합 한천배지에 집적하여 42℃에서 이틀 동안 배양하였다. Specifically, to confirm the susceptibility to cell wall synthesis inhibitors and osmotic perturbants depending on the cell wall structure changed by HpGAS1 gene disruption or HpGAS2 gene disruption, Hansen's polyomorpha DL1 wild type strain, HpGAS1 disruption strain and HpGAS2 disruption strain The cells were preincubated in a 3 ml glucose 2% complex medium at 37 ° C for 16 hours at 200 rpm. The cultivated strains were diluted 1 ml in sterilized water starting from the initial OD 600 value of 1 at 1/10 of the initial volume, and then diluted with glucose 2% complex agar medium, cell wall synthesis inhibitor 3% Calcofluor White (CFW) 1 μl of each strain was integrated into a 2% glucose agar medium containing 1% Congo Red (CR) and 0.01% sodium dodecyl sulfate (SDS), an osmotic disturbance agent, and cultured at 37 ° C for two or three days In addition, to confirm the susceptibility to heat stress, the cells were integrated in a glucose 2% complex agar medium and cultured at 42 ° C for two days.

그 결과, 세포벽의 구조 변화로 인해 HpGAS1 유전자 파쇄 균주는 대조군에 비해 37℃와 42℃ 포도당 2% 복합 한천배지에서 생장이 저해되었으며, 세포벽 합성 저해제 감수성 배지 및 삼투교란제 감수성 배지에서도 야생형 또는 HpGAS2 파쇄 균주에 비해 생장이 저해되고 성장속도가 느려짐을 확인할 수 있었다(도 9의 1, 2 및 3).
As a result, the HpGAS1 gene disruption strain was inhibited in 37% and 42% glucose 2% complex agar medium compared with the control group due to the structural change of the cell wall, and the wild type or HpGAS2 fragment was also observed in the cell wall synthesis inhibitor sensitive medium and osmotic disturbance sensitive medium The growth was inhibited and the growth rate was slower than that of the strain (1, 2 and 3 in Fig. 9).

<실험예 2> 유전자 파쇄 변이주의 총 단백질 분비능 확인<Experimental Example 2> Confirmation of total protein secretion ability of gene-disrupted mutants

본 발명자들은 HpGAS1 유전자 파쇄 및 HpGAS2 유전자 파쇄에 따른 세포벽의 구조 변화에 의해 총 단백질 분비량이 증가하는지 확인하기 위하여 브래드포드 분석(Bradford assay) 방법으로 확인하였다.The present inventors confirmed by the Bradford assay method that the total protein secretion amount was increased by the structural change of the cell wall due to the HpGAS1 gene disruption and the HpGAS2 gene disruption.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주, HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후 50 ml 포도당 2% 복합 배지에 초기 OD600 값이 0.3이 되도록 접종하여 같은 조건으로 본 배양하였다. 배양 시간대 별로 배양액을 취하여 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 확보하여 분비된 단백질 양을 브래드포드(protein assay dye reagent concentrate -BIORAD) 분석 방법으로 측정하였으며, bovine serum albumin (BSA)을 사용하여 스탠다드 커브를 그리고 측정된 단백질 양을 OD600값으로 노말라이제이션 하였다. 그 결과, 야생형에 비하여 HpGAS1 유전자 파쇄 균주에서 시간 의존적으로 총 단백질 분비량이 늘어남을 확인하였고, 지수기의 후기를 넘어 정체기가 지날수록 총 분비된 단백질의 양이 확연히 차이가 나는 것을 확인하였다(도 10). HpGAS2 유전자 파쇄 균주는 야생형과 비슷한 단백질 분비량이 확인되었다.
Specifically, Hansenulla polymorpha DL1 wild type strain, HpGAS1 gene disruption strain and HpGAS2 gene disruption strain were preincubated in a 3 ml glucose 2% complex medium at 200 rpm for 16 hours at 37 ° C, and then mixed with 50 ml glucose 2% complex medium To an initial OD 600 value of 0.3, and the cells were cultured under the same conditions. After incubation at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, the supernatant was collected and the amount of protein secreted was measured by protein assay dye reagent concentrate (BIOAD) assay. Bovine serum albumin (BSA ), And the amount of protein measured was normalized to an OD 600 value. As a result, it was confirmed that the total protein secretion amount was increased in a time-dependent manner in the HpGAS1 gene disruption strain as compared to the wild type, and it was confirmed that the total secreted protein amount was significantly different as the stasis passed beyond the late period of the exponent period ). HpGAS2 gene fragment was found to have a similar amount of wild type.

<실험예 3> 유전자 파쇄 변이주의 외래 재조합 단백질 분비능 확인<Experimental Example 3> Confirmation of the ability of foreign gene recombinant protein to secrete mutant gene

<3-1> GOD 생산균주의 Glucose oxidase 분비능 확인<3-1> Confirmation of Glucose oxidase secretion ability of GOD producing strains

본 발명자들은 HpGAS1 유전자 파쇄 및 HpGAS2 유전자 파쇄에 의해 GOD 생산균주의 Glucose oxidase의 분비량이 증가하는지 확인하였다.The present inventors confirmed that the secretion amount of glucose oxidase in the GOD producing strain was increased by the HpGAS1 gene disruption and the HpGAS2 gene disruption.

구체적으로, 야생형 GOD 생산균주 [H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)], HpGAS1 유전자 파쇄 균주[H. polymorpha ΔHpGAS1/pDLMOX-GOD(H)] 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주[H. polymorpha ΔHpGAS2/pDLMOX-GOD(H)]를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후, MOX 프로모터를 이용해 발현되는 해당 외래 재조합 단백질의 발현유도를 위해 메탄올 2% 복합 배지 50 ml에 초기 OD600 값이 0.3이 되도록 접종한 후 같은 조건으로 본 배양하였다. 그 후, OD600 값 2에 해당하는 배양액을 취한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 상등액을 확보하였다. 상기 상등액을 5x샘플 로딩 버퍼와 혼합하여 5분 동안 끓인 후 샘플을 절반씩 나눠서(즉, OD600 값 1에 해당하는 상등액) 8% SDS-PAGE 젤 두 조에 전기영동하였다. 젤 두 조 중 하나는 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution(BIO-RAD)으로 염색하고 destaining 버퍼로 탈색하였다. 다른 젤은 PVDF 막으로 단백질을 옮긴 후 해당 PVDF 막을 5% 스킴 밀크 용액으로 차단하였으며, 1차 항체인 His-probe(Santa Cruz Biotechnology)를 1:1000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl 및 0.05% Tween 20) 용액으로 10분씩 3번 씻은 뒤 2차 항체인 Anti-Mouse IgG(Sigma)를 1:3000으로 희석하여 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후, TBST 용액으로 10분씩 3번 씻어준 뒤 ECL advanceTM Western Blotting Detection Kit(AmershamTM-GE Healthcare)으로 검출하였다. Specifically, wild type GOD producing strains ( H. polymorpha / pDLMOX-GOD (H)), the HpGAS1 gene fragment [ H. polymorpha HpGAS1 / pDLMOX-GOD (H)] and the HpGAS2 gene fragment [ H. polymorpha HpGAS2 / ml glucose 2% complex medium at 200 rpm at 37 ° C for 16 hours. To induce the expression of the foreign recombinant protein expressed using the MOX promoter, 50 ml of a 2% methanol methanol solution was added to an initial OD 600 value of 0.3 And then cultured under the same conditions. Thereafter, the culture solution corresponding to the OD 600 value 2 was taken and centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to obtain a supernatant. The supernatant was mixed with 5x sample loading buffer, boiled for 5 minutes and then electrophoresed in two sets of 8% SDS-PAGE gels by dividing the sample in half (ie, supernatant corresponding to OD 600 value 1). One of the gels was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution (BIO-RAD) and decolorized with destaining buffer. The other gels were transferred to a PVDF membrane and the PVDF membrane was blocked with a 5% skim milk solution. The primary antibody, His-probe (Santa Cruz Biotechnology) was diluted 1: 1000 and reacted for 2 hours. After the reaction, the cells were washed 3 times with TBST (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl and 0.05% Tween 20) for 10 minutes each. Then, the secondary antibody, Anti-Mouse IgG And reacted for 1 hour and 30 minutes. After washing with TBST solution three times for 10 minutes, the cells were detected with ECL advance TM Western Blotting Detection Kit (Amersham TM -GE Healthcare).

그 결과, 염색한 젤에서는 전체적으로 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 단백질 밴드가 진하게 나와서 총 단백질이 많이 분비된 것을 확인할 수 있었으며, 웨스턴 블랏의 결과를 통해 100 KDa 부근에 Glucose oxidase가 발현된 것을 확인할 수 있었고 야생형과 HpGAS2 파쇄 균주보다 특히 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 많은 양의 GOD가 검출 되었다(도 11).As a result, in the dyed gel, the protein band was evidently concentrated in the sample of the HpGAS1 disrupted strain, and the total protein was secreted. As a result, the result of Western blotting revealed that glucose oxidase was expressed near 100 KDa, And a large amount of GOD was detected in a sample of the HpGAS1 disruption strain, especially in the case of the HpGAS2 disruption strain (Fig. 11).

또한, 배양 상등액으로 분비된 Glucose oxidase의 활성을 GLUCOSE OXIDASE 분석 키트(MEGAZYME)로 측정한 결과, 야생형에 비해 HpGAS1 파쇄 균주의 배양 상등액에서 1.9배 증가함을 확인하였다(도 12). 따라서 야생형 균주에 비하여 HpGAS1 파쇄 균주에서 GOD 분비량이 늘어날 뿐만 아니라 활성형태로 분비가 잘 됨을 확인하였다. HpGAS2 파쇄 균주는 야생형과 비슷한 활성측정 값을 보였다.
In addition, the activity of the glucosoxidase secreted in the culture supernatant was measured by the GLUCOSE OXIDASE assay kit (MEGAZYME), which was 1.9 times higher in the culture supernatant of the HpGAS1 disruption strain than in the wild type (Fig. 12). Therefore, it was confirmed that GDO secretion was increased in HpGAS1 disruption strain as well as secreted into active form compared with wild type strain. The HpGAS2 disruption strain showed similar activity measurements as wild type.

<3-2> G3T8 균주의 사람 혈청 알부민(Human serum albumin) 분비능 확인<3-2> Confirmation of human serum albumin secretion ability of G3T8 strain

본 발명자들은 HpGAS1 유전자 파쇄 및 HpGAS2 유전자 파쇄에 의해 재조합 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin, HSA) 생산균주의 HSA 분비량이 증가하는지 확인하였다.The present inventors have confirmed that HSA secretion amount of recombinant human serum albumin (HSA) producing strains is increased by disruption of HpGAS1 gene and disruption of HpGAS2 gene.

구체적으로, 야생형 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8), HpGAS1 유전자 파쇄 균주(H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS1) 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주(H. polymorpha G3T8 Δ HpGAS2)를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후 50 ml 메탄올 2% 복합 배지에 초기 OD600 값이 0.3이 되도록 접종한 후 같은 조건으로 본 배양한 후, 이때 HSA 발현을 유도하기 위하여 메탄올 2% 복합 배지를 사용하여 배양하였다. 그 후, OD600 값이 0.1이 되도록 배양액을 취한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 상등액을 확보하였다. 상기 상등액을 5x샘플 로딩 버퍼와 혼합하여 5분 동안 끓인 후 샘플을 절반씩 나눠서(즉, OD600 값 0.05에 해당하는 상등액) 10% SDS-PAGE 젤 두 조에 전기영동하였다. 젤 두 조 중 하나는 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution(BIO-RAD)으로 염색하고 destaining 버퍼로 탈색하였다. 다른 젤 하나는 단백질을 PVDF 막으로 옮긴 후 해당 PVDF 막을 5% 스킴 밀크 용액으로 차단하였으며, 1차 항체인 Anti-Human Albumin antibody(Sigma)를 1:10000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl 및 0.05% Tween 20) 용액으로 10분씩 3번 씻은 뒤 2차 항체인 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)를 1:5000으로 희석하여 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후, TBST 용액으로 10분씩 3번 씻어준 뒤 ECL Western Blotting Detection Kit(AmershamTM-GE Healthcare)으로 검출하였다. Specifically, the wild-type HSA-producing strain (H. polymorpha G3T8), HpGAS1 gene disrupted strain (H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS1) and HpGAS2 gene disrupted strain (H. polymorpha G3T8 HpGAS2 Δ) to 200 rpm in 3 ml of 2% glucose complex media After incubation at 37 ° C for 16 hours, the cells were inoculated in 50 ml methanol 2% complex medium with an initial OD 600 value of 0.3, and then cultured under the same conditions. To induce HSA expression, 2% Lt; / RTI &gt; Then, the culture solution was taken to have an OD 600 value of 0.1, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to obtain a supernatant. The supernatant was mixed with 5x sample loading buffer, boiled for 5 minutes and then electrophoresed in two sets of 10% SDS-PAGE gels by dividing the sample in half (ie, supernatant with an OD 600 value of 0.05). One of the gels was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution (BIO-RAD) and decolorized with destaining buffer. One of the other gels was transferred to a PVDF membrane, and the PVDF membrane was blocked with a 5% skim milk solution. The primary antibody, Anti-Human Albumin antibody (Sigma) was diluted to 1: 10000 and allowed to react for 2 hours. After the reaction, the cells were washed three times with TBST (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl and 0.05% Tween 20) for 10 minutes each. Then, secondary antibody, goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology) : 5000 and reacted for 1 hour and 30 minutes. Subsequently, the cells were washed three times for 10 minutes with TBST solution and then detected with ECL Western Blotting Detection Kit (Amersham TM -GE Healthcare).

그 결과, 염색한 젤에서는 전체적으로 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 단백질 밴드가 진하게 나와 총 단백질이 많이 분비된 것을 확인할 수 있었으며, 웨스턴 블랏의 결과를 통해 66 KDa 부근에 인간 혈청 알부민이 검출된 것을 확인할 수 있었고 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 야생형과 HpGAS2 파쇄 균주보다 많은 양의 HSA가 검출 되었다(도 13).
As a result, it was confirmed that the total protein was secreted from the sample of the HpGAS1 disrupted strain as a whole in the dyed gel, and the total protein was secreted in the sample, and the result of Western blot confirmed that the human serum albumin was detected in the vicinity of 66 KDa A larger amount of HSA was detected in the sample of the HpGAS1 disruption strain than the wild-type and the HpGAS2 disruption strain (Fig. 13).

<실험예 4> 유전자 회복에 의한 기능 보완 확인&Lt; Experimental Example 4 >

<4-1> <4-1> HpGAS1HpGAS1 및  And HpGAS2HpGAS2 유전자 파쇄 균주의 Of the gene disruption strain URA3URA3 파쇄 Shredding

본 발명자들은 상기 실험예와 같은 효과가 lacZ-URA3-lacZ 카세트에 의해 HpGAS1 가 파쇄되었기 때문인지 확인하기 위하여 유전자 회복에 의한 기능 보완 실험을 하고자 하여, 상기 유전자 파쇄 균주에서 lacZ-URA3-lacZ 카세트를 제거하였다.The inventors of the present invention attempted to carry out a complementary function test by gene recovery in order to confirm whether or not HpGAS1 was disrupted by the lacZ - URA3 - lacZ cassette in the same manner as in the above Experimental Example, and the lacZ - URA3 - lacZ cassette Respectively.

구체적으로, lacZ-URA3-lacZ 제거용 카세트를 제작하기 위하여 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 HpGAS1_N_Forward (서열번호 9) 및 HpGAS1_N_Reverse (서열번호 10)를 이용하여 HpGAS1의 N-말단 절편(537 bp)을, HpGAS1_C_Forward_GNR (서열번호 23) 및 HpGAS1_C_Reverse (서열번호 12)를 이용하여 HpGAS1의 N-말단 절편과 융합할 수 있는 HpGAS1의 C-말단 절편(524 bp)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. 상기 두 절편을 fusion PCR하여 lacZ-URA3-lacZ 제거용 카세트를 얻은 후 HpGAS1이 파쇄된 균주에 상동재조합을 통해 도입하여 URA3 유전자가 없는 균주만 생장 가능한 5-FOA 배지에서 생존가능한 URA3 유전자가 파쇄된 돌연변이주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3)를 얻었다(도 14).
Specifically, lacZ - URA3 - lacZ removed century Cronulla poly Maurepas DL1 template a chromosome DNA isolated from the strain in order to produce a cassette for HpGAS1 _N_Forward (SEQ ID NO: 9) and HpGAS1 _N_Reverse (SEQ ID NO: 10) HpGAS 1 using the N- terminal fragment (537 bp), HpGAS1 _C_Forward_GNR (SEQ ID NO: 23) and HpGAS1 _C_Reverse (SEQ ID NO: 12) C- terminal fragment of HpGAS 1 to fusion with the N- terminal fragment HpGAS 1 using (524 bp) were obtained by polymerase chain reaction (PCR). The two fragments for fusion PCR by lacZ - URA3 - lacZ after obtaining the cassette for removal HpGAS1 is introduced through homologous recombination in the crushed strain in viable URA3 gene in 5-FOA medium, only the strain without the URA 3 gene as possible growth is disrupted ( H. polymorpha DL1 &lt; / RTI &gt; HpGASl &lt; RTI ID = 0.0 &gt; AURA3 ) &lt; / RTI &gt;

<4-2> <4-2> HpGAS1HpGAS1 ,, HpGAS2  HpGAS2 및  And ScGAS1ScGAS1 유전자 도입 Gene introduction

본 발명자들은 HpGAS1, HpGAS2 및 ScGAS1 유전자가 각각 클로닝된 벡터를 제작하여 상기 HpGAS1 유전자 파쇄 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3)에 각각 도입하였다. The present inventors produced a vector in which HpGAS1 , HpGAS2 and ScGAS1 genes were respectively cloned Were introduced into the HpGAS1 gene disruption strain ( H. polymorpha DL1 DELTA HpGAS1 DELTAURA3 ).

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 각각 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 증폭한 HpGAS1, HpGAS2 유전자 카세트와 사카로마이세스 세레비지애 BY4741 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 서열변호 21 및 22의 프라이머를 이용하여 증폭한 ScGAS1 유전자 카세트를, 제한효소 MssⅠ을 처리한 pDLGUK 벡터에 평활 말단으로 클로닝 하였다(도 7의 1). pDLGUK 벡터는 염색체 DNA의 텔로미어 부근으로 무작위적으로 삽입할 수 있는 HARS 및 URA3 유전자를 가진 벡터로써, 형질전환체는 URA3 유전자가 삽입되기 때문에 SC-URA 최소배지에서 자라는 형질전환체를 얻을 수 있다. 상기 HpGAS1가 삽입된 벡터(pDLGUK-HpGAS1), HpGAS2가 삽입된 벡터(pDLGUK-HpGAS2), ScGAS1가 삽입된 벡터(pDLGUK-ScGAS1) 및 pDLGUK 공벡터를 URA3 유전자 및 HpGAS1가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주(H. polymorpha DL1 Δ HpGAS1 ΔURA3)에 각각 형질전환하였다.Specifically, chromosomal DNA isolated from Hansenulla polypharmacia DL1 strain was used as a template The primers of SEQ ID NOS: 21 and 22 were used as a template and the chromosomal DNAs isolated from the HpGAS1 , HpGAS2 gene cassette and Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain amplified using the primers of SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 19 and 20, respectively The ScGAS1 gene cassette amplified by the above method was cloned into a pDLGUK vector which had been treated with a restriction enzyme M ss I and was blunt ended (Fig. 7, 1). The pDLGUK vector is a vector with the HARS and URA3 genes that can be inserted randomly into the vicinity of telomeres of chromosomal DNA. Transformants grow in SC-URA minimal medium because the URA3 gene is inserted into the transformant. The HpGAS1 the inserted vector (pDLGUK- HpGAS1), HpGAS2 the inserted vector (pDLGUK- HpGAS2), ScGAS1 the inserted vector (pDLGUK- ScGAS1) and empty vector pDLGUK the URA3 gene and the disrupted HpGAS1 century Cronulla poly Maurepas DL1 strain ( H. polymorpha DL1 ? HpGAS1 ? URA3) .

그 결과, SC-URA 최소 배지에서 생장 가능한 벡터가 삽입된 형질전환체 H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS1, H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS2, H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-ScGAS1 및 H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK를 얻을 수 있었다.
As a result, transgenic H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 Δ URA3 / pDLGUK-HpGAS1, H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 Δ URA3 / pDLGUK-HpGAS2 , H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 Δ URA3 / pDLGUK-ScGAS1 and H. polymorpha DL1 ? HpGAS1? URA3 / pDLGUK were obtained.

<4-3> 유전자 삽입 균주의 생리적 특성 확인<4-3> Identification of physiological characteristics of gene insertion

본 발명자들은 상기 실험예 <4-2>에서 도입한 유전자로 인한 생리적 특성을 고형배지상에 순차적으로 희석된 세포배양액을 집적배양하여 확인하였다.The physiological characteristics of the genes introduced in Experimental Example < 4-2 > were confirmed by collectively culturing cell cultures sequentially diluted on a solid medium.

구체적으로, 상기 실험예 <4-2>의 형질전환체의 생장을 비교하기 위하여 상기 벡터들로 각각 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 균주들을 각각 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양하였다. 상기 배양한 균주들을 멸균수 1 ml에 처음 OD600 값을 1로 시작하여 연속적으로 1/10씩 희석하여 포도당 2% 복합 한천배지와 세포벽 합성 저해제인 3% 칼코플로어 화이트(Calcofluor White, CFW), 1% 콩고레드(Congo Red, CR) 및 삼투교란제인 0.01% 도데실 황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)이 각각 포함된 포도당 2% 복합 한천배지에 1 ㎕씩 집적하여 37℃에서 이틀 또는 삼일 동안 배양하였다. 또한, 열 스트레스에 대한 감수성을 확인하기 위해 포도당 2% 복합 한천배지에 집적하여 42℃에서 이틀 동안 배양하였다. Specifically, in order to compare the growth of the transformant of Experimental Example <4-2>, Hansenula polymorpha strains transformed with the respective vectors were cultured in 3 ml glucose 2% complex medium at 200 rpm at 37 ° C Lt; / RTI &gt; for 16 hours. The cultivated strains were diluted 1 ml in 1 ml of sterilized water starting from the initial OD 600 value of 1 and continuously diluted 1/10 in a 2% complexed agar medium containing glucose and 3% Calcofluor White (CFW), a cell wall synthesis inhibitor, 1 μl was added to a 2% glucose agar medium containing 1% Congo Red (CR) and 0.01% sodium dodecyl sulfate (SDS), an osmotic disturbance agent, and cultured at 37 ° C for two or three days . In order to confirm the susceptibility to heat stress, the cells were integrated on a 2% glucose agar medium and cultured at 42 ° C for two days.

그 결과, HpGAS1 유전자를 보완한 균주는 야생형과 비슷한 생장 정도를 보였으며(도 9의 4), HpGAS2 유전자를 보완한 균주는 야생형보다는 느리지만 감수성 배지에서 생장함을 알 수 있었다(도 9의 5). 반면, 사카로마이세스 세레비지애의 GAS1 유전자인 ScGAS1 유전자를 보완한 균주는 생장 증대가 확인되지 않았으며, pDLGUK 공벡터가 도입된 균주와 같은 정도의 생장을 보였다(도 9의 6 및 7). 한편, 형질전환하지 않은 HpGAS1 파쇄균주 보다ScGAS1 발현 벡터나 pDLGUK 공벡터가 도입된 균주의 성장이 약간 증대된 것을 관찰할 수 있었는데 이는 비록 복합배지라도 야생형 한세눌라 폴리모르파 균주가 URA3 파쇄 균주보다 생장이 빠르다고 보고된 것과 같은 현상으로 판단되었다.
As a result, the strain supplemented with the HpGAS1 gene showed a similar degree of growth to the wild type (Fig. 9, 4), and the strain supplemented with the HpGAS2 gene was found to grow in the susceptible medium although it was slower than the wild type strain ). On the other hand, the strain supplemented with the ScGAS1 gene, which is the GAS1 gene of Saccharomyces cerevisiae , showed no growth increase and showed the same growth as the strain in which the pDLGUK vector was introduced (FIG. 9, 6 and 7) . On the other hand, it was observed that the growth of the strains into which the ScGAS1 expression vector or pDLGUK empty vector was introduced was slightly increased than that of the non-transformed HpGAS1 disruption strain, even though the wild type Hansenulla polypharmacite strains grow more than the URA3 disruption strains Was reported to be fast.

<실험예 5> 사카로마이세스 세레비지애(&Lt; Experimental Example 5 > Sakeromyces cerevisiae ( Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae )에서의 ) In ScGAS1ScGAS1 돌연변이 기능보완 확인 Confirm mutation function supplement

<5-1> <5-1> ScGAS1ScGAS1 유전자 파쇄 균주의 Of the gene disruption strain 생장 확인Growth Confirmation

본 발명자들은 GAS1 유전자 파쇄에 의한 세포벽 약화에 의한 생장 저해를 사카로마이세스 세레비지애에서도 확인하였다.The present inventors also confirmed the inhibition of growth by cell wall weakening by GAS1 gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.

구체적으로, 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741)와 ScGAS1 파쇄 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 30℃에서 16시간 동안 전 배양하였다. 전 배양한 균주를 멸균수 1 ml에 OD600 값 1에서 연속적으로 1/10씩 희석한 뒤, 포도당 2% 복합 한천배지와 0.005% 콩고레드(Congo Red, CR) 및 0.01% 도데실 황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)이 각각 포함된 포도당 2% 복합 한천배지에 1 ㎕씩 집적하여 30℃에서 삼일 또는 사일 동안 배양하였다.
Specifically, Saccharomyces cerevisiae BY4741 and ScGAS1 disrupted strains ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 ) were pre-cultured in a 3 ml glucose 2% complex medium at 200 rpm at 30 ° C. for 16 hours. Before a sterile cultured strain by 1/10 in a row in the OD 600 value of 1 in 1 ml after dilution, glucose 2% agar compound and 0.005% konggoredeu (Congo Red, CR) and 0.01% sodium dodecyl sulfate (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS), and cultured at 30 ° C. for 3 or 4 days.

<5-2> <5-2> HpGAS1HpGAS1 및  And HpGAS2HpGAS2 유전자 삽입 균주의 생리적 특성 확인 Identification of physiological characteristics of gene insertion

본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용하여 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자의 기능을 확인하기 위하여 상기 유전자가 각각 클로닝된 벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1, YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2)를 제작하여 ScGAS1 파쇄 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)에 각각 형질전환하였다. The present inventors constructed a vector (YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1, YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2) obtained by cloning each of the above genes to confirm the function of the HpGAS1 and HpGAS2 genes using Saccharomyces cerevisiae strain, and used a ScGAS1 disruption strain ( S. cerevisiae BY4741? ScgAS1 ).

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 각각 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 증폭한 HpGAS1, HpGAS2 유전자 카세트를 제한효소 XbaⅠ으로 처리하고, 제한효소 XbaⅠ을 처리한 YEp352ScGAPDHpt 벡터에 클로닝 하였다(도 7의 2). YEp352ScGAPDHpt 벡터는 2 micron origin, URA3 유전자와 GAPDH 프로모터를 가진 벡터로써, 형질전환체는 URA3 유전자가 삽입되기 때문에 SC-URA 최소배지에서 형질전환체를 얻을 수 있다. 상기 HpGAS1가 삽입된 벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1), HpGAS2가 삽입된 벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2) 및 YEp352ScGAPDHpt 공벡터를 ScGAS1 파쇄 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)에 각각 형질전환하였고 SC-URA 최소 배지에서 형질전환체를 얻어내어 희석한 세포배양액을 감수성 고형배지에 집적하여 생장을 비교하였다.Specifically, chromosomal DNA isolated from Hansenulla polypharmacia DL1 strain was used as a template It was cloned into the respective SEQ ID NO: 17 and 18, YEp352ScGAPDHpt vector by using primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 process the amplified HpGAS1, HpGAS2 gene cassette with a restriction enzyme X baⅠ, treated with restriction enzymes X baⅠ (2 in Fig. 7 ). The YEp352ScGAPDHpt vector is a vector with 2 micron origin, URA3 gene and GAPDH promoter, and the transformant is inserted into the URA3 gene. Therefore, a transformant can be obtained from the SC-URA minimal medium. The HpGAS1 inserted vector (YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1), the HpGAS2 inserted vector (YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2) and the YEp352ScGAPDHpt empty vector were transformed into ScGAS1 disrupted Saccharomyces cerevisiae strain ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 ) The transformants were obtained from the URA minimal medium and the diluted cell culture was integrated into the susceptible solid medium to compare the growth.

그 결과, HpGAS1 유전자를 보완한 ScGAS1 유전자가 파쇄된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1)는 야생형(S. cerevisiae BY4741)과 유사한 정도로 생장이 회복되었으며(도 15의 3), HpGAS2 유전자를 보완한 균주(S. cerevisiae BY4741 Δ ScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2)도 야행성(S. cerevisiae BY4741)과 유사한 정도로 생장이 회복되었다(도 15의 4). 이를 통해 HpGAS2 유전자가 한세눌라 폴리모르파에서는 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈의 기능을 부분적으로 보완하는 것과 달리 사카로 마이세스 세레비지애에서는 기능을 완전히 보완하는 것을 알 수 있다. 한편, YEp352ScGAPDHpt 공벡터가 도입된 대조군 균주도 ScGAS1 파쇄 균주와 생장의 차이가 없었는데, 이를 통해 사카로마이세스 세레비지애는 한세눌라 폴리모르파와 달리 URA3 유전자 있는 균주와 URA3 유전자 없는 균주의 생장차이가 없다는 것을 확인할 수 있었다(도 15의 5).
As a result, the growth of Saccharomyces cerevisiae strain ( S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1 / YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1) in which the ScGAS1 gene complementary to the HpGAS1 gene was recovered was recovered to a degree similar to that of wild type ( S. cerevisiae BY4741) ( S. cerevisiae BY4741 ? ScGAS1 / YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2) complementing the HpGAS2 gene also regained growth to a similar extent to that of S. cerevisiae BY4741 (Fig. 15, 4). This shows that the HpGAS2 gene partially complements the function of beta-1, 3- glucanosyltransglucosylase in Hansenulla polypharmacia , but it completely complement the function of Saccharomyces cerevisiae have. In contrast, the control strain to which the YEp352ScGAPDHpt Blank vector was introduced had no difference in growth with the ScGAS1 disruption strain. Thus, the difference in the growth of the URA3 gene-bearing strain and the URA3 gene- deficient strain, unlike the Hansenula polymorpha, (Fig. 15, 5).

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC12220BPKCTC12220BP 2012052420120524

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> HpGAS gene deleted yeasts and methods of producing recombinant proteins using them <130> 13p-04-24 <150> KR10-2012-0065686 <151> 2012-06-19 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1650 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 1 atgatcttct cgtggaaaac gatcggcgcc ctctttggcg ccatgaccgc tgtggccaag 60 gccgcctccg acttcccaac catcgaagtt gttggaaaca aattctttta ctcgaacaac 120 ggatcccaat tctatattcg aggagtggcc taccaagccg acactgctct gaccaccaac 180 acgtcttttg tcgatcctct ggccgacaag accacctgcg aaagagacat tccttacctg 240 agggagctga acaccaatgt catcagagtg tatgctctgg atgccgacgc tgaccacagc 300 gactgcatgt cgctcttgca agacgcgggc atctatgtga ttgcggatct ttcgcagcct 360 aaactgtcga tctctaccac ggaccctgag tggtctgagg ccttgtacga gagatacacg 420 tctgtggtcg acgtgatgca gcagtacgac aacgtgcttg gattttttgc cggaaacgag 480 gtcatcacaa actcttccaa cactgacgcc gctccgttcg tcaaggctgc catcagagac 540 atgaagcagt acatgaagga caggggatac cgtaccattc cagtcggata ctctgcgaac 600 gacgactccg agaccagagt cgcctcggcc aactacttcg cctgcggaga tgaggacgag 660 agagccgatt tctatggtat caacatgtac gagtggtgcg gaagttcctc atttgaaacg 720 tccgggtacg aggacagaac caaggagttc tccaacctca caattcccgt cttcttctcc 780 gagtacggct gcaacaccat ccaacctaga aaattcaccg atgtccctac cctcttctcc 840 gacgagatga ccgacgtgtg gtccggaggc attgtgtaca tgtacttcga ggaggacaac 900 aactatggtc ttgtctctgc catcgacgac accaccgtaa gcaccatgac cgacttcaaa 960 tactactcgt ccgagatcaa caacgtgtcg ccaacctcag ccaccctcgc ctcggccagc 1020 agcaccgcca ccgagctgtc gtgtccaacc ggattcaagt actggaatgc gtccgacact 1080 ctaccgccaa cgccagaaga gactgtctgt gactgcatgg ctagctccct ttcgtgtgtt 1140 gtgtctgacg acgtcgacag cgcagactat gatgagctgt tcggaacggt gtgcggtctt 1200 gtcaactgcg atggcatctc cgccaacgga aagacaggca agtacggagc atactcgttc 1260 tgcagctcca aagacatgct ttcgttcgct ctaaacctgt actatttgga ccagaacgag 1320 gactccagcg cctgcgactt tgacggctct gccagcatcc agagtgccac caccgcatcg 1380 acctgctctt ctatcctgag cgccgcagga accgccggaa ccggcaccgt cagcggcgtc 1440 agcggctctg gctctggttc tggctctggt tctggctcca cagcatccgg ctccgggggc 1500 tcgtcgtctg ggtcctcctc aggttcttcg tccacatctt ccggatcgac atccaacagc 1560 gccgccgtta gatcgtacag ctcaaacagc tactacacca tcctggtttc tggcctgtgt 1620 gctgttggtg ctctggttgt tctgacaatg 1650 <210> 2 <211> 1611 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 2 atgcagctaa aatctatcct ctcgctcacg ggcctgctct ccaccacgct ggctctgcct 60 accattgacg tggtgtccaa caagttcttc tattcgaaca acgggtccca attctatgtg 120 aaaggtgtcg cgtaccagaa gaacacagaa aatgctaccg acgacgcaac ctacgtcgat 180 ccgctcgctg acgaagagtc gtgcaagcga gacatcccgt acctacagaa tctgggaatc 240 aacgttatcc gggtgtatgc agtcgatgcc tccaaggacc atgacggatg catgtctctg 300 ctcgaggatg ctggaatcta tgtcatctcc gatctctcga ccccaaacga gtcgatcgag 360 accaccagtc catcctggac tgttgatctg tacaacaggt atgccacggt gatcgatatg 420 ttccaaagct acgacaacgt gctcggcttt tttgcaggta atgaggttat caccaacagg 480 accaacaccg acgctgctcc gttcgtcaag gccgccatta gagacatgaa gcagtacatg 540 aaggacaaca actacagaga cattccgatt ggctactcgg ccaacgacga ttccaaaacc 600 agagttcctt ctgcggacta cttctcctgc ggagacgacg acgtcaaggc agacttttac 660 ggtatcaaca tgtacgagtg gtgtggaaat gccacgttct cgagctccgg ctacgaggcc 720 agaacgaagg agttttcaaa tttgacgatc ccgatctttt tctcagagta cggttgcaac 780 agcgtcaagc cacgtgagtt cacagaggtg caggctatct actccgatga aatgacagac 840 gtttggtccg gcggtatcgt gtacatgtac ttccaggaag agaacgacta cggccttgtt 900 tccatcaaag acaatgctgt ctcgactttg ggcgactaca ctaacctcaa gagcgagctt 960 gcgaaaatta gccctaccac ggcgtctgcc tctgctgcat cgcagtcggc cacagaattg 1020 agctgtccaa ccagtcagag caactgggag gcatccacag accttcctcc aactccaaac 1080 gaggccgtgt gcgactgtct cgggtcgtcg ctcaaatgtg ttgtttccga cgacgtcgac 1140 tccaacgact acggcgactt ctttggtatt atctgcgacc tcaccgactg ttctgaaatc 1200 tccagcagcg gcagtaacgg cacctacggc gcatactcat actgctcagc caaggacaag 1260 ctttcgttcc tgctcaacaa atattacgag gaacaggact ccaactcgtc ggcctgtgac 1320 ttcagcggct ccgcctcgct caactccaac ggttcgaccg catccagctg ctcttcctta 1380 ttgagctctg cctcggcctc accatcggcc actggctcct caaactcctc ccctgcatct 1440 ggctccggct ctagttccgg ctccagctcc ggctccggct ctagcagctc cagctcctcg 1500 tcgtcctctg ccggcgcagg cgtcaacgct gtcccattgt cggctccaca actgggcctg 1560 ctctccttgt tctccacctt cttcttgggc ggactctcct acatccttat c 1611 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_N_Forward primer <400> 3 cgggaattcc aacgaagcac atcaactgg 29 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_N_Reverse_ZRF primer <400> 4 gaagctatgg tgtgtggggg atccgcacag agagacatgg gag 43 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_C_Forward_ZRR primer <400> 5 gcaagctgga gaccaacatg ggatccgtcc tctactatgt cgatg 45 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_C_Reverse primer <400> 6 cgggaattcg tttgttggag gtgaagtcg 29 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeo resistance_Forward primer <400> 7 cgcggatccc ccacacacca tagcttc 27 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeo resistance_Reverse primer <400> 8 cgcggatccc atgttggtct ccagcttgc 29 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_N_Forward primer <400> 9 tgcatgctga tgtggctg 18 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_N_Reverse_LUF primer <400> 10 agctcggtac ccggggatcc ccagacaggg caccgatt 38 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Forward_LUR primer <400> 11 gcacatcccc ctttcgccag agatcgtcgt ccagcagc 38 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Reverse primer <400> 12 tagacactgg acaggggg 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_N_Forward primer <400> 13 cccagaaatg cggtagaa 18 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_N_Reverse_LUF primer <400> 14 agctcggtac ccggggatcc cccgtgagcg agaggata 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_C_Forward_LUR primer <400> 15 gcacatcccc ctttcgccag ggcctgctct ccttgttc 38 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_C_Reverse primer <400> 16 cggattatca acggacga 18 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_Forward primer <400> 17 tgctctagaa agcttatgat cttctcgtgg aaaacaatc 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_Reverse primer <400> 18 tgctctagaa ctagtgtcct acattgtcag aacaaccag 39 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_Forward primer <400> 19 tgctctagag gcctgaaaaa tgcagctaa 29 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_Reverse primer <400> 20 tgctctagag cactagataa agatgtagga gagtcc 36 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScGAS1_Forward primer <400> 21 cccaagcttc aaacacagct aaatctcaac aatgt 35 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScGAS1_Reverse primer <400> 22 ggactagttc aaaccaaagc aaaaccgaca c 31 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Forward_GNR primer <400> 23 ggatccccgg gtaccgagct agatcgtcgt ccagcagc 38 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_N_Forward primer <400> 24 ggatccccgg gtaccgagct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_N_Reverse primer <400> 25 caccggtagc taatgatccc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_C_Forward primer <400> 26 cgaacatcca agtgggccga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_C_Reverse primer <400> 27 ctggcgaaag ggggatgtgc 20 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> HpGAS gene deleted yeasts and methods of producing recombinant          proteins using them <130> 13p-04-24 <150> KR10-2012-0065686 <151> 2012-06-19 <160> 27 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 1650 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 1 atgatcttct cgtggaaaac gatcggcgcc ctctttggcg ccatgaccgc tgtggccaag 60 gccgcctccg acttcccaac catcgaagtt gtgggaaaca aattctttta ctcgaacaac 120 ggatcccaat tctatattcg aggagtggcc taccaagccg acactgctct gaccaccaac 180 acgtcttttg tcgatcctct ggccgacaag accacctgcg aaagagacat tccttacctg 240 agggagctga acaccaatgt catcagagtg tatgctctgg atgccgacgc tgaccacagc 300 gactgcatgt cgctcttgca agacgcgggc atctatgtga ttgcggatct ttcgcagcct 360 aaactgtcga tctctaccac ggaccctgag tggtctgagg ccttgtacga gagatacacg 420 tctgtggtcg acgtgatgca gcagtacgac aacgtgcttg gattttttgc cggaaacgag 480 gtcatcacaa actcttccaa cactgacgcc gctccgttcg tcaaggctgc catcagagac 540 atgaagcagt acatgaagga caggggatac cgtaccattc cagtcggata ctctgcgaac 600 gacgactccg agaccagagt cgcctcggcc aactacttcg cctgcggaga tgaggacgag 660 agagccgatt tctatggtat caacatgtac gagtggtgcg gaagttcctc atttgaaacg 720 tccgggtacg aggacagaac caaggagttc tccaacctca caattcccgt cttcttctcc 780 gagtacggct gcaacaccat ccaacctaga aaattcaccg atgtccctac cctcttctcc 840 gcgagatga ccgacgtgtg gtccggaggc attgtgtaca tgtacttcga ggaggacaac 900 aactatggtc ttgtctctgc catcgacgac accaccgtaa gcaccatgac cgacttcaaa 960 tactactcgt ccgagatcaa caacgtgtcg ccaacctcag ccaccctcgc ctcggccagc 1020 agcaccgcca ccgagctgtc gtgtccaacc ggattcaagt actggaatgc gtccgacact 1080 ctaccgccaa cgccagaaga gactgtctgt gactgcatgg ctagctccct ttcgtgtgtt 1140 gtgtctgacg acgtcgacag cgcagactat gatgagctgt tcggaacggt gtgcggtctt 1200 gtcaactgcg atggcatctc cgccaacgga aagacaggca agtacggagc atactcgttc 1260 tgcagctcca aagacatgct ttcgttcgct ctaaacctgt actatttgga ccagaacgag 1320 gactccagcg cctgcgactt tgacggctct gccagcatcc agagtgccac caccgcatcg 1380 acctgctctt ctatcctgag cgccgcagga accgccggaa ccggcaccgt cagcggcgtc 1440 agcggctctg gctctggttc tggctctggt tctggctcca cagcatccgg ctccgggggc 1500 tcgtcgtctg ggtcctcctc aggttcttcg tccacatctt ccggatcgac atccaacagc 1560 gccgccgtta gatcgtacag ctcaaacagc tactacacca tcctggtttc tggcctgtgt 1620 gctgttggtg ctctggttgt tctgacaatg 1650 <210> 2 <211> 1611 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 2 atgcagctaa aatctatcct ctcgctcacg ggcctgctct ccaccacgct ggctctgcct 60 accattgacg tggtgtccaa caagttcttc tattcgaaca acgggtccca attctatgtg 120 aaaggtgtcg cgtaccagaa gaacacagaa aatgctaccg acgacgcaac ctacgtcgat 180 ccgctcgctg acgaagagtc gtgcaagcga gacatcccgt acctacagaa tctgggaatc 240 aacgttatcc gggtgtatgc agtcgatgcc tccaaggacc atgacggatg catgtctctg 300 ctcgaggatg ctggaatcta tgtcatctcc gatctctcga ccccaaacga gtcgatcgag 360 accaccagtc catcctggac tgttgatctg tacaacaggt atgccacggt gatcgatatg 420 ttccaaagct acgacaacgt gctcggcttt tttgcaggta atgaggttat caccaacagg 480 accaacaccg acgctgctcc gttcgtcaag gccgccatta gagacatgaa gcagtacatg 540 aaggacaaca actacagaga cattccgatt ggctactcgg ccaacgacga ttccaaaacc 600 agagttcctt ctgcggacta cttctcctgc ggagacgacg acgtcaaggc agacttttac 660 ggtatcaaca tgtacgagtg gtgtggaaat gccacgttct cgagctccgg ctacgaggcc 720 agaacgaagg agttttcaaa tttgacgatc ccgatctttt tctcagagta cggttgcaac 780 agcgtcaagc cacgtgagtt cacagaggtg caggctatct actccgatga aatgacagac 840 gtttggtccg gcggtatcgt gtacatgtac ttccaggaag agaacgacta cggccttgtt 900 tccatcaaag acaatgctgt ctcgactttg ggcgactaca ctaacctcaa gagcgagctt 960 gcgaaaatta gccctaccac ggcgtctgcc tctgctgcat cgcagtcggc cacagaattg 1020 agctgtccaa ccagtcagag caactgggag gcatccacag accttcctcc aactccaaac 1080 gaggccgtgt gcgactgtct cgggtcgtcg ctcaaatgtg ttgtttccga cgacgtcgac 1140 tccaacgact acggcgactt ctttggtatt atctgcgacc tcaccgactg ttctgaaatc 1200 tccagcagcg gcagtaacgg cacctacggc gcatactcat actgctcagc caaggacaag 1260 ctttcgttcc tgctcaacaa atattacgag gaacaggact ccaactcgtc ggcctgtgac 1320 ttcagcggct ccgcctcgct caactccaac ggttcgaccg catccagctg ctcttcctta 1380 ttgagctctg cctcggcctc accatcggcc actggctcct caaactcctc ccctgcatct 1440 ggctccggct ctagttccgg ctccagctcc ggctccggct ctagcagctc cagctcctcg 1500 tcgtcctctg ccggcgcagg cgtcaacgct gtcccattgt cggctccaca actgggcctg 1560 ctctccttgt tctccacctt cttcttgggc ggactctcct acatccttat c 1611 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_N_Forward primer <400> 3 cgggaattcc aacgaagcac atcaactgg 29 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_N_Reverse_ZRF primer <400> 4 gaagctatgg tgtgtggggg atccgcacag agagacatgg gag 43 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_C_Forward_ZRR primer <400> 5 gcaagctgga gaccaacatg ggatccgtcc tctactatgt cgatg 45 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_C_Reverse primer <400> 6 cgggaattcg tttgttggag gtgaagtcg 29 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeo resistance_Forward primer <400> 7 cgcggatccc ccacacacca tagcttc 27 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeo resistance_Reverse primer <400> 8 cgcggatccc atgttggtct ccagcttgc 29 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_N_Forward primer <400> 9 tgcatgctga tgtggctg 18 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_N_Reverse_LUF primer <400> 10 agctcggtac ccggggatcc ccagacaggg caccgatt 38 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Forward_LUR primer <400> 11 gcacatcccc ctttcgccag agatcgtcgt ccagcagc 38 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Reverse primer <400> 12 tagacactgg acaggggg 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_N_Forward primer <400> 13 cccagaaatg cggtagaa 18 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_N_Reverse_LUF primer <400> 14 agctcggtac ccggggatcc cccgtgagcg agaggata 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_C_Forward_LUR primer <400> 15 gcacatcccc ctttcgccag ggcctgctct ccttgttc 38 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_C_Reverse primer <400> 16 cggattatca acggacga 18 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_Forward primer <400> 17 tgctctagaa agcttatgat cttctcgtgg aaaacaatc 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_Reverse primer <400> 18 tgctctagaa ctagtgtcct acattgtcag aacaaccag 39 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_Forward primer <400> 19 tgctctagag gcctgaaaaa tgcagctaa 29 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_Reverse primer <400> 20 tgctctagag cactagataa agatgtagga gagtcc 36 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScGAS1_Forward primer <400> 21 cccaagcttc aaacacagct aaatctcaac aatgt 35 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScGAS1_Reverse primer <400> 22 ggactagttc aaaccaaagc aaaaccgaca c 31 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Forward_GNR primer <400> 23 ggtccccgg gtaccgagct agatcgtcgt ccagcagc 38 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_N_Forward primer <400> 24 ggtccccgg gtaccgagct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_N_Reverse primer <400> 25 caccggtagc taatgatccc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_C_Forward primer <400> 26 cgaacatcca agtgggccga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HplacZ_URA3_C_Reverse primer <400> 27 ctggcgaaag ggggatgtgc 20

Claims (8)

서열번호 1로 구성되는 유전자가 결손된, 단백질 분비능이 향상된 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주.
A Hansenula polymorpha mutant strain in which the gene consisting of SEQ ID NO: 1 is deficient and the protein-releasing ability is improved.
제 1항에 있어서, 상기 변이 균주는 기탁번호 KCTC12220BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 변이 균주.
The mutant strain according to claim 1, wherein the mutant strain is deposited with the accession number KCTC12220BP.
1) URA3 유전자 파쇄 카세트를 상동재조합을 통해 효모 균주에 도입하는 단계; 및
2) 상기 균주에 서열번호 1로 구성되는 유전자 파쇄 카세트를 형질전환한 후 상동재조합을 통해 염색체상의 서열번호 1로 구성되는 유전자를 파쇄하는 단계를 포함하는 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법.
1) introducing the URA3 gene disruption cassette into the yeast strain through homologous recombination; And
2) transforming a gene disruption cassette consisting of SEQ ID NO: 1 into the strain and disruption of a gene consisting of SEQ ID NO: 1 on the chromosome through homologous recombination to produce a yeast strain having improved protein secretion ability.
제 3항에 있어서, 상기 URA3 유전자 파쇄 카세트는 서열번호 1로 구성되는 유전자의 N 말단 절편, 서열번호 1로 구성되는 유전자의 C 말단 절편 및 Zeocin 저항성 유전자 (ZeoR) 카세트를 이용하여 제작한 파쇄카세트인 것을 특징으로 하는 방법.
4. The method of claim 3 wherein the URA3 gene disrupted cassette is broken prepared using the gene of the N-terminal fragment, C-terminal fragment and the Zeocin resistance gene (Zeo R) cassette of a gene consisting of SEQ ID NO: 1 consisting of SEQ ID NO: 1 Gt; cassette. &Lt; / RTI &gt;
제 3항에 있어서, 상기 서열번호 1로 구성되는 유전자 파쇄 카세트는 서열번호 1로 구성되는 염기서열로 구성되는 유전자의 N 말단 절편 및 유전자의 C 말단 절편, 및 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편 및 C-말단 절편을 이용하여 제작한 파쇄카세트인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 3 wherein the gene consisting of the SEQ ID NO: 1 is disrupted cassette C-terminal fragment of the N-terminal fragment and the gene of a gene consisting of the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1, and the lacZ - HpURA3 - the lacZ cassette N- End fragment and a C-end fragment.
1) 제 1항의 변이 균주에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜 재조합 효모 균주를 제조하는 단계; 및
2) 상기 재조합 효모 균주를 배양하는 단계를 포함하는 외래 재조합 단백질 생산 방법.
1) introducing a vector comprising a gene encoding a target protein into the mutant strain of claim 1 to produce a recombinant yeast strain; And
2) culturing the recombinant yeast strain.
삭제delete 제 6항에 있어서, 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 상기 변이 균주를 대량 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
The method according to claim 6, further comprising the step of mass-culturing the mutant strain using a bioreactor.
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