KR101496005B1 - 열안정성 글루탐산탈탄산효소 b 변이체 - Google Patents
열안정성 글루탐산탈탄산효소 b 변이체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101496005B1 KR101496005B1 KR1020130060752A KR20130060752A KR101496005B1 KR 101496005 B1 KR101496005 B1 KR 101496005B1 KR 1020130060752 A KR1020130060752 A KR 1020130060752A KR 20130060752 A KR20130060752 A KR 20130060752A KR 101496005 B1 KR101496005 B1 KR 101496005B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gadb
- val6ile
- val6leu
- thr7glu
- thr7asp
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 열안정성을 갖는 글루타민탈탄산효소 B 변이체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 글루타민탈탄산효소 B 변이체는 정상 글루타민탈탄산효소 B(GadB)의 N-말단으로부터 5 내지 7번째 아미노산 잔기 중 2개 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이체로 정상 글루탐산탈탄산효소 B와 비교하여 고온의 환경에서 안정한 효소활성 및 활성부위 구조를 갖으며, 대량생산 시스템을 통해 많은 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyrate, GABA)을 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 글루탐산탈탄산효소 B의 N-말단으로부터 아미노산 잔기를 치환하여 열안정성을 갖는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체에 관한 것이다.
글루탐산탈탄산효소(Glutamate decarboxylase, GAD)는 피리독살 5′-포스페이트(Pyridoxal 5′-phosphate, PLP)를 조효소로 하여 L-글루탐산(L-glutamate)을 탈카르복시화하여 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyrate, GABA)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 이러한 GAD는 호박, 당근, 현미, 밀, 녹차 등 많은 고등식물에 많이 함유되어 있으며, 대장균(E.coli), 프로테우스 속(Proteus vulgaris 등), 클로스트라듐 속(Clostridium 등) 등에서도 발견된다.
상기 GABA는 주로 중추신경계에서 억제성 신경전달물질의 역할을 하여, 뇌기능 향상, 혈관확장을 통한 고혈압 저하 효과, 이뇨효과 등 많은 생리활성에 효과를 나타낸다. 또한, 고리화반응으로 2-피롤리돈(2-Pyrrolidone)으로 전환하여 나일론 4(Nylon 4) 및 산업적 용매 등의 원료 및 용제로도 사용될 수 있으며, 특히, 나일론 4의 모노머(monomer)는 대표적 나일론인 나일론 6(Nylon 6) 및 나일론 66(Nylon66)과 내열성 및 기계적 물성이 유사하여 생분해 산업분야에 적용할 수 있다(Adeghate & ponery, 2002; Kawasaki et al., 2005; Pennacchietti et al., 2009; Thu Ho et al., 2012). 그러나, GAD는 고온에서의 안정성이 낮아 GABA의 대량 생산에 적합하지 않다는 문제점이 있다.
이와 같은 문제를 해결하기 위해 GAD에 유퍼지트 C(Eupergit C) 또는 칼슘 알지네이트(calcium alginate)와 같은 수불용성 담체를 고정시켜 고온 및 중성의 pH에서도 활성을 나타내 GABA를 생산할 수 있다. 이와 관련된 기술로 대한민국 등록특허 제10-0851296호는 글루타메이트 디카르복실라이제를 이용한 생물전환공정에 의한 GABA의 제조방법에 대하여 기재하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0753003호는 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 대하여 기재하고 있다. 그러나 상기 문헌들에서 담체 고정화는 담체와 효소간의 결합력이 약하고, 반응이나 재생 중 효소의 이탈이 가능하며, 다량의 효소가 필요하다는 문제점이 있다.
한편, 글루탐산탈탄산효소 B(Glutamate decarboxylase beta, GadB)는 대장균(E.coli) 내의 산성 pH 조건에서 생성되는 GAD의 동형체 중 하나로, 대장균 내의 생리적 산도를 유지하기 위해 생성되어 산성 저항 시스템을 구성한다. 상기 GadB의 활성부위(Activity site) 구조는 pH에 따라 달라진다. 구체적으로, 도 1에서 보는 바와 같이, 산성 pH(pH 3.8 내지 4.6)에서 GadB는 N-말단(N-terminal)부위에 삼중나선다발(Triple-helix bundle)구조를 가지며, 중성 pH(pH 7.6 내지 8.0)에서의 GadB는 C-말단이 플러그(Plug)구조를 가진다. 따라서 GadB의 활성은 산성 pH에서 이루어지며 이는 N-말단부위의 구조와 연관이 있다(Capitani et al., 2003).
이에 본 발명자들은 열안정성을 갖는 GadB의 제조방법을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 글루탐산탈탄산효소 B(Glutamate decarboxylase beta, GadB)의 삼중나선다발구조를 구성하는 서열번호 1의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 열안정성을 가지는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 글루탐산탈탄산효소 B(Glutamate decarboxylase beta, GadB)의 삼중나선다발구조를 구성하는 서열번호 1의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 열안정성을 가지는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 글루탐산탈탄산효소 B(Glutamate decarboxylase beta, GadB)의 삼중나선다발구조를 구성하는 서열번호 1의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 열안정성을 가지는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 글루탐산탈탄산효소 B(GadB)는 대장균(E.coli) 내의 산성 pH 조건에서 생성되는 글루탐산탈탄산효소(GAD)의 동형체 중 하나로, 대장균내의 생리적 산도를 유지하거나 피리독살 5'-포스페이트(Pryridoxal 5'-phosphate, PLP)를 조효소로 하여 L-글루탐산을 탈카르복시화하여 감마-아미노부티르산(γ-aminobutryrate, GABA)의 생성을 촉매하는 효소이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이는 자연적 또는 인위적인 작용으로 단백질을 암호화하는 염기의 삽입, 결실 및 치환되어 단백질의 성질이 변화하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 열안정성은 효소를 포함한 단백질의 활성이 최적일 때의 온도보다 최소 10℃이상의 높은 온도에서도 동일하거나 적어도 60% 이상의 활성을 유지하는 단백질의 상태를 말한다.
본 발명에 있어서, 아미노산 잔기의 치환은 야생형 또는 비돌연변이 아미노산 다음에 교체되는 위치의 번호가 오고 그 다음에 치환된 아미노산을 써서 정의되며, 하나의 예로 Gln5Asp는 5번째 위치하는 글루타민(Gln, Q)이 아스파르트산(Asp, D)으로 치환되는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 삼중나선다발구조는 글루탐산이 반응하는 활성부위로 글루탐산탈탄산효소 B의 N-말단으로부터 1 내지 14번에 위치한다. 이를 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내었으며, 그 서열 중 5번째, 6번째 및 7번째 아미노산은 글루타민(Gln, Q), 발린(Val, V) 및 트레오닌(Thr, T) 잔기인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 서열번호 1의 5 내지 7번째 아미노산 중 2개 또는 3개의 아미노산 잔기가 아스파르트산(Asp, D), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I) 또는 글루탐산(Glu, E) 중 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명의 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 (1) Gln5Asp 및 Val6Leu; (2) Gln5Asp 및 Val6Ile; (3) Gln5Glu 및 Val6Ile; (4) Gln5Glu 및 Val6Leu; (5) Thr7Asp 및 Val6Ile; (6) Thr7Asp 및 Val6Leu; (7) Thr7Glu 및 Val6Ile; (8) Thr7Glu 및 Val6Leu; (9) Gln5Asp, Val6Ile 및 Thr7Asp; (10) Gln5Glu, Val6Ile 및 Thr7Asp; (11) Gln5Asp, Val6Leu 및 Thr7Asp; (12) Gln5Glu, Val6Leu 및 Thr7Asp; (13) Gln5Asp, Val6Ile 및 Thr7Glu; (14) Gln5Glu, Val6Ile 및 Thr7Glu; (15) Gln5Asp, Val6Leu 및 Thr7Glu; 및 (16) Gln5Glu, Val6Leu 및 Thr7Glu;으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 변이를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 아미노산 변이에 있어서, 아미노산 잔기가 2개 미만으로 치환된 경우에는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 정상 글루탐산탈탄산효소 B와 온도변화에 따른 안정성 및 활성이 거의 차이가 없으나, 2개 이상으로 치환된 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 온도변화에 따른 안정성 및 활성이 현저히 증가하는 효과를 가진다.
본 발명에 따른 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 pH 3.8 내지 5.2, 바람직하게는 pH 4.2 내지 4.8의 범위에서 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 30 내지 70℃, 바람직하게는 45 내지 60℃의 온도에서 열안정성을 나타낸다.
하나의 구체적 실시에서, 서열번호 1의 N-말단으로부터 5번째, 6번째 및 7번째 아미노산인 글루타민(Gln, Q), 발린(Val, V) 및 트레오닌(Thr, T)을 아스파르트산(Asp, D), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I) 또는 글루탐산(Glu, E)으로 1개, 2개 및 3개를 치환하여 pH 4.6, 30 내지 70℃의 온도에서의 활성을 관찰한 결과, 2개 및 3개의 아미노산을 치환시킨 글루탐산탈탄산효소 B 변이체에서 활성을 나타냈으며, 특히 Gln5Asp, Val6Ile 및 Thr7Glu의 아미노산 변이를 갖는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 효소활성은 pH4.6, 온도 65℃의 조건에서 상대적 활성이 60%를 유지하는 것으로 확인되었다.
다른 하나의 구체적 실시에서, 서열번호 1의 N-말단으로부터 5번째, 6번째 및 7번째 아미노산인 글루타민(Gln, Q), 발린(Val, V) 및 트레오닌(Thr, T)의 아미노산 잔기가 아스파르트산(Asp, D), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I) 또는 글루탐산(Glu, E)으로 치환된 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 pH 4.6, 30 내지 70℃의 온도에서의 분자동역학 모의실험결과, 삼중나선다발구조를 형성하는 서열번호 1의 아미노산 잔기는 정상 글루타민탈탄산효소 B에 비하여 위치의 변동이 적게 일어나는 것으로 확인되었다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 글루탐산탈탄산효소 B(Glutamate decarboxylase beta, GadB)의 삼중나선다발구조를 구성하는 서열번호 1의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 열안정성을 갖는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 글루탐산탈탄산효소 B의 삼중나선다발구조를 구성하는 서열번호 1의 아미노선 서열 중 5번째, 6번째 및 7번째 아미노산 잔기 중 2개 또는 3개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 코딩하는 유전자를 발현벡터에 재조합하고, 이를 숙주세포에 형질전환하여 발현시켜 이를 정제하고 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 잔기, 치환되는 아미노산 및 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 아미노산 서열 등에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
또한, 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 활성 및 구조 등에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 유전자는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것으로, 당업계에 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 글루탐산탈탄산효소 B를 암호화 하는 글루탐산탈탄산효소 B의 유전자를 합성하거나 미생물의 게놈 DNA(Genome DNA)에서 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 증폭하여 얻은 글루탐산탈탄산효소 B의 유전자에 대하여 글루탐산탈탄산효소 B의 N-말단 부위로부터 아미노산 잔기가 2개 이상, 바람직하게는 2개 또는 3개의 아미노산 잔기가 치환될 수 있도록 제작된 상보적인 짧은 단선의 유전자 서열인 프라이머를 이용하여 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 발현하는 유전자를 재조합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 적당한 숙주세포로 외래 유전자를 도입하여 그것이 발현될 수 있도록 하는 수단으로서, 플라스미드 벡터(Plasmid Vector), 코즈미드 벡터(Cosmid Vector), 박테리오파지 벡터(Bacteriophage Vector) 및 아데노바이러스 벡터(Adenovirus Vector), 레트로바이러스 벡터(Retrovirus Vector), 아데노-연관 바이러스벡터(Adeno-dependent virus Vector) 같은 바이러스 벡터(Virus Vector) 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 또한, 정제가 용이하도록 다른 서열과 융합된 플라스미드, 파지 또는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 상기 융합된 서열은 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(Glutathione S-trasnferase), 말토스 결합 단백질(Maltose-binding protein) 및 6x 히스티딘(Six-Histidine) 등이 있으며, 바람직하게는 6x 히스티딘이다.
하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 유전자는 돌연변이체를 형성하는 특정 프라이머들을 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 통해 합성한 후 6x 히스티딘이 융합된 발현벡터에 삽입한 후 발현에 E.coli DH5α에 형질전환하여 정제하였다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포로는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, 대장균(E.coli), 바실러스 속(Bacillus) 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonellae typhimurium), 세라티아 마르세센스균(Serratia marcescens) 및 슈도모나스 속(Pseudomonas) 균주 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질전환 하는 방법은 발현벡터가 숙주세포 안으로 삽입되는 것이라면 제한되지 않으며, 하나의 예로서 CaCl2 방법 또는 전기천공방법 등 어느 것이나 가능하다.
본 발명에 있어서, 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 유전자를 포함하는 발현벡터, 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 유전자를 포함하는 발현벡터가 형질전환된 숙주세포 또는 정제된 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 모두 포함한다.
본 발명에 따르면, 정상 글루탐산탈탄산효소 B와 비교하여 고온의 환경에서 안정한 효소활성 및 활성부위 구조를 가진 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 제공할 수 있으며, 대량생산 시스템을 통해 많은 아미노부티르산(γ-aminobutyrate, GABA)이 생성할 수 있다.
도 1은 pH 변화에 따른 정상 글루탐산탈탄산효소 B(GadB-WT)의 구조이다.
도 2는 pH 및 온도의 변화에 따른 정상 글루탐산탈탄산효소 B(GadB-WT)의 효소활성을 측정한 결과이다.
도 3은 염화나트륨(NaCl) 첨가 및 온도의 변화에 따른 정상 글루탐산탈탄산효소 B(GadB-WT)의 효소활성을 측정한 결과이다.
도 4는 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 변이된 단량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다.
도 5는 2개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 변이된 이량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다.
도 6은 3개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 변이된 삼량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다.
도 7은 온도의 변화에 따른 정상 글루탐산탈탄산효소 B(GadB-WT), N-말단으로부터 아미노산 잔기가 제거된 글루탐산탈탄산효소 B(GadB △1-14) 및 열안정성이 가장 좋은 삼량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체(GadB-TM)들의 열안정성을 측정한 결과이다.
도 2는 pH 및 온도의 변화에 따른 정상 글루탐산탈탄산효소 B(GadB-WT)의 효소활성을 측정한 결과이다.
도 3은 염화나트륨(NaCl) 첨가 및 온도의 변화에 따른 정상 글루탐산탈탄산효소 B(GadB-WT)의 효소활성을 측정한 결과이다.
도 4는 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 변이된 단량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다.
도 5는 2개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 변이된 이량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다.
도 6은 3개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 변이된 삼량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다.
도 7은 온도의 변화에 따른 정상 글루탐산탈탄산효소 B(GadB-WT), N-말단으로부터 아미노산 잔기가 제거된 글루탐산탈탄산효소 B(GadB △1-14) 및 열안정성이 가장 좋은 삼량체 글루탐산탈탄산효소 B 변이체(GadB-TM)들의 열안정성을 측정한 결과이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 글루탐산탈탄산효소 B 변이체 유전자 클로닝
유전자은행(Gene bank)에 있는 대장균(E.coli)의 유전자 서열을 검색하여gadB 유전자 서열을 발견한 후 유전자 합성 회사(GenScript, USA)에 의뢰하여 gadB 유전자를 C-말단에 여섯 개의 히스티딘을 포함하고 있는 pUC57 벡터(Genscript, USA)에 클로닝 되도록 하였다.
상기 gadB 유전자를 포함하는 벡터를 대장균 DH5α(RBC Bioscience, Taiwan)에 형질전환 시킨 후 0.01% X-gal(Sigma-Aldrich, USA)와 100㎍/ml의 엠피실린 항생제를 포함하는 고체배지(Luria-Bertani media, LB media; Tryptone 10g/L, NaCl 10g/L, Yeast extract 5g/L, Agarose 1.5%)에서 gadB 유전자를 가지는 pUC57 벡터를 포함하는 형질전환체를 선별하였다. 그 다음 플라스미드 추출 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 gadB 유전자를 가지는 pUC57 벡터를 정제하였다.
상기 정제한 gadB 유전자를 가지는 pUC57 벡터를 제한효소 NdeⅠ(Takara, Japan)과 EcoRⅠ(Takara, Japan)을 이용하여 절단하여 pET-22b(+) 벡터(Novagen, USA)에 라이게이션(ligation) 시켰다. 그 다음 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 통해 글루탐산탈탄산효소 B의 N-말단으로부터 특정 아미노산 잔기가 변이된 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 코딩하는 gadB 유전자(GadB-TM)를 갖는 플라스미드(p22GadB)를 제조하였다.
| 변형된 아미노산 잔기 | 프라이머a | |
| 1개 | Gln5Asp | 전방향:5′-CAAAAAAGATGTGACGGACCTGCGC-3′(서열번호 2) 역방향:5′-CCGTCACATCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 3) |
| Gln5Glu | 전방향:5′-CAAAAAAGAAGTGACGGACCTGCGCC-3′(서열번호 4) 역방향:5′-CCGTCACTTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 5) |
|
| Val6Ile | 전방향:5′-CAAAAAACAAATCACGGACCTGCGCTCG-3′(서열번호 6) 역방향:5′-GCAGGTCCGTGATTTGTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 7) |
|
| Val6Leu | 전방향:5′-CAAAAAACAACTGACGGACCTGCGCTCG-3′(서열번호 8) 역방향:5′-GCAGGTCCGTCAGTTGTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 9) |
|
| Thr7Asp | 전방향:5′-CAAGTGGACGACCTGCGCTCGGAAC-3′(서열번호 10) 역방향:5′-CAGGTCGTCCACTTGTTTTTTGTCC-3′(서열번호 11) |
|
| Thr7Glu | 전방향:5′-CAAGTGGAGGACCTGCGCTCGGAAC-3′(서열번호 12) 역방향:5′-CAGGTCCTCCACTTGTTTTTTGTCC-3′(서열번호 13) |
|
| 2개 | Gln5Asp/Val6Ile | 전방향:5′-CAAAAAAGACATCACGGACCTGCGC-3′(서열번호 14) 역방향:5′-CCGTGATGTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 15) |
| Gln5Asp/Val6Leu | 전방향:5′-CAAAAAAGACCTGACGGACCTGCGC-3′(서열번호 16) 역방향:5′-CCGTCAGGTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 17) |
|
| Gln5Glu/Val6Ile | 전방향:5′-CAAAAAAGAAATCACGGACCTGCGCTCGGAACTG-3′(서열번호 18) 역방향:5′-CCGTGATTTCTTTTTTGTCCATATGTATATCTCC-3′(서열번호 19) |
|
| Gln5Glu/Val6Leu | 전방향:5′-CAAAAAAGAACTGACGGACCTGCGCTCGGAACTG-3′(서열번호 20) 역방향:5′-CCGTCAGTTCTTTTTTGTCCATATGTATATCTCC-3′(서열번호 21) |
|
| Thr7Asp/Val6Ile | 전방향:5′-CAAATCGACGACCTGCGCTCGGAACTGCTG-3′(서열번호 22) 역방향:5′-CAGGTCGTCGATTTGTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 23) |
|
| Thr7Asp/Val6Leu | 전방향:5′-CAACTGGACGACCTGCGCTCGGAACTGCTG-3′(서열번호 24) 역방향:5′-CAGGTCGTCCAGTTGTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 25) |
|
| Thr7Glu/Val6Ile | 전방향:5′-CAAATCGAGGACCTGCGCTCGGAACTGCTG-3′(서열번호 26) 역방향:5′-CAGGTCCTCGATTTGTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 27) |
|
| Thr7Glu/Val6Leu | 전방향:5′-CAACTGGAGGACCTGCGCTCGGAACTGCTG-3′(서열번호 28) 역방향:5′-CAGGTCCTCCAGTTGTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 29) |
|
| 3개 | Gln5Asp/Val6Ile/Thr7Asp | 전방향:5′-CAAAAAAGACATCGACGACCTGCGC-3′(서열번호 30) 역방향:5′-GTCGATGTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 31) |
| Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Asp | 전방향:5′-CAAAAAAGAAATCGACGACCTGCGC-3′(서열번호 32) 역방향:5′-GTCGATTTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 33) |
|
| Gln5Asp/Val6Leu/Thr7Asp | 전방향:5′-CAAAAAAGACCTGGACGACCTGCGC-3′(서열번호 34) 역방향:5′-GTCCAGGTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 35) |
|
| Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Asp | 전방향:5′-CAAAAAAGAACTGGACGACCTGCGC-3′(서열번호 36) 역방향:5′-GTCCAGTTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 37) |
|
| Gln5Asp/Val6Ile/Thr7Glu | 전방향:5′-CAAAAAAGACATCGAGGACCTGCGC-3′(서열번호 38) 역방향:5′-CTCGATGTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 39) |
|
| Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Glu | 전방향:5′-CAAAAAAGAAATCGAGGACCTGCGC-3′(서열번호 40) 역방향:5′-CTCGATTTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 41) |
|
| Gln5Asp/Val6Leu/Thr7Glu | 전방향:5′-CAAAAAAGACCTGGAGGACCTGGGC-3′(서열번호 42) 역방향:5′-CTCCAGGTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 43) |
|
| Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Glu | 전방향:5′-CAAAAAAGAACTGGAGGACCTGCGC-3′(서열번호 44) 역방향:5′-CTCCAGTTCTTTTTTGTCCATATG-3′(서열번호 45) |
|
| a프라이머들의 변형부위는 밑줄로 표기하였음. | ||
실시예 2 : 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 과발현 및 정제
상기 실시예 1에서 제조된 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 코딩하는 gadB 유전자를 포함한 p22GadB 플라스미드를 발현 숙주인 대장균 BL21(λDE3; RBC Bioscience, Taiwan)에 형질전환 시켰다. 그 다음 p22GadB를 포함하는 콜로니를 엠피실린 항생제를 포함하는 액체배지(Luria-Bertani media, LB medium; Tryptone 10g/L, NaCl 10g/L, Yeast extract 5g/L) 15ml에 접종하여 37℃에서 200rpm으로 16시간 동안 배양한 후, 상기 배양한 형질전환 균주 배양액을 상기 액체배지 300ml에 재접종하여 37℃에서 200rpm으로 배양하고 1mM IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 한 후 25℃에서 200rpm 중간-대수기(OD600=0.6~0.8)까지 배양하여 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 발현을 유도하였다.
상기 글루탐산탈탄산효소 B 변이체가 과발현된 p22GadB 플라스미드를 포함하는 배양액을 4℃의 온도가 유지되는 원심분리기를 이용하여 4,000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였다. 그 다음 상기 회수한 세포를 세포용해 용액(lysis buffer; 50mM NaH2PO4, 10mM 이미다졸, pH8.0)에 현탁시킨 후 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하고 4℃의 온도가 유지되는 원심분리기를 이용하여 12,000rpm으로 30분 동안 원심분리 하여 세포조각을 제거하고 상층액은 세척용액(Washing buffer; 0mM NaH2PO4, 20mM 이미다졸, pH8.0)으로 평형화된 Ni가 결합된 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography; Ni-NTA agarose, Qiagen, USA) 컬럼에 걸어 4℃의 온도에서 1시간 동안 로딩하였다. 그 다음 컬럼에 세척용액(Washing buffer; 50mM NaH2PO4, 20mM 이미다졸, pH8.0)을 로딩하여 세척한 후 용출용액(Elution buffer; 50mM NaH2PO4, 250mM 이미다졸, pH8.0)을 적용하여 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 정제하였다.
100mM 인산-구연산 용액(pH4.6)과 100mM 염화나트륨 용액이 혼합된 완충용액으로 amicon® ultra-15 원심분리 장치(MWCO=10kDa, Millipore, USA)의 컬럼을 세척한 후 상기 정제한 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 100mM 염화나트륨 용액이 포함된 100mM 인산-구연산 완충용액(pH4.6)과 혼합하여 원심분리 장치의 컬럼에 넣고 5,000×g에서 30분 동안 원심분리하여 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 농축한 다음 4℃에 보관하였다. GadB의 농도는 브래드퍼드(Bradford) 방법을 이용하여 측정하였다.
비교예 1 : 글루탐산탈탄산효소 B의 N-말단으로부터 1번 위치에서 14번 위치 사이 아미노산 잔기가 삭제된 글루탐산탈탄산효소 B(GadB △1-14)제조, 과발현 및 정제
상기 실시예 1의 gadB 유전자에 특이적인 프라이머인 5′-GGCCATGGGTTCACGTTTTGGTTGCG-3′(서열번호 46) 및 5′-GGAAGCTTACCCGTTAAACGTTATCAGGT-3′(서열번호 47)을 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 통해 N-말단으로부터 1 내지 14번째 잔기를 제거시킨 gadB 유전자(GadB △1-14)를 제조하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법으로 14개의 잔기가 삭제된 GadB △1-14를 과발현 및 정제하였다.
실험예 1 : 글루탐산탈탄산효소 B의 최적 pH 및 효소활성 측정
상기 비교예 1에서 정제된 효소 GadB △1-14 및 정상 GadB(GadB-WT)을 pH 4.6 및 8.0 완충용액에 희석한 후 20mM L-글루타민 및 1mM 피리독산-5′-포스테이트(Pyridoxal-5′-phosphate, PLP)를 첨가하여 30 내지 70℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 효소활성을 측정하였다.
또한, 상기 정상 GadB(Gad-WT)을 pH 4.6 완충용액에 희석한 후 20mM L-글루타민, 1mM 피리독산-5′-포스테이트(Pyridoxal-5′-phosphate, PLP) 및 100mM 염화나트륨(Sodium chloride, NaCl)을 첨가하여 30 내지 70℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 효소활성을 측정하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
실험결과, 도 2에서 보는바와 같이 정상 GadB(GadB-WT)의 경우 37℃, pH 4.6에서 최적의 활성을 보였으나, GadB △1-14는 pH 4.6과 pH 8.0에서 비슷한 효소활성을 보였다. 또한 도 3에서 보는바와 같이, 100mM NaCl이 첨가된 GadB-WT이 첨가되지 않은 GadB-WT 보다 효소활성이 더 좋은 것으로 확인되었다.
실험예 2 : 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 열안정성 측정
상기 실시예 2에서 정제된 효소 글루탐산탈탄산효소 B 변이체들을 1mM 피리독산-5′-포스테이트(Pyridoxal-5′-phosphate, PLP) 및 100mM 염화나트륨(Sodium chloride)이 포함된 pH 4.6 완충용액에 희석한 후 L-글루타민을 첨가하여 30 내지 70℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 효소활성도가 절반으로 떨어지는 온도를 측정하였다. 그 다음 4℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 효소 불활성화 시켰다. 그 다음 잔여 GadB의 변이체들을 37℃에서 활성화 시킨 후 60℃에서 0 내지 60분 동안 열처리를 하고, 4℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 불활성화 시켜 열안정성을 측정하였다. 대조군으로 정상 GadB(GadB-WT)를 사용하였다. 그 결과를 도 4, 도 5, 도 6 및 표 2에 나타내었다.
| 변형잔기 수 | 변형된 N-말단 부위 | △T50 10(℃) |
| 2개 | 대조군(GadB-WT) | 0.0 |
| Glu5Asp/Val6Ile | +4.0 | |
| Glu5Asp/Val6Leu | +2.7 | |
| Gln5Glu/Val6Ile | +1.7 | |
| Gln5Glu/Val6Leu | +1.2 | |
| Thr7Asp/Val6Ile | +4.5 | |
| Thr7Asp/Val6Leu | +3.2 | |
| Thr7Glu/Val6Ile | +4.0 | |
| Thr7Glu/Val6Leu | +3.5 | |
| 3개 | Glu5Asp/Val6Ile/Thr7Asp | +7.0 |
| Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Asp | +7.0 | |
| Glu5Asp/Val6Leu/Thr7Asp | +1.8 | |
| Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Asp | +2.1 | |
| Glu5Asp/Val6Ile/Thr7Glu | +7.7 | |
| Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Glu | +4.1 | |
| Glu5Asp/Val6Leu/Thr7Glu | +4.1 | |
| Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Asp | +3.5 |
실험결과, 도 4, 도 5, 도 6 및 표 2에서 보는 바와 같이, 2개 이상의 아미노산 잔기가 치환된 GadB 변이체들만 열안정성을 가지며, 구체적으로 2개의 잔기를 변형시킨 GadB 변이체들은 대조군(GadB-WT)보다 1.2 내지 4.5℃ 높은 온도에서 50%의 잔여 활성을 유지하였고, 3개의 잔기를 변형시킨 GadB 변이체들은 1.8 내지 7.7℃ 높은 온도에서 50%의 잔여 활성을 유지하는 것으로 확인되어 높은 열안정성을 가진다. 구체적으로, 3개의 잔기(Glu5Asp/Val6Ile/Thr7Glu, GadB-TM)를 변형시킨 GadB 변이체는 대조군보다 7.7℃ 높은 온도에서 50%의 잔여 활성을 가지며, 2개 및 3개의 잔기를 변형시킨 GadB 변이체들 중 이소루이신(Ile) 변형체(1.7 내지 4.5℃ 및 4.1 내지 7.7℃)가 루신(Leu) 변형체(1.2 내지 3.5℃ 및 1.8 내지 4.1℃)보다 높은 열안정성을 가지는 것으로 확인되었다.
실험예
3 :
열안정성이
가장 높은
GadB
의
변이체(GadB-TM)의
반응속도론 및
열안정성
측정
3-1. 열안정성이 가장 높은 GadB의 변이체(GadB-TM)의 반응속도론 측정
상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 3개의 잔기를 변형시킨 GadB 변이체 중 가장 좋은 열안정성을 가지는 GadB 변이체(Glu5Asp/Val6Ile/Thr7Glu, GadB-TM) 및 GadB △1-14를 1mM 피리독산-5′-포스테이트(Pyridoxal-5′-phosphate, PLP) 및 100mM 염화나트륨(Sodium chloride)이 포함된 pH 4.6 완충용액에 희석한 후 L-글루타민을 다양한 농도로 혼합하여 반응속도론을 확인하였다. 그 다음 실험식 1을 이용하여 촉매효율을 결정하였다. 대조군으로 정상 GadB(GadB-WT)를 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
[실험식 1]
촉매효율(V)= 반응 회전수(Kcat) / 미카엘리스 상수(Km)
| 효소(pH 4.6) | 반응 회전수(Kcat,s-1) | 미카엘리스 상수(Km, mM) | 촉매효율(V, mM-1s-1) |
| 대조군 (GadB-WT) |
59.26 | 23.31 | 2.54 |
| 비교예 1 (GadB △1-14) |
73.35 | 25.09 | 2.92 |
| 실시예 2 (GadB-TM) |
75.41 | 26.02 | 2.89 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, GadB-TM의 촉매효율은 GadB-WT 및 GadB △1-14와 비교하여 GadB △1-14와 비슷한 촉매효율을 보임을 확인하였다.
3-2. 열안정성이 가장 높은 GadB의 변이체(GadB-TM)의 열안정성 측정
상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 3개의 잔기를 변형시킨 GadB 변이체 중 가장 좋은 열안정성을 가지는 GadB 변이체(Glu5Asp/Val6Ile/Thr7Glu, GadB-TM) 및 GadB △1-14를 1mM 피리독산-5′-포스테이트(Pyridoxal-5′-phosphate, PLP) 및 100mM 염화나트륨(Sodium chloride)이 포함된 pH 4.6 완충용액에 희석한 후 20mM L-글루타민을 첨가하여 30 내지 70℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 효소활성도가 절반으로 떨어지는 온도를 측정하였다. 그 다음 4℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 효소 불활성화 시켰다. 그 다음 잔여 GadB-TM 및 GadB △1-14를 37℃에서 활성화 시킨 후 60℃에서 0 내지 60분 동안 열처리를 하고, 4℃의 온도에서 10분 동안 반응시켜 불활성화 시켜 열안정성을 측정하였다. 대조군으로 정상 GadB(GadB-WT)을 사용하였다. 그 결과를 도 7 및 표 4에 나타내었다.
| 효소(pH 4.6) | 50% 활성 온도(T50 10,℃) | 용해온도(Tm) | 불활성 값(Kd) |
| 대조군(GadB-WT) | 58.5 | 42.5 | 9.40ㅧ10-3 |
| 비교예 1(GadB △1-14) | 47.0 | 40.4 | not determined |
| 실시예 2(GadB-TM) | 66.2 | 50.4 | 3.78ㅧ10-5 |
실험결과, 도 7 및 표 4에서 보는 바와 같이, GadB-TM의 불활성 값(Kd)은 대조군(GadB-WT)보다 낮아 효소활성이 더 높은 것을 확인하였고, 용해온도 역시 대조군 및 GadB △1-14보다 7.9 및 10 ℃ 더 높은 것으로 확인되었다. 또한, 실시예 2에서 제조된 글루탐산탈탄산효소 B 변이체(GadB-TM)는 65℃에서 70%의 상대적 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 4 : 열안정성이 가장 높은 글루타민탈탄산효소 B 변이체(GadB-TM)의 분자동역학 모의실험(Molecular dynamics simulation)
상기 실시예 2에서 제조된 열안정성이 가장 높은 글루타민탈탄산효소 B 변이체(Gln5Asp/Val6Ile/Thr7Glu, GadB-TM)의 분자동역학 모의실험을 위해 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio version 3.1; Accelrys, USA)를 사용하여 변이체 구조를 정렬하였다. 대조군으로 정상 GadB(GadB-WT)을 사용하였으며, 대조군의 구조는 단백질 데이터 은행(Protein data bank, RCSB)에서 얻어 사용하였다. 구체적으로, 상기 정렬된 GadB-WT과 GadB-TM의 구조를 역장(Forcefield, CHARMM(Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics)) 파라미터를 이용하여 2000 피코초(ps)의 시간 동안 잔기와 잔기 사이의 평균거리인 평균 제곱근 편차(root mean square deviation, RMSD)를 계산하였다. 상기 모의실험 계산과정 중에 온도는 300K 및 600K로 일정하게 유지하였다. 전체 시스템이 최저 포텐션 에너지를 나타내고 평형이 유지되면 분석된 궤적(Trajectory)에 의해 매 20 피코초(ps)마다 구조 및 에너지가 저장하였다. 그 결과를 표 5 및 표 6에 나타내었다.
| 효소의 평균 RMSD(Å) | N-말단(1-14) 잔기의 평균 RMSD(Å) |
|||
| 300K | 600K | 300K | 600K | |
| 대조군(GadB-WT) | 0.953 | 1.990 | 1.278 | 3.036 |
| 실시예 2(GadB-TM) | 0.994 | 1.857 | 1.143 | 2.266 |
| 삼중나선 다발 표면의 주요 잔여 잔기 평균 RMSD 변화[Å] | |||||
| 대조군(GadB-WT) | 실시예 2(GadB-TM) | ||||
| 잔기 | 300K | 600K | 잔기 | 300K | 600K |
| Lys3 | 2.343 | 6.074 | Lys3 | 1.488 | 2.621 |
| Lys4 | 0.993 | 3.384 | Lys4 | 1.226 | 2.590 |
| Gln5 | 0.665 | 2.817 | Gln5Asp | 0.607 | 2.072 |
| Val6 | 1.202 | 3.246 | Val6Ile | 1.007 | 3.065 |
| Thr7 | 0.906 | 2.321 | Thr7Glu | 1.048 | 2.089 |
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 300K일 때 대조군(GadB-WT) 및 실시예 2(GadB-TM)의 평균 RMSD 변화는 0.953Å 및 0.0994Å로 유사하나, 600K일 때 대조군(GadB-WT) 및 실시예 2(GadB-TM)의 평균 RMSD 변화는 1.990Å 및 1.857Å로 GadB-WT의 RMSD 변화가 더 높은 것으로 나타났다. 특히, 600K에서 실시예 2(GadB-TM)의 N-말단 잔기(1-14)는 대조군(GadB-WT)에 비해 위치의 변동이 적게 일어나는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 표 6에서 보는바와 같이, pH 4.6의 환경에서 대조군(GadB-WT) 및 실시예 2(GadB-TM)의 삼중-나선 다발 표면에 존재하는 잔여잔기의 평균 RMSD를 살펴본 결과, 600K 일 때 실시예 2(GadB-TM)은 대조군(GadB-WT)에 비하여 잔기의 평균 거리의 변화가 적은 것으로 확인되었다.
<110> Chosun University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Thermostabilization of glutamate decarbosylase B mutant
<130> PA-13-0046
<160> 47
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp Forward primer
<400> 2
caaaaaagat gtgacggacc tgcgc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp Reverse primer
<400> 3
ccgtcacatc ttttttgtcc atatg 25
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu Forward primer
<400> 4
caaaaaagaa gtgacggacc tgcgcc 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu Reverse primer
<400> 5
ccgtcacttc ttttttgtcc atatg 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val6Ile Forward primer
<400> 6
caaaaaacaa atcacggacc tgcgctcg 28
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val6Ile Reverse primer
<400> 7
gcaggtccgt gatttgtttt ttgtccatat g 31
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val6Leu Forward primer
<400> 8
caaaaaacaa ctgacggacc tgcgctcg 28
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val6Leu Reverse primer
<400> 9
gcaggtccgt cagttgtttt ttgtccatat g 31
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Asp Forward primer
<400> 10
caagtggacg acctgcgctc ggaac 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Asp Reverse primer
<400> 11
caggtcgtcc acttgttttt tgtcc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Glu Forward primer
<400> 12
caagtggagg acctgcgctc ggaac 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Glu Reverse primer
<400> 13
caggtcctcc acttgttttt tgtcc 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Ile Forward primer
<400> 14
caaaaaagac atcacggacc tgcgc 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Ile Reverse primer
<400> 15
ccgtgatgtc ttttttgtcc atatg 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Leu Forward primer
<400> 16
caaaaaagac ctgacggacc tgcgc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Leu Reverse primer
<400> 17
ccgtcaggtc ttttttgtcc atatg 25
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Ile Forward primer
<400> 18
caaaaaagaa atcacggacc tgcgctcgga actg 34
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Ile Reverse primer
<400> 19
ccgtgatttc ttttttgtcc atatgtatat ctcc 34
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Leu Forward primer
<400> 20
caaaaaagaa ctgacggacc tgcgctcgga actg 34
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Leu Reverse primer
<400> 21
ccgtcagttc ttttttgtcc atatgtatat ctcc 34
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Asp/Val6Ile Forward primer
<400> 22
caaatcgacg acctgcgctc ggaactgctg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Asp/Val6Ile Reverse primer
<400> 23
caggtcgtcg atttgttttt tgtccatatg 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Asp/Val6Leu Forward primer
<400> 24
caactggacg acctgcgctc ggaactgctg 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Asp/Val6Leu Reverse primer
<400> 25
caggtcgtcc agttgttttt tgtccatatg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Glu/Val6Ile Forward primer
<400> 26
caaatcgagg acctgcgctc ggaactgctg 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Glu/Val6Ile Reverse primer
<400> 27
caggtcctcg atttgttttt tgtccatatg 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Glu/Val6Leu Forward primer
<400> 28
caactggagg acctgcgctc ggaactgctg 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr7Glu/Val6Leu Reverse primer
<400> 29
caggtcctcc agttgttttt tgtccatatg 30
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Ile/Thr7Asp Forward primer
<400> 30
caaaaaagac atcgacgacc tgcgc 25
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Ile/Thr7Asp Reverse primer
<400> 31
gtcgatgtct tttttgtcca tatg 24
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Asp Forward primer
<400> 32
caaaaaagaa atcgacgacc tgcgc 25
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Asp Reverse primer
<400> 33
gtcgatttct tttttgtcca tatg 24
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Leu/Thr7Asp Forward primer
<400> 34
caaaaaagac ctggacgacc tgcgc 25
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Leu/Thr7Asp Reverse primer
<400> 35
gtccaggtct tttttgtcca tatg 24
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Asp Forward primer
<400> 36
caaaaaagaa ctggacgacc tgcgc 25
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Asp Reverse primer
<400> 37
gtccagttct tttttgtcca tatg 24
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Ile/Thr7Glu Forward primer
<400> 38
caaaaaagac atcgaggacc tgcgc 25
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Ile/Thr7Glu Reverse primer
<400> 39
ctcgatgtct tttttgtcca tatg 24
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Glu Forward primer
<400> 40
caaaaaagaa atcgaggacc tgcgc 25
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Ile/Thr7Glu Reverse primer
<400> 41
ctcgatttct tttttgtcca tatg 24
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Leu/Thr7Glu Forward primer
<400> 42
caaaaaagac ctggaggacc tgggc 25
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Asp/Val6Leu/Thr7Glu Reverse primer
<400> 43
ctccaggtct tttttgtcca tatg 24
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Glu Forward primer
<400> 44
caaaaaagaa ctggaggacc tgcgc 25
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln5Glu/Val6Leu/Thr7Glu Reverse primer
<400> 45
ctccagttct tttttgtcca tatg 24
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GadB 1-14 mutant Forward primer
<400> 46
ggccatgggt tcacgttttg gttgcg 26
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GadB 1-14 mutant Reverse primer
<400> 47
ggaagcttac ccgttaaacg ttatcaggt 29
Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 글루탐산탈탄산효소 B의 삼중나선다발구조를 구성하는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 (1) Gln5Asp 및 Val6Leu; (2) Gln5Asp 및 Val6Ile; (3) Gln5Glu 및 Val6Ile; (4) Gln5Glu 및 Val6Leu; (5) Thr7Asp 및 Val6Ile; (6) Thr7Asp 및 Val6Leu; (7) Thr7Glu 및 Val6Ile; (8) Thr7Glu 및 Val6Leu; (9) Gln5Asp, Val6Ile 및 Thr7Asp; (10) Gln5Glu, Val6Ile 및 Thr7Asp; (11) Gln5Asp, Val6Leu 및 Thr7Asp; (12) Gln5Glu, Val6Leu 및 Thr7Asp; (13) Gln5Asp, Val6Ile 및 Thr7Glu; (14) Gln5Glu, Val6Ile 및 Thr7Glu; (15) Gln5Asp, Val6Leu 및 Thr7Glu; 및 (16) Gln5Glu, Val6Leu 및 Thr7Glu;으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 변이를 가지는 것을 특징으로 하는 열안정성 글루탐산탈탄산효소 B 변이체.
- 제3항에 있어서, 상기 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 pH 4.2 내지 4.8의 범위에서 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 열안정성 글루탐산탈탄산효소 B 변이체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 글루탐산탈탄산효소 B의 삼중나선다발구조를 구성하는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 (1) Gln5Asp 및 Val6Leu; (2) Gln5Asp 및 Val6Ile; (3) Gln5Glu 및 Val6Ile; (4) Gln5Glu 및 Val6Leu; (5) Thr7Asp 및 Val6Ile; (6) Thr7Asp 및 Val6Leu; (7) Thr7Glu 및 Val6Ile; (8) Thr7Glu 및 Val6Leu; (9) Gln5Asp, Val6Ile 및 Thr7Asp; (10) Gln5Glu, Val6Ile 및 Thr7Asp; (11) Gln5Asp, Val6Leu 및 Thr7Asp; (12) Gln5Glu, Val6Leu 및 Thr7Asp; (13) Gln5Asp, Val6Ile 및 Thr7Glu; (14) Gln5Glu, Val6Ile 및 Thr7Glu; (15) Gln5Asp, Val6Leu 및 Thr7Glu; 및 (16) Gln5Glu, Val6Leu 및 Thr7Glu;으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 변이를 가지는 글루탐산탈탄산효소 B 변이체를 코딩하는 유전자를 발현벡터에 재조합하고, 이를 숙주세포에 형질전환하여 발현시켜 이를 정제하고 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 열안정성 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 글루탐산탈탄산효소 B 변이체는 pH 4.2 내지 4.8의 범위에서 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 열안정성 글루탐산탈탄산효소 B 변이체의 제조방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130060752A KR101496005B1 (ko) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | 열안정성 글루탐산탈탄산효소 b 변이체 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130060752A KR101496005B1 (ko) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | 열안정성 글루탐산탈탄산효소 b 변이체 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140140227A KR20140140227A (ko) | 2014-12-09 |
| KR101496005B1 true KR101496005B1 (ko) | 2015-03-04 |
Family
ID=52458139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130060752A KR101496005B1 (ko) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | 열안정성 글루탐산탈탄산효소 b 변이체 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101496005B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100851296B1 (ko) * | 2005-07-29 | 2008-08-08 | (주)바이오벤 | 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용한 생물전환공정에의한 ｇａｂａ의 제조방법 |
-
2013
- 2013-05-29 KR KR1020130060752A patent/KR101496005B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100851296B1 (ko) * | 2005-07-29 | 2008-08-08 | (주)바이오벤 | 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용한 생물전환공정에의한 ｇａｂａ의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140140227A (ko) | 2014-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2990483T3 (en) | Psychosis epimerase mutant and method of producing psychosis using it | |
| KR102055874B1 (ko) | 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 | |
| CN111511389A (zh) | 转谷氨酰胺酶变体 | |
| US20230295602A1 (en) | Method of improving acid decarboxylase activity in vitro under alkaline ph | |
| WO2018116266A1 (en) | D-psicose 3-epimerase mutant and uses thereof | |
| CN110546255A (zh) | 对赖氨酸脱羧酶酶类的修饰 | |
| US9926542B2 (en) | Practical method for enzymatically synthesizing cyclic di-GMP | |
| CN112867797B (zh) | 果糖-4-差向异构酶以及使用其制备塔格糖的方法 | |
| CN113462678B (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶突变体 | |
| KR102448351B1 (ko) | 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법 | |
| EP2374873A1 (en) | Modified aspartate kinase from corynebacterium and its application for amino acid production | |
| KR101496005B1 (ko) | 열안정성 글루탐산탈탄산효소 b 변이체 | |
| US20140296571A1 (en) | Microorganisms And Methods For Producing Propionic Acid | |
| WO2013052717A2 (en) | Microorganisms and methods for producing acrylate and other products from homoserine | |
| EP2559758A1 (en) | Modified glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from corynebacterium glutamicum and uses thereof | |
| Wang et al. | Cloning, expression and characterization of d-aminoacylase from Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans ATCC 15173 | |
| JP7214952B2 (ja) | オルニチン脱炭酸酵素変異型及びそれを用いたプトレシンの生産方法 | |
| KR101778878B1 (ko) | 박테로이데스 속 미생물 유래의 ｇａｂａ 생성 고활성 글루탐산탈탄산효소 및 이의 용도 | |
| EP3489361B1 (en) | Microorganism having activity of acyltransferase and use thereof | |
| US8137943B2 (en) | Heat-resistant DNA ligase with high reactivity | |
| KR101378690B1 (ko) | 내열성 디형젖산탈수소효소를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물 및 그를 사용한 디형젖산 제조방법 | |
| KR101716414B1 (ko) | 클로스트리디움 셀룰로보란스 유래 엔도글루카나제 z의 열 안정성 변이체 | |
| US11408018B2 (en) | Fructose-C4-epimerase and preparation method for producing tagatose using the same | |
| CN112867793B (zh) | 新型果糖-c4-差向异构酶及使用其制备塔格糖的方法 | |
| EP3645713A1 (en) | Penicillin-g acylases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180202 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190211 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200203 Year of fee payment: 6 |