KR101488822B1 - 암의 진단 및 치료를 위한 마이크로버블-나노리포좀 복합체 - Google Patents

암의 진단 및 치료를 위한 마이크로버블-나노리포좀 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 세포 특이적인 진단 및 치료를 가능하게 하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀이 화학적으로 안정적인 공유결합으로 결합되어 있는 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 복합체 구조 내부에 하나 이상의 치료제 뿐 아니라 추가의 소수성 또는 친수성 형광물질을 하나 이상 담지할 수 있으면서 외부에 타켓팅 모이어티(targetting moiety)를 포함하여 우수한 표적 특이성을 나타내므로, 암세포에 특이적인 초음파 또는 형광 조영을 이용한 다중 영상 분석을 통해 암을 진단함과 동시에 하나 이상의 치료제를 표적 암세포에 효과적으로 전달하여 암을 치료할 수 있으므로, 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암 등의 암 질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

암의 진단 및 치료를 위한 마이크로버블-나노리포좀 복합체 {Microbubble-nanoliposome complex for diagnosis and treatment of cancer}
본 발명은 암 세포 특이적인 진단 및 치료를 가능하게 하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀이 화학적으로 안정적인 공유결합으로 결합되어 있는 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 복합체 구조 내부에 하나 이상의 치료제 뿐 아니라 추가의 소수성 또는 친수성 형광물질을 하나 이상 담지할 수 있으면서 외부에 타켓팅 모이어티(targetting moiety)를 포함하여 우수한 표적 특이성을 나타내므로, 암세포에 특이적인 초음파 또는 형광 조영을 이용한 다중 영상 분석을 통해 암을 진단함과 동시에 하나 이상의 치료제를 표적 암세포에 효과적으로 전달하여 암을 치료할 수 있으므로, 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암 등의 암 질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
치료용 조영 물질(theragnostic agent)은 병의 진단과 치료를 동시에 가능하게 하는 물질들을 일컫는다. 이들은 보통 작은 크기의 물질로 이뤄져 있으며, 대개 형광 염료, 방사성 분자 등이 리포좀, 고분자 및 나노 입자 등의 내부에 담지되고 약물이나 진단용 마커가 외부에 도입된 형태를 갖는다. 최근에는 생체 적합성(biocompatibility)이 우수한 지질구조체(lipid structure)로 이루어진 치료용 조영 물질의 합성 연구가 주를 이루고 있으며, 특히 지질구조체로 이뤄진 마이크로미터 크기의 공기방울 초음파 조영제인 마이크로버블(Microbubble ultrasound agent, MB)을 이용한 생체 영상 분석 연구가 활발히 진행되고 있다[David C., Eur J Radiol (2006), 60(3), 324-330]. 이러한 연구들은 최근 '나노-바이오 분야(nano-bio field)'로 불리고 있는 나노물질의 생물관련 분야로의 응용을 위해 비독성, 고-수용성 또는 용이한 표면 변형 등의 특성을 부과하는데 주로 초점이 맞춰져 있다.
지금까지 공지된 지질구조체를 기반으로 하는 마이크로버블들을 살펴보면, 우수한 생체적합성을 통해 여러 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 연구에서 혈관 또는 암조직의 영상 분석을 통한 진단 뿐 아니라 치료용 유전자나 약물을 전달하여 암을 치료할 수 있는 것으로 보고되고 있다[Katherine F. 등, Annual Review of Biomedical Engineering (2007), 9, 415-447]. 그러나 마이크로버블을 통한 초음파 조영 분석은 낮은 해상도와 표적 비특이성(nonspecific property)으로 인해 암의 정확한 진단에는 역부족이며, 따라서 초음파 조영 뿐 아니라 형광 조영을 동시에 사용하여 초음파 분석을 통한 생체 조직의 형태 확인과 동시에 형광 영상 분석을 통한 세부적인 분포도를 확인할 수 있도록 하는 형광 및 초음파를 통한 다중 영상 조영 물질을 개발하기 위한 연구들이 이루어지고 있다[Bart G. 등, Journal of Controlled Release (2011), 152, 249-256].
그러나 공지된 물질들 대부분이 여전히 표적 비특이적인 조영 효과에 그치고 있어 실질적으로 혈관, 림프관 등의 선형적인 조직 진단에만 활용가능하거나, 병변 세포에만 표적 특이적으로 치료 유전자나 약물을 전달하여 치료하는데 한계를 나타내고 있어 치료용 물질을 담지하기 위해 또 다른 구조체와의 혼성체를 형성시켜야 하는 구조적 어려움이 있어왔다[Wang C. 등, Biomaterials (2012), 33, 1939-1947].
이에 본 발명자들은 암세포 특이적인 다중 영상 분석을 통한 암 진단과 동시에 하나 이상의 치료제를 표적 특이적으로 전달하여 암 치료를 가능하게 할 수 있는 치료용 조영 물질을 개발하기 위해 연구한 결과, 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀이 공유결합으로 결합되어 있는 복합체로서, 상기 복합체 구조 내부에 하나 이상의 치료제 뿐 아니라 추가의 소수성 또는 친수성 형광물질을 하나 이상 담지할 수 있으면서 외부에 타겟팅 모이어티(targetting moiety)를 포함하고 있는 마이크로버블-나노리포좀 복합체가 암세포 특이적으로 초음파 또는 형광 조영을 이용한 다중 영상 분석을 통해 암을 진단함과 동시에 치료용 유전자 및 약물 등의 하나 이상의 치료제를 표적 세포에 안정적으로 전달하여 암을 치료할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 암세포 특이적인 다중 영상 분석을 통한 암 진단과 동시에 하나 이상의 치료제를 표적 세포에 특이적으로 전달하여 암 치료를 가능하게 할 수 있는 치료용 조영 물질(theragnostic agent)를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 치료용 조영 물질의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀이 공유결합으로 결합되어 있는 복합체로서, 상기 복합체 구조 내부에 하나 이상의 치료제를 담지하면서 외부에 타겟팅 모이어티(targetting moiety)를 포함하고 있는 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 치료제는 치료유전자 및 약물 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 복합체 구조 내부에 소수성 또는 친수성 형광물질을 하나 이상 추가로 담지할 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물, 아민기를 갖는 화합물 및 다이설파이드기를 갖는 화합물을 유기용매에 넣고 반응시켜 필름을 제조한 후 이를 소수성 가스와 함께 유기 혼합용매에 넣고 진동반응(vibrating)시켜 마이크로버블을 제조하는 단계;
2) 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물 및 아민기를 갖는 화합물을 유기용매에 넣고 반응시켜 필름을 제조한 후 이를 물에 넣고 초음파분산 및 여과하여 나노리포좀을 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 얻어진 나노리포좀을 하나 이상의 치료제와 반응시켜 하나 이상의 치료제를 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 단계;
4) 상기 단계 1)에서 얻어진 마이크로버블과 상기 단계 3)에서 얻어진 나노리포좀을 혼합하고 진탕(shaking)시켜 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)에서 제조된 복합체를 타겟팅 모이어티(targetting moiety)와 반응시켜 타겟팅 모이어티를 복합체 외부에 결합시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계 1) 또는 2)는 마이크로버블 또는 나노리포좀 제조 후 이를 형광물질과 반응시켜 형광물질을 상기 마이크로버블 또는 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 암 세포 특이적인 진단 및 치료를 가능하게 하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀이 화학적으로 안정적인 공유결합으로 결합되어 있어 복합체 구조 내부에 치료 유전자 및 약물 등의 하나 이상의 치료제 뿐 아니라 추가의 소수성 또는 친수성의 형광물질을 하나 이상 안정적으로 담지할 수 있으면서 외부에 타켓팅 모이어티(targetting moiety)가 결합되어 있어 우수한 표적 특이성을 나타내므로, 암세포에 특이적인 초음파 또는 형광 조영을 이용한 다중 영상 분석을 통해 암을 진단할 수 있음과 동시에 하나 이상의 치료제를 표적 암세포에 효과적으로 전달하여 암을 치료할 수 있으므로, 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암 등의 암 질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 구조 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블(a) 및 나노리포좀(b)을 대상으로 각각 광학현미경(optical microscope) 및 극저온 전자 현미경(cryogenic electron microscopy, Cryo-EM)으로 확인한 결과 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope)을 사용하여 저배율 및 고배율(상단 우측 삽입도면)로 확인한 결과 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 대상으로 자외-가시선 분광분석(UV-vis spectroscopy)을 수행하여 공유결합시 발생되는 부산물인 SPDP(N-succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]-propionate)의 존재 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 시판중인 마이크로버블 초음파 조영제인 SonoVue(TM)(a), 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블(b) 및 마이크로버블-나노리포좀 복합체(c)를 사용하여 각각 초음파 영상 장치를 통한 인공혈관 팬텀에서의 초음파 조영 효과를 비교 분석한 결과 사진이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 사용하여 1회에서 10회까지의 음파 자극을 가하였을 때 인공혈관 팬텀에서의 초음파 조영 효과의 변화를 확인한 결과 사진(1회~10회) 및 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 대상으로 BSA 정량분석을 수행하여 복합체 표면에 포함된 항체의 양을 확인한 결과 그림이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체 및 대조군으로써 항체 도입을 생략하여 제조한 마이크로버블(MB)-나노리포좀 복합체를 사용하여 유방암 세포주인 SkBr3 세포를 대상으로 공초점 형광 현미경을 통한 다중 영상 분석(multimodal imaging analysis)(a) 및 FACS 분석(b)을 수행한 결과 사진 및 그림이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 유방암 세포주인 SkBr3 세포에 처리하고 외부 음파 자극을 1분 동안 가한 후 공초점 형광 현미경 분석을 수행하여 복합체 내부에 담지되어 있던 형광 물질이 암세포 내부에 전달되었는지를 확인한 결과 사진이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 약물 포집 효율을 자외-가시선 분광기(UV-vis spectrometer)를 이용한 분광분석을 통해 확인한 결과 그림이다.
도 11은 아무것도 처리하지 않거나(1) 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체(2) 또는 독소루비신(3)을 처리한 유방암 세포주 Skbr3를 일정 시간(24시간, 48시간 또는 72시간) 동안 배양한 후 MTT 분석을 수행하여 세포독성을 확인한 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 유방암 세포주 SkBr3에 처리한 후 외부 음파 자극을 가하거나 가하지 않고 일정 시간(48시간, 72시간 또는 96시간) 동안 배양한 후 공초점 형광 현미경을 사용하여 tGFP의 발현을 확인한 결과 사진이다.
도 13은 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 유전자 전달 실험을 위한 프로타민(PA)과 pGFP 복합체의 최적화 및 로딩용량을 측정한 것이다.
도 14는 본 발명의 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 pGFP 전달 효과를 비교한 것이다.
도 15는 마이크로 버블-나노리포좀 복합체에서 독소루비신의 로딩용량 및 세포에서의 특성을 모니터한 것이다.
도 16은 마이크로 버블-나노리포좀 복합체를 이용한 약물 및 치료 유전자 전달에 의한 세포 생존율 시험 결과이다. Pop-particle은 마이크로 버블-나노리포좀 복합체를 의미한다.
도 17은 siSTAT3를 포함하고 있는 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 세포사멸 시험 후 암세포에서 STAT3 단백질 및 유전자에 대한 발현 수준을 측정한 것이다.
도 18은 토끼의 신장에서 이식된 VX2 종양의 특성을 나타낸 것이다.
도 19는 생체 내에서 약물 및 유전자의 암 특이적 초음파 이미지 및 전달을 나타낸 것이다.
도 20은 토끼 종양 모델에서 마이크로 버블-나노리포좀 복합체를 이용한 암치료 효과에 대해 평가한 것이다.
도 21은 생채 내에서 형광물질을 포함한 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 생체 내 분포를 나타낸 것이다.
도 22는 생체 내에서 형광물질을 포함한 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 방출(excretion)을 측정한 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀이 공유결합으로 결합되어 있는 복합체로서, 상기 복합체 구조 내부에 하나 이상의 치료제를 담지하면서 외부에 항체 등의 타겟팅 모이어티(targetting moiety)를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 복합체 구조 내부에 소수성 또는 친수성 형광물질을 하나 이상 추가로 담지할 수 있으며, 이때 소수성 형광물질은 마이크로버블 구조 내부에, 친수성 형광물질은 나노리포좀 구조 내부에 담지될 수 있다.
본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 도 1에 나타낸 바와 같이 평균 직경 1-2 ㎛의 균일한 입자 크기를 갖는 미세 공기방울 형태의 소수성 마이크로버블 구조 외부에 100-200 nm 크기의 친수성 지질 구조체인 나노리포좀이 표면에 결합된 형태를 가지며, 복합체 내부에는 SF6 , CO2 또는 CF4 등의 소수성의 기체가 내포되어 있다. 이때, 소수성 마이크로버블과 친수성 나노리포좀은 서로 화학적으로 안정적인 공유결합으로 결합되어 있고, 각각의 구조내에 소수성 또는 친수성의 성질에 따라 하나 이상의 유전자 및 약물 중에서 선택된 치료제 뿐 아니라 추가의 소수성 또는 친수성 형광물질을 하나 이상 담지할 수 있으며 복합체 외부에는 항체 등의 타겟팅 모이어티(targetting moiety)를 포함하므로, 표적 특이적으로 초음파 또는 형광 조영을 통한 다중 영상화(mutimodal imaging)를 구현함과 동시에 하나 이상의 치료제를 생체 내에 안정적으로 전달할 수 있는 특징이 있다. 상기 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 본 명세서 또는 도면에서 '팝-파티클(pop-particle)'이라는 용어로도 표현된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체는 바람직하게 평균 직경 1-2 ㎛의 균일한 크기를 나타낼 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 복합체 제조시 나노리포좀의 사용 농도 및 여과 방법에 따라 100 nm 내지 10 ㎛로 입자크기를 조절할 수 있다. 또한, 이러한 입자크기는 현재 상용화 되어 있는 초음파 기기의 주파수에 맞춰 다양화시킬 수 있는데, 사용되는 초음파 기기의 주파수가 높아지면 복합체의 평균 직경은 작아질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체에서 상기 마이크로버블은 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물, 아민기를 갖는 화합물 및 다이설파이드기를 갖는 화합물을 포함할 수 있으며, 이때 필름형성물질로는 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등이; 인지질로는 콜레스테롤(cholesterol) 등이; 음전하 화합물로는 DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), DMPA (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) 또는 DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) 등이; 아민기를 갖는 화합물로는 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등이; 그리고 다이설파이드기를 갖는 화합물로는 DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]} 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체에서 상기 나노리포좀은 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물 및 아민기를 갖는 화합물을 포함할 수 있으며, 이때 필름형성물질로는 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등이; 인지질로는 콜레스테롤(cholesterol) 등이; 음전하 화합물로는 DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), DMPA (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) 또는 DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) 등이; 그리고 아민기를 갖는 화합물로는 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체는 pH, 반응온도 또는 반응시간 등의 조절을 통해 마이크로버블의 지질구조체 또는 나노리포좀의 지질구조체의 일부분을 변형하여 진탕반응시킴으로써 간단하게 공유결합을 유도하여 형성될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체 구조 내부에 담지되는 하나 이상의 치료제는 치료용 유전자 및 약물 중에서 선택된 것이라면 어느 것이나 사용될 수 있으며, 예를 들면 암 치료에 사용될 수 있는 DNA, RNA 등의 유전자 및 항암제 등의 약물 등을 포함하는 군에서 선택된 것을 사용될 수 있다. 구체적으로, 치료용 유전자를 사용하는 경우에는 예를 들면 항암 효과가 공지된 유전자를 발현시키거나 암 발생에 관련된 유전자의 발현을 저해할 수 있는 발현 플라스미드, siRNA, shRNA, 마이크로 RNA 또는 마이크로 RNA의 길항제 등의 DNA 또는 RNA가 사용될 수 있으며, 약물을 사용하는 경우에는 예를 들면 항암 효과가 알려진 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel) 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 유전자 및 약물은 통상적인 방법에 따라 나노리포좀과 반응시켜 복합체 구조 내에 담지시킬 수 있는데, 유전자의 경우 프로타민(protamine) 등의 생체고분자와의 혼성체 형태로 나노리포좀과 반응시켜 담지시킬 수 있으며, 약물의 경우 통상적인 황산암모늄 농도구배법[ammonium sulfate gradient method, Bowen T. 등, International Journal of Pharmaceutics (2011), 416, 443-447]을 통해 리포좀 내부에 담지시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체의 독소루비신(doxorubicin) 약물 포집 효율은 88.57%이며, tGFP 발현 플라스미드 유전자 포집 효율은 30%를 나타내었다.
또한 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체 구조 내부에 추가로 담지될 수 있는 상기 형광물질은 임상 진단에 사용될 수 있는 소수성 또는 친수성 형광물질이라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 예를 들면 FITC, 텍사스 레드(Texas-red). RITC, Cy3, Cy5 또는 Cy7 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 형광물질들은 통상적인 방법에 따라 소수성을 갖는 형광물질인 경우 마이크로버블과, 친수성을 갖는 형광물질인 경우 나노리포좀과 30℃에서 교반 또는 초음파분산(sonication)시켜 담지시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체의 표면에 결합되어 있는 항체 등의 타겟팅 모이어티(targetting moiety)는 표적세포 표면의 분자(molecule), 리간드(ligand) 또는 수용체(receptor) 등의 표적물질을 선택적으로 인식(recognition)/결합(binding)할 수 있는 물질이라면 어느 것이든 사용가능하며, 예를 들면 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 항체, 항원, 앱타머(RNA, DNA 및 펩타이드 앱타머), 수용체, 호르몬, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 렉틴, 리간드, 아고니스트, 안타고니스트, 효소, 조효소, 무기이온, 효소보조인자, 당, 지질, 효소기질, 합텐(hapten), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 셀렉틴 (selectin), 칼슘 설페이트 및 기체 결합제(예: Pt, Pd, Au, Ag, Nb, Ir, Rh 및 Ru) 등을, 바람직하게는 바이오틴, 스트렙타비딘, 아비딘, 항체, 앱타머, 폴리펩타이드, 펩타이드, 리간드, 수용체, 렉틴, 당, 지질, 당지질 또는 핵산 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 표적물질은 분리(또는 분리와 검출, 또는 분리, 검출 및 정량)하고자 하는 시료 내 물질을 의미하며, 구체적으로 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 펩타이드, 항원, 당, 지질, 세균, 바이러스, 세포, 유기 화합물, 무기화합물, 금속 및 무기이온을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 시료는 생물학적 시료, 화학적 시료 및 환경 시료를 포함하며, 상기 생물학적 시료는 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체의 표면에 포함되어 있는 항체 등의 타겟팅 모이어티(targetting moiety)는 통상적인 반응을 통해 본 발명의 복합체 표면에 직접 또는 간접적으로 공유 또는 비공유 방식으로 결합되어 포함될 수 있으며, 예를 들어 이온결합, 정전기적 결합, 소수성 결합, 수소 결합, 공유결합, 친수성 결합 또는 반데르 발스 결합을 통해 결합되어 포함될 수 있다. 또한, 상기 간접 결합의 경우 결합제 등의 중간 매개체(intervening agent)가 사용될 수 있는데, 이때 중간 매개체로는 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복합체가 표면의 타겟팅 모이어티에 의해 표적 세포에 접근하면 외부 음파 자극(ultrasonic flow, UF)을 통해 파괴시켜 복합체 구조 내부에 담지되어 있던 치료 유전자 및 약물 등의 치료제 및 형광물질을 동시에 표적 세포내로 전달시킬 수 있으며, 이때 음파 자극의 세기는 특별히 제한되는 것은 아니나 그 기계지수(mechanical index) (mechanical index = PNP/
Figure 112013070288632-pat00001
: PNP; Peak negative pressure of the ultrasound wave (MPa), Fc; center frequency of the ultrasound wave (MHz))가 0.01 내지 2.0인 것이 바람직하다. 이와 같이, 본 발명의 복합체를 초음파에서 고에너지 또는 높은 기계지수에 노출시키는 것을 플래쉬(flash)라고 하며, 이하 실시예에서 플래쉬라는 용어로도 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 형광물질로 FITC 및 텍사스 레드를, 유전자로 tGFP 발현 플라스미드를, 약물로 독소루비신을 복합체 구조 내부에 담지시키고, 표면에 유방암 세포에 특이적인 항-HER2 단일클론 항체(anti-HER2 monoclonal antibody)인 헤르셉틴(Herceptin)을 결합시킨 복합체를 사용하여 유방암 세포주인 SkBr3에 처리한 후 외부 음파 자극(UF)을 준 조건에서 형광물질인 FITC 및 텍사스 레드가 세포내로 전달된 것을 확인하였으며, 3일 후에는 독소루비신에 의한 65% 이상의 세포괴사를 확인하였으며, 또한 2일 후부터 90% 이상의 세포에 유전자가 전달되어 tGFP가 발현되는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 높은 표적 특이성을 통해 부작용을 최소화하면서 암세포에 특이적인 초음파 또는 형광 조영을 이용한 다중 영상 분석을 통해 암을 진단함과 동시에 치료 유전자 및 약물 등의 하나 이상의 치료제를 표적 암세포에 효과적으로 전달하여 암을 치료할 수 있으므로, 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암 등의 암 질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물, 아민기를 갖는 화합물 및 다이설파이드기를 갖는 화합물을 유기용매에 넣고 반응시켜 필름을 제조한 후 이를 소수성 가스와 함께 유기 혼합용매에 넣고 진동반응(vibrating)시켜 마이크로버블을 제조하는 단계;
2) 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물 및 아민기를 갖는 화합물을 유기용매에 넣고 반응시켜 필름을 제조한 후 이를 물에 넣고 초음파분산 및 여과하여 나노리포좀을 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 얻어진 나노리포좀을 하나 이상의 치료제와 반응시켜 하나 이상의 치료제를 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 단계;
4) 상기 단계 1)에서 얻어진 마이크로버블과 상기 단계 3)에서 얻어진 나노리포좀을 혼합하고 진탕시켜 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)에서 제조된 복합체를 타겟팅 모이어티(targetting moiety)와 반응시켜 타겟팅 모이어티를 복합체 외부에 결합시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법에서, 상기 단계 1)에서 사용되는 필름형성물질로는 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등이; 인지질로는 콜레스테롤(cholesterol) 등이; 음전하 화합물로는 DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), DMPA (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) 또는 DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) 등이; 아민기를 갖는 화합물로는 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등이; 그리고 다이설파이드기를 갖는 화합물로는 DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]} 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 단계 1)에서 사용되는 소수성 가스는 SF6, CO2 또는 CF4 등의 통상적인 마이크로버블 제조시 사용되는 소수성 가스를 사용할 수 있으며, 유기용매로는 클로로포름(chloroform)이, 유기 혼합용매로는 글리세린, 프로필렌글리콜 및 물을 혼합한 용매를 사용할 수 있다.
또한, 상기 단계 2)에서 사용되는 필름형성물질로는 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등이; 인지질로는 콜레스테롤(cholesterol) 등이; 음전하 화합물로는 DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), DMPA (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) 또는 DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) 등이; 그리고 아민기를 갖는 화합물로는 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 단계 3)에서 하나 이상의 치료제를 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 공정은, 상기 치료제가 치료 유전자인 경우 프로타민(protamine) 등의 생체고분자와의 혼성체 형태로 나노리포좀과 반응시켜 수행할 수 있고, 상기 치료제가 약물인 경우에는 통상적인 황산암모늄 농도구배법[ammonium sulfate gradient method, Bowen T 등, International Journal of Pharmaceutics (2011), 416, 443-447]을 통해 상온에서 교반시켜 수행할 수 있다.
또한, 상기 단계 4)의 마이크로버블과 나노리포좀의 복합체 형성 반응은 pH, 반응온도 또는 반응시간 등의 조절을 통해 마이크로버블의 지질구조체와 나노리포좀의 지질구조체의 일부분을 변형하여 진탕반응시킴으로써 간단하게 공유결합을 유도하여 수행할 수 있다.
또한, 상기 단계 5)의 항체 등의 타겟팅 모이어티(targetting moiety)를 복합체 외부에 결합시키는 공정은 통상적인 반응을 통해 타겟팅 모이어티를 본 발명의 복합체 표면에 직접 또는 간접적으로 공유 또는 비공유 방식으로 결합시켜 수행할 수 있으며, 예를 들어 이온결합, 정전기적 결합, 소수성 결합, 수소 결합, 공유결합, 친수성 결합, 또는 반데르 발스 결합을 통해 결합시켜 수행할 수 있다. 이때, 상기 간접 결합의 경우 결합제 등의 중간 매개체(intervening agent)가 사용될 수 있는데, 이때 중간 매개체로는 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계 1) 또는 2)는 제조된 마이크로버블 또는 나노리포좀에 형광물질을 첨가 후 반응시켜 형광물질을 상기 마이크로버블 또는 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 형광물질을 마이크로버블 또는 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 공정은, 상기 형광물질이 소수성인 경우 마이크로버블과, 또는 상기 형광물질이 친수성인 경우 나노리포좀과 통상적인 방법에 따라 30℃에서 교반 또는 초음파분산(sonication)시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 포함하는 암세포 특이적 초음파, 자기공명영상(MRI) 또는 형광 분석용 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 조영제는 생체 내에서 강력하고 특이적으로 암세포를 조영(contrast) 또는 영상화(imaging)하기 위해 체내 투여되는 물질을 말하는 것으로, 현재 의료, 진단 분야에서 조직 및 세포의 이미지 강화를 위해 광범위하게 사용되고 있다. 본 발명의 조영제라는 용어는 종래 알려진 CT, PET 또는 MRI 조영제의 범위로 한정되지 않으며 초음파 이미지 분석용 영상제, 형광 이미지 분석용 영상제 등을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 일실시예에서는 형광물질, 타겟 유전자, 항체 등을 담지시킨 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 이용하여 초음파 분석, MRI 분석, 형광 분석이 용이하게 이루어짐을 확인하였다 (시험예 7 참조).
본 발명의 조영제 조성물은 암세포 또는 암조직의 표적 및 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구 제형은 바람직하게는 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 포함하는 멸균 수용액 또는 현탁액을 포함하며, 약학적 수용액 또는 현탁액의 다양한 제조기술이 당업계에 공지되어 있다. 상기 용액은 또한 약학적으로 허용되는 완충제, 안정제, 항산화제 및 염화나트륨과 같은 전해질을 포함할 수 있다. 비경구 제형은 직접 주사되거나 대용량의 비경구 제형과 혼합될 수 있다.
경구 투여용 제형은 매우 다양할 수 있으며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로 그러한 제형은 진단적 유효량의 본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 포함하는 수용액 또는 현탁액을 포함한다. 상기 경구 제형은 선택적으로 완충제, 계면활성제, 보조제(adjuvant), 요변성제(thixotropic agent) 등을 포함할 수 있다. 또한 경구 투여용 제형은 향미료 및 기타 관능성을 증가시키기 위한 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조영제 조성물은 이미징 영상의 목적하는 조영 효과를 달성하는데 유효한 양으로 투여된다. 그러한 투여량은 영상 절차의 대상인 기관 또는 조직, 사용되는 영상 장치 등에 따라 광범위하게 변할 수 있다. 상기 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 조영제로서 사용하기 위한 투여 농도는 0.1 mM 내지 10 M이 될 수 있다.
본 발명의 조영제 조성물은 영상 진단 분석의 통상적인 방식으로 사용된다. 예를 들어, 상기 조영제 조성물을 포유동물에 전신적으로 또는 영상화되는 기관 또는 조직에 국부적으로, 적절한 시각화를 제공하는데 충분한 양으로 투여한 다음, 포유동물을 초음파 촬영 또는 MRI 촬영할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 마이크로버블-나노리포좀 복합체와, 항암제 또는 항암 유전자를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체에 항암제 또는 항암 유전자를 도입시켜 암세포의 사멸 또는 암조직의 성장 억제 효과를 확인함으로써, 암 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 (시험예 6 및 7 참조).
본 발명의 항암용 약학 조성물이 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서 공지의 항암제 또는 항암 유전자를 담지시킨 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제화 시에 통상적으로 이용되는 것으로서 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인살 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 주사제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 건강상태, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여방법 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 당 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법
1) 실험재료
DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), 콜레스테롤(cholesterol), DCP (dicetyl phosphate), DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]}, 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 트라우츠 시약(Trauts Reagent, 2-iminothiolane), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 및 프로타민(protamine)은 모두 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였으며, 별도의 변형을 가하지 않고 사용하였다.
2) 세포 배양
유방암 세포주인 SkBr3를 10% FBS 함유 RPMI 1640 배지(Hyclone, Logan, UT)에서 습기를 가한 5% CO2 대기 및 37℃ 온도 조건 하에 배양하였다.
3) MTT 분석
MTT 분석키트(Sigma-Aldrich 사)를 사용한 세포독성 시험(cytotoxicity assay)을 다음과 같이 수행하였다.
배양된 세포주를 시험에 사용하기 위해 배지제거 후 세척하고 트립신 처리 후 재부유(resuspend)시켜 회수하였다. 회수된 세포들을 96-웰 플레이트(96-well plate)에 웰 당 5,000 세포의 농도로 넣어 5% CO2 대기 및 37℃ 온도 조건하에 밤새 배양하였다. 배양된 세포에 시험 용액을 다양한 농도로 처리한 후, 처리된 세포들을 다시 동일 조건하에 일정시험시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 웰 당 MTT 용액 0.1 ml씩을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 3시간 동안 반응시킨 후 MTT 용액을 제거하였으며, 여기에 MTT 가용화 용액(MTT solubilization solution) 0.1 ml 씩을 첨가하여 포르마잔 크리스탈(formazan crystals)을 용해시켰다. 웰 플레이트를 ELISA 리더(reader)를 사용해 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포생존성을 결정하였다.
제조예: 본 발명에 따른 마이크로버블(MB)-나노리포좀 복합체의 제조
단계 1) 마이크로버블(MB) 제조
DPPC, 콜레스테롤, 마이크로버블의 뭉침을 막기 위한 음전하(negative charge) 화합물인 DCP, 아민 말단기를 갖는 화합물인 DPPE 및 다이설파이드기(disulfide)를 갖는 화합물인 DSPE-PEG-SPDP를 각각 15.4 mg, 3.5 mg, 1.0 mg, 1.2 mg 및 5 mg 씩 5 mL 클로로포름(chloroform)에 용해시켰다. 얻어진 용액을 회전식 증발농축기(Rotary evaporator)에 넣어 35℃에서 5분 동안 반응시켜 용매인 클로로포름을 제거한 후, -45℃에서 약 24시간 동결건조시켜 필름을 제조하였다. 여기에 글리세린, 프로필렌글리콜 및 물을 혼합한 용매(glycerin:propylene glycol:H2O=1:2:7) 2 mL를 가하여 혼합한 후 수득한 혼합용액을 밀봉된 병(hermetic vial)에 담았다. 여기에 SF6 가스(gas)를 충진한 후 진동기(vibrator)로 15초 동안 진동시켜 마이크로버블(MB)을 제조하였다.
단계 1-1) 마이크로버블 구조 내에 소수성 형광물질 담지
상기 단계 1)에서 제조된 마이크로버블에 녹색 형광을 갖는 소수성 유기 형광 염료인 FITC 0.1 mg을 가하고 상온에서 교반 반응시켜 형광물질을 구조 내부에 담지시킨 마이크로버블을 수득하였다(평균직경: 1 ~ 2 ㎛).
단계 2) 나노리포좀 제조
DPPC, 콜레스테롤, 나노리포좀의 뭉침을 막기 위한 음전하 화합물인 DCP 및 아민 말단기를 갖는 화합물인 DPPE를 각각 15.4 mg, 3.5 mg, 1.0 mg 및 1.2 mg 씩 5 mL 클로로포름에 넣어 용해시켰다. 얻어진 용액을 회전 증발농축기에 넣어 35℃에서 5분 동안 반응시켜 용매를 제거한 후 -45℃에서 약 24시간 동안 동결건조시켜 필름을 제조하였다. 수득한 필름에 H2O 2 mL을 가한 후 초음파 분산기(sonicator)를 이용하여 60℃에서 5분 동안 분산시킨 후, 액체 질소를 이용하여 동결 및 해동을 5회 반복하여 리포좀 혼합용액을 제조하였다. 이 리포좀 혼합용액을 200 nm 필터로 60℃에서 2회 여과하여 입자크기가 200 nm 이하인 나노리포좀을 제조하였다.
단계 2-1) 나노리포좀 구조 내에 친수성 형광물질 담지
상기 단계 2)에서 제조한 나노리포좀에 붉은색 형광을 나타내는 친수성 유기 형광 염료인 텍사스-레드(Texas-red) 0.1 mg을 가하고 상온에서 교반시켜 형광물질을 구조 내부에 담지시킨 나노리포좀을 수득하였다(평균크기: 100~200 nm).
단계 3) 나노리포좀 구조 내에 약물 및 유전자 담지
상기 단계 2) 또는 2-1)에서 수득한 나노리포좀을 대상으로 다음과 같은 반응을 수행하여 나노리포좀 구조 내부에 유전자 및/또는 약물을 담지시켰다.
상기 나노리포좀을 동결건조한 후 수득한 파우더(powder) 형태의 나노리포좀(21 mg)에 녹색형광단백질(green fluorescent protein, tGFP) 발현 플라스미드 유전자 26.6 ㎍ 및 프로타민(protamine) 18.8 μM 함유 혼합용액 0.1 ml을 가하여 25℃에서 5분 동안 진탕(shaking)시켰다. 생성된 반응 혼합물을 13000 rpm에서 5분 동안 2회 원심분리하여 리포좀에 포집되지 않은 잔여 유전자 및 프로타민을 제거하여 치료 유전자가 구조 내부에 담지된 나노리포좀을 수득하였다.
또한, 암 치료에 효과적인 것으로 알려진 0.5 ~ 20 mM의 독소루비신(doxorubicin) 용액을 1 ~ 120 mM 농도의 상기 나노리포좀 용액에 첨가한 후, 상온에서 교반하여 나노리포좀 내부에 있던 황산암모늄이 삼투압 현상에 의해서 외부에 있는 독소루비신과 교체되어 독소루비신을 나노리포좀 내부에 담지시킴으로써 구조 내부에 약물(독소루비신)을 함유하는 나노리포좀을 제조하였다.
단계 4) 마이크로버블-나노리포좀 복합체 제조
상기 단계 1) 또는 1-1)에서 수득한 마이크로버블 0.2 mL; 및 상기 단계 3)에서 수득한 나노리포좀 1.8 mL를 밀봉 병(hermetic vial)에 넣고 pH를 8로 조정 후 25℃에서 2시간 동안 진탕반응시켜 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하였다.
단계 5) 마이크로버블-나노리포좀 복합체 외부에 항체 결합
상기 단계 4)에서 제조된 복합체에 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 5 mg을 가한 후 pH를 8로 조정하여 25℃에서 3시간 동안 진탕시켰으며, 얻어진 말레이미드(maleimide)-마이크로버블-나노리포좀 복합체 용액에 유방암 세포에 특이적인 항-HER2 단일클론 항체(anti-HER2 monoclonal antibody)인 헤르셉틴(Herceptin) 0.1 mL를 가하고 pH를 7로 조정한 후 4℃에서 24시간동안 진탕반응시켜 복합체 외부에 항체를 결합시켰다. 얻어진 혼합용액을 13000 rpm에서 5분 동안 2 회 원심분리하여 미반응 물질을 제거함으로써 본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하였다.
시험예 1: 본 발명의 마이크로버블 ( MB )- 나노리포좀 복합체의 물성 확인
1) 광학현미경, 극저온 전자 현미경 및 동적광산란 분석
상기 제조예의 단계 1) 또는 1-1)에서 수득한 마이크로버블 및 상기 제조예의 단계 2), 2-1) 또는 3)에서 수득한 나노리포좀을 대상으로 광학현미경(optical microscope), 극저온 전자 현미경(cryogenic electron microscopy, Cryo-EM) 및 동적광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석을 수행하여 각 분자 모양 및 크기 분포를 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마이크로버블(MB)은 구형의 모양을 갖고 있으며 평균 크기는 1.713 ㎛였고, 나노리포좀 역시 구형의 모양에 평균 크기 197 nm를 나타내었다. 또한, 마이크로버블 및 나노리포좀은 모두 균일한 입자 크기 분포를 나타내는 것으로 확인되었다.
2) 공초점 형광 현미경 분석 및 자외-가시선 분광분석
본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 조영 효과 및 안정성을 확인하기 위해, 상기 제조예에서 제조된 복합체를 대상으로 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope) 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 저배율 분석에서는 대부분 입자 들이 붉은색 형광과 녹색 형광을 동시에 갖고 있음을 확인하였으며, 이로부터 녹색 형광의 FITC를 함유하는 마이크로버블과 붉은색 형광의 텍사스 레드를 함유하는 나노리포좀이 한 입자 내에 잘 결합되어 있음을 알 수 있었다. 또한, 도 3의 삽입 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 고배율 분석에서는 입자 내부의 녹색 형광과 외부의 붉은색 형광이 뚜렷하게 관찰되었으며, 이로써 본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체가 도 1에서와 같이 마이크로버블의 표면에 나노리포좀이 결합되어 있는 구형의 구조로 이루어졌음을 육안으로 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 평균 약 1-2 ㎛ 직경의 균일한 크기 분포를 나타내는 것을 확인하였다.
한편, 본 발명의 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 마이크로버블과 나노리포좀이 화학적 안정성이 우수한 공유결합으로 결합되어 있어, 입자 내에 담지된 유전자, 약물 또는 형광물질을 생체 내 표적 기관, 조직 또는 세포로 운송 및 전달하는 데 우수한 안정성을 나타낸다. 따라서 상기 제조예에서 제조된 복합체가 공유결합으로 결합되어 있는지 확인하기 위해, 자외-가시선 분광분석(UV-vis spectroscopy)을 통해 공유결합시 발생되는 부산물인 SPDP(N-succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]-propionate)의 존재 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 340 nm 영역에서 SPDP를 확인할 수 있었으며, 텍사스 레드와 FITC 형광도 확인되었다. 이로써 본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 마이크로버블과 나노리포좀이 화학적 안정성이 우수한 공유결합으로 결합되어 있어, 입자 구조 내에 담지된 유전자, 약물 또는 형광물질을 생체 내 표적 기관, 조직 또는 세포로 운송 및 전달하는 데 우수한 안정성을 나타낼 것을 기대할 수 있다.
3) 초음파 조영 분석
본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 초음파 조영 효과를 확인하기 위해, 시판중인 마이크로버블 초음파 조영제인 SonoVue(TM)와 상기 제조예에서 제조된 복합체 및 상기 제조예의 단계 1) 또는 1-1)에서 수득한 마이크로버블을 각각 사용하여 임상에서 사용되고 있는 초음파 영상 장치(IU22, Philips사)를 통한 인공혈관 팬텀에서의 초음파 조영 효과를 비교 분석하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 제조예의 단계 1) 또는 1-1)에서 수득한 마이크로버블(b) 및 단계 5)에서 최종 제조된 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체(c)는 기존 시판 제품(a)과 비교하여도 충분히 높은 수준의 조영 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 이렇게 우수한 안정성을 갖는 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체가 표적 기관, 조직 또는 세포에 도달했을 때 외부 음파의 자극으로 파괴되어 구조 내부에 담지되어 있던 하나 이상의 치료제 또는 형광물질을 표적 세포에 효과적으로 전달할 수 있는지를 확인하기 위해, 초음파 영상 장치(IU22, Philips사)를 통해 총 10회의 음파 자극(기계지수: 0.7)을 수행하여 인공혈관 팬텀에서의 초음파 조영 효과가 어떻게 변화하는지를 확인하였으며, 그 결과를 도 6의 사진 및 그래프로 나타내었다. 본 발명의 복합체를 초음파에서 고에너지 또는 높은 기계지수에 노출시키는 것을 플래쉬(flash)라고 한다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 음파 자극의 횟수가 증가함에 따라 복합체의 구조가 파괴되어 초음파 조영 효과가 크게 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 5회 이상에서는 대부분의 복합체의 구조가 파괴되어 조영 효과가 거의 사라지는 것을 확인하였다. 이로써 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체가 암세포와 같은 타겟 부위에 하나 이상의 치료제 뿐 아니라 형광물질을 동시에 효과적으로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
4) 단백질 정량 분석(BSA 분석)
본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 표면에 결합된 항체의 양을 확인하기 위해, 상기 제조예에서 제조된 MB-나노리포좀 복합체를 대상으로 당분야에 통상적인 단백질 분석 기법인 BSA 분석을 실시하였으며, 이때 분광분석은 자외-가시선 분광분석기(UV-vis spectrometer)를 사용하여 수행되었다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 파장 560 nm에서 표면에 도입된 항체가 검출되었으며 그 양은 정량분석을 통해 복합체 1 mg 당 1.62 μM임을 확인하였다.
시험예 2: 본 발명의 마이크로버블 ( MB )- 나노리포좀 복합체를 이용한 다중 영상 분석 시험
본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 암세포 표적 특이성을 확인하기 위해, 상기 제조예에서 제조된 복합체와 대조군으로써 상기 제조예의 단계 4)에서 수득한 항체를 함유하지 않는 마이크로버블(MB)-나노리포좀 복합체를 각각 사용하여 유방암 세포주인 SkBr3 세포를 대상으로 공초점 형광 현미경을 통한 다중 영상 분석(multimodal imaging analysis) 및 FACS 분석을 실시하여 비교하였다.
그 결과, 도 8의 a에서 볼 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 유방암 세포 및 항체를 함유하지 않는 MB-나노리포좀 복합체에서는 형광조영이 거의 나타나지 않은 반면, 본 발명에 따른 항체 함유 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 경우 표적 세포에서 매우 우수한 형광 조영을 나타냄을 확인하였다. 또한 FACS를 사용한 정량 분석을 통해 녹색 및 붉은색 형광의 세포 함유량이 94% 이상으로 우수한 것을 확인하였다(도 8의 b). 이로써 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체가 항체결합을 통해 우수한 표적 특이성을 나타냄을 알 수 있다.
또한, 외부 음파 자극에 의해서 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 내부에 담지되어 있는 형광물질이 암세포 특이적으로 세포내부에 전달될 수 있는지를 확인하기 위해, 초음파 영상 장치를 통해 음파 자극(기계지수: 0.7)을 1분 동안 가한 후 공초점 형광 현미경으로 형광 조영을 확인하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체 내부에 담지되어 있던 녹색 형광 염료인 FITC 및 붉은색 형광 염료인 텍사스 레드가 SkBr3 특이적으로 세포 내에 침투되어 암세포의 형광 조영을 가능하게 함을 확인하였다. 이로써 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 이용하여 특정 암 조직 또는 세포 표적에 특이적인 다중 영상 분석을 통한 효과적인 진단이 가능함을 알 수 있다.
시험예 3: 본 발명의 마이크로버블 ( MB )- 나노리포좀 복합체를 이용한 약물 전달 시험
본 발명의 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 치료제 전달 효과를 확인하기 위해, 상기 제조예에서 제조된 복합체를 대상으로 자외-가시선 분광기를 이용한 분광분석을 수행하여 복합체에 담지된 약물(독소루비신)의 포집 효율을 확인하였다.
그 결과, 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 복합체에 함유된 대표 항암제인 독소루비신(doxorubicin)의 포집 효율은 88.57%였으며, 따라서 본 발명의 복합체는 내부에 암 치료에 관여하는 다양한 약물을 효과적으로 담지하여 표적 세포에 전달할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 복합체를 이용한 암세포 치료의 효용성을 확인하기 위해 상기 제조예에서 제조된 MB-나노리포좀 복합체를 이용하여 다음과 같은 세포독성(cytotoxicity) 시험을 수행하였다. 먼저, 유방암 세포주인 Skbr3에 상기 제조예에서 제조된 독소루비신이 내부에 담지된 마이크로버블-나노리포좀 복합체 10 mg 또는 대조예로 독소루비신 자체 0.2 ㎍을 각각 처리한 후 3시간 동안 배양하였다. 이후 세포에 결합하지 않은 복합체들을 제거하고 강한 초음파(기계지수: 0.7)를 5분 동안 가한 후 또다시 3시간 동안 배양하였으며, 처리 배지 제거 후 일정 시간(24시간, 48시간 또는 72시간) 동안 배양한 후 MTT 분석을 수행하여 세포독성을 확인하였다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 항암제 함유 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 약물을 처리하지 않은 세포주 뿐 아니라 항암제 자체만 처리한 세포주와 비교하여도 우수한 세포독성을 나타냄을 확인하였다(약물만 처리한 경우 72시간이 지나도 85%의 세포 생존율을 나타낸 반면, 본 발명의 복합체를 처리한 경우 24시간 후 63%, 48시간 후 61%, 그리고 72시간 후 35%의 생존율을 나타냄). 이로써 본 발명의 복합체를 사용하는 경우 복합체에 결합되어 있는 항체로 인한 세포 특이성으로 인해 약물이 암세포 특이적으로 세포 내부로 효과적으로 전달되어 우수한 치료효과를 가져올 수 있음을 알 수 있다.
시험예 4: 본 발명의 마이크로버블 ( MB )- 나노리포좀 복합체를 이용한 유전자 전달 시험
본 발명에 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 유전자 전달 효과를 확인하기 위해, 상기 제조예에서 제조된 녹색 형광 단백질인 tGFP(turbo green fluorescent protein, tGFP) 발현 플라스미드가 내부에 담지된 복합체를 사용하여 유방암 세포주인 SkBr3를 대상으로 다음과 같이 유전자 전달 효과를 확인하였다.
먼저, 분광광도기(spectrophotometer, Nano drop)를 이용하여 상기 제조예에서 제조된 복합체 내 담지된 tGFP 발현 플라스미드의 포집 효율이 약 30%임을 확인하였다. 또한, 복합체 10 mg을 SkBr3에 처리하여 3시간 동안 배양한 후 세포에 결합하지 않은 복합체들을 제거하고 강한 초음파(기계지수(mechanical index): 0.07)를 5분 동안 처리하였으며, 이때 대조군으로 일부 세포들은 초음파 처리를 생략하였다. 대상 세포들을 3시간 동안 추가 배양한 후 복합체를 모두 제거하였으며, 일정 시간(48시간, 72시간 또는 96시간) 동안 배양 후 공초점 형광 현미경을 사용하여 tGFP의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 초음파 처리를 생략한 대조군과 비교하여 본 발명의 복합체를 처리하고 초음파 처리한 세포군에서 시간이 지남에 따라 녹색 형광이 강해진 것을 확인하였다. 이는 tGFP가 세포 내부에서 발현되고 있음을 의미하는 것으로, 따라서 강한 초음파의 처리를 통해 본 발명의 복합체가 파괴되어 내부에 담지되어 있던 플라스미드가 표적 세포 내부로 효과적으로 전달되어 tGFP가 발현되었음을 알 수 있다.
결과적으로, 본 발명의 따른 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 마이크로버블과 나노리포좀이 화학적으로 안정적인 공유결합을 통해 결합되어 있으며, 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀 구조 내에 다양한 치료 유전자 및 약물 등의 하나 이상의 치료제 뿐 아니라 추가의 소수성 또는 친수성 형광물질을 하나 이상 담지할 수 있으면서 복합체 외부에 타겟팅 모이어티(targetting moiety)가 결합되어 있으므로, 암 세포 특이적인 초음파 조영 또는 형광 조영을 이용하여 다중 영상 분석(multimodal imaging analysis)을 통해 암을 정확히 진단함과 동시에 하나 이상의 치료제를 표적 암 세포에 접근할 때까지 안정적으로 담지하고 표적 세포 특이적으로 전달할 수 있어 암을 효과적으로 치료할 수 있으므로, 암의 진단 및 치료제 개발에 광범위하게 활용될 수 있다.
시험예 5: 유전자 전달 물질로서 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 적용
녹색형광단백질 플라스미드 DNA (pGFP, 10 kbp)를 나노리포좀(Lipo)의 친수성 영역 내부에 위치시켰다. pGFP 로딩 효율을 증가시키기 위해, 프로타민(protamine; PA, 7.5 kD)을 이용한 복합 방법을 사용하였다. pGFP는 서로 다른 농도 비율로 PA와 결합시켜 pGFP 당 600 PAs를 나타내는 20 μM PA 및 34 nM pGFP가 되도록 PA-pGFP 복합체 비를 최적화하였다. 약한 양전하를 띄는 상기 복합체는 음전하를 띄는 Lipo로 이동하여 95% 이상의 로딩용량(loading capacity)을 나타내었다 (도 13 참조). 이하 도면의 설명에서 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 팝-파티클로도 표현된다.
도 13은 PA와 pGFP 복합체의 최적화 및 로딩용량을 측정한 것이다. 프로타민(PA)과 플라스미드-GFP(pGFP)의 복합체는 몰 비율로 최적화되었고 전기영동 시험에 의해 PA와 pGFP의 정확한 수치를 특정할 수 있다. 그 결과, 7.5 kD의 600 PAs는 하나의 10 kbp pGFP와 연결된다. PA-pGFP 복합체는 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 나노리포좀 안으로 전달될 수 있는데, 이는 상기 복합체가 지속적인 양전하를 갖고 있기 때문이다.
pGFP가 포함된 나노리포좀을 동일한 연결 과정으로 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체 시스템에 제시하였다. 붉은색 형광(red dye) 및 pGFP를 포함하고 Her2 수용체 항체를 표면에 부착한 마이크로 버블-나노리포좀 복합체, MB-Lipo(R+pGFP)-Her2Ab를 유방암 세포주인 SKBR3에 1시간 동안 처리한 후 1분간 고 초음파 에너지 (Mechanical index: 0.61)를 노출 (이를 ‘flash’라 한다) 시켰다. 이후 세포들을 48시간 동안 계속 배양하였다.
도 14는 본 발명의 마이크로버블-나노리포좀 복합체 시스템의 pGFP 전이 효과를 비교한 것이다. 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 플라스미드 유전자 전달 효과를 상업적으로 구할 수 있는 대표적인 형질주입 물질인 LipofectamineTM과 비교하였다. SKBR3 세포에 발현된 녹색 형광 단백질은 저배율의 공초점레이저형광현미경(CLSM)으로 관찰된 단일 세포에서 녹색 점으로 관찰되었다. 유세포분석기(FACS) 연구를 이용한 정량분석으로 특정하였다. 마이크로버블-나노리포좀 복합체 시스템은 LipofetamineTM과 비교하여 3배 정도 플라스미드 유전자 전이가 우수하다. 고배율로 관찰시, 대부분의 암 세포는 세포기질에서 녹색 단백질을 포함하였다(b right-hand corner). 게다가, 마이크로버블-나노리포좀 복합체 시스템은 심장 섬유아세포에서 추출된 1차세포(CFt)로 pGFP 전이가 되며, 상기 시스템은 CLSM 및 FACS 분석에 의해 약 60%의 높은 효과가 있음이 나타났다.
도 14에서, 대조군으로서 대표적으로 세포 실험에 사용되는 형질 주입 물질인 LipofectamineTM (a)에 비하여 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 대부분 세포의 세포기질에서 밝은 녹색 형광을 나타내었고 LipofectamineTM 보다 높은 우수한 전달 효율(3배)을 나타내었다. 게다가, 심장 섬유아세포 일차세포주(CFf)에 특이적인 CD29 항체를 가진 마이크로버블-나노리포좀 복합체 합성하여 pGFP 전이에 사용하였다. 이는 세포주에 전이시키기 어려운 유전자로 알려져 있으나 좋은 효율을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 상기 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 타겟팅 및 초음파 에너지 자극 실험(시험예 3, 4, 5)에 기초한 임의의 세포에 대한 목적 유전자 전달체로 용이하였다.
시험예 6: 약물 또는 siRNA 전달체로서 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 치료적 적용
독소루비신(Doxorubicin, Dox)은 암 치료에 사용되는 약물이며 핵에서 DNA에 끼어들어 작동한다. Dox는 황산암모늄 구배 방법에 따라 (Haran, G., et al., Biochim. Biophys . Acta 1151, 201-215 (1993)), 나노리포좀(Lipo)의 친수성 코어 내부에 쉽게 포함될 수 있다.
도 15는 팝-파티클에서 독소루비신의 로딩용량 및 세포에서의 특성을 모니터한 것이다. Dox는 황산 암모늄 구배법을 통하여 팝-파티클(마이크로버블-나노리포좀 복합체)의 나노리포좀으로 삽입되었고, 전달 효과는 자외-가시광 흡수 시험을 통해 정량적으로 산출되었다.
도 15에서, Dox의 로딩 효율은 UV-Vis 분광법을 이용하여 90% 이상으로 확인되었다 (도 15의 a). Her2 수용체 항체가 부착되고 Dox를 포함한 마이크로버블- 나노리포좀(DPPC 2.1 mM 및 Dox 19 μM)인 MB-Lipo(Dox)-Her2Ab는 유방암 세포 치료를 진척시켰다. 로딩된 Dox는 CLSM 측정에서 자가-붉은색 형광을 나타내는 전좌(translocation)를 간단하게 모니터될 수 있다 (도 15의 b). 그것은 타겟팅 시점에 세포막 상에서 나타났으며 상기 조건과 같은 초음파 에너지에 노출시키는 플래쉬(flash) 적용 후 세포질에서 사라졌다. 24시간 동안 계속 배양함에 따라, Dox는 세포핵에 침투되었다. 세포 사멸로 인하여 48시간 후에는 건강한 세포 형태를 관찰할 수 없었다. 초음파 노출의 대조 실험군으로서, 초음파에 노출 되지 않은 세포는 48시간 배양에서 살아있었다 (푸른색: DAPI 염색). 이는 마이크로버블-나노리포좀 복합체 시스템이 적절한 에너지의 초음파가 노출 된 경우에만 선택적으로 치료제를 전달하는 것을 의미한다.
도 16은 약물 및 치료 유전자 전달과 같은 치료적 마이크로버블-나노리포좀 복합체에 대한 세포 생존율 시험 결과이다. 도 16의 a에서, Dox를 포함하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 암세포의 세포사멸을 진행시켰으나 (생존율 40% 이하) 마이크로버블-나노리포좀 복합체 없이 초음파만 노출시킨 경우 또는 Dox만 처리된 세포는 세포생존율의 유의한 감소가 없었다. 즉, Dox를 포함하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체로 치료한 세포에 대한 분석은 72시간에서 동일한 농도의 유리 Dox 처리 시(생존율 ~90%) 보다 세포 사멸을 더 높게(생존율 ~35%) 유도함을 나타내었다 (도 16의 a). 도 16의 b에서, 치료 유전자 전달에 대한 실험에서는 항암제의 실험과 마찬가지 결과로서 마이크로버블-나노리포좀 복합체 없이 초음파만 노출시킨 경우 또는 siSTAT3만 투여한 세포들은 세포생존율에 영향을 미치지 않았다. 또한, siSTAT3를 포함하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체만 처치하고 초음파를 노출 시키지 않은 경우 72시간에서 세포생존율이 약간 감소되었으나 120시간에서 세포수는 오히려 증가되었는데, 이는 비-효과적인 siSTAT3 유전자 전달로 인하여 세포 증식 과정이 회복된 것으로 판단된다. 그러나 siSTAT3를 포함하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 처치하고 초음파를 노출시킨 후의 세포는 120시간 후에서 약 ~30%의 낮은 생존율을 나타내었다. 도 16의 c에서, 이중 치료적 팝-파티클(Dox+siSTAT3)로 암세포를 처리하는 경우에는 동일한 120 시간에서 약 10%만의 세포 생존율을 보여서 현저한 치료 효과를 나타내었다. 대조군으로서 Dox와 siSTAT3 (Dox+siSTAT3)만을 처리하거나 초음파의 노출이 없는 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 세포사멸을 유도하는데 있어서 높은 효과를 나타내지 못했다. 또한 도 16의 d에서, 치료 시험 동안 현미경으로 세포 밀도를 모니터하였다. 실제로, 72시간 및 120시간에서 Dox와 siSTAT3를 포함하고 있는 마이크로버블-나노리포좀 복합체(Dox+siSTAT3)에 의하여 처리된 세포는 밀도가 낮게 나타났으며 48시간에서 세포자살 세포에 대한 전형적인 형태를 명확하게 관찰할 수 있었다.
STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)은 전사인자이고 STAT3 유전자에 의해 암호화되는 그 단백질은 세포 증식에 관여하는 STAT 단백질 패밀리에 속한다. 최근의 STAT3에 대한 종양 억제 siRNA는 경로가 사멸 수용체 DR4 및 DR5와 관련되어 있는 것으로 보고되어 있다 (Kang, Y. et al. Biochim. Biophys. Acta 1830, 2638-2648 (2013)). 유전자 도입 과정과 같이, STAT3에 대한 siRNA(siSTST3)는 PA 복합체 형성 후 리포좀에 간단히 삽입되어 유사한 로딩 용량 약 95%를 나타내었다. SKBR3에 siSTAT3의 전달 후, 타겟 유전자 및 단백질은 PCR 및 웨스턴 블롯팅을 이용하여 발현 수준을 측정하였다 (도 17의 a와 b 참조).
도 17은 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체(siSTAT3) 처리 및 세포사멸 시험 후 암세포에서 STAT3 단백질 및 유전자에 대한 발현 수준을 측정한 것이다. siSTAT3를 포함하고 항체가 있는 마이크로버블-나노리포좀 복합체, 즉 MB-Lipo(siSTAT3)-Her2Ab로 처리한 후 암세포는 PCR 및 웨스턴 블롯으로 타겟 STAT3 유전자 및 단백질 수준을 측정하였다.
도 17의 a와 b에서, siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체(siSTAT3)로 처리된 세포의 타겟 단백질 발현 수준은 그 타겟 유전자 및 단백질 강도가 현저하게 감소되었다. 대조군으로서 초음파만 노출시킨 세포나 siSTAT3만 투여한 세포는 STAT3 유전자의 발현에서 별다른 변화를 보이지 않았다. 정량적인 분석을 하였을 때 상기 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체(siSTAT3), MB-Lipo(siSTAT3)-Her2Ab는 대조군으로서 초음파만 노출하였거나 또는 네이키드(naked) siSTAT3 처리한 세포들와 비교하여 5배의 타겟 STAT3 유전자 및 단백질의 억제 수준을 나타내었다.
또한 도 17의 c와 d에서, siSTAT3 전달을 통해 세포 사멸 메커니즘을 규명하기 위해, 본 발명자들은 세포 증식 및 세포자살성 세포사멸과 관련되어 있는 cyclin-D1, c-Myc, cyclin-D2 및 caspase3에 대한 유전자와 단백질들을 조사하였다. 이들은 대조군과 비교하여 STAT3와 cyclin-D1, c-Myc 및 cyclin-D2의 억제 수준이 유의하게 나타났다. 또한, siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체(siSTAT3)에 처리된 세포는 세포자살(apoptosis)에 대한 지시 단백질인, caspase3이 활성화되었으며 이는 세포자살성 세포사멸 과정이 이어짐을 의미한다. 대조군으로서 네이키드 siSTAT3로 처리되거나 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체(siSTAT3)에 처리되었다 하더라도 초음파에 노출 되지 않은 세포는 세포사멸 과정을 나타내지 않았다.
도 16에서, siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체(siSTAT3)에 처리되고 초음파에 노출 된 세포는 120시간에서 세포 생존율이 ~ 30%였다. 또한, 마이크로버블-나노리포좀 복합체 시스템의 상승적 치료 효과를 강화하기 위해, 본 발명자들은 Dox와 siSTAT3를 동시에 포함하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체로 암세포를 처리를 진행하였다. 72시간에서 세포생존율이 ~20%, 120시간에서 10% 이하로 나타났다. 현미경으로 처리 동안의 세포를 관찰하였을 때, 120시간에서 생존할 세포를 사실상 찾지 못했다 (도 16의 d). 또한 48시간에서 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체(Dox+siSTAT3) 치료 동안 세포자살성 세포 형태를 확인하였다.
시험예 7: 동물모델의 생체 내에서 초음파 기반 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 치료진단 적용
초음파(ultrasound, US)에 기초한 마이크로버블-나노리포좀 복합체의 생체내 진단 및 자극-반응성 치료를 확인하기 위해, 신장에 VX2 간암세포의 이식을 통해 암 발생 토끼 동물모델을 제조하였다. 지난 수십년간, 토끼는 VX2 암종(carcinoma)을 지닌 악성종양의 진단 및 치료의 실험 연구에 사용되어 왔다 (Virmani, S. et al. J. Vasc . Interv . Radiol. 18, 1280-1286 (2007)). 본 발명자가 개발한 마이크로버블-나노리포좀을 이용한 타겟 특이적인 약물 및 유전자 전달을 확인하기 위해, 이식된 VX2 암 조직이 세포-타겟팅 마커를 적절하게 발현하는지를 확인하였다.
도 18은 토끼의 신장에서 이식된 VX2 암의 특성을 나타낸 것이다. 도 18의 a에서, 신장에서 생긴 VX2 종양의 Her2 수용체 발현을 확인하기 위해, 포매된 종양(embedded tumor)(양성) 및 토끼 근육 조직(음성 대조군)의 조직학적 절단한 후 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 도 18의 b에서, Her2 발현을 반영하는 어두운 갈색은 종양 영역에서 나타났다. 도 18의 c에서, Her2 수용체 발현 수준은 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 이식된 VX2 암은 상대적으로 높은 Her2 발현 수준을 나타내었다. 도 18의 d에서, 붉은색 형광물질을 함유하고 Her2 항체가 결합된 마이크로버블-나노리포좀 복합체(MB-Lipo(R)-Her2Ab)로 특이적 타겟팅에 대한 능력을 확인한 결과, CLSM에 의해 정상 신장 조직과 비교하여 생체외 시험에서 이식된 암 조직에 대해 충분한 선택성을 나타내었다 (d; D+R; merged DAPI and red fluorescence images).
즉, 포매된 VX2 암은 특정 Her2 수용체를 발현하였고 조직의 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색 및 웨스턴 블로팅을 이용하여 그 수준을 결정하였다. 또한 붉은색 형광물질을 함유하고 Her2 항체가 결합된 마이크로버블-나노리포좀 복합체, MB-Lipo(R)-Her2Ab은 생체외 실험에서 VX2 암 조직을 인식할 수 있었다.
또한, 초음파(US) 이미징과 치료 효과의 이중 능력이 있는 상기 마이크로버블-나노리포좀 복합체는 토끼의 trans-catheter intra-articular (IA) 주사를 통해 신장에 종양을 직접적으로 이식하였다.
도 19는 생체 내에서 약물 및 유전자의 암 특이적 초음파 이미지 및 수송을 나타낸 것이다. (a) Her2 항체가 결합되고 대표적인 항암제인 Dox와 대표적인 siRNA 유전자 치료제인 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체, MB-Lipo(Dox+siSTAT3)-Her2Ab를 IA(intra-articular) 주사한 후, 초음파 영상으로 토끼 신장에서 이식된 종양 영역을 시각화하였고 초음파 에너지를 노출시킨 후 마이크로버블의 파괴로 인해 초음파 영상 신호가 사라짐을 볼 수 있다. (b) 추출된 암 조직에서, CLSM을 이용하여 양성대조군으로서 초음파 에너지에 노출시키지 않은 종양 조직 및 Her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 처리하지 않은 종양조직들과 비교할 때 Her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 처리한 종양 조직은 Dox(붉은색 형광)는 높은 농도를 나타내었다. (c) 또한, Her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체에 의해 전달된 siSTAT3의 효율은 PCR로 STAT3 타겟 유전자 수준을 직접적으로 측정하였으며 세포 실험에서와 마찬가지로 현저히 감소된 수준을 나타내었다. (d) 종양 조직을 H&E 염색으로 조직학적 변화를 분석하였을 때에도 Her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체로 처리한 조직이 그렇지 않은 조직들에 비하여 그 세포 밀도가 감소함을 알 수 있었다.
도 19에서, her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 IA 주사 후, 토끼의 신장에서 발생한 종양은 마이크로버블-나노리포좀의 복합체 중 마이크로버블의 초음파 조영효과에 의하여 초음파 영상에서 고에코를 보여 밝게 이미지되었고 10회의 초음파 고에너지 노출 (Mechanical index: 0.61)후 그 에코는 점차적으로 약해졌다. 반면에 her2 항체가 결합되지 않은 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 대조군 종양에 주입하였을 때, 생체 내에서 항체 결합된 팝-파티클의 강력한 타겟팅 능력을 나타내는 초음파 신호는 높은 강도를 나타내지 않았다 (데이터 미도시). 항암제(Dox) 및 치료 유전자(siSTAT3)를 포함하는 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 토끼에 주사하고 토끼에서 자란 VX2 종양에 초음파 고에너지에 노출 후 종양 조직을 추출하였다. 추출한 종양 조직은 CLSM(Confocal Laser Scanning Microscope) 및 PCR을 통해 항암제와 치료 유전자의 종양조직으로의 전달을 확인하였다. 상기 VX2 암 조직에 전이된 Dox는 스스로 붉은색 형광을 뚜렷하게 나타내었으며 타겟 STAT3 유전자 수준은 전달된 siSTAT3에 의해 해당 유전자의 발현이 억제되었다. 초음파 고에너지에 노출되지 않은 조직은 Dox와 siSTAT3의 효과가 전혀 검출되지 않았고 her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체로 처리하지 않은 대조군도 역시 Dox와 siSTAT3의 효과가 나타나지 않았다. 이는 본 발명의 타겟 지향성 치료제 함유 마이크로버블-나노리포좀 복합체가 단지 특이적 암 사이트에만 전달되어 외부 초음파 고에너지 자극에 의해 치료제의 방출 여부가 조절될 수 있음을 의미한다. H&E 염색에서, 대조군에 비하여 her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체로 치료한 암 조직의 암세포 밀도가 대조군과 비교하여 드문드문 분포하였는데 이는 VX2 종양조직이 마이크로 버블-나노리포좀 복합체를 이용한 전달체의 종양세포로의 전달에 의하여 부분적으로 파괴되었기 때문이다.
또한, 토끼 종양 모델에서 타겟 지향성 치료제 함유 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 반복하여 투여함으로써 실제 임상과 비슷한 환경에서의 생체 내에서 치료 효과를 확인하였다.
도 20은 타겟 지향성 치료제 함유 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 이용하여 토끼 종양에서의 암치료에 대해 평가한 것이다. 생체 내에서 her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체, MB-Lipo(Dox+siSTAT3)-Her2Ab에 의한 종양 성장 저해의 진척을 모니터하기 위해, 정확한 종양 크기를 자기공명영상 (MRI, 횡단면) 및 초음파 영상기기로 측정하였다 (a: 흰색 화살표는 이식된 암 종양을 나타낸다).
도 20에서, her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 실험 시작 1일 및 5일에 반복적으로 투여 하였고 실험 0일, 4일, 10일에 MRI 및 초음파를 이용하여 종양의 정확한 크기를 측정하였다. 상기 her2 항체가 결합되고 Dox와 siSTAT3를 포함한 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 투여하고 초음파의 고에너지를 이용하여 치료한 종괴는 초음파 고에너지를 이용하여 치료하지 않은 종괴나 아예 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 투여하지 않은 종괴와 비교하여 그 성장 속도가 감소되었다.
또한, 토끼 동물 종양 모델에서 her2 항체가 결합된 마이크로 버블- 나노리포좀 복합체의 생체 내 분포(bio-distribution)를 간, 폐, 신장 및 암에서 확인하였다.
도 21은 생채 내에서 형광을 포함한 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 생체 내 분포를 나타낸 것이다. 검출을 위해, 녹색 및 붉은색 형광 마이크로 버블-나노리포좀 복합체, MB(G)-Lipo(R)-Her2Ab를 정맥으로 주사하고 생체 조직 밖의 CLSM 분석에 의해 유기염료 강도를 특성화하였다. 유기염료는 플래쉬 적용에 관계없이 간과 폐 기관에 주로 분포하는 것으로 나타났다. 그러나 종양 조직에서, 상기 염료는 플래쉬 후 약 3배 정도 강도가 증가하였다.
또한, 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 방출(excretion issue)은 임상적용 가능성을 이해하는데 중요하므로 다양한 조직에서 조사되었다.
도 22는 생체 내에서 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 방출을 측정한 것이다. 마이크로 버블-나노리포좀 복합체 시스템을 이용한 조영제(imaging agent) 또는 치료 적용을 시험하기 위해, 방출 시험(excretion study)이 필요하다. 여기서는, 본 발명자들이 마우스 동물모델을 사용하였는데 토끼 보다 빠른 대사 생체 모델이기 때문이다. 형광물질을 포함하고 있는 마이크로 버블-나노리포좀 복합체를 꼬리 정맥으로 주사한 후, 48시간째에 마우스의 여러 장기에서 형광을 측정하였다. 그 결과, 상기 형광물질 함유 마이크로 버블-나노리포좀 복합체는 어떠한 이상 조직 형태가 없이 마우스 체내에서 완전하게 빠져 나갔다. 즉, 형광물질 함유 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 주사 후, 48시간 후 마우스의 여러 장기에서 형광물질 함유 마이크로 버블-나노리포좀 복합체의 분명한 방출을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

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  12. 1) 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물, 아민기를 갖는 화합물 및 다이설파이드기를 갖는 화합물을 유기용매에 넣고 반응시켜 필름을 제조한 후 이를 소수성 가스와 함께 유기 혼합용매에 넣고 진동반응(vibrating)시켜 마이크로버블을 제조하는 단계;
    2) 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물 및 아민기를 갖는 화합물을 유기용매에 넣고 반응시켜 필름을 제조한 후 이를 물에 넣고 초음파분산 및 여과하여 나노리포좀을 제조하는 단계;
    3) 상기 단계 2)에서 얻어진 나노리포좀을 치료제와 반응시켜 치료제를 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 단계;
    4) 상기 단계 1)에서 얻어진 마이크로버블과 상기 단계 3)에서 얻어진 나노리포좀을 혼합하고 진탕(shaking)시켜 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하는 단계; 및
    5) 상기 단계 4)에서 제조된 복합체를 타겟팅 모이어티(targetting moiety)와 반응시켜 타겟팅 모이어티를 복합체 외부에 결합시키는 단계를 포함하는, 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 단계 1) 또는 2)는 마이크로버블 또는 나노리포좀 제조 후 이를 형광물질과 반응시켜 형광물질을 상기 마이크로버블 또는 나노리포좀 구조 내에 담지시키는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이크로버블-나노리포좀 복합체를 제조하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11766485B2 (en) 2017-10-18 2023-09-26 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate having complex of Cas9 protein, guide RNA inhibiting SRD5A2 gene expression and cationic polymer encapsulated in nanoliposome and composition for ameliorating or treating hair loss containing the same
US11944705B2 (en) 2018-06-18 2024-04-02 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same
US11980688B2 (en) 2018-06-18 2024-05-14 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10052394B2 (en) 2014-11-21 2018-08-21 General Electric Company Microbubble tether for diagnostic and therapeutic applications
KR101683463B1 (ko) * 2014-12-19 2016-12-08 서울대학교산학협력단 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체 및 이를 포함하는 조영제
ES2896012T3 (es) * 2017-09-05 2022-02-23 Sintef Tto As Sistema para suministro de componentes médicos a los pulmones
CN109554397A (zh) * 2017-09-26 2019-04-02 广州宏柯源生物科技有限公司 纳米颗粒及其制备方法
KR102076518B1 (ko) * 2018-02-08 2020-02-13 서강대학교산학협력단 수용성 항암제를 담지하는 마이크로버블을 포함하는 간동맥색전술용 조성물 및 그 제조방법
WO2019182353A1 (ko) * 2018-03-20 2019-09-26 (주) 바이오인프라생명과학 약물전달을 위한 초음파 반응형 미소기포를 포함하는 리포좀 제조 방법 및 이를 이용한 리포좀
CN111886002A (zh) * 2018-03-20 2020-11-03 百奥医福股份有限公司 一种包括用于递送药物的超声响应性微泡的脂质体的制备方法以及使用该方法的脂质体
JP7160385B2 (ja) * 2018-06-01 2022-10-25 ソガン ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション 脂質を用いた表面改質によって細胞内摂取効率を向上させたナノ粒子複合体及びその製造方法
CN112055581B (zh) * 2018-09-21 2023-04-07 三育大学校产学协力团 利用包含纳米气泡和药物的药物载体的超声波诱导药物传递系统
GB201908352D0 (en) * 2019-06-11 2019-07-24 Innovation Ulster Ltd Sonodynamic therapy
KR102379296B1 (ko) * 2019-09-02 2022-03-29 (주)아이엠지티 면역 마이크로버블 복합체 및 이의 이용
CN114558133B (zh) * 2021-12-20 2024-02-09 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种同时递送声敏剂和靶向抗体的超声靶向微泡及其制备方法和应用
CN114948876A (zh) * 2022-05-12 2022-08-30 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种多功能微泡及其制备方法和应用
CN115073726B (zh) * 2022-07-04 2023-09-26 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种靶向m2型巨噬细胞甘露糖受体的超声分子探针及其制备方法与应用
KR102610361B1 (ko) * 2022-07-14 2023-12-06 (주) 바이오인프라생명과학 소수성 약물을 전달하기 위한 초음파 감응형 약물전달체를 생성하는 방법 및 이를 이용한 초음파 감응형 약물전달체
CN115192739A (zh) * 2022-08-08 2022-10-18 新疆医科大学第一附属医院 一种用于人卵巢癌的靶向超声造影剂及制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.L. Klibanov et al, Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs, Journal of controlled release, 2010, Vol. 148, pp. 13-17 *
A.L. Klibanov et al, Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs, Journal of controlled release, 2010, Vol. 148, pp. 13-17*
B. GEERS et al, Self-assembled liposome-loaded microbubbles, Journal of controlled release, 2011, Vol. 152, pp. 249-256 *
B. GEERS et al, Self-assembled liposome-loaded microbubbles, Journal of controlled release, 2011, Vol. 152, pp. 249-256*

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11766485B2 (en) 2017-10-18 2023-09-26 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate having complex of Cas9 protein, guide RNA inhibiting SRD5A2 gene expression and cationic polymer encapsulated in nanoliposome and composition for ameliorating or treating hair loss containing the same
US11944705B2 (en) 2018-06-18 2024-04-02 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same
US11980688B2 (en) 2018-06-18 2024-05-14 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same

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