KR101477708B1

KR101477708B1 - Ｅｇｆ 마이크로스피어를 함유하는 생체 접착제 조성물

Info

Publication number: KR101477708B1
Application number: KR1020130015497A
Authority: KR
Inventors: 김정주; 서한솔; 유현승; 서준혁
Original assignee: (주)시지바이오
Priority date: 2013-02-13
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2014-12-30
Also published as: WO2014126274A1; KR20140102067A

Abstract

본 발명은 시아노아크릴레이트 성분 및 생분해성 고분자인 PLCL 매트릭스 중에 분산된 키토산으로 이루어진 EGF 마이크로스피어 성분을 포함하는 시아노아크릴레이트 조성물로 이루어진 생체 접착제에 관한 것이다.

Description

ＥＧＦ 마이크로스피어를 함유하는 생체 접착제 조성물{Biological glue composition containing EGF microspheres}

의료분야 중에서도 특히 외과적 처치분야에서 외과수술 등에 의해 피부가 절개된 경우에는 최종적으로 절개된 피부의 봉합이 진행되어야 한다.

봉합 시에는, 일반적으로는 비분해성 또는 생분해성 봉합사가 사용되는데 절개 부위가 클수록 봉합사의 사용 길이와 봉합 단위수가 늘어나게 된다. 또한, 봉합 후에는 붕대 등으로 덮은 후 자주 붕대를 갈아주어야 하는 불편함이 있으며, 또한 봉합사가 지나간 부위가 그대로 흉터로 남는 문제점이 있다. 특히, 얼굴이나 손, 다리 등과 같이 노출이 많은 부위에 있어서는 환자들이 봉합사의 사용을 꺼리기도 하고, 흉터를 없애는 2차 수술이 요구되는 등 여러 가지 문제점이 있다.

이러한 봉합사를 이용한 봉합을 대체하기 위해 생체 접착제를 사용하는 방법이 알려져 있다. 생체 접착제란 피부나 혈관 또는 뼈와 같은 생체조직 사이의 결합이나 인공재료와 생체 조직과의 결합에 사용하는 접착제를 의미한다.

생체 접착제의 종류에는 시아노아크릴레이트 접착제와 피브린 글루, 그리고 젤라틴 글루 및 우레탄계 접착제 등이 있으며(대한민국특허 등록번호 제10-0328733호, 대한민국특허 등록번호 제10-0450142호), 이 중에서 시아노아크릴레이트는 피부 표면 또는 공기 중에 있는 습기의 OH- 에 의한 친핵성 공격에 의해 단량체로부터 고분자화 반응이 개시되어 사슬연장 단계와 사슬연장의 종료단계로 진행되어 중합이 종료되는 것으로 알려져 있다.(D. Kotzev, V. Kotzev, International Journal of Adhesion and Adhesives, Volume 12, Issue 3, July 1992, Pages 150-157; Pratik J. Mankidy, Ramakrishnan Rajagopalan, Henry C. Foley, Polymer, Volume 49, Issue 9, 29 April 2008, Pages 2235-2242).

한편, 시아노아크릴레이트는 분자내 알킬 종류에 따라 생체 독성에 차이가 있으며, (Gabriela Ciapetti, Susanna Stea, Elisabetta Cenni, Alessandra Sudanese, Daniela Marraro, Aldo Toni, Arturo Pizzoferrato, Biomaterials, Volume 15, Issue 1, 1994, Pages 63-67; C. E. Evans, G. C. Lees, I. A. Trail, The Journal of Hand Surgery: Journal of the British Society for Surgery of the Hand, Volume 24, Issue 6, December 1999, Pages 658-661), 이를 토대로 피부나 손톱, 발톱 그리고 치아 등의 봉합이 필요한 부위에 적용하는 시도 및 관련 제품들이 보고되고 있다.

현재 시판되는 것으로는 Octyl 2-cyanoacrylate(상품명: Dermabond)과 N-Butyl 2-cyanoacrylate(상품명: Histoacryl)이 알려져 있으며, 모두 미국이나 독일로부터 수입된 완제품들이다. 상기 제품들은 수분과의 급격한 반응속도와 중합이 종료된 폴리알킬시아노아크릴레이트는 매우 단단한 물성을 가지고 있어 생체조직에 적용은 가능하지만, 시술 후 피부 등과 같이 유연한 부위에서는 물리적 특성의 차이로 인해 환자들이 불편함이나 거부감 등을 호소하는 경우가 많으며, 충격강도가 약해져 실금이 가거나 백화 현상이 나타난다는 보고도 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하고자, 시아노아크릴레이트의 물성을 변화시키는 시도가 있어 왔으며, 일례로 시아노아크릴레이트에 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 저분자량의 에테르계 접착강화제 또는 에스테르계 가소제를 혼합하면 물성변화가 있다는 보고가 있으며, 폴리(DL-락티드)(PDLA)나 폴리(락티드-코-글리콜라이드)(PLGA)등을 일정량 혼합하고자 하는 연구도 보고된 바 있다. (대한민국특허 등록번호 제10-0523662호; 대한민국특허 등록번호 제10-0810836호; 대한민국특허 등록번호 제10-0827264) 또한, 시아노아크릴레이트를 화학적으로 변성시켜 물성을 조절하고자 하는 연구도 보고되고 있다(대한민국특허 공개번호 제10-2009-0077759호).

그러나, 저분자량의 가소제나 PEG의 경우 가소성을 부여할 수는 있으나 중합체로부터 용출이 되어 체내에 영향을 줄 수 있으며, PDLA나 PLGA의 경우 비교적 단단한 물성을 가지기는 하나 강한 접착력을 부여하기에는 부족함이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 화학적 변성은 중합반응에 영향을 주며 생체 친화성에도 영향이 있으므로 극히 제한된 산업용 접착제에만 사용이 가능하다는 단점이 있다.

상기의 문제점들로 인하여 저 분자량의 가소제 등을 사용하지 않고 인위적인 반응성 접착제의 사용 없이 향상된 접착력이 부여된 생체 친화성 시아노아크릴레이트의 개발이 요구되고 있다.

한편, EGF는 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor)로 종래 유로가스트론(urogastrone)으로 알려진, 53개의 아미노산과 3개의 이황화물(disulfide) 결합을 갖는 분자량 6045의 폴리펩타이드로서, 상피세포와 간엽(messenchymal)세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다(참조: Carpenter, Experimental Cell Research, 164:1-10, 1986). 이러한 EGF가 충분한 치료효과를 나타내기 위해서는 상처 회복에 가장 중요한 최초의 며칠 동안 EGF를 상처부위에 수시로 적용하여 유효농도가 지속적으로 유지되도록 해 주어야 한다. (참조: Franklin et al., J. Lab. Clin. Med., 108:103-108, 1986).

이에 본 발명자들은 변성 아미노산을 시아노아크릴레이트 생체 접착제에 도입함으로써 피착체와 강력한 결합력과 향상된 물성을 가진 코팅막을 형성시킬 수 있고, 또한 점도조절이 용이하여 상처 내부로 접착제 성분의 침투가 저해되어 염증 등의 부작용을 현저히 줄일 수 있을 뿐 만 아니라 경제성까지 제고할 수 있는 생체 접착제를 제공할 수 있음을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 이러한 생체접착제에 EGF　마이크로스피어를 첨가하여 EGF를 상처부위에 지속적으로 공급되도록 함으로써 상처 부위의 재생을 촉진할 수 있음도 발견하였다.

따라서 본 발명은 피착제와의 강력한 결합력과 향상된 물성을 가진 코팅막을 형성시킬 수 있으며, EGF의 방출 속도를 조절하여 생체 접착력을 향상시킨 생체 접착제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이러한 목적을 달성하기 위해 본 발명에 의하면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 상피세포 성장인자(EGF) 마이크로스피어를 함유시킨 것을 특징으로 하는 생체 접착제 조성물이 제공된다.

상기 식에서, A는 결합 또는 -(CH₂)n-B-(CH₂)m-이고, B는 CH₂ 또는 0이고, n과 m은 각각 1 내지 9의 정수이고, 상기 n과 m의 합은 2 내지 10이다

또한, 본 발명에 따르면, 상기 EGF 마이크로스피어의 함량은 상기 화합물 1mL에 대해 10-100 ng으로 함유되는 것을 특징으로 하는 생체 접착제 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 키토산 수용액 중의 키토산 농도가 0.03 내지 5중량%의 범위인 경우 상기 EGF 마이크로스피어의 크기는 20-60㎛인 것을 특징으로 하는 생체 접착제 조성물이 제공된다.

본 발명에서는 기존의 생체 접착제의 단점을 해결하여 생체 접착력을 향상시키기 위하여, 피착제와 강력한 결합력을 가지면 향상된 물성을 가진 코팅막을 형성시킬 수 있는 생체접착제에 상처 재생효과가 있는 EGF 마이크로스피어를 첨가한다. 이때 EGF 마이크로스피어의 농도와 크기를 조절하여 생체 접착제를 사용할 때에 EGF의 방출속도를 조절할 수 있게 하였다.

본 발명에 따른 변성 아미노산을 시아노아크릴레이트 생체 접착제에 EGF 마이크로스피어를 함유한 화합물은 피착체와 강력한 결합력을 가지며 향상된 물성을 가진 코팅막을 형성하는 것이 가능하고, 또한 점도 조절이 용이하여 상처 내부로 접착제 성분의 침투가 저해됨으로써 염증 등의 부작용을 현저히 줄일 수 있을 뿐만 아니라 EGF 마이크로스피어에서 방출되는 EGF로 인하여 상처 부위의 빠른 치유 및 흉터의 극소화로 의료분야에서 유용한 생체 접착제로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 생체 접착제에 다량의 EGF 마이크로스피어가 함유된 사진이다.
도 2는 본 발명에 따라 EGF 마이크로스피어의 함량에 따른 L-929 세포의 성장률을 측정한 결과이다.
도 3 및 도 4는 본 발명에 따라 EGF 마이크로스피어의 함량에 따른 CCD-986sk 세포의 성장률을 측정한 결과로서, 도 3은 24시간 배양 후, 도 4는 48시간 배양 후를 각각 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따라 동물에게 각각의 생체 접착제를 적용한 후 치료효능을 나타내는 결과이다.
도 6은 도 5에서 실시한 피부조직의 인장강도 측정을 통한 피부의 치료촉진 효과를 나타내는 결과이다. (1, 2 : EGF 마이크로스피어 무첨가; 3, 4 : 실시예)

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에서는 상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 식에서, A는 결합 또는 -(CH₂)n-B-(CH₂)m-이고, B는 CH₂ 또는 0이고, 상기 n 및 m은 각각 1 내지 9의 정수이고, 및 상기 n과 m의 합은 2 내지 10이다.

바람직하게는, 상기 A는 결합, C1-10 알킬렌, 또는 -(CH2)-O-(CH2)-이고, 보다 바람직하게는 상기 A는 결합, 에틸렌(-CH2-CH2-), 또는 -(CH2)-O-(CH2)-이다.

또한, 상기 화학식 1은 가능한 모든 광학이성질체를 포함한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 예로는,

1) (2S)-2-(7-(2-시아노아크릴로일옥시)-2-하이드록시헵틸아미노)-3-(3,4-디하이드록시페닐) 프로판산 ((2S)-2-(7-(2-cyanoacryloyloxy)-2-hydroxyheptylamino)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid),

2) (2S)-2-(8-(2-시아노아크릴로일옥시)-2-하이드록시옥틸아미노)-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로판산 ((2S)-2-(8-(2-cyanoacryloyloxy)-2-hydroxyoctylamino)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid),

3) (2S)-2-(3-(5-(2-시아노아크릴로일옥시)펜틸옥시)-2-하이드록시프로필아미노)-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로판산 ((2S)-2-(3-(5-(2-cyanoacryloyloxy)pent

yloxy)-2-hydroxypropylamino)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid) 등이다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 시아노아크릴레이트에 변형된 아미노산이 도입된 구조를 가지고 있다. 상기 화학식 1 구조의 기본이 되는 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA), 특히 L-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)는 페닐알라닌(Phenylalanine)의 변성된 아미노산으로서 바위에 강하게 결합되어 있는 홍합으로부터 발견된 물질인데, 체내에서 거부감이나 부작용이 알려지지 않았으며, 수분의 존재 하에 강한 접착력을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 상기 DOPA에 시아노아크릴레이트를 도입함으로서, 피착체와의 강력한 결합력을 형성하고 향상된 물성을 가진 코팅막을 얻을 수 있어 생체 접착제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 기존의 시아노아크릴레이트 생체 접착제에 수용액 물질이 닿았을 때 중합반응이 일어나서 경화되는 반응을 이용하였다. 이에 본 발명의 생체 접착제 용액에 점성이 있는 키토산 용액 중의 EGF의 농도를 조절하였고, 경화반응이 일어나게 하여 마이크로스피어 형태로 제작하였다.

EGF는 피부 등에 상처가 나면 땀·침·혈액 등을 통해 공급돼 흉터 없이 자연적으로 상처를 아물게 하는 생체에 존재하고 있는 단백질이다. 이러한 EGF가 생리적인 농도보다 작거나 높게 세포주에 처리하면 세포성장이 억제되어 세포군락수가 줄어드는 현상이 나타난다. 이를 이용하여 본 발명에서의 EGF 농도를 결정하였다.

본 발명의 생체 접착제 내에 함유될 마이크로스피어가 원하는 EGF 방출특성을 나타내기 위해서는 키토산 0.03 내지 5중량%으로 생체 접착제 내에서 제조되는 것이 바람직하다. 또한 섬유아세포의 증식으로 EGF의 방출거동을 살펴보았을 때, 생체 접착제 1mL에 대해 EGF 마이크로스피어의 함량이 10~100ng로 되는 경우 상처부위의 재생촉진에 바람직하다는 사실을 밝혀냈다. EGF 마이크로스피어의 함량이 10ng 미만으로 되는 경우 첨가량이 너무 적어 첨가효과를 실질적으로 기대하기 어렵고, 반대로 그 양이 100ng를 초과하면 생리적으로 존재하는 EGF의 수용체 농도보다 더 높은 농도가 되어 오히려 세포의 성장이 억제되어 바람직하지 않다.

또한, 본 발명에서는 상기의 방법으로 제조된 마이크로스피어의 크기를 조절하였으며, 본 발명자들의 연구 결과에 의하면 20㎛ 내지 60㎛ 범위의 크기를 갖는 마이크로스피어가 생체 접착제에 혼합되었을 때 EGF 방출에 바람직하다는 사실을 밝혀냈다. 마이크로스피어의 크기는 곧 EGF 용액의 함유량 및 방출량과 직결된다.

마이크로스피어의 크기는 제작시에 조절하는데 키토산 농도가 0.03 내지 5중량%의 범위인 경우를 예로 들면, 마이크로스피어의 크기가 20㎛미만으로 되는 경우 방출되는 EGF 양이 너무 적어 하한선인 10ng미만이 되므로 바람직하지 않고, 반대로 마이크로스피어의 크기가 60㎛를 초과되는 경우에는 방출되는 EGF의 양이 너무 많아 상한선인 100ng 초과로 되어 바람직하지 않다. 따라서 마이크로스피어의 크기는 키토산 수용액중의 키토산의 농도에 따라 적정한 범위로 조절하여 제조할 필요가 있다.

[실시예]

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예. EGF 마이크로스피어의 함유

저 점성의 키토산 용액 1mL당 EGF 1mg으로 희석하여 EGF 용액을 만든 후, 공기분사형 방울제조기와 연결된 주사기 펌프에 방울제조기의 공기주입구로 공기관을 연결해 CO₂를 6.0 kgf/cm²의 압력으로 주입하였다. 주사기 펌프를 1.6 mL/hr 속도로 밀어 넣으면서 EGF 용액을 본 발명에 따라 개질된 생체 접착제에 낙하시킨 후, 10분간 EGF 마이크로스피어를 충분히 반응시켰다. 10분 후에 수거하여 공기가 차단된 용기에 담아 냉장 보관하였다. 얻어진 EGF 마이크로스피어는 도 1에 나타낸 바와 같이, 20㎛ 내지 60㎛ 범위로 크기가 조절된 것을 확인하였다.

실험예 1. 세포실험에서 EGF 마이크로스피어의 함량별 효과

EGF 마이크로스피어의 함량에 대한 세포의 성장률을 하기와 같이 측정하였다. Fibroblast Cell Line (L-929)를 현탁하여 혈구 계산판으로 계수하여 24 웰 플레이트에 세포를 1×10⁵ 농도로 파종하였고 24시간 후, 실시예에서 EGF 마이크로스피어의 함량을 각각 10, 50, 100ng, 1, 3, 5㎍씩 가하였다. 세포 배양액을 1mL씩 채우고 24시간 배양한 후 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트리졸리움을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 MTT 분석을 시행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터, EGF 마이크로스피어의 양이 100ng를 초과하는 경우 세포의 성장이 오히려 억제되는 경향을 보이고 있어 100ng이하, 특히 EGF 마이크로스피어의 함량이 10~100ng의 농도범위일 때 세포의 성장이 촉진되는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2. 세포실험에서 EGF 마이크로스피어의 함량별 효과

EGF 마이크로스피어의 함량에 대한 피부세포의 성장률을 하기와 같이 측정하였다.

Human Skin Fibroblast Cell Line (CCD-986sk)를 현탁하여 혈구 계산판으로 계수하여 24 웰 플레이트에 세포를 1×10⁵ 농도로 파종하였고 24시간 후, 실시예에서 EGF마이크로스피어의 함량을 각각 10, 100, 500 ng, 1, 3, 5, 10 ㎍씩 가하였다. 세포 배양액을 1mL씩 채우고 24시간, 48시간 배양한 후 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트리졸리움을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 MTT 분석을 시행하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 100ng를 초과하는 경우 세포의 성장이 오히려 억제되는 경향을 보이고 있어 100ng이하, 특히 EGF 마이크로스피어의 함량이 10~100ng의 농도범위일 때 세포의 성장이 촉진되는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3. 동물에서의 치료효과 검증

실시예의 접착제가 치료촉진의 효능을 보이는지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

실험군으로는 실시예에서와 같이 EGF 마이크로스피어를 첨가한 생체 접착제를 사용하였고, 대조군으로는 EGF 마이크로스피어를 첨가하지 않은 그대로의 생체 접착제를 사용하였다. 동물이나 인간은 부위마다 또는 개개마다 치유 속도가 다르다. 따라서 각각의 개체끼리 혹은 각각의 다른 부위로는 치유속도를 비교 할 수 없기 때문에 도 5에 나타낸 바와 같이, 7주령의 SD Rat, Female의 등 피부를 절개하기 위해 털을 제거한 후 표피가 드러나면 각각 앞다리 쪽 두 군데, 뒷다리 쪽 두 군데를 2cm씩 절개하였다.

이와 같이 피부 손상 모델을 성립하여 한 개체에 2가지의 접착제를 약 0.1cc씩 도포하였다. 부위마다 치유속도가 다르기 때문에 부위 별로 번갈아 가면서 사용을 하였는데 이를 표 1에 나타내었다.

도 5에서 볼 수 있듯이, 빨간색으로 표시한 부분이 본 발명의 실시예의 생체 접착제를 사용한 것으로서 EGF 마이크로스피어 무첨가 생체 접착제의 경우에 비해 육안으로도 식별이 가능할 정도로 피부재생이 촉진됨을 확인할 수 있다. 이에 대한 정량적인 결과는 실험예 4 에서 확인하도록 한다.

실험예 4. 재생된 피부의 치밀함 측정

실험예 3의 동물실험에서 재생된 피부의 정도를 정확하게 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 하였다.

채취한 피부조직을 25×1×40mm로 자른 후 Rheometer에 위 아래 각각 10mm씩 고정한 후 최대응력 10kg, 테이블 스피드 60mm/min의 조건에서 인장강도 측정기를 이용하여 재생된 피부의 인장강도를 측정하고, 그 결과를 도 6에 나타냈다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 피부 손상 후 일주일째에 실시예의 접착제를 사용한 부위의 피부재생이 더 치밀하게 이루어진다는 것을 확인할 수 있다.

본 발명은 외과수술 후 봉합사를 이용한 봉합을 대체하기 위해 피부나 혈관 또는 뼈와 같은 생체조직 사이의 결합이나 인공재료와 생체조직과의 결합을 위한 생체 접착제로 사용될 수 있다.

이상에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예를 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물에, 상피세포 성장인자(EGF) 마이크로스피어를 상기 화합물 1mL에 대해 10-100ng으로 함유시킨 것을 특징으로 하는 생체 접착제 조성물.

(상기 식에서, A는 결합 또는 -(CH₂)n-B-(CH₂)m-이고, B는 CH₂ 또는 0이고, n과 m은 각각 1 내지 9의 정수이고, 상기 n과 m의 합은 2 내지 10이다)
삭제
제 1항에 있어서,
상기 EGF 마이크로스피어의 크기는 20-60㎛인 것을 특징으로 하는 생체 접착제 조성물.