KR101491788B1 - 토마토황화잎말림바이러스 진단용 프라이머 세트및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

토마토황화잎말림바이러스 진단용 프라이머 세트및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

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Abstract

토마토에 발생하는 TYLCV를 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 1종 세트와 PCR의 정상 작동 유무를 판단할 수 있는 토마토 베타튜불린 (β-tubulin) 유전자 프라이머 1종 세트를 개발하여 토마토의 핵산 분리 없이 토마토 즙액을 가지고 바로 TYLCV의 진단을 정확하게 가능하도록 하고자 서열목록 1 내지 2의 PCR 프라이머 세트 및 서열번호 3 내지 4의 PCR 프라이머 세트로 구성된 토마토황화잎말림 바이러스 진단을 위한 단일 튜브-멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 제공한다.

Description

토마토황화잎말림바이러스 진단용 프라이머 세트및 이를 이용한 진단 방법{Pimer set for Tomato yellow leaf curl virus}
최근 토마토 농가에서 심각한 피해를 일으키고 있는 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus: TYLCV) 병의 조기 진단을 통하여 피해 확산을 방지하고자 한다.
최근 수년 동안 국내 여러 지역의 토마토 시설하우스에서 제미나이비러디과(Geminiviridae family), 베고모바이러스 속(Begomovirus genus)으로 분류되고 있는 바이러스의 발병이 급속도로 확산되어 국내 토마토 농가에 심각한 경제적 손실을 초래하고 있다. 그중 하나인 Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV, 토마토황화잎말림바이러스)는 단일가닥 DNA로 구성된 단분절지놈(monopartite genome)을 가진 바이러스로서 자연에서는 담배가루이(Bemisia tabaci)에 의해 매개되고 전세계적으로 광범위하게 분포되어 있다. TYLCV는 단기간 내에 돌연변이가 발생하여 국제적으로도 수많은 변이종이 보고되었다. 국내에서도 2008년도부터 전국적으로 확산되어 토마토 시설농가에 큰 피해를 주고 있으며, 유전적으로 다양한 변이종(quasi isolate)이 빈번하게 보고되고 있다 [Kim et al., 2011, Virus Genes 42:117-127].
토마토에 발생한 토마토황화잎말림바이러스를 간단하게 진단하기 위하여 PCR 방법을 이용한 여러가지 프라이머가 개발되어 왔다. 그러나 종래의 PCR을 이용한 진단 방법은 토마토 추출물의 핵산 분리가 필요하거나, 토마토 스쿼시를 이용하여 핵산 분리 없이 바로 PCR을 진행하는 경우 PCR 결과물의 오류가 발생되어 진단에 어려움이 있었다.
토마토에 발생하는 TYLCV를 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 1종 세트와 PCR의 정상 작동 유무를 판단할 수 있는 토마토 베타튜불린 (β-tubulin) 유전자 프라이머 1종 세트를 개발하여 토마토의 핵산 분리 없이 토마토 즙액을 가지고 바로 TYLCV의 진단을 정확하게 가능하도록 하고자 한다.
상기 과제를 해결하고자 본 발명은 서열목록 1 내지 2의 PCR 프라이머 세트 및 서열번호 3 내지 4의 PCR 프라이머 세트로 구성된 토마토황화잎말림 바이러스 진단을 위한 단일 튜브-멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 한 개의 튜브에 토마토 잎을 마쇄한 즙액과 상기 따른 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 첨가하여 PCR을 진행하는 토마토황화잎말림 바이러스 진단 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 TYLCV 진단 프라이머 2종 세트를 이용하면 TYLCV를 신속, 정확하게 진단하여 효율적인 TYLCV 진단에 적용할 수 있다.
도 1은 개발된 프라이머 2종 세트를 이용하여 TYCLV 진단 PCR 결과이다.
(M: 100bp DNA ladder, Ty: TYLCV DNA control, H: healthy control)
도 2는 즙액 및 순화된 토마토 genomic DNA의 순차적 희석에 의한 토마토 TYLCV 진단용 프라이머 2종 세트들의 PCR 감도 결과이다.
(M: 100bp marker, 주형 성분은 좌측에, 희석농도는 각 gel 사진 상단부에 표시하였음)
도 3은 토마토 TYLCV 진단용 프라이머를 이용한 TYLCV 검정 결과이다.
(M: 100bp DNA ladder, Ty: TYLCV DNA control, H: healthy control, 1 to 10: tomato samples from different farms)
토마토에 문제가 되는 TYLCV를 특이적으로 PCR법으로 진단하기 위하여 Genbank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 기탁된 전체 TYLCV 분리주들의 유전체 염기서열들을 수집하여 특이 프라이머 1종 세트를 고안 및 제작하였으며, 또한 PCR 작동 유무를 동시에 확인하기 위하여 내재대조유전자 (internal control gene) 으로서 토마토 베타튜불린 (β-tubulin)을 Genbank database에서 염기서열 정보를 획득하여 1종의 특이적 프라이머 세트를 고안 및 제작하였다.
[표 1] TYLCV 및 토마토 베타튜불린 특이 프라이머 세트 2종의 서열번호, 염기서열 정보 및 예상 증폭 PCR산물 크기
서열번호 프라이머 이름 프라이머 염기서열 (5´→ 3´방향) PCR 산물 크기
(base pair)
1 TyCWF789 tcgataatgagcccagtacc 754
2 TyCWR1543 aagcgtgtagacctagactg
3 To-TUBF857 ctcagacctgaggaaattgg 468
4 To-TUBR1325 cattccttcacctgtgtacc
별도의 DNA 추출 과정 없이, 토마토 잎 10mg에 1x TE 완충용액 [10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA (pH 8.0)]을 100μL를 첨가하여 마쇄한 즙액을 이용하여, 한 개의 tube에 제작된 프라이머 2개 세트를 동시에 각 반응액에 첨가하여 PCR로 진단을 실시하였으며, PCR 반응 조성 및 반응 조건은 아래의 [표 2]와 같다.
TYLCV 진단용 PCR 반응 조성물 및 PCR 조건
PCR 조성물 최종농도 PCR 조건 반복횟수
Template DNA 40ng (즙액은 2μL첨가) 95℃, 3분 1
10X PCR 반응완충액 1X 95℃, 30초

35
dNTPs 200μM 60℃, 30초
Forward & Reverse primers
(total 4 primers)		 0.4μM
72℃, 60초
Taq DNA polymerase 0.5unit
멸균 3차 증류수 20μL 되게 증류수 첨가 72℃, 5분 1
PCR 반응 결과, TYLCV가 감염된 이병 식물체에서는 754bp 크기의 TYLCV 특이적 DNA 절편 및 468bp 크기의 토마토 베타튜불린 DNA 절편이 증폭되었다. 그러나 건전식물체에서는 TYLCV 특이적 DNA절편은 검출되지 않았으며 오로지 468bp 크기의 토마토 베타튜불린 DNA 절편이 agrarose gel에서 확인되었다[도 1].
대조구로서 상업용 추출 DNA키트 (Qiagen, Germany)를 이용하여 위의 즙액 추출에서 사용된 동일한 토마토 잎에서 genomic DNA를 추출하여, 위에서 기술한 동일한 조건 및 방법으로 증폭한 결과, 상기 기술한 즙액을 이용하였을 경우와 동일한 진단 결과가 산출되었다[도 1]. 그러므로 즙액만으로도 앞서 기술한 프라이머 2종 세트들을 이용하면 신속하고 간편하게 TYLCV 감염 유무 및 PCR 정상 작동 유무를 동시에 판정할 수 있음을 확인하였다.
개발된 프라이머 세트들을 이용하여 PCR 진단을 할 경우 검출 감도를 측정하기 위하여, 토마토 잎 10mg에 1x TE 완충용액 [10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA (pH 8.0)]을 100μL를 첨가하여 마쇄한 즙액을 원액으로 하여 순차적으로 즙액을 희석하여 프라이머 2종 세트를 첨가하여 PCR로 진단을 실시하였다.
대조구로서 즙액 마쇄 후 상업용 추출 DNA키트 (Qiagen, Germany)를 이용하여 위의 즙액 추출에서 사용된 동일한 토마토 잎에서 genomic DNA를 추출하여 순차적으로 희석하여, 앞서 기술한 동일한 조건 및 방법으로 PCR 증폭한 결과, 10-15g 농도의 DNA가 희석된 시료에서도 TYLCV 및 토마토 베타튜불린 DNA 절편들을 검출이 가능하였다[도 2].
본 TYLCV 특이적 프라이머 세트들의 효율성을 측정하기 위하여, 부여 및 논산지역의 토마토 재배 농가들로부터 TYLCV 의심 증상을 보이는 토마토 시료들을 채집하여, 잎 10mg에 1x TE 완충용액 [10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA (pH 8.0)]을 100μL를 첨가하여 마쇄한 즙액에서 2μL를 첨가하여, 한 개의 tube에 제작된 프라이머 2종 세트를 동시에 각 반응액에 첨가 후 PCR로 진단을 실시하였다.
토마토 TYLCV 진단용 프라이머 2종 세트들을 이용하여 재배중인 10개의 시료를 검정한 결과 모든 시료에 TYLCV가 감염된 것을 확인할 수 있으며, 대조구로 사용된 건전토마토에서는 TYLCV가 검출이 안 되었다[도 3].
<110> Korea <120> Pimer set for Tomato yellow leaf curl virus <130> PAA12-0172-KR0 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TyCWF789 <400> 1 tcgataatga gcccagtacc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TyCWR1543 <400> 2 aagcgtgtag acctagactg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> To-TUBF857 <400> 3 ctcagacctg aggaaattgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> To-TUBR1325 <400> 4 cattccttca cctgtgtacc 20

Claims (2)

  1. 서열목록 1 내지 2의 PCR 프라이머 세트 및 서열번호 3 내지 4의 PCR 프라이머 세트로 구성된 토마토황화잎말림 바이러스 진단을 위한 단일 튜브-멀티플렉스 PCR 프라이머 세트.
  2. 한 개의 튜브에 토마토 잎을 마쇄한 즙액과 상기 청구항 1에 따른 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 첨가하여 PCR을 진행하는 토마토황화잎말림 바이러스 진단 방법.
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