KR101464592B1 - 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101464592B1
KR101464592B1 KR20140075107A KR20140075107A KR101464592B1 KR 101464592 B1 KR101464592 B1 KR 101464592B1 KR 20140075107 A KR20140075107 A KR 20140075107A KR 20140075107 A KR20140075107 A KR 20140075107A KR 101464592 B1 KR101464592 B1 KR 101464592B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hydrolyzate
inflammatory
lactoglobulin
bsa
whey protein
Prior art date
Application number
KR20140075107A
Other languages
English (en)
Inventor
남명수
유재민
오덕근
Original Assignee
충남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충남대학교산학협력단 filed Critical 충남대학교산학협력단
Priority to KR20140075107A priority Critical patent/KR101464592B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101464592B1 publication Critical patent/KR101464592B1/ko

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A61K38/018Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from milk
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 α-락트알부민(α-Lactalbumin, α-LA), β-락토글로불린(β-lactoglobulin, β-LG) 및 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제(alcalase)를 처리하여 얻은 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 유청 단백질의 가수분해물 중 분자량 10kDa 이하인 것을 선택적으로 추출한 가수분해물이 특히 염증 억제 효과가 우수하여, 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 신장염 등과 같은 각종 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising hydrolysate of whey protein prepared by using alcalase for preventing or treating inflammatory diseases}
본 발명은 알칼라아제(alcalase)를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
우유는 건강에 유익한 효과를 나타내는 기능성 식품이며(Gill et al., 2000), 기능성 식품과 건강음료의 첨가제로서의 가치가 있는 것으로 알려져 있다(Huth et al ., 2004). 또한 우유에 함유된 유청 단백질은 대사활동에서 폭 넓게 생리활성 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 유청은 치즈제조공정에서 얻어지는 부산물로 버려지는 산물로 여겨졌지만, 근래에 영양학적으로 응용가치를 높일 수 있는 기능성 식품으로서 재발견되면서 이에 대한 연구가 급증하고 있다(Walzem et al ., 2002).
유청(whey)은 우유를 치즈로 가공할 때 형성되는 부산물이다. 우유에는 수분, 단백질, 지방, 탄수화물, 무기질, 비타민, 효소 등이 포함되어 있다. 지방은 가장 중요한 성분이며 이것을 제외한 것을 탈지유라고 한다. 탈지유에 산 또는 응유효소를 첨가하면 응고물이 생기는데 이것을 응유(curd)라 하며 우유의 주단백질인 카세인이 주성분이다. 응유를 제외한 수용액을 유청이라 하고 전 단백질의 20%를 포함한다. 유청에는 유당, 무기질, 각종 유청 단백질 등이 포함되어 있다. 유청에 포함된 유청 단백질은 α-락트알부민(α-Lactalbumin, α-LA), β-락토글로불린(β-lactoglobulin, β-LG) 또는 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA), 락토페린(lactoferrin), 면역글로불린(immunoglobulin), 효소(enzyme), GMP(glycomacropeptide) 등이 있으며, 면역글로불린은 특히 초유에 다량 함유되어 있다. 유청은 다양한 필수아미노산을 함유하고 있으며, 면역 증진 효과가 있다고도 보고된 바 있다(Marshall, 2004).
우유 단백질의 가수분해물에 대한 생리활성 기능연구는 많이 진행되어 왔는데 지금까지 가장 잘 알려진 것은 면역조절 펩티드로서 β-카세인(β-casein, f1-28) 유래 CPP(casein phosphopeptide)이다. CPP는 마우스 비장과 토끼 Peyer’s patch 세포에서 세포분열물질 촉진제(mitogen)로서의 활성을 나타내고 IgA 생산을 활성화한다고 보고된 바 있다(Hata et al ., 1998). 또한 β-카세인 유래의 β-카소케모타이드-1(β-casochemotide-1)이라는 펩티드가 단핵구(monocyte)와 대식세포(macrophage)에서의 주화성을 높인다고 보고되기도 하였다(Kitazawa et al ., 2007).
염증(inflammation)은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출(渗出), 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변(病變)을 일컫는다. 원인은 기계적 상해작용, 온도, 방사선 등의 물리적 인자, 독물 등의 화학적 인자, 세균감염 등의 기생체에 의한 것 등이며 이 중 세균에 의한 것이 가장 많다. 이러한 주요 원인 외에도, 여러 부수적 요인과 각 개체의 소인(素因)이나 면역 능력 등이 원인이 되기도 하다.
한편, 본 발명자들은 치즈 제조시 생성되는 부산물인 유청 단백질 중에서, α-락트알부민, β-락토글로불린 또는 소혈청알부민을 알칼라아제로 분해한 가수분해물이 염증을 억제하는 효과가 있음을 확인하고, 상기 가수분해물이 다양한 염증질환의 치료제로 이용될 수 있음을 밝힘으로서, 본 발명을 완성할 수 있었다.
유청 단백질을 효소분해한 가수분해물에 대해 분석된 선행문헌으로서, 효소가수분해에 의한 초유 유청으로부터 철-결합 펩티드(iron-binding peptide)의 생성에 관한 연구에서는 알칼라아제(alcalase)를 이용한 가수분해는 유청 단백질의 주요 성분들을 가수분해시켰으나 펩신(pepsin)은 그렇지 않음이 개시된 바 있다(Kim et al., 2010). 여기에서 열처리된 초유 유청을 120분 동안 가수분해한 가수분해도는 알칼라아제(alcalase) 25.31%, 펩신(pepsin) 12.42%, 파파인(papain) 10.66%, 트립신(trypsin) 10.83%로 확인된다. 다른 단백질 분해효소에 비해 알칼라아제에 의한 유청 단백질의 가수분해가 우수하다고 보고된 바 있다(Smyth 및 Fitz-Gerald, 1998; Kim et al ., 2007). 이러한 선행기술에서는 기능성 식품들과 의약품 소재로서 유청 단백질 가수분해물이 산업적으로 응용 가능함을 제시하고 있다. 또한, 한국등록특허 제1038354호에 유청단백질의 알칼라아제 및 트립신 가수분해물이 항염 효과가 있음이 개시되어 있고, 일본공개특허 제2004-155751호에는 β-락토글로불린 등의 트립신 가수분해물이 항염 효과가 있음이 개시되어 있기는 하지만, 본 발명에서처럼, 알칼라아제를 이용하여 유청 단백질인 α-락트알부민, β-락토글로불린 또는 소혈청알부민이 가수분해된 유청 단백질의 항염증 효과를 개시한 선행기술은 확인되지 않는다.
한국등록특허 제1038354호(영양 조성물, 2011.05.25. 등록) 일본공개특허 제2004-155751호 (생체 침습시의 경구 면역 영양 요법에 유용한 펩타이드, 2004.06.03. 공개)
Alder-Nissen. 1979. Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid. J. Agric. Food Chem. 27:1256. Gill HS, Rutherford KJ, Cross ML. 2000. Bovine milk : a unique source of immunomodulatory ingredients for functional foods. In Buttriss J, Saltmarsh M, eds. Functional Food II-Claims and Evidence. Cambridge, England: Royal Society of Chemistry Press pp. 82-90. Royal Society of Chemistry Press, Cambridge, England. Hata I, Higashiyama S, Otani H. 1998. identification of a phosphopeptide in bovine alpha s1-casein digest as a factor influencing proliferation and immunoglobulin production in lymphocyte cultures. J. Dairy Res. 65:569-578. Huth PJ, Layman DK, Brown PH. 2004. The emerging role of dairy proteins and bioactive peptides in nutrition and health. J. Nutr. 134: 961S. Kwak J, Lee K, Shin D, Maeng J, Park D, Oh HW. 2007. Biochemical and genetic characterization of arazyme, an extracellular metalloprotease produced from Serratia proteamaculans HY-3. J Microbiol Biotechnol 17: 761-768. Kim SB, Ku MJ, Cho WM, Ki KS, Kim HS, Nam MS. 2010. Production of Iron-Binding Peptides from Colostral Whey by Enzymatic Hydrolysis. Kor. J. Animal Food Sci. Resour. 20: 566-577. Kim SB, Seo IS, Khan MA, Ki KS, Nam MS, Kim HS. 2007. Separation of iron-binding protein whey through enzymatic hydrolysis. Internat.Dairy J. 17: 625-631. Kitazawa H, Yonezawa K, Tohno M, Shimosato T, Kawai Y, saito T, Wang JM. 2007. Enzymatic digestion of the milk protein β-casein releases potent chemotactic peptide(s) for monocytes and macrophages. Inter. Immunopharmac. 7: 1150-1159. Kunitz M. 1947. Crystalline soybean trypsin inhibitor. II. General properties. J. Gen. Physiol. 30: 291-297. Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Marshall K. 2004. Therapeutic applications of whey protein. Alternative Medicine Review. 9: 136-156. Nam MS, Whang KS, Choi SH, Bae HC, Kim YK, Park YW. 2013. Purification, characterization, and properties of an alkaline protease produced by Serratia marcescens S3-R1 inhabiting in Korean Ginseng Rhizosphere. J. Sci. Food Agric. Published online in Wiley Online Library: 30 September 2013. Romero F, Garcia LA, Salas JA, Diaz M, Quiros LM. 2001. Production purification and partial characterization of two extracellular proteases from Serratiamarcescens grown inwhey. Process Biochem 36:501515 (2001). Salamone PR and Wodzinski RJ. 1997. Production, purification and characterization of a 50-kDa extracellular metalloprotease from Serratiamarcescens. Appl Microbiol Biotechnol 48:317324. Smyth M, Fitz-Gerald RJ. 1998. Relationship between some characteristics of WPC hydrolysates and the enzyme complement in commercially available proteinase preparations. Internat. Dairy J. 8: 819-827. Tao K, Long Z, Liu K, Tao Y, Liu S. 2006. Purification and properties of a novel insecticidal protein from the locust pathogen Serratia marcescens HR-3. Curr Microbiol 52:4549. Walzem RL, Dillard CJ, German JB. 2002. Whey components: millennia of evolution create functionalities for mammalian nutrition: what we know and what we may be overlooking. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 42: 353-375. Wan M-H, Wu B, Ren W and He BF. 2010. Screening, characterization, and cloning of solvent-tolerant protease from Serratia marcescens MH6. J. Microbiol Biotechnol 20: 881-888.
본 발명의 목적은 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 α-락트알부민(α-Lactalbumin, α-LA), β-락토글로불린(β-lactoglobulin, β-LG) 및 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제(alcalase)를 처리하여 얻은 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 가수분해물은 분자량 10kDa 이하인 것만 선택적으로 추출한 것일 수 있다.
상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 α-락트알부민(α-Lactalbumin, α-LA), β-락토글로불린(β-lactoglobulin, β-LG) 및 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제(alcalase)를 처리하여 얻은 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서 유청 단백질의 가수분해물 제조시 이용하는 유청 단백질은 치즈 제조 후 남은 부산물인 총 유청(whole whey)을, 투석을 이용하여 유청에 함유되어 있는 단백질 이외의 다른 성분들을 제거한 후, 상기 단백질만을 농축한 것으로서, 분리 유청 단백질(isolated whey protein)이라고도 한다.
본 발명은 α-락트알부민, β-락토글로불린 및 소혈청알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제를 처리하여 얻은 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 가수분해물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 알칼리 단백분해효소를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 α-락트알부민, β-락토글로불린 및 소혈청알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제를 처리하여 얻은 가수분해물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 가수분해물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 α-락트알부민, β-락토글로불린 및 소혈청알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제를 처리하여 얻은 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 유청 단백질의 가수분해물 중 분자량 10kDa 이하인 것을 선택적으로 추출한 가수분해물이 특히 염증 억제 효과가 우수하여, 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 신장염 등과 같은 각종 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 유청 단백질, BSA, α-락트알부민, β-락토글로불린에 관해, 각 해당 단백질, 이들의 총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물, 이들의 10kD 이하 가수분해물을 전기영동한 것을 나타내는 사진이다(유청 단백질 관련 : 도 1A의 lane 2~5, BSA 관련 : 도 1A의 lane 6~9, α-락트알부민 관련 : 도 1B의 lane 2~5, β-락토글로불린 관련 : 도 1B의 lane 6~9)
도 2는 BSA, BSA의 총 가수분해물, BSA의 10kD 초과 가수분해물, BSA의 10kD 이하 가수분해물의 HPLC 스펙트럼 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 α-락트알부민, α-락트알부민의 총 가수분해물, α-락트알부민의 10kD 초과 가수분해물, α-락트알부민의 10kD 이하 가수분해물의 HPLC 스펙트럼 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 β-락토글로불린, β-락토글로불린의 총 가수분해물, β-락토글로불린의 10kD 초과 가수분해물, β-락토글로불린의 10kD 이하 가수분해물의 HPLC 스펙트럼 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 5A는 LPS 처리된 대식세포에서 α-락트알부민, α-락트알부민의 총 가수분해물, α-락트알부민의 10kD 초과 가수분해물, α-락트알부민의 10kD 이하 가수분해물에 관한 TNF-α, iNOS, COX-2의 활성 억제 효과를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5B는 β-락토글로불린, β-락토글로불린의 총 가수분해물, β-락토글로불린의 10kD 초과 가수분해물, β-락토글로불린의 10kD 이하 가수분해물에 관한 COX-2의 활성 억제 효과를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 LPS 처리된 대식세포에서 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA의 각 해당 단백질, 이들의 총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물, 이들의 10kD 이하 가수분해물에 관한, TNF-α 억제 효과를 ELISA로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다(유청 단백질 관련 : 도 6의 lane 3~6, α-락트알부민 관련 : 도 6의 lane 7~10, β-락토글로불린 관련 : 도 6의 lane 11~14, BSA 관련 : 도 6의 lane 15~18).
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 알칼라아제를 이용한 유청 단백질, α- 락트알부민 , β- 락토글로불린 및 BSA 가수분해물 제조>
치즈 제조 후 얻은 총 유청(whole whey)에서 유청에 함유되어 있는 단백질 이외의 다른 성분들(유당 등)을 제거하기 위해 투석막(시그마, 투석막, 12kDa, D-9527)으로 투석시킨 후(투석하여 분자량이 12kDa보다 큰 것을 얻음) 유청 단백질을 얻었고, 이를 동결건조하여 유청 단백질 분말을 수득하였다. 각 개별 유청 단백질은 시그마(Sigma)사에서 구입하였다. *α-락트알부민(L6010), β-락토글로불린(L3908), BSA(A7906).
0.5M NaOH을 사용하여 상기 유청 단백질과 α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA를 증류수에 20㎎/㎖ 농도로 녹여, 유청 단백질 용액, α-락트알부민 용액, β-락토글로불린 용액 또는 BSA 용액을 제조하여 각각의 pH를 8.0으로 조정하였다. 알칼라아제(Sigma, A30079)를 증류수에 1%(w/v)로 녹여 알칼라아제 용액 상태로 만들고, 상기 알칼라아제 용액과 상기 유청 단백질 용액, α-락트알부민 용액, β-락토글로불린 용액 또는 BSA 용액(기질) 각각을 1:100의 부피비로 혼합하였다. 각 단백질 용액은 효소처리하기 전에 100℃에 10분 동안 가열처리하였는데, 이 과정을 통해 효소처리 중에 단백질 가수분해가 더 원활하게 수행된다. 각 단백질 용액의 효소반응(가수분해)은 50℃에서 5시간 동안 수행하였고, 효소반응을 마친 후에는 90℃에서 10분간 가열하여 효소활성을 실활시켰으며, 4℃, 12,000×g에 25분 원심분리하여 얻은 상등액을 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린 또는 BSA의 총 가수분해물로 취하였다.
한편, 상기 가수분해물의 일부를 분자량 10kDa용 비바스핀 6 튜브(Vivaspin 6 tube, GE Healthcare, Sweden)를 이용하여 4℃, 10,000×g에 1시간 동안 원심분리하여, 상기 가수분해물을 10kDa 초과하는 것과 10kDa 이하인 것으로 선택적으로 분리추출하였다. 이렇게 얻은 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린 또는 BSA의 가수분해물과 10kDa 초과 또는 이하의 분리물들은 모두 동결건조하여 보관하였다.
< 비교예 1. 트립신을 이용한 유청 단백질, α- 락트알부민 , β- 락토글로불린 및 BSA 가수분해물 제조>
비교예 1-1. 트립신만을 이용한 유청 단백질, α- 락트알부민 , β- 락토글로불린 및 BSA 가수분해물
실시예 1과 동일한 조건으로 가수분해물들을 제조하되, 알칼라아제 대신에 같은 농도의 트립신을 가하여 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린 및 BSA 각각에 대한 가수분해물을 제조하였다.
비교예 1-2. 알칼라아제 및 트립신을 이용한 유청 단백질, α- 락트알부민 , β- 락토글로불린 BSA 가수분해물
실시예 1과 동일한 조건으로 가수분해물들을 제조하되, 알칼라아제는 3시간만 처리하고 2시간은 같은 농도의 트립신(돼지췌장 유래 PTN 6.0S, Novozymes Novozymes)을 가하여 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린 및 BSA 각각에 대한 가수분해물을 제조하였다.
< 실시예 2. 유청 단백질의 알칼라아제의 가수분해물의 분석>
실시예 2-1. SDS - PAGE 이용
Laemmli(1970)의 방법을 따른 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 유청 단백질, BSA, α-락트알부민, β-락토글로불린 및 실시예 1에서 얻은 이들의 알칼라아제 가수분해물들(총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물, 이들의 10kD 이하 가수분해물)을 전기영동하였고, 전기영동 사진은 도 1에 나타내었다(유청 단백질 관련 : 도 1A의 lane 2~5, BSA 관련 : 도 1A의 lane 6~9, α-락트알부민 관련 : 도 1B의 lane 2~5, β-락토글로불린 관련 : 도 1B의 lane 6~9).
도 1을 참고하면, 알칼라아제가 각 단백질의 주요 성분들을 가수분해시켜 분자량이 작은 다양한 펩티드가 생성되었음을 알 수 있다.
한편, 비교예 1의 트립신만을 이용한 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린 및 BSA의 가수분해물과 알칼라아제 및 트립신을 이용한 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린 및 BSA의 가수분해물(총단백질, 10kD 초과 단백질, 10kD 이하 단백질)에 대해서도 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 한 결과, 비슷한 패턴으로 분자량이 작은 펩티드가 많이 생성된 것이 확인된다(겔 사진은 기재하지 않음).
실시예 2-2. HPLC 이용
하기 조건을 이용하여 유청 단백질, α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA 및 실시예 1에서 얻은 이들의 알칼라아제 총 가수분해물의 HPLC를 수행하였다. 알칼라아제에 의한 가수분해물의 HPLC 결과는 도 2 내지 4에 나타내었다. HPLC 기기는 RP-HPLC 시스템(Waters 2487 Dural Dector, 600 Controller, 2410 Refractive index Detector, Milford, MA, USA)으로 분석하였다.
Column : protein C18 (4.6×250㎜, Vydac, Hesperia, CA. U.S.A)
Flow rate : 1㎖/min
Elution solution : solution A - 0.1% of TFA in distilled water
solution B - 0.1% of TFA in acetonitrile
Elution condition : linear gradient
Elution time : 40min
Infection volume : 20㎕ of sample, concentrated 5 times in freezing drying machine (20㎕ of sample - [BSA, α-LA, β-LG : 20㎕ of 5㎎/㎖], [BSA hydrolysates, α-LA hydrolysates, β-LG hydrolysates : 20㎕ of 12.5㎎/㎖])
Absorbance of the elute column : 214nm
도 2 내지 4를 참고하면, SDS-PAGE 분석결과와 유사하게 BSA, α-락트알부민, β-락토글로불린을 5시간 동안 가수분해시킨 가수분해물은 대조구에 비해 여러 종류의 피크(peak)가 나타남으로써 분자량이 작은 펩티드가 많이 생성되었음을 알 수 있다(BSA 관련 : 도 2, α-락트알부민 관련 도 3, β-락토글로불린 관련 : 도 4; 유청 단백질 데이터는 나타내지 않았지만 단백질 분해 패턴은 도 2 내지 4와 유사하였음).
< 실시예 3. 유청 단백질 가수분해물의 염증 억제 효과 확인 I>
RAW 264.7 세포(대식세포주)를 KRIBB(Daejeon, Korea)에서 분양받아 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, 100U/㎎)을 첨가하여 배양하였다. 배양기는 37℃, 5% CO2와 대기습도가 유지되는 조건에서 배양하였다. 12-웰(well) 세포배양접시(Nunc, Denmark)에 세포 수를 5×105/웰로 조정하여 12시간 배양한 후, LPS(lipopolysaccharide) 1㎍/㎖을 처리하고, 다시 30분 후에 실시예 1에서 준비한 각각의 시료로서, α-락트알부민, β-락토글로불린에 관해, 각 해당 단백질, 이들의 총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물, 이들의 10kD 이하 가수분해물(상기 가수분해물은 모두 알칼라아제를 이용하여 5시간 동안 효소분해함)을 각각 30㎍/㎖의 농도로 처리하여 3시간 동안 반응시켰다. 대조군에는 LPS와 시료를 모두 처리하지 않았다.
시료 처리 3시간이 지나면, 각각의 시료처리 세포에서 TRIzol 용액(Invitregon, USA)을 이용하여 총 RNA를 추출하였으며, Promega사(USA)의 cDNA 합성 키트(oligo dT, dNTP, M-MLV RT, RNAs inhibitor)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 RAW 264.7 세포에서의 iNOS(inducible NO synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 유전자를 RT-PCR로 분석하였으며(PCR machine : GeneAmp, PCR system 9700, USA) 이에 대한 결과는 도 5에 나타내었다. RT-PCR 조건은 94℃에서 5분(1 cycle), 94℃에서 30초; 55~60℃에서 30초; 72℃에서 30초(22~23 cycle 반복), 72℃에서 5분(1 cycle)로 하였고 사용한 PCR용 프라이머(primer)는 하기 표 1에 나타난 것을 이용하였다. 각 PCR 산물은 2% 아가로오스 겔에 로딩(loading)하여 100V 조건에서 20분 동안 전기영동을 통하여 분석하였다.
타겟 유전자 Size (bp) Forward Reverse
GAPDH 450 ACCACAGTCCATGCCATCAC CACCACCCTGTTGCTGTAGCC
TNF-α 290 TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC
COX-2 583 TTGAAGACCAGGAGTACCGC GGTACAGTCCCATGACATCG
iNOS 311 CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG GGGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA
도 5A는 LPS 처리된 대식세포에서 α-락트알부민, α-락트알부민의 총 가수분해물, α-락트알부민의 10kD 초과 가수분해물, α-락트알부민의 10kD 이하 가수분해물에 관한, TNF-α, iNOS, COX-2의 활성 억제 효과를 나타내며, 도 5B는 β-락토글로불린, β-락토글로불린의 총 가수분해물, β-락토글로불린의 10kD 초과 가수분해물, β-락토글로불린의 10kD 이하 가수분해물에 관한, COX-2의 활성 억제 효과를 나타낸다.
이를 참고하면, LPS만을 처리한 군과 비교하여, α-락트알부민, β-락토글로불린에 관해, 각 해당 단백질, 이들의 총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물의 TNF-α, iNOS 또는 COX-2는 거의 비슷하거나 오히려 증가되는 것처럼 확인된다. 그러나, α-락트알부민, β-락토글로불린의 알칼라아제 가수분해물 중 10kDa 이하인 것에서는 TNF-α, iNOS 또는 COX-2에 대한 활성이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다. 따라서, α-락트알부민, β-락토글로불린의 알칼라아제 가수분해물 중 10kDa 이하인 것이 우수한 염증 억제 효과가 있을 것으로 판단된다.
< 실시예 4. 유청 단백질 가수분해물의 염증 억제 효과 확인 II >
마우스 대식세포인 Raw264.7 세포를 2×105/㎖이 되도록 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48웰 플레이트(Corning, USA)에 500㎕씩 분주하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하였다. 실시예 1에서 준비한 각각의 시료로서, α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA에 관해, 각 해당 단백질, 이들의 총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물, 이들의 10kD 이하 가수분해물(상기 가수분해물은 모두 알칼라아제를 이용하여 5시간 동안 효소분해함)을 각각 30㎍/㎖의 농도로 세포에 처리하여 20시간 동안 배양 한 후 배양액을 수거하여 TNF-α의 발현량을 ELISA를 수행하여 분석하였다. ELISA에 사용된 시약은 BD bioscience mouse TNF-α ELISA 세트를 사용하였고, 이에 대한 결과는 도 6에 나타내었다(유청 단백질 관련 : 도 6의 lane 3~6, α-락트알부민 관련 : 도 6의 lane 7~10, β-락토글로불린 관련 : 도 6의 lane 11~14, BSA 관련 : 도 6의 lane 15~18).
도 6을 참고하면, LPS 처리된 대식세포에서 α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA에 관해, 각 해당 단백질, 이들의 총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물의 TNF-α는 LPS만을 처리한 군과 비교하여 거의 비슷하거나 오히려 증가되는 것처럼 확인된다. 그렇지만, α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA의 10kD 이하 가수분해물에서는 우수한 TNF-α 억제 효과가 있는 것을 알 수 있으며, 상기 결과가 실시예 3의 분석 결과와도 일치하는 것으로 확인된다.
한편, 같은 조건에서 비교예 1에서 준비한 α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA에 관해, 트립신(트립신 단독 또는 알칼라아제와 병용)으로 분해한 단백질, 이들의 총 가수분해물, 이들의 10kD 초과 가수분해물, 이들의 10kD 이하 가수분해물에 대해서 TNF-α 억제 효과를 확인한 바, 하기와 같은 효과가 있음을 알 수 있어, 알칼라아제만을 단독 처리한 본 발명의 α-락트알부민, β-락토글로불린, BSA의 10kD 이하 가수분해물의 효과가 더 현저함을 알 수 있다. 이는 알칼라아제와 트립신이 작용하는 단백질 분해작용기가 다르기 때문인 것으로 예상되며, 알칼라아제 처리 후 트립신으로 처리하였을 때도 역시 트립신의 작용으로 인해 성질이 각각 다른 단백질들이 형성되었기 때문인 것으로 판단된다.
조건 TNF-α(pg/㎖)
대조군-무처리군 0.08
LPS 0.90
LPS + 유청 단백질의 10kD 이하 트립신 가수분해물 0.62
LPS + α-락트알부민의 10kD 이하 트립신 가수분해물 0.57
LPS +β-락토글로불린의 10kD 이하 트립신 가수분해물 0.50
LPS + BSA의 10kD 이하 트립신 가수분해 0.54
LPS + 유청 단백질의 10kD 이하 알칼라아제/트립신 가수분해물 0.64
LPS + α-락트알부민의 10kD 이하 알칼라아제/트립신 가수분해물 0.46
LPS +β-락토글로불린의 10kD 이하 알칼라아제/트립신 가수분해물 0.47
LPS + BSA의 10kD 이하 알칼라아제/트립신 가수분해 0.46
< 제제예 1. 약학적 제제>
실시예 1에서 BSA에 알칼라아제를 처리하여 얻은 10kDa 이하의 가수분해물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10%(v/w) 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
< 제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
실시예 1에서 BSA에 알칼라아제를 처리하여 얻은 10kDa 이하의 가수분해물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
실시예 1에서 BSA에 알칼라아제를 처리하여 얻은 10kDa 이하의 가수분해물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙( gravies )의 제조
실시예 1에서 BSA에 알칼라아제를 처리하여 얻은 10kDa 이하의 가수분해물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품( dairy products )의 제조
실시예 1에서 BSA에 알칼라아제를 처리하여 얻은 10kDa 이하의 가수분해물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
실시예 1에서 BSA에 알칼라아제를 처리하여 얻은 10kDa 이하의 가수분해물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
실시예 1에서 BSA에 알칼라아제를 처리하여 얻은 10kDa 이하의 가수분해물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (6)

  1. α-락트알부민(α-Lactalbumin, α-LA), β-락토글로불린(β-lactoglobulin, β-LG) 및 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제(alcalase)를 처리하여 얻은 가수분해물을 함유하는 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가수분해물은 분자량 10kDa 이하인 것만 선택적으로 추출한 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. α-락트알부민(α-Lactalbumin, α-LA), β-락토글로불린(β-lactoglobulin, β-LG) 및 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유청 단백질에 알칼라아제(alcalase)를 처리하여 얻은 가수분해물을 함유하는 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 가수분해물은 분자량 10kDa 이하인 것만 선택적으로 추출한 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 염증 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.








KR20140075107A 2014-06-19 2014-06-19 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 KR101464592B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140075107A KR101464592B1 (ko) 2014-06-19 2014-06-19 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140075107A KR101464592B1 (ko) 2014-06-19 2014-06-19 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101464592B1 true KR101464592B1 (ko) 2014-11-25

Family

ID=52291443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20140075107A KR101464592B1 (ko) 2014-06-19 2014-06-19 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101464592B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102622616B1 (ko) * 2022-09-20 2024-01-10 충남대학교산학협력단 유청 단백질 가수분해물 유래 활성 펩타이드를 포함하는 항산화, 항염 또는 노화억제용 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
African Journal of Biotechnology (2012), 11(12):2993-2999. *
CNU Journal of Agricultural Science (2012), 39(4):561-568. *
CNU Journal of Agricultural Science (2013),40(3):221-226. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102622616B1 (ko) * 2022-09-20 2024-01-10 충남대학교산학협력단 유청 단백질 가수분해물 유래 활성 펩타이드를 포함하는 항산화, 항염 또는 노화억제용 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sánchez et al. Bioactive peptides: A review
Danquah et al. Pharmaceutical applications of bioactive peptides
Saleh et al. Recent research in antihypertensive activity of food protein-derived hydrolyzates and peptides
Tagliazucchi et al. Release of angiotensin converting enzyme-inhibitory peptides during in vitro gastro-intestinal digestion of camel milk
EP1568377A1 (en) Cysteine protease inhibitor
US10308681B2 (en) Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cardiovascular disease comprising the peptide having the ability to inhibit angiotensin-1 converting enzyme as an active ingredient
JP5745402B2 (ja) α−ラクトアルブミン由来のトリプトファン含有ペプチドを含有する乳漿タンパク質加水分解物およびその使用
Korhonen et al. Bioactive peptides from food proteins
CN101305017A (zh) 奶酪蛋白的酶水解产物中鉴定的生物活性肽及其生产方法
JP4250599B2 (ja) プロテアーゼ阻害剤
KR101464592B1 (ko) 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101626291B1 (ko) 알칼리 단백분해효소를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101565299B1 (ko) 알칼라아제를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 아토피 피부염 또는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물
Sgarbieri Food proteins and bioactive peptides, function-al diets
KR101404850B1 (ko) 클로렐라 유래 항고혈압 활성을 갖는 펩티드
KR101491902B1 (ko) 콜라게나제의 활성 저해 효과를 갖는 신규 펩타이드 및 그의 용도
TWI466896B (zh) 分離自一鮪魚蒸煮液的水解產物的胜肽以及該水解產物與該等胜肽的應用
Chamorro et al. Non-marine Animal Bioactive Peptides: Properties, Sources, and Applications
Abedin et al. 20 Soybean-DerivedBioactive
Ganaie et al. Fermentable bioactive peptides as a functional molecule
Tokuşoğlu By-Products from Milk and Dairy Foods Bioactivity and Utilization
JP6309367B2 (ja) カゼイン加水分解物の製造方法
Yu et al. Whey protein hydrolytic properties and its immunomodulation activity by produced enzyme from Serratia marcescens S3-R1
JP2021024847A (ja) 脳機能障害改善用組成物
Prasad Patil et al. Biofunctional properties of milk protein derived bioactive peptides-a review.

Legal Events

Date Code Title Description
A302 Request for accelerated examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171025

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181030

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191031

Year of fee payment: 6