KR101456627B1 - 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 마우스 위암 세포주 - Google Patents
면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 마우스 위암 세포주 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101456627B1 KR101456627B1 KR1020130045644A KR20130045644A KR101456627B1 KR 101456627 B1 KR101456627 B1 KR 101456627B1 KR 1020130045644 A KR1020130045644 A KR 1020130045644A KR 20130045644 A KR20130045644 A KR 20130045644A KR 101456627 B1 KR101456627 B1 KR 101456627B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gastric cancer
- ncc
- cell line
- cancer cell
- cell lines
- Prior art date
Links
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 182
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 182
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 182
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 title abstract description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 title abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 11
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 title description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 title 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 title 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000002257 antimetastatic agent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 16
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 claims description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 36
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 21
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 abstract 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 164
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 45
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 33
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 102000049937 Smad4 Human genes 0.000 description 26
- 108091007854 Cdh1/Fizzy-related Proteins 0.000 description 21
- 102000038594 Cdh1/Fizzy-related Human genes 0.000 description 20
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 101150110129 CHD1 gene Proteins 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 6
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710150912 Myc protein Proteins 0.000 description 4
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- 206010063916 Metastatic gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 3
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 3
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 208000026787 diffuse type adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 102000045222 parkin Human genes 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 231100000338 sulforhodamine B assay Toxicity 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CHMNMRMSFMQHGI-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-diphenyl-1H-tetrazol-1-ium-3-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole 2H-tetrazol-1-ium dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].[NH2+]1C=NN=N1.S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)[NH2+]C(C=2C=CC=CC=2)=N1 CHMNMRMSFMQHGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000619542 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase parkin Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100384865 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cot-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000096 clonogenic assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000009643 clonogenic assay Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 208000024558 digestive system cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 201000010231 gastrointestinal system cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012603 in vitro chemosensitivity assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012910 preclinical development Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001187 pylorus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003210 sulforhodamine B staining Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가 또는 전이 억제 유전자의 발굴 및 억제제의 개발을 위한, 자연발생 위암 동물모델 및 이로부터 수립된 위암 세포주에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 위암 동물모델 및 이로부터 수립된 위암 세포주는 조직병리학적 특징이 인체 위암과 유사하고, 항암활성이 있는 4-1BB 억제제에 의해 암세포의 크기가 줄어드는 것을 확인함으로써, 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 위암 세포주 중 하나는 전이가 빠르기 때문에 다른 세포주들과 유전자 발현을 비교하여, 전이에 관련하는 유전자를 발굴하고 전이 억제제의 개발 및 효능평가에 유용하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 위암 동물모델 및 위암 세포주는 면역억제 마우스를 대신하여 위암 억제제 및 위암 전이 억제제의 효능평가 및 면역치료제(immunotherapy) 평가에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
Description
본 발명은 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가 또는 전이 억제 유전자의 발굴 및 억제제의 개발을 위한 위암 동물 모델 및 마우스 위암 세포주, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
항암신약이나 새로운 항암화학요법을 개발하기 위한 전임상 연구의 핵심은 항암활성을 정확하고 신속하게 평가하는 데 있다. 새로운 항암제 및 항암화학요법을 개발하기 위해서는 비용 및 신속성의 면에서 시험관(in vitro) 시험계가 생체내(in vivo) 실험계에 비해 경제적이고 우수하지만, 시험관 실험계에 있어서 효능평가의 유효성은 상기 실험계가 생체 내 상황을 충분히 대변하여 임상적으로 의미있는 효능이 검증될 수 있는지의 여부에 달려있다. 현재까지 전임상 개발 단계를 거쳐 임상시험에 진입한 항암 후보물질들의 약 90%가 최종개발에 실패하였는데 이는 적절한 실험계의 부재로 인해 임상 효능의 가능성을 지닌 화합물의 발굴에 실패했기 때문이다(Staquet M.J. et al., Cancer Treat Rep:67, 753-765, 1983; Twentyman P.R., Ann Oncol:5, 394-396, 1994: von Hoff D.D., Clin Cancer Res:4, 1079-1086, 1998).
지금까지 널리 쓰이고 있는 시험관 내 화학감수성 분석방법(in vitro chemosensitivity assay)으로는 콜론 형성 분석법(clonogenic assay), 염료 배제 분석법(dye exclusion assay), MTT 분석법[tetrazolium salt 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay] 또는 SRB 분석법(sulforhodamine B assay) 등이 있다. 상기한 방법은 항암신약개발에 있어서 대량검색(high-throughput)이 필요한 1차 스크리닝 계로서는 의미가 있으나, 인체 고형암의 생체 내 조건과는 조건이 매우 달라서 고형암에 대한 반응률을 예측하기에는 무리가 있다. 고형암의 경우, 항암화학요법제에 대한 반응률이 낮은 이유는 고형암 세포의 삼차원적 조직화와 다세포계(multicellular system)에서 기인하는 세포간 및 세포와 세포간질(extracellular matrix, ECM)간의 상호작용 등이 항암약물의 암조직내 침투저하 및 조직 내 농도저하를 가져오는 등의 여러 기전으로 말미암아 약물에 대한 내성을 유발하기 때문으로 알려져 있다(Wolfgang M.K., Crit Rev Oncol Hematol:36, 123-139, 2000: Bernard D. et al., Crit Rev Oncol Hematol:36, 193-207, 2000).
위암은 전 세계적으로 발생빈도가 높은 암 중 하나로 한국 및 일본 등 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다(Parkin et al., Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugut et al., Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996; Parkin, Lancet Oncol. 2: 533-543, 2001). 또한, 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있으며, 위암의 증상이 어떤 특성을 갖는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 보이며, 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 증상이 있다 하더라도 비교적 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람 이를 간과하기 쉬워 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다. 따라서, 실제 위암 환자들 중 원발암(primary culture)의 상태에서 사망하는 것보다 약 90% 정도의 환자가 전이암으로 악화한 후 사망에 이르고 있다.
현재 위암 항암제의 전임상 시험을 위해서는 인간 위암세포주를 면역억제마우스(SCID 또는 누드마우스)에 주입하여 항암신약의 활성을 평가하고 있다. 그러나 상기 면역억제마우스를 이용한 전임상 시험은 면역요법의 효능평가 및 면역 치료에 대한 안전성 평가방법에 부적합하다는 문제점이 있기 때문에 상기 원발성 위암의 전이 억제제 개발에 필요한 세포주 및 동물모델의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 위암 항암신약의 활성 평가를 위한 마우스 모델 및 세포주를 연구하던 중, 조직병리학적 특징이 인체 위암과 유사한 위암 마우스 모델 및 이로부터 수립된 위암 세포주를 개발하였으며, 상기 위암 세포주가 각각 항암활성이 있는 4-1BB 억제제에 의해 암세포의 크기가 줄어든 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 세포주 중 두 종류의 위암 마우스 세포주의 유전자 발현을 비교한 결과, 전이에 관련하는 유전자가 존재하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 위암 동물모델 및 이로부터 수립된 위암 세포주는 항암신약의 활성평가 및 전이 억제제의 발굴에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 위암치료제의 효능평가 및 면역 치료에 대한 안전성 평가방법를 위한 마우스 위암 동물 모델 및 이로부터 수립된 마우스 위암 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 위암 동물모델 및 위암 세포주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 위암 동물모델 및 위암 세포주를 이용하여 면역치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성평가 또는 전이억제 유전자를 발굴하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전형 Cre+;Smad4fl/fl;p53fl/fl;Cdh1fl/+ 형질을 가지고, 위암을 갖는 위암 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 동물모델의 제조방법을 제공한다:
1) Smad4fl / fl 마우스, p53fl / fl 마우스 및 Cdh1fl / fl 마우스를 각각 Villin-Cre 마우스와 교배시킨 후, 선별하여 Cre+;Smadfl /+ 마우스, Cre+;p53fl /+ 마우스 및 Cre+;Chd1fl/+ 마우스를 수득하는 단계;
2) 단계 1)의 Cre+;Smadfl /+ 마우스, Cre+;p53fl /+ 마우스 및 Cre+;Chd1fl /+ 마우스를 무작위 교배시킨 후, 선별하여 Cre+;Smadfl /+;p53fl /+;Chd1fl /+ 마우스를 수득하는 단계; 및
3) 단계 2)의 Cre+;Smadfl /+;p53fl /+;Chd1fl /+ 마우스들 사이에 교배시킨 후, 선별하여 Cre+;Smad4fl / fl;p53fl / fl;Cdh1fl /+ 마우스를 수득하는 단계.
또한, 본 발명은 본 발명의 위암 동물모델로부터 분리된 위암세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 세포주의 제조방법을 제공한다:
1) 본 발명의 위암 동물모델의 위의 종괴를 절제한 후, 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양된 종괴로부터 위암 세포를 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 세포주의 제조방법을 제공한다:
1) 본 발명의 위암 동물모델의 위의 종괴를 절제한 후, 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 종괴로부터 위 줄기세포 양성 세포를 분리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 세포를 면역결핍 마우스(SCID)에 주사한 후, 전이소를 분리하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 전이소로부터 위암 세포주를 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법을 제공한다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암 세포를 억제하는 정도를 측정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 제공한다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 전이 억제제 후보물질의 효능평가방법을 제공한다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암세포의 전이를 억제하는 정도를 측정하는 단계.
아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 제공한다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계.
본 발명의 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 자연발생 위암 동물 모델 및 이로부터 수립된 위암 세포주는 조직병리학적 특징이 인체 위암과 유사하고, 전이가 빠르며 전이의 일관성 및 높은 예측성을 보이므로 전이억제 유전자의 발굴 및 억제제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 자연발생 위암 마우스를 위한 교배 계획을 나타낸 도이다.
도 2는 제조된 자연발생 위암 마우스의 원발 종양에 대한 육안 및 조직병리학적 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 수립된 NCC-S2 및 NCC-S1가 위암 세포주인 것을 확인한 도이다.
도 3A는 수립된 NCC-S1M의 모세포를 확인한 도이다.
도 3B는 수립된 NCC-S1M이 위암 세포주인 것을 확인한 도이다.
도 4A는 NCC-S1이 NCC-S1M과 비슷한 패턴의 유전자 불안정성(genomic instability)을 나타냄을 확인한 도이다.
도 4B는 NCC-S1M에서 Smad4 및 p53의 발현을 확인한 도이다.
도 5는 NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주에서 Myc 단백질 발현이 증가함을 확인한 도이다.
도 6은 NCC-S1M 세포주의 전이성을 육안으로 확인한 도이다.
도 7은 NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주의 세포독성을 확인한 도이다.
A: 5-FU, 및
B: 시스플라틴(cisplatin).
도 8은 루시퍼라제가 발현되어 암의 발생 및 전이 여부를 더욱 용이하게 확인할 수 있는 마우스 모델을 나타내는 도이다.
도 9는 항-4-1BB를 처리한 시험군이 랫 IgG를 처리한 대조군에 비해서 종양의 성장이 유의적으로 감소함을 확인한 도이다.
도 2는 제조된 자연발생 위암 마우스의 원발 종양에 대한 육안 및 조직병리학적 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 수립된 NCC-S2 및 NCC-S1가 위암 세포주인 것을 확인한 도이다.
도 3A는 수립된 NCC-S1M의 모세포를 확인한 도이다.
도 3B는 수립된 NCC-S1M이 위암 세포주인 것을 확인한 도이다.
도 4A는 NCC-S1이 NCC-S1M과 비슷한 패턴의 유전자 불안정성(genomic instability)을 나타냄을 확인한 도이다.
도 4B는 NCC-S1M에서 Smad4 및 p53의 발현을 확인한 도이다.
도 5는 NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주에서 Myc 단백질 발현이 증가함을 확인한 도이다.
도 6은 NCC-S1M 세포주의 전이성을 육안으로 확인한 도이다.
도 7은 NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주의 세포독성을 확인한 도이다.
A: 5-FU, 및
B: 시스플라틴(cisplatin).
도 8은 루시퍼라제가 발현되어 암의 발생 및 전이 여부를 더욱 용이하게 확인할 수 있는 마우스 모델을 나타내는 도이다.
도 9는 항-4-1BB를 처리한 시험군이 랫 IgG를 처리한 대조군에 비해서 종양의 성장이 유의적으로 감소함을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 유전형 Cre+;Smad4fl / fl;p53fl / fl;Cdh1fl /+ 형질을 가지고, 위암을 갖는 위암 동물모델을 제공한다.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 동물모델의 제조방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) Smad4fl / fl 마우스, p53fl / fl 마우스 및 Cdh1fl / fl 마우스를 각각 Villin-Cre 마우스와 교배시킨 후, 선별하여 Cre+;Smadfl /+ 마우스, Cre+;p53fl /+ 마우스 및 Cre+;Chd1fl/+ 마우스를 수득하는 단계;
2) 단계 1)의 Cre+;Smadfl /+ 마우스, Cre+;p53fl /+ 마우스 및 Cre+;Chd1fl /+ 마우스를 무작위 교배시킨 후, 선별하여 Cre+;Smadfl /+;p53fl /+;Chd1fl /+ 마우스를 수득하는 단계; 및
3) 단계 2)의 Cre+;Smadfl /+;p53fl /+;Chd1fl /+ 마우스들 사이에 교배시킨 후, 선별하여 Cre+;Smad4fl / fl;p53fl / fl;Cdh1fl /+ 마우스를 수득하는 단계.
상기 동물모델 제조방법에 있어서, 단계 1)의 표적 유전자는 Smad4, p53 및 Cdh1인 것이 가장 바람직하나, 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)라면 모두 사용가능하다.
상기 동물모델 제조방법에 있어서, 단계 1)의 표적 유전자 녹아웃 방법은 Cre-loxP 위치 특이성 재조합(site specific recombination)을 사용하는 것이 가장 바람직하나, 표적 유전자를 녹아웃시킬 수 있다면 당업계에 알려진 보편적인 방법은 모두 사용가능하다.
상기 동물모델 제조방법에 있어서, 단계 2)의 헤테로 마우스는 Cre+;Smad4fl/+, Cre+;p53fl /+ 및 Cre+;Cdh1fl /+의 유전자형을 갖는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 동물모델 제조방법에 있어서, 단계 2)의 수득된 마우스는 유전자형이 Cre+;Smad4fl/fl;p53fl/fl;Cdh1fl/+인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 동물모델 제조방법에 있어서, 단계 3)의 제조된 마우스 중 Cdh1fl / fl 형질을 갖는 경우, 배아에 치명적이기 때문에 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cdh1fl/+ 형질을 갖는 마우스가 제조되었으나 이에 한정하지 않는다.
상기 동물모델 제조방법에 있어서, 단계 3)의 동물모델은 설치류인 것이 바람직하고, 마우스인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 동물모델은 암이 발생하는 것이 바람직하고, 위장관계열 암이 발생하는 것이 더욱 바람직하나, 위암, 소장암 및 대장암이 발생하는 것이 가장 바람직하다. 또한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 상기 위암은 인체 미만형 위암과 조직병리학적 특성이 거의 동일한 것이 바람직하고, 인환세포(signet ring cell)을 갖는 저분화 미만형 위암(poorly differentiated diffuse-type adenocarcinoma)인 것이 가장 바람직하다.
상기 동물모델 제조방법으로 제조된 위암 동물모델에서 위암 형성을 확인하는 방법은, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 부검이 사용되었으나 이에 한정하지 않는다.
본 발명은 본 발명의 위암 동물모델로부터 분리된 위암세포주를 제공한다.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 세포주의 제조방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 상기 위암 동물모델의 위의 종괴를 절제한 후, 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양된 종괴로부터 위암 세포를 분리하는 단계.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 1)의 절제된 종괴는 둘 이상의 암세포 집단이 혼합하여 자라고 있는 것을 특징으로 하나 이에 한정하지 않는다.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 2)의 분리 배양은, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 일곱 번째 계대에서 수행하는 것이 가장 바람직하나, 시험관 내(in vitro)에서 형태학(morphology)적 차이가 육안으로 관찰되면 수행하여도 무방하다.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 2)의 수립된 세포주는 Smad4 및 p53을 발현하지 않는 것을 특징으로 하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 표적 유전자의 녹아웃 여부를 확인하기 위한 방법은 단백질 또는 RNA 수준에서 확인 가능하며, RNA 수준에서 확인할 경우 RT-PCR 및 DNA 칩의 방법을 사용할 수 있고, 표적 단백질을 사용할 경우 면역형광법, 질량분석법, 단백질 칩, 웨스턴 블랏 및 ELISA로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 세포주의 제조방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 상기 위암 동물모델의 위의 종괴를 절제한 후, 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 종괴로부터 위 줄기세포 양성 세포를 분리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 세포를 면역결핍 마우스(SCID)에 주사한 후, 전이소를 분리하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 전이소로부터 위암 세포주를 분리하는 단계.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 1)의 절제된 종괴는 둘 이상의 암세포 집단이 혼합하여 자라고 있는 것을 특징으로 하나 이에 한정하지 않는다.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 2)의 위 줄기세포 양성 세포를 분리하기 위한 마커는 Epcam이 사용되었으나 이에 한정하지 않으며, 당업계에 잘 알려진 위 줄기세포 마커라면 모두 사용가능하다.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 3)에서 분리된 전이소를 다른 면역결핍 마우스에 이식한 후, 형성된 전이소를 분리하는 단계를 추가적으로 포함하나 이에 한정하지 않는다.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 3)의 주사는 피하에 주사하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한 주사 부위는 마우스의 몸통부위에 주사하는 것이 바람직하고, 복부에 주사하는 것이 더욱 바람직하나, 옆구리에 주사하는 것이 가장 바람직하다.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 3)의 세포 주입은 4 × 104 내지 6 × 104개의 세포를 주입하는 것이 바람직하고, 4.5 × 104 내지 5.5 × 104개의 세포를 주입하는 것이 더욱 바람직하며, 5 × 104개의 세포를 주입하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 위암 세포주의 수립방법에 있어서, 단계 3)의 전이소는 폐에서 발견된 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 수립방법에 의해 수립된 높은 전이성을 갖는 위암 세포주가 본 발명의 NCC-S2 및 NCC-S1 중 어느 세포주에서 유래하였는지 확인하기 위하여 본 발명의 바람직한 실시예에서 Cgh 어레이(array)를 사용하였으나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 수립된 높은 전이성을 갖는 위암 세포주는 본 발명의 동물모델 유래 암세포에서 유래한 것이 바람직하고, 상기 동물모델의 위암 세포주인 NCC-S2 및 NCC-S1에서 유래한 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 NCC-S1에서 유래한 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 자연발생 위암 마우스를 제조하기 위하여 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)인 Smad4, p53 및 Cdh1을 결손시켜 위암을 유발한 마우스 모델을 제조하였고(도 1 참조), 상기 마우스 모델의 원발 종양이 인체 미만형 위암과 거의 동일한 특성을 가짐을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 상기의 마우스 모델에서 생성된 위암 종괴를 이용하여 마우스 유래 위암 세포주를 수립하기 위해 배양을 시도하였다. 초기 계대 배양 단계에서 둘 이상의 암세포가 혼합하여 자라는 것을 확인하였고, 이를 분리배양하여 NCC-S2 및 NCC-S1를 수립하였으며, 상기 NCC-S2 및 NCC-S1 세포주에서 Smad4 및 p53의 단백질 발현이 되지 않음을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 상기의 마우스 모델에서 생성된 위암 종괴를 피하주사 및 수술적 이식의 두 차례에 걸쳐서 면역결핍마우스(SCID)에 주입하였으며, 상기 종괴에서 유래된 폐 전이소를 분리배양하여 NCC-S1M을 수립하였다. 상기 NCC-S1M 세포주는 NCC-S1에서 유래된 것으로 보이며, 모세포와 마찬가지로 Smad4를 발현하지 않는 암세포임을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 제작된 세포주가 암 세포주인지 확인하기 위하여 발암 유전자인 Myc 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 수행하였으며, NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M 모두에서 Myc 단백질이 발현되었음을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M의 종양형성 능력을 확인하였는데, NCC-S1M이 더 낮은 농도에서 종양을 형성하여 더 높은 종양형성 능력이 있음을 확인하였다(표 1 참조).
또한, 본 발명자들은 NCC-S1M 세포주의 전이성을 확인하였고, NCC-S1M은 NCC-S1에 비해 빠른 생체 내 성장을 보였으며 육안으로도 관찰가능한 전이소를 가짐을 확인하였다(표 2 및 도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 NCC-S1 및 NCC-S1M의 세포독성을 확인하였고, NCC-S1M이 NCC-S1에 비해 모든 약에 대한 높은 저항성이 있음을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 NCC-S1M 세포주가 마우스 모델에서 전이를 확인하기 쉽도록 하기 위해 루시퍼라제 결합된 NCC-S1M 세포주를 제작하여, 마우스에서 전이성 위암의 발생을 확인하였다(도 8 참조).
아울러 본 발명자들은 NCC-S1M 세포주가 암 면역치료요법에 적용 가능한지 여부를 확인하였고, 항-4-1BB를 처리한 시험군이 랫 IgG를 처리한 대조군에 비해서 종양의 성장이 유의적으로 감소함을 관찰하였다(표 3 및 도 9 참조).
따라서, 본 발명자들은 마우스에서 원발성 위암을 발생시키는 세포주 NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M을 수립하였으며, 그 중 NCC-S1M은 높은 전이성을 가짐을 확인하였다. 또한 상기 세포주를 이용한 위암 마우스 모델을 제작하여 위암 항암제 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암 세포를 억제하는 정도를 측정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암세포의 전이를 억제하는 정도를 측정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 본 발명의 위암 동물모델 또는 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 동물모델 또는 위암 세포주의 위암 또는 위암세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 자연발생 위암 마우스의 제작
<1-1> 자연발생 위암 마우스를 위한 교배
본 발명의 마우스 위암세포주 마우스모델 제작을 위하여, 조건 유전자 녹아웃(conditional gene knockout) 방법을 이용하여, 암억제유전자(tumor suppressor gene)인 Smad4, p53, Cdh1 유전자를 위장관계열 상피세포 특이적으로 결손시켜 위암을 유발한 마우스 모델을 제조하였다.
구체적으로, loxP 유전자를 갖는 Smad4fl /fl(Chuxia Deng 박사님으로부터 제공받음, NIH, 미국), p53fl / fl(NCI Mouse Repository, 미국), Cdh1fl /fl(Jackson Laboratory, 미국) 마우스를 Cre-loxP 위치특이성 재조합(site specific recombination)의 수행을 위하여 Villin-Cre 마우스(NCI Mouse Repository, 미국)와 각각 교배하여, Cre+;Smad4fl /+, Cre+;p53fl /+ 및 Cre+;Cdh1fl /+의 헤테로 마우스(hetero mouse)를 제조하였다. 상기 3종류의 헤테로 마우스를 무작위 교배를 수행하여, 유전형이 Cre+;Smad4fl /+;p53fl /+;Cdh1fl /+인 마우스를 두 마리 수득한 후, 상기 두 마리의 마우스를 무작위로 교배하여 최종적으로 Cre+;Smad4fl/fl;p53fl/fl;Cdh1fl/+, Cre+;Smad4fl / fl;p53fl / fl, Cre+;p53fl / fl 또는 Cre+;Smad4fl/fl의 유전자형을 갖는 마우스를 수득하였다(도 1).
상기 제조된 마우스 유전자형의 확인을 위하여 유전자형 PCR(genotyping PCR)을 수행하였으며, 구체적으로 당업계에 널리 알려진 방법으로 게놈 DNA를 추출하여, gDNA 0.45 ul(50 ~ 100 ng/ul DNA), 10x 버퍼(buffer) 1 ul, dNTP(2.5 mM) 0.8 ul, 프라이머-F 0.3 ul, 프라이머-R 0.3 ul, EX-Taq(다카라, 일본) 0.05 ul, 증류수 7.1 ul의 혼합물을 만들어 유전자형 PCR(genotyping PCR)(94℃ 5분, 94℃ 40초, 55℃ 35초, 72℃ 40초, 72℃ 3분, 40회 반복)을 수행하였다.
상기 유전자형 PCR에 사용된 프라이머의 서열은 하기와 같다:
Villin-Cre-F(2): 5'-TCCTCTAGGCTCGTCCCG-3'(서열번호 1),
Villin-Cre-F(3): 5'-CAGATTACGTATATCCTGGCAG-3'(서열번호 2),
Smad4-Genotype-F: 5'-GGGCAGCGTAGCATATAAGA-3'(서열번호 3),
Smad4-Genotype-R: 5'-GACCCAAACGTCACCTTCAC-3'(서열번호 4),
Trp53-Genotype-F: 5'-TGGAGATATGGCTTGGCTTGGAGTAG-3'(서열번호 5),
Trp53-Genotype-R: 5'-CAACTTACTTCGAGGCTTGTC-3'(서열번호 6),
Cdh1-Genotype-F: 5'-CGTTCATGGATCAGAAGATCAC-3'(서열번호 7), 및
Cdh1-Genotype-R: 5'-GAACTAGGGAGGTAGAAGGAGC-3'(서열번호 8).
한편, 상기 제조방법에 있어서, Cre+ 마우스에서 Cdh1fl / fl인 경우 배아에 치명적이어서(embryo-lethality) Cre+;Cdh1fl / fl 형질을 갖는 마우스는 태어나지 않기에 Cdh1fl/+를 사용하였다.
<1-2>
원발
종양에 대한 육안 및 조직병리학적 관찰
상기 실시예 <1-1>에서 제작한 Cre+;Smad4fl/fl;p53fl/fl;Cdh1fl/+ 유전형을 갖는 마우스에서 원발종양의 발생여부를 확인하기 위하여, 부검 후, 육안 및 조직병리학적 관찰을 수행하였다.
구체적으로, 하룻밤 동안 금식한 마우스를 이소플루레인(isoflurane)을 이용하여 안락사시키고, 위장관(gastrointestinal tract)을 바로 제거하였다. 위(stomach)는 가위를 이용하여 큰만곡(greater curvature)을 따라 절제되어 여과지에 조각을 펼쳐놓았다. 창자는 대장(large intestine) 및 소장(small intestine)으로 나눠지고, 소장은 십이지장(duodenum), 공장(jejunum) 및 회장(ileum)의 세 부분으로 절단되었다. 창자의 각 부분은 가위를 이용하여 조심스럽게 세로로 자른 후, 여과지에 펼쳐 놓았다. 그리고 위 및 창자는 차가운 PBS로 씻어내고, 상기 위 및 창자에 남은 PBS는 종이타월을 이용해 제거한 후, 전체적인 관찰을 수행하였다. 그리고나서 창자는 나무 막대기에 전단부(proximal end)에서 후단부(distal end)로 루미날 측면(luminal side)을 말고, 상기 말린 창자의 끝 부분은 26-게이지(gauge)로 고정하여 10% 중화포르말린(neutral buffered formalin)에 고정시켰다. 고정 하루 후, 십이지장에서 회장축(ileal axis)을 따라 면도날을 이용하여 위는 6개 조각으로 잘라내고, 말린 창자는 반으로 잘라내었다. 그 후, 상기 조직들은 당업계에 널리 알려진 방법으로 파라핀(paraffin)에 끼워넣고, 5 ㎛ 횡단면(cross section)을 잘라내어 병리조직학적시험을 위한 H & E 염색을 수행하였다. 상기 H & E 염색은 당업계의 당업자라면 누구나 알 수 있는 보편적인 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 유문(pylorus) 부위에 직경 7 × 9 mm 의 종괴와 소장에 2 ~ 3 mm 가량의 다발성 종괴가 관찰되었다(도 2A). 또한, 병리조직학적 검사 결과, 위에서 관찰된 종괴는 인환세포(signet ring cell)를 갖는 저분화 미만형 위암(poorly differentiated diffuse-type adenocarcinoma)으로 진단되었다. 또한 상기 모델 마우스에서 발생한 위암의 조직병리학적인 특성이 인체 미만형 위암과 거의 동일한 것을 확인하였다(도 2B).
<
실시예
2> 마우스 위암세포주의 수립
<2-1> NCC-S2 및 NCC-S1 세포주의 수립
상기 <실시예 1>의 방법으로 확립된 마우스 모델을 이용한 마우스 위암 세포주인 NCC-S2 및 NCC-S1 세포주를 수립하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>의 마우스 모델의 위에서 관찰된 종괴를 절제하고, 차가운 PBS로 세척하여, 세척된 종괴를 소량의 RPMI1640 배지가 담긴 세포 배양접시(tissue culture dish)로 옮긴 후, 종괴를 외과용 메스(surgical blade)로 잘게 다져 작은 조각으로 만들고 수차례 파이펫팅(pipetting)을 통해 더 작은 조각으로 만들었다. 상기 잘게 부셔진 종괴를 20% FBS, 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함한 RPMI1640 배지가 담긴 25 cm2 플라스크에 접종(seeding) 하였다. 충분한 정도의 종양세포집단(tumor cell population)의 형성 및 심각한(heavy) 종양세포 성장이 관찰되었을 때, 트립신처리(trypsinization)을 통해 1차 계대를 수행하였다. 1차 계대 이후로는 10% FBS를 포함한 RPMI1640을 이용하여, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
그 결과, 초기 계대(initial passage)의 세포주에서는 둘 이상의 암세포 집단(cancer cell population)이 혼합되어 자라고 있었으며, 일곱 번째 계대에서 서로 다른 시험관 내(in vitro) 형태(morphology)가 확인되어, 상기 세포주의 분리 배양을 시도하여, 상기 분리된 각각의 세포주에 대하여 NCC-S2 및 NCC-S1로 명명하였다.
<2-2> NCC-S2 및 NCC-S1 세포주 확인
상기 <2-1>에서 제조된 세포주가 <실시예 1>의 마우스 모델에서 유래된 위암 세포주인 것을 확인하기 위하여, Smad4 및 p53의 발현을 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, 100 mm 배양접시에 70 내지 80% 배양된 세포를 리프터(lifter)로 긁어 모으고, 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻은 후, PBS로 1회 세척하고 다시 원심분리를 수행하여 웨스턴 블랏에 사용될 펠렛을 수득하였다. 상기 펠렛에 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitor)[0.8 uM 아프로틴(aprotinin), 0.02 uM 류펩틴(leupeptin), 1 uM 펩스타틴 A(pepstatin A), 0.04 uM 베스타틴(bestatin)]가 첨가된 200 ul T-PER 조직 용해 완충액(Thermo Scientific Inc.)을 넣고, 잘 섞어주어 얼음에 30분간 방치하였다[10분마다 볼텍싱(vortexing)을 수행]. 그리고 4℃, 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리를 하여 상층액을 얻고, 상기 얻어진 상층액을 BCA 용액(Pierce Inc.)을 이용하여 제조사의 사용설명서에 따라 단백질을 정량하였다. 사용 직전에 4% 머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 첨가한 4x 램리 샘플 완충액(Laemmli sample buffer)과 정량한 단백질을 1:3으로 섞은 후, 100℃에서 5분간 끓여주었다. 상기 방법으로 준비된 시료를 9%의 2상(two-phase) SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 단백질을 분리한 후, 겔을 해체하여 겔-막(gel-membrane)[니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막사용] 샌드위치(sandwich)를 만들어 1x 이동 완충액(transfer buffer)에서 단백질을 막으로 이동시켰다. 약 한 시간 후, 상기 단백질이 이동된 막을 전처리하기 위하여 1% BSA 및 2% 탈지우유(skim milk)에 30분 동안 교반해주고, 그리고나서 PBS-T로 5분간 3회 세척하였다. 상기 막은 1차 항체[5% BSA, 0.1% 아지드화 나트륨(sodium azide)이 포함된 PBS-T에 1차 항체는 1/1000으로 희석하여 사용)(Smad4: Santa cruz, P53: Santa cruz sc-6243, E-cadherin: Cell Signaling #4065)를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 다음날, PBS-T로 5분간 3회씩 세척하였다. 또한 2차 항체(5% 전지우유가 함유된 PBS-T에 2차 항체를 1/5000으로 희석하여 사용)[염소(goat) 항-마우스/토끼, GenDEPOT]는 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 2차 항체와 반응 후, PBS-T로 5분간 3회 교반하며 세척하고, ECL 용액(Thermo Scientific Inc.)에 1분간 담가둔 후 X-레이(X-ray) 필름에 인화하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 NCC-S2 및 NCC-S1 세포주에서 Smad4 및 p53이 발현되지 않는 것을 확인함으로써, 상기 세포주가 <실시예 1>의 마우스 모델에서 유래한 위암 세포주임을 확인하였다(도 3).
<2-3>
NCC
-S1M 세포주의 수립
상기 <2-1>에서 NCC-S2 및 NCC-S1의 분리배양을 하기 전의 암세포를 이용하여, 모 세포주보다 더 높은 전이성을 나타내는 세포주인 NCC-S1M을 수립하였다.
구체적으로, <2-1>에서 NCC-S2 및 NCC-S1의 분리배양을 하기 전의 암세포를(여섯 번째 계대) 위 줄기세포(gastric stem cell) 마커인 Epcam으로 양성분류(positive sorting)하여 수득한 5 × 104개의 세포를 면역결핍 마우스(SCID)의 옆구리 피하에 주사한 후, 80일 후 상기 마우스를 부검한 결과 폐에서 전이소가 관찰되었다. 폐조직에서 관찰된 전이소를 절제하여 다른 면역결핍 마우스의 옆구리에 수술적으로 이식하고 55일 후, 상기 마우스를 부검하였으며, 역시 폐에서 전이소가 관찰되었다. 상기 전이소를 절제하여 NCC-S2, NCC-S1를 수립하였던 <2-1>의 방법으로 세포주를 확립하였으며, 이를 NCC-S1M으로 명명하였다.
<2-4>
NCC
-S1M의 모세포 확인
NCC-S1M은 초기 암세포를 이용하여 전이된 세포주를 확보한 것이므로, NCC-S1M이 NCC-S2 및 NCC-S1 중 어느 세포주에서 유래하였는지 확인하기 위하여, DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 각각의 세포주로부터 전체 DNA를 추출한 후, CGH 어레이를 수행하였다.
구체적으로, 유전자 복제 수 변이(copy number alterations; CNA)는 180,000 올리고뉴클레오티드 탐침(probe)을 포함하는 마이크로어레이 슬라이드(microarray slide)를 사용한 CGH 분석법에 의해서 확인되었다(Agilent Technologies, Santa Clara, USA). 시료의 준비 및 혼성화는 제조사의 지침서에 따라 수행되었고, DNA의 온전함(integrity)은 나노드롭(nanodrop), 피코그린(picogreen) 및 아가로스 겔 전기영동법에 의해 확인되었다. CGH 어레이를 위하여, 시험 DNA 1.5 ㎍ 및 참조 DNA 1.5 ㎍이 각각의 분석에 사용되었고, 상기 DNA는 Rsa I 및 Alu I으로 잘라진 후, Cy5-dUTP 또는 Cy3-dUTP 둘 중 하나를 사용하여 무작위로 표지되었다(labeled). 상기 표지된 DNA는 마이크로콘 원심분리 필터(Microcon Centrifugation Filters)인 Ultracel YM-30(Millipore, Billerica, Ma, 미국)을 이용하여 정제된 후, 탐침은 변성되고 인간 Cot-1 DNA(Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada) 50 ㎍과 예비 어닐링(pre-annealed)되었다. 혼성화는 65℃에서 24시간 동안 교반하면서 반응하였다.
혼성화 후, 슬라이드는 완충액 1(buffer 1)로 5분 동안, 완충액 2(buffer 2)로 2분 동안 실온에서 세척하고, 상기 세척한 슬라이드는 DNA 마이크로어레이 스캐너(DNA microarray scanner, Agilent Technologies)로 스캔되었다. 결과 데이터(data)는 스캔된 이미지(images)에서 Feature Extraction software, 버전 10.7.3.1(Agilent)로 추출되었고, 테스트 파일(test files)은 분석을 위하여 Genomic Workbench, 표준형 5.0.14(Agilent)으로 이동되었다. DNA 복제 수 변이를 확인하기 위해 Aberration Detection Method 2(ADM-2) 알고리즘(algorithm)을 사용하여, 통계학적 점수에 기초하여 지속적으로 높거나 낮은 로그 비율(log rations)을 갖는 시료에 있어서 모든 변이 간격(aberrant intervals)을 동정하였다. 그리고나서 변이 부분의 실제 범위를 판단하기 위해서 탐침으로 표본조사를 수행하였다. 통계학적 점수는 표준편차(standard deviation)의 단위에 있어서, 예상된 0의 값으로부터 로그 비율 평균의 편차를 나타낸다. 알고리즘은 시료의 치우친 로그 비율의 평균 질(quality)에 기초한 통계학적 점수에 있어서, 간격을 찾고, 참조 채널(reference channels) 사용자 지정된 한계점(threshold)을 초과하였다. 비록 한계점 6이 사용자 지침서에는 추천되나, 본 발명에 있어서 보존적 한계점 10을 사용하였고, 이는 어레이 구성(array plots)의 외관검사(visual inspection)가 낮은 한계점이라고 불리는 몇몇 변이의 거부를 이끌어내기 때문이다. 최소 5개 탐침의 여과 옵션을 적용하였고, 최소 절대 평균 로그2 비율 > 0.3이었다. USCS 인간 게놈 조립 hg18은 참조로 사용되었고, 복제 수 변이(CNV)는 Agilent Genomic Workbench analytic 소프트웨어에 삽입된 데이타 베이스(data base)로 확인되었다.
그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, NCC-S1가 NCC-S1M과 비슷한 패턴의 유전자 불안정성(genomic instability)을 나타내어, NCC-S1가 NCC-S1M의 모세포임을 확인하였다(도 4A).
또한, NCC-S1M이 모세포인 NCC-S1와 마찬가지로 Smad4 및 p53의 발현을 상기 서술된 웨스턴 블랏을 사용하여 확인한 결과, NCC-S1M에서도 상기 Smad4 및 p53의 발현은 확인되지 않았다(도 4B).
<
실시예3
> NCC-S2, NCC-S1 및
NCC
-S1M 세포주의 특성 확인
<3-1> NCC-S2, NCC-S1 및
NCC
-S1M 세포주에서
Myc
발암 유전자의 활성 확인
상기 실시예 <2-4>의 CGH 어레이를 통해서 Myc 발암 유전자의 증폭이 관찰되었으며, 상기 실시예 <2-2>에 서술된 방법으로 항-Myc 항체(Abcam, 1:1000)을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주에서 Myc 단백질 발현이 증가함을 확인하였다(도 5).
<3-2> NCC-S2, NCC-S1 및
NCC
-S1M 세포주의
종양형성
능력 확인
상기 실시예에서 수립한 NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M의 종양형성 능력을 확인하기 위하여, 5주령의 동종동계(syngenic) 마우스에 하기 표 1에서 제시된 것과 같은 농도로 NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주를 피하에 주사하고 종양의 형성여부를 관찰하였다.
구체적으로, NCC-S2, NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주를 배양하여 충분한 수를 확보하고, 트립신(trypsin) 처리하여 세포를 떨어뜨려 1500 rpm에서 3분 동안 원심분리를 수행하였다. 그 결과 수득된 펠렛을 PBS로 2번 세척한 후, 1 × 106, 1 × 105, 1 × 104, 1 × 103개의 세포를 각각 50 ㎕의 PBS에 부유시킨다. 그리고 1:1 비율로 마트리겔(Matrigel, BD Bioscience)과 잘 섞어 1 cc 인슐린 주사기에 담았다. 각 농도당 6 ~ 7 마리의 5주령 동생성 마우스(syngenic mice)의 옆구리 피하 조직에 주사하고, 4주 후 종양의 형성여부를 육안, 촉진, 조직 병리 판독 등을 통하여 확인하였다.
그 결과, NCC-S1M이 NCC-S2 및 NCC-S1 세포주에 비하여 더 낮은 농도에서 종양을 형성함으로써, NCC-S1M이 더 높은 종양형성 능력이 있음을 확인하였다(표 1).
| 세포주 | 세포주입량 | 종양이 발생한 쥐의 수(%) |
| NCC-S1M | 1 × 106 | 7/7(100) |
| 1 × 105 | 2/6(33.3) | |
| 1 × 104 | 1/6(16.7) | |
| 1 × 103 | 1/6(16.7) | |
| NCC-S1 | 1 × 106 | 1/7(14.3) |
| 1 × 105 | 0/6(0) | |
| 1 × 104 | 0/6(0) | |
| 1 × 103 | 0/6(0) | |
| NCC-S2 | 1 × 106 | 4/7(57.1) |
| 1 × 105 | 0/6(0) | |
| 1 × 104 | 0/6(0) | |
| 1 × 103 | 0/6(0) |
<3-3>
NCC
-S1M 세포주의 전이성 확인
상기 실시예 <3-2>의 결과 가장 높은 종양형성 능력을 나타낸 NCC-S1M 세포주의 전이성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 1 × 106개의 세포를 5주령의 SCID 마우스 8마리의 옆구리 피하에 주사하고, 옆구리에 생긴 종양의 크기가 1600 mm3의 부피가 되었을 때 부검을 수행하였다. 폐로의 전이 여부 및 정도에 대한 판단을 위해서 부검시 폐를 적출하고, 상기 적출된 폐를 보우인의 고정용액(Bouin's fixative solution)에 하룻밤 동안 고정한 후, 현미경으로 관찰하여 폐의 표면에 형성된 전이소의 수를 세었다. 또한, 육안으로 확인된 결절이 전이소인지 확인하기 위하여 최종적으로 조직 병리학적 평가를 수행하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, NCC-S1M은 NCC-S1에 비해 빠른 생체 내 성장을 보였으며, 동일 부피상에서 전이 정도를 비교하였을 경우 NCC-S1M은 육안으로 확인 가능한 전이소가 모든 개체에서 관찰되었으나(도 6), 반면에 NCC-S1은 육안 소견상으로 뿐만 아니라, 표 2에 나타난 바와 같이 조직 병리학적으로도 전이소를 관찰할 수 없었다(표 2).
| 조직병리학적 관찰 | |
| 폐로의 전이 | |
| NCC-S1 | 0/8 |
| NCC-S1M | 8/8 |
<3-4> NCC-S1 및
NCC
-S1M 세포주의 세포독성 확인
본 발명의 NCC-S1 및 NCC-S1M 세포주의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT 검정법을 수행하였다.
구체적으로, NCC-S1 및 NCC-S1M을 웰 플레이트(well plate)에 1 × 104 cells이 되도록 접종하고, 12시간 후, 시스플라틴(cisplatin) 및 5-FU를 각각 0.5, 1, 4, 6 uM의 농도와 1, 10, 100, 1000 uM의 농도로 처리하였고, 음성대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 상기 처리 48시간 후에 MTT 검정법을 수행하여 세포 생존율을 확인하였는데, 웰(well) 당 1 ml의 배지에 200 ㎕의 MTT 용액(PBS용액에 5 mg/ml의 농도가 되도록 첨가)을 첨가하고 2시간 동안 배양한다. 이후, 배지를 제거하고 500 ㎕의 DMSO를 첨가하여 10분 동안 부드럽게 교반하여 침전물이 완전히 용해되도록 하였다. 상기 침전물이 완전히 용해된 DMSO는 570 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, NCC-S1M이 NCC-S1에 비해 모든 약에 대한 높은 저항성을 갖고 있음을 확인하였다(도 7).
<
실시예
4>
루시퍼라제
결합된
NCC
-S1M 세포주를 이식한 마우스 모델에서 전이성 위암 확인
상기 실시예 <3-3>에 의해 전이성이 높다고 확인된 NCC-S1M 세포주가 마우스 모델에서 전이를 확인하기 쉽도록 하기 위해 루시퍼라제 결합된 NCC-S1M 세포주를 제작하였다. 또한 상기 제작된 루시퍼라제 결합된 NCC-S1M 세포주를 마우스 모델에 이식하여 전이성 위암이 발생하는지 확인하였다.
구체적으로, 루시퍼라제 유전자를 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터(SBI Inc.)를 변형시켜 제작한 pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)에 삽입하여 복제하였다. 상기 벡터를 포장벡터(packaging vector)(pMD2.G, psPAX2)와 같이 293FT 세포주(T75 플라스크에 50% 정도 차도록 배양)에 형질감염(transfection)하여 2일 후 배지를 수득하였다. 상기 수득한 배지를 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 얻어진 상층액을 0.4 ㎛ 주사기 필터(syringe filter)(PES; 비-발열성)를 이용하여 여과한 후, 상기 여과액의 1/6 만큼의 20% 자당용액을 첨가한 후, 초원심분리(ultracentrifuge)를 수행(4℃, 25,000 g, 3시간 30분)하여 렌티바이러스를 농축하였다. 상기 농축된 렌티바이러스 펠렛을 100 ㎕ RPMI에 용해시킨 후, 상기 용해액을 NCC-S1M 세포주에 바이러스 농도별로 처리하여[10 ㎍/ml 폴리브랜(polybrene) 첨가] 역가(titer)를 측정하였다. 이때, 역가는 500 ug㎍/ml G418을 처리하여 선별된 세포수와 G418을 처리하지 않은 세포수와 비교하여 상대적인 값을 얻고, 역가 측정 후 5 MOI 상당의 렌티바이러스를 NCC-S1M 세포에 10 ug㎍/ml 폴리브랜과 함께 처리하여 선별하였다. 약 2주간 선별된 1 × 105개의 루시퍼라제 결합된 NCC-S1M 세포주를 25 ㎕의 PBS에 부유시켜 1:1의 비율로 마트리겔과 섞은 후, 1 cc 인슐린 주사기에 담아 SCID 마우스의 복강을 열어 위 표면에 주사하였다.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 루시퍼라제가 발현되어 암의 발생 및 전이 여부를 더욱 용이하게 확인할 수 있는 마우스 모델을 제작하였다(도 8).
<
실험예
1> 암 면역치료요법을 위한
NCC
-S1M의 사용
상기 제작된 NCC-S1M 세포주가 암 면역치료요법에 적용 가능한지 여부를 확인하기 위하여 양성대조군으로 4-1BB 및 음성대조군으로 IgG를 투여하여 마우스에서 종양의 성장을 확인하였다.
구체적으로 NCC-S1M 세포를 배양하여 충분한 수를 확보하고, 트립신을 처리하여 세포를 모은다. 상기 모은 세포는 1500 rpm에서 3분간 원심분리 하여 세포만을 수득하고, 수득한 세포는 PBS로 2차례 세척한 후, 1 × 106 세포를 50 ㎕의 PBS에 부유시킨다. 상기 세포를 마트리겔(BD Bioscience)과 1:1의 비율로 섞어서 5주령 SCID 마우스 8마리의 옆구리 피하에 주사하고, 1주일 후에 1차로 항-4-1BB 및 랫 IgG를 복강 내 주사하고, 1차 주사 1주일 후, 상기 항-4-1BB 및 랫 IgG를 2차로 복강 내에 다시 한번 주사하였다. 종양의 부피는 1차 주사한 시점부터 측정되었다.
그 결과 도 9 및 표 3에 나타난 바와 같이, 항-4-1BB를 처리한 시험군이 랫 IgG를 처리한 대조군에 비해서 종양의 성장이 유의적으로 감소함을 관찰하였다.
| 날짜 | 3 | 5 | 7 | 10 | 12 | 14 | 17 | 19 | 21 |
| % T/C | 91.2984 | 88.4776 | 85.8961 | 76.3758 | 76.2079 | 70.7477 | 73.6646 | 66.3761 | 58.3387 |
| P 값 | 0.07561 | 0.11206 | 0.23562 | 0.05514 | 0.06322 | 0.0362 | 0.05723 | 0.00659 | 0.00328 |
T: 항-4-1BB, C: 랫 IgG
P값: 스튜던트 t-검정(student t-test)
<110> National Cancer Center
<120> Gastric cancer animal model for efficacy and immunotoxicity
assessments of gastric cancer drugs
<130> 12P-11-27
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Villin-Cre-F(2)
<400> 1
tcctctaggc tcgtcccg 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Villin-Cre-F(3)
<400> 2
cagattacgt atatcctggc ag 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Smad4-Genotype-F
<400> 3
gggcagcgta gcatataaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Smad4-Genotype-R
<400> 4
gacccaaacg tcaccttcac 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Trp53-Genotype-F
<400> 5
tggagatatg gcttggcttg gagtag 26
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Trp53-Genotype-R
<400> 6
caacttactt cgaggcttgt c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cdh1-Genotype-F
<400> 7
cgttcatgga tcagaagatc ac 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cdh1-Genotype-R
<400> 8
gaactaggga ggtagaagga gc 22
Claims (22)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 기탁번호 KCLRF-BP-00288로 기탁된 위암 세포주.
- 기탁번호 KCLRF-BP-00289로 기탁된 위암 세포주.
- 기탁번호 KCLRF-BP-00290으로 기탁된 위암 세포주.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 1) 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 세포를 억제하는 정도를 측정하는 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법.
- 1) 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법.
- 1) 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 세포의 전이를 억제하는 정도를 측정하는 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법.
- 1) 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130045644A KR101456627B1 (ko) | 2013-04-24 | 2013-04-24 | 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 마우스 위암 세포주 |
| PCT/KR2014/002760 WO2014175567A1 (ko) | 2013-04-24 | 2014-04-01 | 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 마우스 위암 세포주 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130045644A KR101456627B1 (ko) | 2013-04-24 | 2013-04-24 | 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 마우스 위암 세포주 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101456627B1 true KR101456627B1 (ko) | 2014-11-03 |
Family
ID=51792089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130045644A KR101456627B1 (ko) | 2013-04-24 | 2013-04-24 | 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 마우스 위암 세포주 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101456627B1 (ko) |
| WO (1) | WO2014175567A1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160094081A (ko) * | 2015-01-30 | 2016-08-09 | 국립암센터 | E-카데린 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주 및 이의 용도 |
| KR20240130899A (ko) | 2023-02-22 | 2024-08-30 | 아주대학교산학협력단 | Gfp 형광을 발현하는 불멸화된 마우스 위 유래 섬유아세포주 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI604054B (zh) * | 2016-11-09 | 2017-11-01 | 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學 | 原位胃癌細胞株及其製備方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080242742A1 (en) * | 2003-11-26 | 2008-10-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Animal models of pancreatic adenocarcinoma and uses therefor |
| KR20130033170A (ko) * | 2011-09-26 | 2013-04-03 | 인제대학교 산학협력단 | 전이성 유방암 세포주 ｔｕｂｏ－ｐ２ｊ |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8835539B2 (en) * | 2011-06-22 | 2014-09-16 | Kankyokeieisogokenkyusho Co., Inc. | Manufacturing method for resin composition containing fine paper powder |
-
2013
- 2013-04-24 KR KR1020130045644A patent/KR101456627B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-04-01 WO PCT/KR2014/002760 patent/WO2014175567A1/ko active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080242742A1 (en) * | 2003-11-26 | 2008-10-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Animal models of pancreatic adenocarcinoma and uses therefor |
| KR20130033170A (ko) * | 2011-09-26 | 2013-04-03 | 인제대학교 산학협력단 | 전이성 유방암 세포주 ｔｕｂｏ－ｐ２ｊ |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Cellular and Molecular Life Sciences, 2011.11 * |
| 국립암센터의 김학균에 의해 공개된 연구과제 최종보고서(2012.02.10) * |
| 국립암센터의 김학균에 의해 공개된 연구과제 최종보고서(2012.02.10)* |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160094081A (ko) * | 2015-01-30 | 2016-08-09 | 국립암센터 | E-카데린 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주 및 이의 용도 |
| KR101695165B1 (ko) | 2015-01-30 | 2017-01-11 | 국립암센터 | E-카데린 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주 및 이의 용도 |
| US9683987B2 (en) | 2015-01-30 | 2017-06-20 | National Cancer Center | Gastric cancer cell line derived from murine gastric adenocarcinoma lacking p53 and E-cadherin and use thereof |
| KR20240130899A (ko) | 2023-02-22 | 2024-08-30 | 아주대학교산학협력단 | Gfp 형광을 발현하는 불멸화된 마우스 위 유래 섬유아세포주 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014175567A1 (ko) | 2014-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Park et al. | YAP and AP-1 cooperate to initiate pancreatic cancer development from ductal cells in mice | |
| KR101456627B1 (ko) | 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 및 독성 평가를 위한 마우스 위암 세포주 | |
| CN108884472A (zh) | 用于体内双重组酶介导的盒式交换(dRMCE)的系统和方法及其疾病模型 | |
| Čemažar et al. | Mouse Models of Cancer: Methods and Protocols | |
| Wei et al. | Orthotopic xenograft mouse model of cervical cancer for studying the role of MicroRNA-21 in promoting lymph node metastasis | |
| CN109562121A (zh) | 转移性癌症的诊断和治疗方法 | |
| JP2016028569A (ja) | がん幹細胞集団の調製方法、異種移植片の調製方法、スクリーニング方法、ｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法及びがん幹細胞増殖抑制剤 | |
| CA2582236A1 (en) | Tumor models employing green fluorescent protein | |
| US9683987B2 (en) | Gastric cancer cell line derived from murine gastric adenocarcinoma lacking p53 and E-cadherin and use thereof | |
| CN117462683B (zh) | Eif3h在结直肠癌治疗中的应用 | |
| CN112656805A (zh) | 抑制ythdf1活性的物质在制备预防或治疗胃癌产品中的应用 | |
| EP4074821A1 (en) | System for detecting extracellular purinergic receptor ligand and nonhuman animal having same transferred thereinto | |
| JP5891172B2 (ja) | 正常乳腺上皮細胞からの腫瘍細胞の製造方法 | |
| KR20200067296A (ko) | Rarres1 유전자 넉아웃 동물 모델 및 그의 제조방법 | |
| CN114672517B (zh) | 一种全新基因组合模式在小鼠中建立胰腺癌的方法 | |
| Wenta et al. | Disassembly of hemidesmosomes promotes tumorigenesis in PTEN-negative prostate cancer by targeting plectin into focal adhesions | |
| Song et al. | Establishment of highly tumorigenic human gastric carcinoma cell lines from xenograft tumors in mice | |
| Brandt | Investigating Tissue Specific Functions of the Hippo Pathway and Its Core Kinases | |
| Turrell | Gain-of-function and dominant-negative effects of distinct p53 mutations in lung tumours | |
| Warren | Targeting Yap/Taz-Tead in Metastatic Disease | |
| Pitarresi | The Roles of Hedgehog, Pten, and ETS2 Signaling in the Regulation of Pancreatic Tumorigenesis by Stromal Fibroblasts | |
| COUM | NUCLEAR SEGREGATION OF RNA AS A POTENTIAL NOVEL MARKER AND REGULATION MECHANISM OF QUIESCENCE IN NEURAL STEM CELL | |
| Dang | ETV1-Driven Drug Resistance in BRAFV600E Melanoma | |
| Yang | The role of ErbB2 and its splice variant in lung tumour progression | |
| Khuda-Bukhsh et al. | Mice as Experimental Models for Cancer Research |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170920 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180912 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190903 Year of fee payment: 6 |