KR101453447B1

KR101453447B1 - 갈렉틴을 포함하는 생물농약 조성물

Info

Publication number: KR101453447B1
Application number: KR1020110121248A
Authority: KR
Inventors: 최수근; 박승환; 정다은
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2014-10-21
Also published as: WO2013073919A1; KR20130055479A

Abstract

본 발명은 갈렉틴을 유효성분으로 포함하는 생물농약 보조용 조성물, 상기 갈렉틴과 바실러스 투린지엔시스를 포함하는 생물농약 조성물, 바실러스 투린지엔시스에서 발현되기에 적합하도록 최적화된 염기서열로 구성된 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입되어 갈렉틴을 발현하도록 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 포함하는 생물농약 조성물 및 상기 생물농약 조성물을 이용한 살충방법에 관한 것이다. 본 발명의 갈렉틴과 바실러스 투린지엔시스를 포함하는 생물농약은 종래의 바실러스 투린지엔시스의 살충활성 보다도 현저하게 향상된 살충활성을 나타내어, 해충에 의한 식물의 손상을 보다 효과적으로 방지할 수 있으므로, 향상된 효과를 나타내는 생물농약의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

갈렉틴을 포함하는 생물농약 조성물{Biotic pesticide composition comprising galectin}

본 발명은 갈렉틴을 포함하는 생물농약에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 갈렉틴을 유효성분으로 포함하는 생물농약 보조용 조성물, 상기 갈렉틴과 바실러스 투린지엔시스를 포함하는 생물농약 조성물, 바실러스 투린지엔시스에서 발현되기에 적합하도록 최적화된 염기서열로 구성된 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입되어 갈렉틴을 발현하도록 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 포함하는 생물농약 조성물 및 상기 생물농약 조성물을 이용한 살충방법에 관한 것이다.

일반적으로, 식물은 유전적인 특성과 기후 및 외부 환경 변화 등에 따라 생육 장애가 발생되고, 병원균에 의한 감염 등에 노출되어 있다. 통상적으로 다양한 병원균에 의한 감염 또는 자체적으로 생육 저하나 발육 장애가 나타날 경우 조치 방법은 농약이나 화학적 치료제를 살포하여 처방하게 된다.

이와 같은 농약이나 화학적 치료제의 사용은 식물병 치료 목적으로 효과적으로 이용되어 왔으나, 남용과 과다사용으로 인해 생태계 교란과 변화를 가속시키는 요인되고 있으며, 토양 오염을 포함하여 환경 파괴와 인체 흡수에 의한 질병 유발 등을 일으키는 등 2차적인 문제를 발생시킨다. 또한, 농약은 기본적으로 독성 물질을 직접 병원균에 접촉시켜 목적물을 치료하는 구제용 제재로 분류되며, 인체에 흡수되어 농약 중독에 의한 질병 유발 등 다양한 문제를 야기시키는 유해성 물질로서, 취급에 주의를 요하는 대표적인 물질이다.

식물 병원균 방제를 위한 화학합성 농약 사용량 증대는 내성균주의 출현을 유발하였고, 이에 따라 내성 균주를 방제하기 위하여 새로운 종류의 합성농약 수요와 농약 사용량은 계속 증가하고 있는 실정이다. 이같이 점차적으로 증가하는 화학합성 농약은 생분해성과 선택성이 낮아 생태계를 파괴함은 물론 토양에 축적되어 먹이 사슬을 통해 사람과 가축에 직접적, 간접적인 피해를 준다. 그러므로 화학합성 농약에 비하여 인간의 건강과 환경에 해가 적고, 저독성이며, 생분해성인 생물농약 또는 생물학적 방제(biological control)제에 대한 관심이 크게 증가하고 있다.

미생물이나 이들이 생산하는 물질을 이용한 생물농약은 화학농약의 오 남용에 의한 부작용 없이 식물 병원균을 방제하는 대체 수단으로 이용되고 있다. 그람양성 세균인 바실러스 속 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 다음으로 널리 연구되고 상용화된 미생물로서 내생포자(endospore)를 형성하는 특징을 가지는 속으로 다양한 식물병 방제제로 보고되어 있다. 이들 바실러스 속의 미생물은 즈비터마이신(zwittermicin)-A, 카노사민(kanosamine)이나, 설팍틴(surfactin), 이투린(iturin) 및 펜지신(fengycin)이 속한 리포 펩타이드(lipopeptides)계 항균물질을 생산하는 것으로 알려져 있다.

이러한 바실러스 속의 미생물 중에서, 생물농약으로 사용되고 있는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis, Bt, 비티)는 포자를 형성하는 동안 델타-내독소(δ-endotoxin)라 불리는, 내독소 결정형 단백질(insecticidal crystal proteins, ICPs)을 생산하는 그람 양성 세균이다. 100 가지 이상의 Bt 크리스탈(ICPs)은 살충 특성 및 분자구조에 근거하여 크게 Cry Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ의 5 종류로 분류된다. 이들은 나비목(Cry Ⅰ), 나비목 및 파리목(Cry Ⅱ) 딱정벌레목(Cry Ⅲ), 파리목(Cry Ⅳ), 나비목 및 딱정벌레목(Cry Ⅴ)에 대한 살충 활성이 있다. 이 중 나비목에 대한 Bt 내독소 결정형 단백질의 경우는 유충 발육단계 동안에 다양한 독성을 지닌다. 대부분의 나비목 충에 높은 독성을 나타내는 바실러스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키(B.thuringiensis subsp. kurstaki) Cry1Ac의 델타-내독소(δ-endotoxin)는 파밤나방에 대해서 초기 어린 유충을 제외하고는 높은 살충효과를 나타내지 않는다. Bt가 생산하는 내독소 결정형 단백질(ICPs)은 분자량이 약 130 kDa이며 자체적으로는 살충 활성이 없으나, 상기 전독소 단백질을 곤충이 섭식하였을 때, 알칼리 상태인 곤충의 중장 내에서 단백질 소화효소에 의해서 약 55-70kDa의 살충성을 나타내는 독소 단백질로 분해된다. 이러한 독소는 중장세포의 수용체에 결합하여 구멍을 냄으로써, 중장세포막의 이온교환의 불균형 및 영양분의 흡수가 이루어지지 않게 되며, 이에 따라 패혈증이 유발되어, 곤충은 섭식이 중단되고 결국은 사멸하게 된다.

하지만 Bt에 내성이 강한 파밤나방의 경우의 내독소 결정형 단백질이 중장효소에 의해 과분해되어 살충성을 나타내는 독소단백질 보다 더 작은 분자로 분해되어 결국 살충 활성이 약화 된다. 이렇듯 단백질 분해효소가 Bt 독소의 살충력을 결정하는 중요한 요소이다. 따라서 이러한 소화효소의 강한 분해력을 억제시키는 단백질 분해효소 억제자 및 Bt를 함께 섭식시켜 독소 단백질이 과분해되지 않도록 하여 살충성을 높이는데 초점을 두고 있다. 나비목 유충의 중장 내 소화효소는 세린계 단백질 분해효소(Serine proteases)가 높은 비율을 차지하며, 이는 단백질 가수분해 과정에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 Bt는 화학농약에 비해 상대적으로 낮은 활성을 나타내고, 재현성이 저조하며 가격이 비싸다는 단점이 있어서, 이를 해결하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기 Bt의 단점을 극복하고자 예의 연구노력한 결과, 갈렉틴을 Bt와 병용처리할 경우 Bt의 활성을 증대시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 갈렉틴을 유효성분으로 포함하는 생물농약 보조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 갈렉틴과 바실러스 투린지엔시스를 포함하는 생물농약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 균주에서 발현되기에 적합하도록 최적화된 염기서열로 구성된 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입되어, 갈렉틴을 발현하도록 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 포함하는 생물농약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생물농약 조성물을 이용한 살충방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 갈렉틴을 유효성분으로 포함하는 생물농약 보조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "갈렉틴(galectin)"이란, 구조적으로 베타-갈락토시드에 대한 친화성을 가지는 적어도 하나의 특징적인 당인식부위(carbohydrate recognition domain, CRD)을 포함하고, 갈랍틴(galaptin) 또는 S-렉틴(S-lectin)으로도 호칭되는 베타-갈락토시드와 결합하는 렉틴의 일종으로서, 포유류, 조류, 양서류, 어류, 선충류, 해면동물류 및 진균류에 존재하며, 세포질로부터 외부로 분비되지만, 핵이나 다른 세포내 소기관에 작용하기도 하며, 만성 염증성 질환, GVHD 및 알레르기 반응의 억제와 같은 다양한 기능을 수행한다. 본 발명의 목적상 바실러스 투린지엔시스의 살충활성을 향상시키기 위한 보조제의 용도로서 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "생물농약(biotic pesticide)"이란, 천적곤충, 천적미생물, 길항미생물 등을 이용하여 화학농약과 같은 형태로 살포 또는 방사하여 병해충 및 잡초를 방제하는 약제를 의미하는데, 천적곤충제, 천적미생물제와 같은 해충방제용 생물농약, 균핵을 살멸하는 병해방제용 생물농약, 잡초방제용 생물농약 등을 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 생물농약은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바실러스 투린지엔시스를 포함하는 해충방제용 생물농약이 될 수 있고, 바람직하게는 상기 바실러스 투린지엔시스와 갈렉틴을 포함하여 향상된 살충활성을 나타내는 해충방제용 생물농약이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "생물농약 보조용 조성물"이란, 상술한 해충방제용 생물농약, 병해방제용 생물농약, 잡초방제용 생물농약의 활성을 향상시키거나 또는 범위를 확장시키는 등의 보조적인 역할을 수행하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 생물농약 보조용 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 해충방제용 생물농약의 활성을 향상시키는 용도로서 사용될 수 있고, 바람직하게는 바실러스 투린지엔시스의 활성을 향상시키기 위한 용도로서 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 갈렉틴을 이용하여 바실러스 투린지엔시스의 살충활성을 향상시키기 위한 용도로서 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 배추좀나방에 대하여 갈렉틴 자체는 별다는 살충활성을 나타내지 않으나, 바실러스 투린지엔시스 배양액과 함께 갈렉틴을 처리할 경우에는 바실러스 투린지엔시스의 살충활성을 4배 이상 증진시킬 수 있음을 확인하였다(도 2).

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 갈렉틴과 바실러스 투린지엔시스를 포함하는 생물농약 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis, Bt)"란, 포자를 형성하는 동안 델타-내독소(δ-endotoxin)라 불리는, 내독소 결정형 단백질(insecticidal crystal proteins, ICPs)을 생산하는 그람 양성 세균을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 Bt는 갈렉틴에 의하여 활성이 향상되는 대상물로서 사용되나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 생물농약 조성물은 단독으로 사용하거나 또는 다른 부형제와 함께 제제화 하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제제화에 일반적으로 사용되는 담체, 기타 보조제 등을 배합하여, 유제, 현탁제, 분제, 입제, 정제, 수화제, 수용제, 수액, 유동제, 과립 수화제, 에어로졸제, 페이스트제, 유탁제 등의 여러 형태로 제제할 수 있다. 이때, 제제화에 사용되는 담체로서는, 고체담체와 액체 담체의 어느 것이나 그 사용목적에 따라 이용할 수 있다. 고체 담체로서는 예를 들면, 전분, 활성탄, 대두분, 소맥분, 목분, 어분, 분유 등의 동식물성 분말; 탈크, 카올린, 벤토나이트, 탄산칼슘, 제올라이트, 규조토, 화이트 카본, 클레이, 알루미나, 황산 암모늄, 요소 등의 무기물 분말을 들 수 있다. 액체 담체로서는 예를 들면 물; 이소프로필알콜, 에틸렌글리콜 등의 알콜; 시클로헥사논, 메틸에틸케톤 등의 케톤류; 디옥산, 테트라히드로퓨란 등의 에테르류; 케로신, 경유 등의 지방족 탄화수소류; 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 메틸나프탈렌, 솔벤트나프타 등의 방향족 탄화수소류; 클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류; 디메틸아세트아미드 등의 산 아미드류; 지방산의 글리세린에스테르 등의 에스테르류; 아세토니트릴 등의 니트릴류; 디메틸술폭시드 등의 함황화합물류 등을 들 수 있다. 계면활성제로서는 예를 들면, 알킬벤젠술폰산금속염, 디나프틸메탄디술폰산 금속염, 알콜황산 에스테르염, 알킬아릴 술폰산염, 리그닌술폰산염, 폴리옥시에틸렌글리콜에테르, 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노알킬레이트 등을 들 수 있다. 그 밖의 보조제로서는 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 아라비아 고무, 알긴산 나트륨, 구아검, 트라간트검, 폴리비닐알콜 등의 고착제 혹은 증점제, 금속 비누 등의 소포제, 지방산, 알킬인산염, 실리콘, 파라핀 등의 물성 향상제, 착색제 등을 사용할 수 있다. 이들 제제의 실제 사용 시에는, 그대로 사용하거나, 또는 물 등의 희석제로 소정 농도로 희석하 여 사용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 바실러스 균주에서 발현되기에 적합하도록 최적화된 염기서열로 구성된 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입되어 갈렉틴을 발현하도록 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 포함하는 생물농약 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드"란, 갈렉틴 단백질을 코딩하는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 의미하는데, 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 갈렉틴 단백질의 아미노산 서열은 변화시키지 않으면서도 바실러스 균주에서 발현되기에 적합하도록 최적화된 염기서열로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자, 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 발현벡터는 바람직하게는 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 1 또는 2이상의 카피수로 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 1 또는 2이상의 카피수로 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "형질전환체"란 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터가 도입되어 형질전환된 세포를 의미하며, 재조합 포유동물 세포, 설치류 세포, 바람직하게는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 바실러스 균주에서 발현되기에 적합하도록 최적화된 염기서열로 구성된 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 바실러스 속 균주일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 바실러스 속 균주일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 바실러스 서틸리스 또는 바실러스 투린지엔시스 균주일 수 있다.

또한, 상기 생물농약 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 바실러스 균주에서 발현되기에 적합하도록 최적화된 염기서열로 구성된 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 바실러스 균주와 바실러스 투린지엔시스 균주를 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 바실러스 균주와 바실러스 투린지엔시스 균주를 포함하거나 또는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 바실러스 투린지엔시스 균주를 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 바실러스 투린지엔시스 균주를 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 생물농약 조성물을 해충이 발생된 영역에 처리하는 단계를 포함하는 살충방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "해충"이란 인간의 생활에 직접 또는 간접으로 해를 주는 곤충의 총칭하여 의미하는데, 이, 빈대, 모기, 독나방 등과 같이 인체에 직접적으로 해독을 미치는 곤충류; 바퀴, 좀, 파리 등과 같이 인체에 간접적으로 해독을 미치는 곤충류; 명나방류의 유충, 바구미, 말매미충, 진딧물, 노린재, 진드기, 털날개류, 하늘소 등과 같이 농작물에 피해를 입히는 곤충류 등을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 해충은 바실러스 투린지엔시스에 의하여 살멸될 수 있는 나비목, 파리목, 딱정벌레목 등의 곤충류를 의미하지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "해충이 발생된 영역"이란 상기 해충이 발생하거나, 서식하거나 또는 군집을 형성하여 직접적 또는 간접적으로 인간의 생활에 해독을 미치는 공간적 영역을 의미하는데, 사람의 거주지, 작업장, 경작지 등을 포함하나 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 생물농약 조성물의 처리방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 분무, 관주 또는 침지 등의 통상의 약제 처리방법에 따라 수행됨이 바람직하다. 또한, 상기 생물농약 조성물의 처리양은 목적하는 해충의 종류, 발생단계, 군집수준 등에 따라 적정수준의 양와 횟수로 처리함이 바람직하다.

본 발명의 갈렉틴과 바실러스 투린지엔시스를 포함하는 생물농약은 종래의 바실러스 투린지엔시스의 살충활성 보다도 현저하게 향상된 살충활성을 나타내어, 해충에 의한 식물의 손상을 보다 효과적으로 방지할 수 있으므로, 향상된 효과를 나타내는 생물농약의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 바실러스에서 Gal 단백질과 Gal-Gal 융합단백질의 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, M은 size marker, 1은 대조구, 2는 Gal, 3은 Gal-Gal이 과발현된 샘플을 나타내고, 화살표는 발현된 Gal 또는 Gal-Gal 융합단백질을 의미한다.
도 2는 Gal 또는 Gal-Gal 융합단백질이 Bt HD1의 살충활성을 증대시키는 지 확인하기 위하여 배추좀나방을 대상으로 살충활성을 검정한 결과를 나타내는 그래프로서, HD1+vector control은 대조군을 나타내고, HD1+gal1과 HD1+gal2는 각각 Gal 또는 Gal-Gal 융합단백질이 과발현된 바실러스균을 Bt HD1과 혼합한 실험군을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 바실러스에서 갈렉틴 대량생산

실시예 1-1: 갈렉틴을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작

CHO(Chinese hamster ovary) 갈렉틴을 바실러스에서 대량발현하기 위하여 상기 갈렉틴을 코딩하는 유전자를 바실러스 코돈에 최적화하여 화학적으로 합성하였다. 이때 아미노산 서열은 변하지 않은 채 바실러스에서 발현을 원활히 하기 위하여 변형된 DNA 염기서열을 갖도록 합성하였다(gal1, 서열번호 1).

상기 합성된 gal1 유전자를 프로모터 P8D에 클로닝하였다. 이때, 프로모터 P8D는 플라스미드 pA84(특허공개 제2011-0090328호)를 주형으로 하고, 프라이머 84-PF1(서열번호 2)과 stabR2(서열번호 3)를 사용한 PCR을 수행하여 수득하였다.

84-PF1: 5'-acgaggccctttcgtcttcaa-3'(서열번호 2)

stabR2: 5'-ttttcttcctccctttcttatcataata-3'(서열번호 3)

또한, 상기 합성된 gal1 유전자를 주형으로 하고, 프라이머 galf (서열번호 4)와 galr (서열번호 5)를 사용한 PCR을 수행하여 gal1 유전자를 증폭시켰다.

galf: 5'-gataagaaagggaggaagaaaaatggcgtgcggtcttgttgccag-3'(서열번호 4)

galr: 5'-gaagctcggcggatttgtcctactcttattcaaacgctaca-3'(서열번호 5)

증폭된 gal1 유전자를 상기 P8D 프로모터에 연결하여 P8D-gal1을 수득하고, 상기 수득한 P8D-gal1을 제한효소 EcoRI/HindIII로 절단한 플라스미드 pAD123(Gene 1999. 226: 297-305)에 Cold fusion cloning kit (System Biosciences Inc.)를 사용하여 클로닝하여, 발현벡터 pA8g를 제작하였다.

실시예 1-2: 갈렉틴 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작

상기 실시예 1-1에서 합성된 gal1 유전자가 서로 융합된 gal-gal 융합유전자(gal2)를 수득하기 위하여, 상기 합성된 gal1 유전자를 주형으로 하고, 프라이머 galf (서열번호 4)와 galr1(서열번호 6)을 사용한 PCR을 수행하여 gal1 유전자를 증폭시켰다.

galr1: 5'-tatcccgggcgtacgactagtggatccgtggtggtggtggtggtgaccctggaagtacaggttctcttcaaacgctacacatttga-3'(서열번호 6)

상기 증폭된 gal1 유전자를 상기 실시예 1-1에서 수득한 P8D 프로모터에 연결하여 P8D-galF를 수득하고, 상기 수득한 P8D-galF를 제한효소 EcoRI/BsiWI으로 절단하여 플라스미드 pDG1661(Gene 1996. 180: 57-61)에 삽입한 다음, 상기 삽입된 플라스미드를 다시 제한효소 EcoRI/NsiI으로 절단하여 플라스미드 pAD123에 클로닝하여, 발현벡터 pA8D-galF를 제작하였다.

한편, 상기 합성된 gal1 유전자를 주형으로 하고, 프라이머 g2f-bam (서열번호 7)과 g2r-spe (서열번호 8)을 사용한 PCR을 수행하여 gal1 유전자를 증폭시켰으며, 증폭된 gal1 유전자를 제한효소 BamHI/ SpeI으로 절단하여 상기 제작된 플라스미드 pA8D-galF에 클로닝함으로써, 두 개의 gal 유전자가 서로 융합된 gal-gal 융합유전자(gal2)를 포함하는 발현벡터 pA8g2를 제작하였다.

g2f-bam: 5'-ataggatccgcgtgcggtcttgttgcc-3'(서열번호 7)

g2r-spe: 5'-ataactagtttattcaaacgctacaca-3'(서열번호 8)

실시예 1-3: 형질전환체의 제작 및 갈렉틴의 대량생산

상기 실시예 1-1에서 제작된 발현벡터 pA8g와 실시예 1-2에서 제작된 발현벡터 pA8g2를 바실러스 서틸리스 168 균(Nature 1997. 390:249-256)에 도입하여 각각의 형질전환체를 제작하고, 상기 제작된 각각의 형질전환체를 TSB(Difco) 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각각의 배양액을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 1). 도 1은 바실러스에서 Gal 단백질과 Gal-Gal 융합단백질의 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, M은 size marker, 1은 대조구, 2는 Gal, 3은 Gal-Gal이 과발현된 샘플을 나타내고, 화살표는 발현된 Gal 또는 Gal-Gal 융합단백질을 의미한다. 도 1에서 보듯이, gal1 유전자와 gal2 유전자 모두 바실러스에서 대량으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 갈렉틴의 살충활성 검정

상기 실시예 1-3에 따라, gal1 유전자로부터 발현된 갈렉틴(Gal1)과 gal2 유전자로부터 발현된 갈렉틴(Gal2)이 살충활성을 나타내는지의 여부를 배추좀나방을 대상으로 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-3에서 수득한 각각의 형질전환체를 배양한 배양물 1㎖를 9㎖의 트라이톤(trito x-100)과 혼합한 다음, 직경 4cm 케일 잎에 처리하였다. 이어, 상기 처리된 케일 잎에 3령기의 배추좀나방 유충 10마리를 접종하고, 72시간이 경과한 후, 죽은 유충을 계수하였다. 그 결과, 죽은 유충이 거의 발견되지 않았으므로, Gal1 또는 Gal2 단독으로는 별다른 살충효과를 나타내지 않음을 확인하였다.

한편, gal1 유전자로부터 발현된 갈렉틴(Gal1)과 gal2 유전자로부터 발현된 갈렉틴(Gal2)이 생물농약으로 사용되고 있는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis, Bt)의 살충활성을 보조할 수 있는지의 여부를 확인하였다.

구체적으로, Bt 쿠스타키 HD1 균주를 배양하고, 상기 배양물을 상기 실시예 1-3에서 수득한 각각의 형질전환체를 배양한 배양물 1㎖ 및 최종농도 0.1%의 트라이톤과 혼합한 다음, 직경 4cm 케일 잎에 처리하였다. 이어, 상기 처리된 케일 잎에 3령기의 배추좀나방 유충 10마리를 접종하고, 72시간이 경과한 후, 죽은 유충을 계수하였다(도 2). 이때, 대조군으로는 실시예 1-3에서 수득한 각각의 형질전환체를 배양한 배양물 대신에, 갈렉틴 유전자가 도입되지 않은 플라스미드 pAD123가 도입된 형질전환체를 배양한 배양물을 사용하였다. 도 2는 Gal 또는 Gal-Gal 융합단백질이 Bt HD1의 살충활성을 증대시키는 지 확인하기 위하여 배추좀나방을 대상으로 살충활성을 검정한 결과를 나타내는 그래프로서, HD1+vector control은 대조군을 나타내고, HD1+gal1과 HD1+gal2는 각각 Gal 또는 Gal-Gal 융합단백질이 과발현된 바실러스균을 Bt HD1과 혼합한 실험군을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, Gal1은 Bt의 살충활성을 약 4.6배 증가시켰고, Gal2는 Bt의 살충활성을 약 4배 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 바실러스를 숙주균으로 대량발현된 Gal 단백질은 친환경 생물농약 특히 Bt제의 보조제로 사용 가능하며 기존 생물농약의 사용량을 줄이거나 성능을 향상시켜 경제성을 확보하는데 도움을 줄 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Biotic pesticide composition comprising galectin <130> PA110882/KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal1 <400> 1 atggcgtgcg gtcttgttgc cagcaatctg aaccttaaac ctggtgaatg tttaaaagtc 60 cgtggcgaag tagctccgga tgccaaatca tttgtcttga acttgggaaa agacagcaat 120 aacctgtgcc ttcattttaa tcctagattt aacgcacatg gtgatgcgaa cacaatcgtt 180 tgtaactcta aagacaacgg cacatgggga acggaacatc gcgaaccggc atttcctttt 240 caaccgggct ccacagttga agtgtgcatt acgtttgatc aggcagactt aacgatcaaa 300 ttgcctgatg gacatgaatt taaatttccg aacagactga acatggaagc aatcaactat 360 atggcagcag atggtgactt taaaatcaaa tgtgtagcgt ttgaataa 408 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 84-PF1 primer <400> 2 acgaggccct ttcgtcttca a 21 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stabR2 primer <400> 3 ttttcttcct ccctttctta tcataata 28 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galf primer <400> 4 gataagaaag ggaggaagaa aaatggcgtg cggtcttgtt gccag 45 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galr primer <400> 5 gaagctcggc ggatttgtcc tactcttatt caaacgctac a 41 <210> 6 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galr1 primer <400> 6 tatcccgggc gtacgactag tggatccgtg gtggtggtgg tggtgaccct ggaagtacag 60 gttctcttca aacgctacac atttga 86 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g2f-bam primer <400> 7 ataggatccg cgtgcggtct tgttgcc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g2r-spe primer <400> 8 ataactagtt tattcaaacg ctacaca 27

Claims

삭제
갈렉틴을 유효성분으로 포함하며, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis, Bt)의 살충활성을 보조하는 것인, 생물농약 보조용 조성물.
삭제
갈렉틴과 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis, Bt)를 포함하는 생물농약 조성물.
제4항에 있어서,
부형제를 추가로 포함하는 것인 생물농약 조성물.
서열번호 1의 염기서열로 구성된 갈렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제7항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드를 1 또는 2 이상의 카피수로 포함하는 것인 발현벡터.
제7항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어, 갈렉틴을 발현할 수 있도록 형질전환된 형질전환체.
제9항에 있어서,
상기 숙주세포는 바실러스 속 균주인 것인 형질전환체.
제10항에 있어서,
상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서틸리스 또는 바실러스 투린지엔시스인 것인 형질전환체.
제9항의 형질전환체를 포함하는 생물농약 조성물.
제12항에 있어서,
바실러스 투린지엔시스를 추가로 포함하는 것인 생물농약 조성물.
제4항, 제5항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항의 생물농약 조성물을 해충이 발생된 영역에 처리하는 단계를 포함하는 살충방법.
제14항에 있어서,
상기 해충은 바실러스 투린지엔시스에 의하여 살멸될 수 있는 곤충류인 것인 살충방법.
제15항에 있어서,
상기 곤충류는 나비목, 파리목 및 딱정벌레목으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 살충방법.