KR101497614B1 - 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마그네틱 비드를 이용한 인간을 제외한 척추동물의 정자 성을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ⅰ) 인간을 제외한 척추동물의 정액을 희석액에 넣어 희석하는 단계; ⅱ) 철을 함유한 나노 크기의 마그네틱 비드(magnetic bead)를 희석액에 넣어 분산하는 단계; ⅲ) 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액을 혼합하여 Y-염색체, 또는 Z-염색체의 정자에 마그네틱 비드를 특이적으로 결합시키는 단계; ⅳ) 상기 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 정자를 자기장 또는 자석을 이용하여 분리하는 단계;를 포함하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법이다.

Description

마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법{Sperm Sexing Method Based on Magnetic Beads}

본 발명은 마그네틱 비드를 이용한 인간을 제외한 척추동물의 정자 성을 분리하는 방법에 관한 것이다.

포유동물, 어류, 조류 등의 난자 또는 정자를 이용한 수정란 생산을 위한 여러 가지 생체 외 프로토콜, 인공수정과 같은 여러 가지 생체 내 프로토콜 등에 있어서, X- 또는 Y-염색체 중 하나를 함유하는 세포를 선택하는 것이 생산 효율적 측면, 관리적 측면, 상업적 측면 등에서 필요성이 더욱 커지고 있다. 지금까지의 출원된 정자 성 분리의 통상적인 방법은, 정자의 크기, 질량, 밀도에 근거하여, 원심분리, 구슬(bead)층, 여러 재질의 칼럼 등을 통과시켜 정자의 유영에 따른 이동속도에 기초하여(미합중국 특허 제5,135,759호, 제4,474,875호, 제5,514,537호, 제4,605,558, 제4,009,260호의 게시내용 참조) 분리하는 방법 등이 소개되어 왔지만 이런 방법으로는 고 순도의 성 분리된 정자를 얻기가 쉽지 않다.

최근 들어 유세포 분리기(flowcytometer)를 이용하는 방법이 소개되어 비교적 많은 수의 정자 집단을 각각의 정자세포의, 질량, 체적, DNA 함량, 밀도 차이에 근거하여 분류하는 방법이 소개되었지만(PCT/US2001/15150), 각 동물마다 각기 다른 정자의 모양, 크기 등 정자 생리학적 특성이 고려되지 않았으며, 출원 청구된 정자의 분리 속도, 분리 정확도 및 분리된 정자를 이용하여 동물을 수정시켰을 때 수태율에 의문점이 제기되어 오고 있으며, 국내외의 여러 연구자들이 유세포 분석기를 이용하여 전방산란(Forward scatter, FSC)과 측방산란(Side scatter, SSC) 만을 사용하여 정자 세포의 성 분리를 시도하였지만 기존에 소개된 방법으로는 명확히 분별 되지않는 부분이 많아 분리된 정자의 순도에 있어 의문점을 제기하고 있다.

본 발명자는 2008년 10월 10일에 유세포 분석기를 이용하여 X 염색체를 갖는 정자세포와 Y 염색체를 갖는 정자세포를 분리하는 방법(제목: 정자의 고순도 성 분리방법, 등록번호:제10-0864138호)을 등록받은 바 있다. 그러나, 상기 방법은 X 염색체를 갖는 정자세포와 Y 염색체를 갖는 정자세포의 분리되는 순도가 매우 높은 장점이 있으나, 상당한 시간이 소요되고 장비가 고가인 문제점이 있었다. 또한, 이러한 기계를 사용하기 위해서는 항시 상당히 숙련된 기술자(operator)가 필요하였다. 따라서, 실제로 이를 활용하는 축산업자 등에게는 상당한 경제적 부담으로 작용하는 문제가 있어서, 현장 적용 가능성이 떨어지는 문제점이 있어 왔다.

한편, 포유류의 성숙 정자 세포막(cell membrane)의 전위(electric charge)는 대체로 -16 ~ -24 mV (Ishijima SA, Okuno M. Mohri H., Int. J. Androl., 1991;14:340-7)를 띄고 있고, 정자 생식능력(capacitation) (Focarelli R, Rosati F, Terana B., J. Androl., 1990;11;97-104 ; Della Giovampaola C., et al., Mol. Reprod. Dev., 2001;60:89-96) 이 진행되면서 점차 전위가 약해지고, 또한 자궁내 유라미니다제(uraminidase) 효소나 난자의 난포액(follicular fluid)에 의해서도 정자 세포막 전위가 변하는 것으로 알려져 있다 (rivastava PN and Faroogui AA., Bio. Reprod., 1980;22:858-63). X-염색체를 가진 정자의 세포막 전위는 상대적으로 음극(negative charge)을 띄고 있고, 반대로 Y-염색체를 가진 정자는 X-정자에 비해 상대적으로 양성 전하를 띤다. 이러한 성질에 기초하여 본 발명자는 X 염색체를 갖는 정자세포와 Y 염색체를 갖는 정자 세포의 세포막 전하의 크기나 종류가 각각 다름을 이용하여 특정 전하를 갖는 정자세포에만 특이적으로 철이 함유된 비드(bead)를 결합시킬 수 있음을 활용하여 상기 비드가 결합된 정자만을 자석을 이용하여 분리하는 방법을 도입하였고 이를 출원한 바 있다. 출원당시 해당방법을 사용하여 돼지 등에 인공수정하여 결과를 살펴보았으나, 자연성비에 비해 다소의 효과가 있는 정도에 불과하였다. 체외 수정을 통한 소 수정란의 성비에 대한 결과는 비교적 결과가 좋은 것에 대해 제시하였던 것이며, 또한, 소 수정란의 상실기 내지 배반포기의 상태의 것을 PCR후 전기영동의 방법을 통해 성분리도를 확인한 것인데, 실제 인공수정의 결과와는 차이를 보여주고 있었다. 차이가 나는 이유에 대해서는 체외수정의 조건과 매우 밀접한 관련이 있을 것으로 추정된다. 다시 말해, X 정자가 산성에 강하므로 체외수정시의 희석액에 영향을 받을 것이며, 대체적으로 수명이 길기 때문에 실제 인공수정시의 결과와는 차이가 있을 것으로 보고 있다.

이에 본 발명자는 마그네틱비드를 이용한 정자의 성분리에 있어 보다 분리도를 높이기 위한 방법을 연구하였다. 이를 위해 Y 정자와 마그네틱비드간의 결합도를 높이고, 마그네틱비드의 뭉침현상을 방지하는 것이 보다 바람직하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 마그네틱 비드를 이용하여 인간을 제외한 척추동물의 정자를 성에 따라 분리하는 방법을 제공하는 것으로서, 그 분리의 성능을 높이려는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은

ⅰ) 인간을 제외한 척추동물의 정액을 희석액에 넣어 희석하는 단계;

ⅱ) 철을 함유한 나노 크기의 마그네틱 비드(magnetic bead)를 희석액에 넣어 분산하는 단계;

ⅲ) 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액을 혼합하여 Y-염색체, 또는 Z-염색체의 정자에 마그네틱 비드를 특이적으로 결합시키는 단계;

ⅳ) 상기 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 정자를 자기장 또는 자석을 이용하여 분리하는 단계;를 포함하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법이다.

그리고, 상기 희석액은 증류수 100 ㎖ 당 염화칼슘을 0.05 내지 3 g을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 마그네틱비드는 감마산화제이철(γ-Fe₂O₃) 또는 자철석(Fe₃O₄)을 TEOS(tetraethyl orthosilicate)로 마이크로 에멀젼 방법에 의해 생성한 마그네틱 비드인 것이 바람직하며, 상기 자기장 또는 자석의 자력은 4,000 내지 8,000 가우스인 것이 바람직하다.

그리고, 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액의 혼합액을 나선형의 관을 통과하게 하고, 나선형의 관 내부 또는 외부로는 솔레노이드형의 전자석의 장치가 구비되어 있는 것을 사용하면, 이를 장치화하는데 바람직하다.

그리고, 정자 하나에 대하여 마그네틱 비드의 개수는 3개인 것이 바람직하고, 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액의 혼합액속에 자석을 삽입하여 저어줌으로써 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 정자가 자석에 붙는 방법을 사용할 수 있고, 상기 자석은 네오디움 자석으로써, 10T의 직사각형 자석 2개를 붙여 중심 자력이 6,000 가우스가 되는 자석인 것을 사용할 수 있다.

본 발명은 마그네틱비드의 뭉침현상을 방지함으로써 보다 효과적으로 대상 정자와 결합할 수 있고, 마그네틱비드의 선택, 전해질 용액의 선택 등을 통해 보다 특정 정자와의 결합도를 높일 수 있어 결과적으로 정자의 성분리의 순도를 더욱 높일 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

성염색체(sex chromosome)는 암수의 분화가 있는 생물에 있어 암수에서 동일한 상염색체에 대해 성에 의해 형태나 수에 차이를 나타나는 염색체이다. 암컷에 2개, 수컷에 1개있는 것을 X, 수컷에만 1개 있는 것을 Y염색체라고 한다. 암컷＝XX, 수컷＝XY로 포유류에서 나타나는 조립이다(수컷 헤테로). 조류, 파충류, 어류 등에서는 암컷 헤테로에서, 암컷을 ZW, 수컷을 ZZ라고 한다. XY형에서는 자성생식세포(난, 난자)는 1종류이지만, 웅성생식세포(정자, 정충)는 2종류이기 때문에 웅성2배우자형이라고 한다. 한편, ZW형에서는 웅성생식세포는 1종류이고, 자성생식세포는 2종류이기 때문에 자성2배우자형이라고 한다. 결국, 성염색체에 따라 정자에 2종류가 있는 경우와 난자에 2종류가 있는 경우가 있다. 이하에서는 암컷을 발현하게 되는 X-염색체, 또는 W-염색체의 정자를 간단하게 X-정자, 그 반대를 Y-정자로 간략하게 호칭하기도 한다.

정자 성분리의 목적은 대체로 X-정자를 수득하기 위함이다. Y-정자는 상대적으로 양성전하를 띠고 있으며, 따라서 Y-정자와 마이크로 비드를 결합시키고, 마이크로 비드를 자력을 이용하여 제거하는 것이 대체적인 본 발명의 원리이다. 그리고, 본 발명에서는 이러한 원리가 보다 잘 구현되기 위한 방법을 제시하는 것이다. 이를 위해 본 발명은, ⅰ) 인간을 제외한 척추동물의 정액을 희석액에 넣어 희석하는 단계; ⅱ) 철을 함유한 나노 크기의 마그네틱 비드(magnetic bead)를 희석액에 넣어 분산하는 단계; ⅲ) 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액을 혼합하여 Y-염색체, 또는 Z-염색체의 정자에 마그네틱 비드를 특이적으로 결합시키는 단계; ⅳ) 상기 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 정자를 자기장 또는 자석을 이용하여 분리하는 단계;를 포함한다.

종래에는 마그네틱 비드가 수용액상에 일정농도로 녹아 있는 비드용액을 섞어 주는 방식이었는데, 정액의 희석액에 이를 넣어주어 잘 섞어주지만, 과정에서 마이크로 비드의 뭉침현상이 발생하였다. 결과적으로 정자와 마그네틱비드의 결합이 방해되는 결과가 발생하였다. 본 발명에서는 마그네틱 비드를 희석액에서 미리 보다 분산시키고, 나아가, 정액을 희석시킨 희석액과 동일한 희석액을 사용함으로써 정액의 희석액과 마그네틱 비드의 희석액을 혼합할 때 이러한 뭉침현상을 더욱 방지하였다. 이는 두 희석액간의 상용성이 증대된 결과일 것이다.

한편, 본 발명에서 사용하는 마그네틱비드는 음성 전하를 가짐으로서 Y- 또는 Z-염색체를 가진 정자(Y-정자)와 결합하게 되는데, 전반적으로 그러한 경향을 가지는 것이고 반드시 그렇게 되는 것만은 아니다. 마그네틱 비드가 X-정자와 결합할 수도 있고, 마그네틱비드가 Y-정자와 결합하지 않을 수도 있으며, 이러한 것들로 인해 분리의 성능이 떨어지게 된다. 본 발명에서는 희석액에 염화칼슘을 포함시켜 전하의 경쟁관계를 유도하고 이로써 정자의 이동도와 이에 따른 결합도의 차이를 더욱 크게 함으로써 마그네틱 비드가 Y-정자와 보다 특이적으로 결합하게 한다. 희석액에는 플라보노이드 당 등이 들어가게 되는데, 여기에 염화칼슘을 섞어 주는 경우 마그네틱 비드가 Y-정자와 보다 특이적으로 결합하는 정도가 높아진다. 상기 희석액은 증류수 100 ㎖ 당 염화칼슘을 0.05 내지 3 g을 포함하는 것이 바람직하며, 이 범위는 정자에 별다른 부작용을 끼치지 않는다.

한편, 종래발명에서는 마그네틱 비드가 철에 폴리스티렌이 코팅된 형태를 사용하였는데, 본 발명에서는 감마산화제이철(γ-Fe₂O₃) 또는 자철석(Fe₃O₄)을 TEOS(tetraethyl orthosilicate)로 마이크로 에멀젼 방법에 의해 생성한 마그네틱 비드인 것이 바람직하다. 감마산화제이철(γ-Fe₂O₃) 또는 자철석(Fe₃O₄)은 자석 등에 의해 추후 부착되게 하기 위한 것일 뿐이다. 감마산화제이철(γ-Fe₂O₃) 또는 자철석(Fe₃O₄)에 계면활성제를 넣어주면 이들을 계면활성제가 둘러싸게 되고 여기에 teos를 넣어주면 계면활성제가 둘러싸고 있는 곳 안으로 실리카 모노머들이 들어가게 되고 이들을 성장시키고 분리하면 감마산화제이철(γ-Fe₂O₃) 또는 자철석(Fe₃O₄)을 실리카가 둘러싸고 있는 형태가 구현되어 나노사이즈의 파티클 형태가 되며 감마산화제이철(γ-Fe₂O₃) 또는 자철석(Fe₃O₄)이 내부에 포함되므로 마그네틱 비드라 할 수 있겠으며, 보다 안정적이며 생체에 무해한 물질이다. 성장의 정도를 조절하여 크기를 조절할 수 있는데, 통상 평균 크기가 50 nm 정도된다. 비드의 바람직한 크기는 10 내지 100 nm 정도이다. 본 발명의 상기 마그네틱 비드는 음성 전하를 띠게 되는데, 스티렌보다 Y-정자와의 특이적 결합도가 뛰어나다.

그리고, 본 발명에서 자력의 크기는 4,000 내지 8,000 가우스인 것이 바람직하다. 네오디움 자석의 경우 2,500 내지 5,000 가우스의 크기를 가지는데, 그 두께에 따라 자력의 크기가 달라진다. 대략 10T의 경우 4,000가우스를 나타내는데, 이러한 10T의 자석을 두개 붙인 경우 중앙의 자력은 대략적으로 6,000 가우스정도가 나온다. 한편, 자력의 크기를 달리하여 여러 조건에서 실험해 본 결과 정자가 들어있는 희석액속에 자석을 직접 넣어서 하는 경우, 상기 10T의 자석을 두개 붙인 것의 중앙부위에 마그네틱 비드가 집중적으로 달라붙는 것을 확인하였으며, 보다 바람직하게는 6,000 가우스 정도의 자력이 분리도를 높이는 데 적정할 것으로 생각된다. 또한 이러한 형태를 구현하는데는 직사각형 형태의 자석이 바람직하다.

한편, 본 발명의 방법을 보다 시스템화한 장치의 형태의 경우에는 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액의 혼합액을 나선형의 관을 통과하게 하고, 나선형의 관 내부 또는 외부로는 솔레노이드형의 전자석의 장치가 구비되어 있는 것이 바람직할 것이다. 이는 미반응되는 것을 보다 줄이고 혼합액이 정체되는 시간을 늘림으로써 Y-정자가 보다 효과적으로 분리되도록 하는데 바람직할 것이며, 부가적으로 관의 세척 등이 문제도 보다 쉽게 될 것이다.

한편, 본 발명에서 정자당 마그네틱 비드의 개수는 1 내지 4개 정도가 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는 정자 하나에 대하여 마그네틱 비드의 개수는 3개이다.

상기의 개선된 방법을 통해 실제 돼지에 대하여 임신을 시켜 그 결과를 살펴보았다. 현재까지 총 9차에 걸쳐 실험을 하였으며, 각 단계별로 상기한 방법의 내용들을 적용해가면서 이를 개선해 나가고 있다. 그 중 6차의 실험결과를 아래에 나타내었으며, 7 내지 9차의 실험을 실시하여 현재 임신 진행중이다. 6차의 경우 마그네틱 비드의 사용시 정액 희석액에 미리 분산시키고 사용하였으며, 희석액에 염화칼슘을 사용하는 구성, 분리시 자력의 크기를 6,000 가우스로 조절하는 등의 내용을 포함시켰다. 대조구는 특별한 처리를 하지 않는 경우이다.

구분	대상복수	수태율	분만율	총산자수	생시사고	암	수
실험구	62	100%	95%	9.7	8.7%	68%	32%
대조구	133	98%	81%	9.1	9.1%	44%	56%

실험결과 자연성비를 유의미하게 넘어섰으며, 본 발명의 방식이 나름의 의미가 있는 것으로 생각된다.

한편, 본 발명의 방식의 분만율이 높은 이유는 본 발명의 경우, 사멸정자의 경우 보다 마그네틱 비드와 결합이 잘되고, 또한 이로써 이들의 분리가 더 잘되기 때문일 것이다. 또한, 본 발명의 경우, 활성이 떨어지는 것에 대하여 보다 마그네틱 비드가 더 잘 붙기 때문에 보다 활동도가 높은 것들이 수집되는 장점이 있다.

Claims (8)

1. ⅰ) 인간을 제외한 척추동물의 정액을 희석액에 넣어 희석하는 단계;
   ⅱ) 철을 함유한 나노 크기의 마그네틱 비드(magnetic bead)를 ⅰ) 단계의 희석액과 동일한 희석액에 넣어 비드를 분산하는 단계;
   ⅲ) 상기 ⅰ)단계의 정액 희석액과 ⅱ)단계의 마그네틱 비드 희석액을 혼합하여 Y-염색체, 또는 Z-염색체의 정자에 마그네틱 비드를 특이적으로 결합시키는 단계;
   ⅳ) 상기 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 정자를 자기장 또는 자석을 이용하여 분리하는 단계;를 포함하되, 상기 희석액은 증류수 100 ㎖ 당 염화칼슘을 0.05 내지 3 g을 포함하는 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 마그네틱비드는 감마산화제이철(γ-Fe₂O₃) 또는 자철석(Fe₃O₄)을 TEOS(tetraethyl orthosilicate)로 마이크로 에멀젼 방법에 의해 생성한 마그네틱 비드인 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 자기장 또는 자석의 자력은 4,000 내지 8,000 가우스인 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 ⅲ) 단계의 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액을 혼합시킨 것을 나선형의 관을 통과하게 하고, 나선형의 관 내부 또는 외부로는 솔레노이드형의 전자석의 장치가 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법.
6. 제 1항에 있어서,
   정자 하나에 대하여 마그네틱 비드의 개수는 3개인 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 ⅳ) 단계에서는 정액 희석액과 마그네틱 비드 희석액의 혼합액속에 자석을 삽입하여 저어줌으로써 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 정자가 자석에 붙는 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 자석은 네오디움 자석으로써, 10T의 직사각형 자석 2개를 붙여 중심 자력이 6,000 가우스가 되는 자석인 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드를 이용한 정자 성 분리방법.