KR101491016B1 - 배반포 및 생식기관 암 세포 특이적인 단백질 운반 방법 및 그 조성물 - Google Patents

배반포 및 생식기관 암 세포 특이적인 단백질 운반 방법 및 그 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배반포 및 생식기관 암 세포 특이적인 단백질 운반 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.

Description

배반포 및 생식기관 암 세포 특이적인 단백질 운반 방법 및 그 조성물{A Method for protein delivery in mouse blastocysts and reproductive cancers and composition thereof}
본 발명은 배반포 및 생식기관 암 세포 특이적인 단백질 운반 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
세포투과 펩타이드(Cell-permeable peptides, 이하 'CPPs'라 함)은 세포 속으로 거대분자의 운반을 매개하기 위하여 널리 사용된다. CPPs는 일반적으로 몇 개의 염기성 아미노산을 포함하고 이 성질은 세포의 지질 이중막을 통과하는데 도움이되는 것으로 간주된다(van den Berg A & Dowdy SF 2011 Curr . Opin . Biotechnol . 22 888-893). PTD(Protein Transduction Domain)는 HIV의 TAT 단백질로부터 유래된 짧은 펩타이드로 보고된 첫번째 CPP이다. PTD 태그된 단백질들은 인 비트로 및 인 비보에서 용이하게 세포로 들어간다(Schwarze SR, Ho A, Vocero-Akbani A & Dowdy SF 1999 Science 285 1569-1572).CPP-매개된 단백질 전달은 줄기 세포를 포함한 여러 세포 시스템에 적용되어 왔다(Peitz M, Jager R, Patsch C, Jager A, Egert A, Schorle H & Edenhofer F 2007 Genesis . 45 508-517). CPPs를 사용한 단백질 발현의 조절의 주된 잇점은 그것이 타겟 세포의 유전자 프로파일을 변화시키지 않는 것이다. 이것은 바이러스 벡터에 의하여 야기된 변경된 유전자 메이크업이 의도하지 않은 발생학적 장애를 야기할 수 있기 때문에 생식세포나 배아에서 특히 중요하다. 포유류 난자와 배아와 관련하여 CPP의 사용은 많이 연구되지 않았다.
[선행 특허문헌]
대한민국특허공개번호 제10-2007-0083218
대한민국특허공개번호 제10-2012-0026408(20120319)
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 특정 세포로의 효과적인 운반방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 특정 세포로의 효과적인 운반용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 배반포 세포 특이적인 단백질 운반용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 성장인자, 형광단백질, 마커 단백질 및 사이토카인 등 다양한 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 배반포 세포는 마우스 배반포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 생식기관 암 세포 특이적인 단백질 운반용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 단백질을 배반포 세포에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 배반포 세포 특이적인 단백질 운반 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 단백질을 생식기관 암 세포에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 생식기관 암 세포 특이적인 단백질 운반 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서 본 발명자들은 LDP12가 단백질 운반을 위한 운반 태그로 사용될 수 있는지 및 이 시스템이 착상전 마우스 배아 및 난모세포에 적용될 수 있는지를 조사하였다. 본 발명자들은 또한 자가포식(autophagic) 활성화의 널리 사용된 마커인 LDP12-EGFP-LC3를 사용하여 기능적 적용 실험을 수행하였다(Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, Kirisako T, Noda T, Kominami E, Ohsumi Y & Yoshimori T 2000 EMBO J. 19 5720-5728). 본 발명자들은 본 특허에서 LDP12-태그된 융합단백질이 생식기관 암(reproductive cancers) 및 마우스 배반포로 단백질들을 운반하는 효과적이고 용이한 선택이라는 것을 보고한다.
본 발명자들은 N-말단 태그로 LDP12를 가지는 LDP12-EGFP 융합단백질을 제조하였다. 이 융합 단백질은 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포에 용이하게 삽입되었다. LDP12-EGFP의 삽입은 amiloride에 의하여 부분적으로 억제된 반면, cytochalasin D 또는 methyl-β-cyclodextrin는 그 삽입을 약간 증가시켰다. LDP12-EGFP는 마우스 배반포에서 효과적인 전달을 보였으나 난모세포, 2세포기 또는 상실기 착상전 배아에서는 그러하지 않았다. EGFP-LC3의 LDP12-매개된 운반은 HeLa 세포와 마우스 배반포에서는 그것이 세포속으로 들어가서 특징적인 펑크테이트(punctate) 패턴을 내기 때문에 성공이었다.
EGFP-LC3의 지질화(Lipidation)는 또한 전달 후에 통상적으로 일어나고 그것은 전달된 단백질이 기능적인 특성들을 보유한다는 것을 시사한다. 종합적으로 본 발명자들은 LDP12-이용한 단백질 전달은 마우스 배반포 및 생식기관 암 세포에 적용될 수 있는 신속하고 편리한 방법이라는 것을 입증하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
HeLa 세포로 LDP12 - EGFP 융합 단백질의 효과적인 트랜스덕션
본 발명자들은 도 1A에 나타낸 것과 같이 융합 단백질 구축물을 제조하였다. LDP12 서열을 EGFP 코딩 서열의 N 말단에서 in frame 클로닝하였다. MPG는 고안된 CPP이고(Morris MC, Vidal P, Chaloin L, Heitz F & Divita G 1997 Nucleic Acids Res . 25 2730-2736), MPG-EGFP는 입증된 효율을 가지는 세포 투과 융합단백질이다(Kwon et al . 2009). 본 발명자들은 일부 실험에서 양성 대조군으로 MPG-EGFP 융합 단백질을 사용하였다. CPP 태그가 없는 EGFP 단백질을 음성 대조군으로 사용하였다. HeLa 세포를 1시간 동안 정제된 단백질로 처리하고 비특이적인 세포 표면 결합을 제거하기 위하여 acid 버퍼로 세척하였다(Kameyama S, Horie M, Kikuchi T, Omura T, Tadokoro A, Takeuchi T, Nakase I, Sugiura Y & Futaki S 2007 Biopolymers 88 98-107). 공초점 라이브 이미징에 의하여, LDP12-EGFP 및 MPG-EGFP 모두가 1 시간 이내에 내부로 들어간 것을 보이고 원형질에 작은 점 패턴을 나타내었다(도 1B). FM4-64는 엔도좀 소포를 적색으로 염색하는 라이브 세포 염료이다(Kwon et al . 2009).
LDP12-EGFP (녹색) 및 FM4-64 (적색)을 HeLa 세포에 함께 첨가할 경우, 소포의 서브셋이 오버랩핑 신호를 나타내었다(황색). 따라서 내재화된 LDP12-EGFP 융합 단백질들은 엔도좀 소포 구조에 부분적으로 위치하는 것 같다. 본 발명자들은 유세포분석법에 의하여 LDP12-EGFP의 세포 흡수 속도를 정량화하였다.
처리 1시간 이내, 약 25%의 HeLa 세포가 EGFP-포지티브였다. 그 속도는 4시간 까지 53%로 증가하였고, 그것은 LDP12-EGFP의 세포 흡수가 점차적으로 증가한다는 것을 시사한다. 이것은 1시간에 97% 세포 흡수를 보이는 MPG-EGFP와 대조적이었다(도 1D). 트랜스덕션의 독특한 시간 역학(temporal kinetics)은 이들 CPP-태그된 단백질들에 의하여 사용된 출입의 다른 기작을 시사한다.
LDP12 - EGFP 의 트랜스덕션에 대한 엔도사이토시스 저해제의 효과
엔도사이토시스 동안에 clathrin-매개된, caveolae-매개된 , 지질 rafts-매개된 엔도사이토시스, 및 대음세포작용(macropinocytosis)와 같은 여러 기작이 사용된다(Conner SD & Schmid SL 2003 Nature 422 37-44). 저해제의 어레이는 CPP에 의한 세포 흡수 동안에 어떠한 경로가 작동되는지를 묘사하는데 사용될 수 있다(Kwon et al . 2009).
나트륨 채널 블록커인 Amiloride는 대음세포작용((macropinocytosis))을 저해하다. Methyl-β-cyclodextrin (MβCD)은 원형질막으로부터 콜레스테롤을 제거하여 caveolae-매개된 엔도사이토시스의 저해제로 사용된다(Hao M, Mukherjee S, Sun Y & Maxfield FR 2004 J. Biol . Chem . 279 14171-14178). 액틴 디폴리머라이징 약제인 Cytochalasin D는 액틴 매개된 대음세포작용을 저해한다(West MA, Bretscher MS & Watts C 1989 J. Cell Biol . 109 2731-2739). 유세포분석은 amiloride는 부분적으로 LDP12-EGFP 흡수를 저해하는 반면에 cytochalasin D 및 MβCD 모두는 트랜스덕션 속도를 증가한다는 것을 보였다(도 2A).
cytochalasin D 또는 MβCD 처리가 LDP12-EGFP의 트랜스덕션을 유의적으로 증가시킨다는 본 발명의 사실은 어떠한 엔도사이토시스 경로의 저해가 LDP12-EGFP의 엔도사이토시스 속도를 다소 증가시킨다는 것을 시사한다. 각 저해제를 처리한 HeLa 세포를 도 2B에 나타내었다. 본 발명의 결과는 LDP12-EGFP의 내재화는 하나 이상의 엔도사이토시스 경로를 이용한다는 것을 시사한다.
마우스 배반포로 LDP12 - EGFP 의 효과적인 출입
다음 본 발명자들은 LDP12-driven 단백질 전달 시스템이 착상전 마우스 배아에 적용할 수 있는지를 테스트하였다.4일 배반포는 두 다른 세포 타입을 가진다: 대부분 embryo proper에 기여하는 내 세포괴(inner cell mass)와 배외 세포 계통(extraembryonic cell lineages)으로 기여하는 영양외배엽(Wang H & Dey SK 2006 Nat . Rev . Genet . 7 185-199). 배반포(Blastocysts)는 임신 4일째 마우스로부터 얻어서 100 μg/ml LDP12-EGFP로 KSOM-AA 배지에서 1시간 동안 배양하였다. 도 3A에 나타낸 것과 같이, GFP 신호의 라이브 이미징은 LDP12-EGFP이 내세포괴 및 영양외배엽 세포 모두 에서 내재화된다는 것을 나타낸다. 이것은 Z 시리즈 절편 이미지를 가지는 도 3B에서 더 명확하게 보인다. 30분 동안 Amiloride 처리는 배아 형태에 영향을 미치고 LDP12-EGFP 흡수를 저해하였다(도 3A). cytochalasin D로 처리한 배반포는 포배강(blastocoel) 위축을 보였지만 LDP12-EGFP의 흡수는 영향을 받지 않았다. 본 발명자들은 LDP12-EGFP가 마우스 난모세포 또는 초기 단계 배아에서 내재화되는지를 테스트하였다. 투명대(zona pellucida)의 존재 유무에 관련없이, 이 단백질은 난모세포 또는 2 세포기 배아에는 내재화되지 않았다(도 4).
LDP12 시스템의 기능적 적용:자가포식( autophagy )을 모니터하는 도구로서의 LDP12 - EGFP - LC3
LDP12 융합 단백질이 마우스 배반포에서 잘 작동하고 본 발명자들은 기능적으로 테스트할 수 있는 단백질 화물(cargo)을 가지고 LDP12 시스템의 적용을 더욱 조사하였다. LC3 (Atg8)는 자가포식 flux의 모니터링 마커로 널리 사용되는 유비퀴톤 유사 자가포식 단백질이다(Kabeya et al. 2000). LC3는 GFP-LC3 융합 단백질 형태로 널리 사용된다(Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, Yoshimori T & Ohsumi Y 2004 Mol.Biol.Cell 15 1101-1111;Mizushima N, Yoshimori T & Levine B 2010 Cell 140 313-326).
일반적으로 세포 배양 시스템에서 GFP-LC3의 융합 유전자를 가지는 플라즈미드는 자가포식 활성화 및 flux를 모니터하기 위하여 트랜스팩션한다(Kimura S, Noda T & Yoshimori T 2007 Autophagy . 3 452-460), 그러나 통상적인 트랜스팩션 방법은 착상전 배아에서 잘 작용하지 않는다. 따라서 본 발명자들은 LDP12-EGFP-LC3 융합 단백질을 제조하고 HeLa 세포 및 마우스 배반포에서 그것의 효과를 테스트하였다. 그 융합 단백질은 배양 1시간 이내에 HeLa 세포 및 배반포 모두에 들어가서 도 5A에 나타낸 것과 같이 시그내처 punctate 패턴을 나타내었다 .
또한 본 발명자들은 그 내재화된 LDP12-EGFP-LC3 융합 단백질들이 PE-부착을 수행하고 LC3-II 형태를 생성한다는 것을 웨스턴 블럿팅에 의하여 확인하였다. 따라서 두 세트의 더블릿(doublets)을 웨스턴 블럿 상에 나타낸다(도 5B 우측 패널, 두 괄호). 더 높은 세트는 anti-GFP 및 anti-LC3 항체 모두에 대해 포지티브이다. 더 낮은 세트는 HeLa 세포에서 내생적인 LC3-I (상단 밴드) 및 LC3-II (하단 밴드)이다. 이 실험은 LDP12-EGFP-LC3는 내재화될 뿐만 아니라 정상적으로 PE 부착을 위하여 가공된다는 것을 나타낸다. 2-세포 또는 상실기 배아에서는 LDP12-EGFP-LC3는 내재화되는 것을 볼 수 없었다(도 6).
본 발명에서 본 발명자들은 LDP12가 마우스 배반포에 기능적으로 적용될 수 있는 효과적인 CPP라는 것을 입증하였다. 배반포에서 통상적인 트랜스팩션 방법이 효과적이지 않다는 것을 고려하여 볼때, LDP12-이용한 단백질 운반은 그들에서 단백질 발현을 조작하는 새로운 시스템을 제공한다. LDP12-EGFP의 내재화(internalization)은 마우스 배반포의 내부세포괴(inner cell mass) 및 영양외배엽(trophectoderm) 모두에서 보이고(도 3B), 이것은 이 시스템이 배아 줄기 세포 및 영양아층(trophoblast) 줄기 세포와 같은 배반포 유래 줄기세포에서 단백질 치료제로 이용할 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 난모세포 및 초기 단계 배아에서 LPD12-매개된 전달의 효율은 제한되는 것 같다(도 4).
LDP12-EGFP-LC3 단백질의 생화학적 특징은 그것의 PE-부착이 세포 출입 후에 통상적으로 일어나므로 트랜스덕션 후에 유지된다(도 5B). 따라서, LC3 단백질의 LDP12-매개된 운반은 생식기관 암 세포 및 배반포에서 자가소화 활성을 모니터하는 옵션일 수 있다.
LDP12-EGFP-LC3의 내재화는 배반포에 대해서 치명적인 효과를 가지지 아니하는 매우 성공적이기 때문에, 그것은 고정화없이 자가소화 반응을 육안화하는 새로운 방법을 제공한다. 따라서 그러한 트랜지언트 시스템의 사용에 의한 자가소화 모니터링은 산화적 스트레스, 영양결핍 및 특정 인자 및 호르몬의 결손과 같은 배양에서 배아에 스트레스 조건을 다루는데 유용할 수 있다.
도 1은 LDP12-EGFP 융합 단백질의 HeLa 세포로의 효과적인 트랜스덕션을 나타낸 그림,
(A) 본 발명에서 사용된 융합 단백질 구축물. LDP12 (12-mer) 또는 MPG (24-mer) 서열을 N-말단 태그로서 EGFP 코딩 서열에 첨가. MPG-EGFP 융합 단백질을 일부 실험에서 포지티브 대조군으로 사용함(Kwon SJ, Han K, Jung S, Lee JE, Park S, Cheon YP & Lim HJ 2009 BMC . Biotechnol . 9 73).
(B) EGFP, LDP12-EGFP, 또는 MPG-EGFP으로 처리된 HeLa 세포의 공초점 라이브 이미징. 40 ㎍/ml MPG-EGFP, 100 ㎍/ml EGFP 또는 LDP12-EGFP으로 세포를 1시간 처리. 세포를 acid 세척. 현미경사진은 40X로 촬영하였고 3X로 주밍함.
(C) 4% paraformaldehyde (PFA) - 고정된 HeLa 세포의 형광 이미징. 세포들을 FM4-64, 엔도좀 마커오 함께염색. LDP12-EGFP를 100 ㎍/ml로 첨가. EGFP 신호는 녹색, FM4-64는 적색. 중복되는 신호는 황색 형광을 생성. FM4-64는 3분 동안 5 ㎍/ml에서 사용. 현미경사진은 60X로 촬영하고 2X로 주밍.
(D)LDP12-EGFP의 세포 흡수 속도의 시간 의존적인 증가. EGFP (100 ㎍/ml), MPG-EGFP (40 ㎍/ml), 또는 LDP12-EGFP (100 ㎍/ml)를 HeLa 세포에 첨가하고 세포 흡수 속도를 1 h, 2 h, 또는 4 h에서 유세포 분석으로 평가. 세포를 acid 세척하고 FACS 분석을 위하여 트립신처리. 2 h 배양에서, 45.5%의 세포가 LDP12-EGFP-양성(데이터 도시 안함).이 실험들은 동일한 결과를 가지는 적어도 3회 반복.
도 2는 LDP12-EGFP의 트랜스덕션이 endocytic 저해제에 의하여 영향을 받는 것을 보여주는 그림.
(A) 여러 엔도사이토시스 저해제의 존재 하에서 LDP12-EGFP 흡수의 유 세포분석을 나타낸 그림. 저해제 또는 DMSO (vehicle, 0.2%)을 EGFP 또는 LDP12-EGFP 융합 단백질 첨가(1 h) 30 분 전에 HeLa 세포에 첨가. 모든 세포를 FACS 분석 전에 에시드 버퍼로 세척. 하기 농도를 사용함: 10 μM cytochalasin D, 4 mM amiloride, 및 5 mM MβCD. 녹색 파선(dashed line), 처리안함; 적색 점선, 저해제 첨가. 이 실험들은 적어도 유사한 결과를 가지는 3회 반복하고 한 대표적인 세트의 데이터를 나타냄.
(B) 기재된 엔도사이토시스 저해제로 처리된 4% PFA-고정된 HeLa 세포의 공초점 이미지. 현미경사진은 40X로 촬영하고 3X로 주밍. CytoD, cytochalasin D; MβCD, methyl-β cyclodextrin.
도 3은 마우스 배반포로 LDP12-EGFP의 효과적인 트랜스덕션을 나타낸 그림.
(A) 4 일 배반포를 4 일 임신 마우스로부터 얻어서 KSOM-AA에서 40 ㎍/ml MPG-EGFP 또는 100 ㎍/ml LDP12-EGFP 융합 단백질의 존재하에서 1시간 동안 배양. 배반포의 라이브 이미지를 공초점 현미경 하에서 관찰. 녹색 형광은 내재화된 융합 단백질을 나타냄. 현미경사진은 40X로 촬영하고 3X로 주밍. CytoD, cytochalasin D.
(B)마우스 배반포에서 내재화된 LDP12-EGFP의 세포 분포를 나타냄. LDP12-EGFP 흡수가 내세포괴 및 영양외배엽 세포 모두에서 관찰되는지를 확인하기 위하여, 3 ㎛ 스텝 사이즈의 Z 시리즈(채널 1, GFP; 채널 2, Cy5.5)를 싱글 배반포로부터 얻었다. 투명대가 있는 배반포를 100 ㎍/ml EGFP 또는 LDP12-EGFP으로 1시간 처리하였다. 배아를 FM4-64로 3분 카운터 염색하였다. 이 실험은 네 다른 배반포를 사용하여 수행하고 한 대표적인 이미지 세트를 나타냄.
도 4는 LDP12-EGFP가 마우스 난모세포 또는 초기 단계 착상전 배아에는 내재화되지 않는다는 것을 나타낸 그림. 난모세포 또는 배아를 100 ㎍/ml EGFP 또는 LDP12-EGFP으로 1시간 동안 처리하였다. 투명대(Zona pellucidae)를 acid Tyrode 용액으로 제거하였다. FM4-64 (적색)에 의한 엔도좀 염색을 주목, 그러나 난모세포 또는 2-세포 배아에서는 녹색 신호가 관찰되지 않음.
도 5는 자가포식(autophagic) 활성화 마커 EGFP-LC3의 LDP12-구동 트랜스덕션을 나타낸 그림.
(A) LDP12-EGFP-LC3 융합 단백질 구축물을 상단에 나타냄. HeLa 세포 또는 마우스 배반포를 LDP12-EGFP-LC3 단백질(100 ㎍/ml)으로 처리. 엔도좀을 FM4-64 (적색)으로 카운터염색함. 왼쪽 패널은 EGFP 신호(녹색)을 나타내고, 우측 패널은 EGFP 및 FM4-64의 오버레이.
(B) 웨스턴 블럿 분석은 내재화된 LDP12-EGFP-LC3 단백질이 내생적인 LC3와 같이 리피데이션을 겪고 LC3-II 형태를 생성한다는 것을 보여줌. HeLa 세포(2X105)를 100 ㎍/ml LDP12-EGFP-LC3로 1시간 처리하고 SDS-PAGE를 수행함. 세포를 SDS 샘플 버퍼(150 ㎕)으로 직접적으로 파쇄하고 30 ㎕를 각 레인에 로딩함. 항-GFP 및 항-LC3 항체를 1:2000로 사용하였음. None, 처리 안함. 상단 괄호, EGFP-LC3-I 및 EGFP-LC3-II 형태; 하단 괄호, 내생적인 LC3-I 및 LC3-II 형태.
도 6은 LDP12-EGFP-LC3는 초기 단계 착상전 배아에 내재화되지 않는다는 것을 나타낸 그림.
배아를 100 ㎍/ml EGFP 또는 LDP12-EGFP-LC3로 1시간 처리. 투명대(Zona pellucidae)를 acid Tyrode 용액으로 제거하였다. FM4-64 (적색)에 의하여 염색된 배아에서 독특한 엔도좀 구조를 주목. LDP12-EGFP-LC3로 처리한 상실배(morula)의 주변에 약간 녹색 신호가 보이지만, 그것은 내재화된 것 같지는 않음. 스케일 바, 20 ㎛.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명에 사용된 HeLa 인간 자궁경부암 세포주는 American Type Culture Collection (Rockville,MD, USA)로부터 구입하고 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 보충된 DMEM 또는 RPMI 배지에서 배양하였다.
또한 Cytochalasin D, amiloride, 및 methyl-β-cyclodextrin는 Sigma-Aldrich (St. Louis,MO, USA)에서 구입하고 기재된 농도로 사용하였다. 엔도좀에 대한 라이브 다이, FM4-64는 Invitrogen으로부터 구입하였다.
실시예 1: 마우스 및 난모세포/배아 핸들링
마우스는 건국대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 유지시켰다.마우스들은 건국대학교의 제어된 사육시설에서 생육하였다. 난자 난모세포 복합체(Cumulus-oocyte-complexes;COCs)는 4-주령 ICR 마우스(Orient-Bio, Kyunggi-do, Korea)로부터 얻었다. Cumulus 세포들을 조심스럽게 피펫팅으로 제거하고 투명대(zona pellucidae)를 acid Tyrode 용액으로 처리하였다(Kwon et al. 2009). 중기(Metaphase) I 또는 II 기 난모세포를 실험에 사용하였다. 2 세포기 배아들은 임신 2일에 난관관류(oviduct flushing)에 의하여 얻었고[질전(vaginal plug) = 임실 1일] KSOM-AA 배지(Millipore, Billerica, MA, USA)에서 배양하였다.
실시예 2: LDP12 융합 단백질들의 발현 및 정제
LDP12 (TAPKRKRTKTKK, 서열번호 1, 인유두종바이러스타입 11 L1의 C 말단으로부터 유래)의 뉴크레오타이드 서열을 5` 프라이머에 포함하고 주형으로 pET15b-EGFP (Novagen, Madison, WI, USA)를 사용하여 EGFP 코딩 서열을 직접적으로 증폭하는데 사용하였다. PCR 산물을 pET15b 벡터의 NdeI 및 BamHI 부위에 클로닝하였다. 사용된 프라이머들은 : C AGC CAT ATG ACT GCC CCT AAA CGT AAG CGC ACC AAA ACT AAA AAG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC (up, LDP12 서열은 밑줄) 및 AGCC GG ATC C TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT (down)이었다. LDP12-EGFP-LC3 구축물은 pProEx/HTa 벡터(Invitrogen)로 클로닝하고, mRFP-EGFP-LC3 플라즈미드(Kimura et al. 2007)를 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. CPP-융합 재조합 단백질의 정제는 전에 기재된 것과 수행하였다 (Kwon SJ, Han K, Jung S, Lee JE, Park S, Cheon YP & Lim HJ 2009 BMC . Biotechnol . 9 73). Ni-NTA 아가로스 레진(1 ml, 50% w/v 슬러리, Qiagen, Valencia, CA)을 제조업자의 프로토콜을 따라 파쇄액으로부터 단백질들을 정제하는데 사용하였다.
실시예 3: 유세포 분석
단백질들로 처리된 HeLa 세포들을 PBS (Invitrogen) 및 acid 세척 버퍼(0.2 M glycine, 0.15 M NaCl, pH 3.0)로 30초간 로 세척하였다. acid 세척은 세포 표면에 대한 비특이적인 결합을 제거하였다 (Kameyama et al . 2007). 그 다음 세포들을 10분 간 0.25% trypsin-EDTA 용액으로 트립신처리하였다. 세포들을 10% FBS으로 보충된 DMEM에 재부유하였고, 3% FBS을 포함하는 PBS로 세척하였다 . 세척 후, 세포들을 Cell Quest Pro 소프트웨어(BD Biosciences)가 구비된 FACSCalibur 유 세포분석기(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)로 분석하였다 .
실시예 4: 공초점 현미경법
세포를 실험 전에 1X105의 밀도로 유리-바텀 공초점 디쉬(SPL Lifesciences, Pocheon, Korea)에 시딩하였다. 단백질 처리된 세포들을 HBSS, acid 세척 버퍼로 세척한 후, HBSS로 다시 세척하였다. EGFP 융합 단백질의 세포 흡수를 웜 플레이트가 구비된 Olympus FV1000 스펙트럼 공초점 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 HBSS에서 육안화하였다. 일부 실험에서,세포를 5 μg/ml FM4-64 (Invitrogen)로 1분 동안 염색하였다. 라이브 이미지를 공초점 현미경법에 의하여 캡쳐하였다.
실시예 5:엔도사이토시스의 저해
Cytochalasin D, amiloride, 또는 methyl-β-cyclodextrin을 특정 엔도사이토시스 경로를 억제하기 위하여 기재된 농도로 사용하였다(Kwon et al . 2009). 세포를 LDP12-EGFP 융합 단백질 첨가 30분 전에 각 저해제로 처리하였다. 1시간 후, 세포들을 acid 세척하고 유세포분석을 수행하였다.
실시예 6: 단백질 조제 및 웨스턴 블럿팅
HeLa 세포(2X105)를 6-웰 플레이트 상에 플레이팅하고 LDP12-EGFP-LC3 단백질을 100 μg/ml로 처리하였다. acid 세척 후, 세포를 SDS 샘플 버퍼(150 μl)에서 직접적으로 파쇄하였다. 파쇄액을 12 600 g에서 3분간 원심분리하였다. 가열 후,그 상등액(30 μl)을 12% SDS polyacrylamide 젤 상에 로딩하고 PVDF 막(Millipore) 상에 블럿팅하였다. 그 막들을 1시간 동안 TBS 내 5% 탈지유로 블럭킹하고 anti-GFP (1:2000, Abfrontier, Seoul, Korea) 또는 anti-LC3 (1:2000, Abcam, Cambridge, UK) 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. HRP-부착된 goat anti-rabbit 항체 (GeneDEPOT, TX, USA)를 1:10000 희석하여 사용하였다. Super Signal West Femto ECL 시약(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)을 사용하였다. 화학발광 신호를 LAS3000 (FUJIFILM, Japan)로 검출하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A Method for protein delivery in mouse blastocysts and reproductive cancers and composition thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LDP12 <400> 1 Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr Lys Lys 1 5 10

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 펩타이드가 단백질에 연결된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 배반포 세포 특이적인 단백질 운반용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단백질은 성장인자, 형광단백질, 마커 단백질 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질인 것을 특징으로 하는 배반포 세포 특이적인 단백질 운반용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 배반포 세포는 마우스 배반포인 것을 특징으로 하는 단백질 운반용 조성물.
  4. 서열번호 1의 펩타이드가 단백질에 연결된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 세포 특이적인 단백질 운반용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단백질은 성장인자, 형광단백질, 마커 단백질 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 세포 특이적인 단백질 운반용 조성물.
  6. 삭제
  7. 서열번호 1의 펩타이드가 단백질에 연결된 융합단백질을 배반포 세포에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 배반포 세포 특이적인 단백질 운반 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단백질은 성장인자, 형광단백질, 마커 단백질 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질인 것을 특징으로 하는 배반포 세포 특이적인 단백질 운반 방법.
  9. 서열번호 1의 펩타이드가 단백질에 연결된 융합단백질을 포함하는 단백질을 자궁경부암 세포에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 자궁경부암 세포 특이적인 단백질 운반 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 단백질은 성장인자, 형광단백질, 마커 단백질 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질인 것을 특징으로 하는 자궁경부암세포 특이적인 단백질 운반 방법.

  11. 삭제
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KR20120026408A (ko) * 2010-09-09 2012-03-19 서울대학교산학협력단 인간 유래 세포 투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드 결합체 및 그 용도

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20070083218A (ko) * 2006-02-20 2007-08-23 이화여자대학교 산학협력단 막투과 단백질 도메인 기능을 갖는 펩타이드
KR20120026408A (ko) * 2010-09-09 2012-03-19 서울대학교산학협력단 인간 유래 세포 투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드 결합체 및 그 용도

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